LA GENETICA MOLECOLARE

LA GENETICA MOLECOLARE
Obiettivi del corso
Studio del genoma
Genomica strutturale
Genomica funzionale
Genomica comparata
Studio del trascrittoma
Analisi dei profili di espressione
Studio del proteoma
Proteomica di espressione
Proteomica funzionale
L’era delle ‘omiche’
Genomica
DNA (Geni)
CGTCCAACTGACGTCTACAA
GTTCCTAAGCT
Trascrittomica
Trascrizione
RNA
Traduzione
Genomica
funzionale
Proteomica
PROTEINE
Reazioni
enzimatiche
Metabolomica
METABOLITI
Un pò di nomenclatura…
Gen
Trascritt
Prote
Metabol
Gen
Prote
~oma =
~omica =
L’insieme di
Studio e
analisi di
Geni
Trascritti
Proteine
Metaboliti
Genoma
Proteoma
Genoma
Il corredo genetico
di ogni individuo
Ogni cellula può essere
vista come una macchina
complessa che esegue
delle istruzioni scritte e
memorizzate nel proprio
genoma
Trascrittoma
Completo set di trascritti e loro relativi
livelli di espressione in particolari
cellule o tessuti sotto
definite condizioni
fisiologiche e/o patologiche
e/o in seguito a trattamento
(chimico e/o fisico)
Proteoma
Il proteoma rappresenta l’insieme di
tutti i possibili prodotti genici,
all’interno di ogni cellula.
Non tutti i geni sono espressi in
tutte le cellule
Varia nelle diverse cellule, nei
diversi tessuti all’interno dello
stesso organismo e nei differenti
stadi di crescita (il proteoma è
variabile, il genoma è costante)
E’ condizionato da fattori ambientali,
malattie, farmaci, stress, condizioni
di crescita (il proteoma è dinamico, il
genoma è statico)
Le proteine sono la ‘chiave’ per comprendere
la funzione biologica
Genome
Transcriptome
Proteom:
The protein complement of genome
P
Transcription
DNA
mRNA
~30,000
Genes
Processing
Translation
Proteins
>1,000,000
Proteins
Modified
proteins
Each protein associated
to ≥1 function(s)
Perchè abbiamo bisogno del proteoma se già conosciamo il genoma?
GENOMA:
Definisce ciò
che può accadere
TRASCRITTOMA:
Definisce ciò che sta per accadere
Biological
function
PROTEOMA: Definisce ciò che sta accadendo
Bioinformatica
- potenza elaborativa
- facilità d’uso
- creazione di specifici software di analisi,
applicazioni ad hoc per risolvere specifici
problemi biologici
- accesso on-line attraverso il World-Wide
Web
Il Genoma umano
Struttura fisica e contenuto genico
Cos’é il Genoma??
Il genoma è l'intero patrimonio
genetico di un organismo vivente.
Si può paragonare ad un'enorme
enciclopedia in cui sono contenute
le istruzioni che regolano lo
sviluppo e il funzionamento
dell'organismo.
Il genoma è "scritto" in un
composto chimico chiamato DNA
(DeoxyriboNucleic Acid, acido
desossiribonucleico)
Il DNA è identico per tutte le cellule di un individuo ed è contenuto
nel nucleo
La scoperta del materiale genetico
Qual’ è la sostanza responsabile dell’ereditarietà dei
“caratteri”?
Quali devono essere le sue caratteristiche fondamentali?
1. Possedere l’informazione
2. Replicare autonomamente
3. Andare incontro a variazione
LA STRUTTURA DI DNA ED RNA
Sia il DNA che l’RNA sono polimeri
I monomeri sono i nucleotidi
Il pentoso è uno zucchero
a 5 atomi di carbonio
LA STRUTTURA DI DNA ED RNA
Catena polinucleotidica di DNA.
Legame fosfodiesterico 5’-3’
Nucleotidi del DNA e dell’RNA.
Le basi sono legate al’atomo di C 1’
del pentoso da un legame covalente.
Nucleotide = pentoso + base azotata
+ gruppo fosfato
Nucleoside = pentoso + base azotata
LA STRUTTURA DI DNA ED RNA
Due fonti di informazione:
1.
