Indicatori microbiologici e molecolari Indicatori microbiologici Dosaggio della carica microbica Rappresenta il numero di microrganismi, appartenenti ad un gruppo fisio-tassonomico generale (lieviti, funghi, batteri, actinobacteri, protozoi), oppure ad uno specifico gruppo fisiologico o funzionale (azotofissatori, proteolitici, ammonificanti, nitrificanti, denitrificanti, cellulosolitici, solfo-ossidanti, etc.), normalmente stimati in relazione al grammo di suolo. Si può stimare la dimensione (quantità), o la composizione (qualità) della microflora tellurica. Può essere determinata per via diretta (osservazione al microscopio) indiretta (colturale) La carica microbica per via diretta Si utilizzano dei coloranti per marcare cromaticamente le cellule microbiche da osservare successivamente al microscopio Batteri Batteri Funghi La carica microbica per via indiretta La carica microbica viene determinata utilizzando terreni colturali agarizzati (in piastra) oppure liquidi, validi per gruppi generici di microrganismi, oppure “selettivi” Schema generale di estrazione dal suolo e messa in coltura di cellule microbiche Dopo incubazione delle piastre, le colonie formate vengono enumerate Tuttavia… Il 99% delle specie di batteri del suolo è sconosciuto (Ritz et al., 2003). Il 95% dei batteri conosciuti (1%) non è coltivabile (Lynch, 2003). Metodi di analisi molecolare Permettono lo studio delle comunità microbiche del suolo in relazione alla loro composizione, struttura, dinamica e funzione Analisi di steroli e di fosfolipidi di membrana (FAME, PLFA) Analisi di acidi nucleici (DNA e RNA) Acidi grassi di fosfolipidi (PLFA) per g soil: µg BC = 5.8·nmol total PLFA Dosaggio dell’ATP Dosaggio del DNA per g soil: µg BC = 6.0·µg DNA Metodi di indagine molecolare Il 16S rDNA rappresenta la molecola di elezione per l’analisi della diversità batterica ed è attualmente la biomolecola più utilizzata nelle indagini di caratterizzazione biomolecolare per lo studio delle comunità batteriche del suolo Variabili misurate - Proprietà fisiche Sabbia, limo, argilla - Proprietà chimiche TOC,TN, pH, CEC, EC, TCa, ACa - Proprietà biochimiche Cmic, Nmic, Extr-C, Extr-N, SBR, qCO2 - Attività enzimatiche fosfatasi acida (AcP), fosfatasi alcalina (AlkP), arilsolfatasi (ArS), deidrogenasi (DH), -glucosidasi (Glu), FDA-idrolasi (FDA) - Struttura molecolare via PCR-DGGE Variabili indagate: 22 Profili campionati: 11 (x 3 replicati) Soil bacterial community analysis Direct soil DNA extraction and purification PCR with bacterial primers targeting the V6-V8 hypervariable regions 16S rDNA Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of PCR-amplified 16S rDNA fragments. Fragments with the same length but different base composition are separated along a denaturing chemical (Urea + Formamide) gradient. 40% UF 58% UF DGGE bacterial community fingerprinting 1-Ap 1-Bw 1-Bk 2-Oa 2-A 2-AB N DGGE bacterial community fingerprinting BS 3-Ap 3-Bw 4-A 4-Bw 4-BC N Dendrogramma di similarità Cluster 1 Cluster 2 Cluster 4 Cluster 3 Cluster 5 Cluster 6 I processi di pedogenesi determinano l'evoluzione del suolo con la formazione di orizzonti diversi - caratterizzati da distinte proprietà chimico-fisiche - che ospitano diversificate comunità microbiche funzionalmente attive, le quali, a loro volta, sostengono il processo pedogenetico dell’orizzonte e ne determinano l’evoluzione