Gli studi di Erwin Chargaff sulla composizione in basi del DNA
•
Indicavano che la molecola di DNA a doppia elica è costituita dal 50%
di purine (A, G) e dal 50% di pirimidine (C, T)
•
Quantità di A = quantità di T e quantità di G = quantità di C
(regole di Chargaff)
•
% GC varia nei diversi organismi
Esempio:
%A
%T
%G
%C
%GC
Homo sapiens
Zea mays
Drosophila
Escherichia coli
31.0
25.6
27.3
26,1
31.5
25.3
27.6
23,9
19.1
24.5
22.5
24.9
18.4
24.6
22.5
25,1
1.67
1.04
1.22
1,00
LA STRUTTURA DI DNA ED RNA
Due fonti di informazione:
2.
Gli studi sulla diffrazione dei raggi X di Rosalind Franklin e Maurice H.
F. Wilkins
Il DNA è una struttura ad elica con 2 periodicità distintive:
0.34 nm e 3.4 nm
IL MODELLO TRIDIMENSIONALE
• La molecola di DNA è costituita da due
catene polinucleotidiche avvolte l’una
intorno all’altra; doppia elica destrorsa;
• Le due catene sono antiparallele;
• Lo scheletro zucchero-fosfato si trova
all’esterno della doppia elica, mentre le
basi sono orientate verso l’interno;
•Le basi complementari dei due filamenti
opposti sono legate insime da legami deboli
(A-T) 2 legami H, (G-C) 3 legami H
secondo le regole di Chargaff;
•Le coppie di basi sono distanziate 0,34
nm, mentre un intero giro dell’elica
richiede 3,4 nm.
•Le impalcature zucchero-fosfato della
doppia elica non sono ugualmente
distanziate tra loro, ciò determina la
formazione di un solco maggiore e di un
solco minore.
IL MODELLO TRIDIMENSIONALE
IL MODELLO TRIDIMENSIONALE
Il DNA può esistere in diverse forme, A, B, e Z
DNA-A
Destrorsa
DNA-B
Destrorsa
DNA-Z
Sinistrorsa
1962: Premio Nobel in Medicina e Fisiologia
James D.
Watson
Francis H.
Crick
Maurice H. F.
Wilkins
Watson, Crick e Wilkins ricevettero il Premio Nobel per la Medicina nel 1962
per la scoperta della struttura del DNA. L'esclusione della Franklin dal premio
è dovuto alla sua morte di cancro nel 1958, probabilmente a causa delle
radiazioni a cui i suoi studi la avevano lungamente sottoposta. Nell'immaginario
comune, la scoperta della struttura del DNA è legata ai soli Watson e Crick.
Nella comunità scientifica è opinione diffusa che i motivi di ciò siano legati alla
scarsa reputazione di Wilkins (che secondo molti era solo "alla ricerca di
pubblicità") e, soprattutto, alla morte della Franklin.
Rosalind
Franklin
L’ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI
Il genoma negli organismi eucarioti
e procarioti è organizzato in
cromosomi
Nelle cellule il DNA è associato a
proteine
formando
un
complesso
denominato cromosoma
Le modalità di compattamento sono
differenti in cellule procariote ed
eucariote:
Il compattamento oltre a rendere più
stabile il DNA ne favorisce la
trasmissione più efficiente alle cellule
figlie
L’ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI
Genoma = cromosoma o set di cromosomi che contiene tutto il DNA di un organismo
(o particella virale)
Cromosomi virali
- DNA o RNA a singolo o a doppio filamento;
- circolare o lineare;
- circondato da proteine.
TMV
T2 batteriofago
λ batteriofago
Cromosomi procarioti
- La maggior parte dei procarioti contiene un singola molecola
di DNA a doppio filamento ciircolare, organizzata in una regione
densa della cellula detta nucleoide.
L’ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI
Problema:
Se misurato linearmente, il genoma di E. coli (4.6 Mb) sarebbe 1.000 volte più grande
della sua cellula.
Il genoma umano se venisse stirato (3.4 Gb) sarebbe lungo 2.3 m.
Soluzioni:
1.
Superavvolgimento:
La doppia elica del DNA è avvolta nello spazio intorno al
suo asse (topoisomerasi)
2.
Il DNA è organizzato in domini ad ansa.
STRUTTURA DEI CROMOSOMI
EUCARIOTI
Cromatina
Complesso di DNA e proteine (quantità circa doppia rispetto a quella
del DNA)
Due fondamentali tipi di proteine:
Istoni:
abbondanti, proteine basiche , cariche positivamente che legano il
DNA;
5 tipi principali: H1, H2A, H2B, H3, H4;
ruolo cruciale nell’impacchettamento del DNA;
quantità e proporzioni conservate in tutte le cellule
eucariote;
evolutivamente conservate.
Non-istoni:
tutte le altre proteine associate al DNA;
meno abbondanti degli istoni;
marcate differenze in tipo e quantità.
STRUTTURA DEI CROMOSOMI
EUCARIOTI
Impacchettamento del DNA nei cromosomi:
Livello 1 Il DNA si avvolge intorno agli istoni per
creare la struttura dei nucleosomi;
Livello 2 I nucleosomi si connettono mediante tratti
di “DNA linker” (147 pb).
Struttura “a filo di perle”;
Livello 3 Impacchettamento dei nucleosomi nella
fibra cromatinica da 30-nm (H1);
Livello 4 Formazione dei domini ad ansa.
proteine non-istone: “scaffold” cromosomico
DNA a doppia elica
STRUTTURA DEI CROMOSOMI
EUCARIOTI
Schema di una sezione di un cromosoma metafasico
Struttura
“a filo di perle”
Cromosomi impacchettati,
“fibre 30-nm”
Componenti non-istoniche
dell’impalcatura
Sezione cromosomica
estesa
Sezione cromosomica
condensata
Cromosomi
metafasici
Impalcatura
cromosomica
Ansa del DNA
La grandezza totale del
genoma umano aploide è di
3.400.000.000 basi
La quantità di DNA contenuta nel genoma aploide è una caratteristica propria di
ciascuna specie vivente ed è definita come valore C
La quantità nei diversi organismi varia in maniera considerevole e non
mostra una relazione diretta con la complessità di struttura e
l’organizzazione di un organismo: paradosso del valore C
Esempi:
Virus e fagi
λ
T4
HIV-1
Batteri
Escherichia coli
Eucarioti
Lilium formosanum (giglio)
Zea mays
(mais)
Amoeba proteus (ameba)
Drosophila melanogaster
(moscerino della frutta)
Mus musculus (topo)
Canis familiaris (cane)
Equus caballus (cavallo)
Homo sapiens (uomo)
valore C (bp)
48,502
168,900
9,750
4,639,221
36,000,000,000
5,000,000,000
290,000,000,000
180,000,000
3,454,200,000
3,355,500,000
3,311,000,000
3,400,000,000
Nell’uomo, il numero di geni è molto inferiore all’atteso
- Solo ~ il 3% del genoma è costituito da sequenze codificanti
-Il genoma umano contiene 30.000-40.000 geni
-~60% dei geni hanno splicing alternativo
- Nel ~70% dei casi, lo splicing genera sequenze aa diverse, quindi
il proteoma è costituito da ~ 1.000.000 proteine
Non è il numero di geni che fa la differenza!!!!!
La somiglianza tra il genoma dell’uomo e quello dello chimpanzé è del
99%!!
Drospophila ha 13.600 geni e C.elegans 18.500, la pianta Arabidnosis
ne ha 25.000.
E’ evidente che le funzioni e le interazioni fra gruppi di geni simili
possono dare risultati molto diversi
Il corredo di enzimi metabolici non è sostanzialmente diverso da quello
degli altri eucarioti ma il numero dei geni coinvolti in funzioni di
regolazione come la trascrizione, la traduzione del segnale e la
segnalazione intercellulare è aumentato in proporzione all’aumento di
dimensioni dell’intero genoma
Quanti sono i geni essenziali?
- Non tutti i geni sono essenziali.
Nel lievito e nella mosca <50% dei geni hanno un effetto
evidente
- Alcuni geni sono ridondanti
Non si sa perché sopravvivano nel genoma geni la cui
funzione è apparentemente ridondante