Identificazione di Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) in potenziali

Identificazione di
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV)
in potenziali piante ospiti e variabilità
genetica degli isolati ticinesi
Lavoro di diploma
Caterina Matasci
Febbraio - Giugno 2002
Swiss Federal Institute of Technology
Institute of Plant Sciences
Plant Pathology group
Referente: Dr. Cesare Gessler
Supervisore scientifico: Dr. Andrea Patocchi
INDICE
RIASSUNTO
1
ABSTRACT
2
1. INTRODUZIONE
3
1.1. Storia della dispersione della malattia
1.1.1. La situazione in Ticino
1.2. Diffusione geografica
1.3. Impatto economico
1.4. Sintomatologia
1.4.1. Sintomi su pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.)
1.4.2. Sintomi su lattuga (Lactuca sativa L. var capitata L.)
1.5. Il virus
1.5.1. Tassonomia
1.5.2. Biologia
1.6. Piante ospiti
1.7. Gli insetti vettori
1.7.1. F. occidentalis Pergande
1.7.1.1. Biologia
1.8. Altri modi di trasmissione
1.8.1. Trasmissione tramite seme
1.8.2. Trasmissione tramite attrezzi di lavoro
1.9. Diagnosi
1.10. Controllo della malattia
1.10.1. Misure per ridurre l’inoculo
1.10.2. Misure di controllo del vettore
1.11. Miglioramento genetico
1.12. Evoluzione dei virus RNA
1.12.1. Evoluzione di TSWV
1.13. Analisi fiolgenetiche
1.14. Scopo della ricerca
2. MATERIALE E METODI
3
3
4
4
5
5
5
6
6
6
8
9
9
9
10
10
10
11
11
11
11
12
12
12
13
14
15
2.1. Provenienza dei campioni 2001
2.2. Provenienza dei campioni 2002
2.3. Prelievo dei campioni di lattuga e pomodoro per diagnosi precoce
2.3.1. Campioni di lattuga (Lactuca sativa L. var capitata L.)
2.3.2. Campioni di pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.)
2.4. Estrazione di RNA
2.4.1. Estrazione con il kit Nucleospin Multi-96 Plant (Machery-Nagel)
2.4.2. Estrazione con RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)
2.4.3. Estrazione con SV Total RNA Isolation System (Promega)
2.4.4. Estrazione con il procedimento descritto da Jones et al., 1998
2.5. Gel elettroforesi del prodotto estratto (RNA)
2.6. Sintesi di cDNA ed amplificazione tramite PCR (RT-PCR)
2.6.1. RT-PCR con Access RT-PCR Introductory System (Promega)
2.6.2. RT-PCR con Reverse Transcriptase AMV (Roche)
i
15
15
15
15
16
17
17
17
17
17
18
18
18
19
2.6.2.1. Sintesi del cDNA
2.6.2.2. Amplificazione specifica tramite PCR
2.6.2.3. Nested PCR
2.6.3. RT-PCR con One Step RT-PCR Kit (Qiagen)
2.6.4. RT-PCR con Robust II RT-PCR Kit (Finnzymes)
2.6.5. Gel elettroforesi del prodotto RT-PCR
2.6.6. Purificazione del prodotto RT-PCR
2.6.7. Quantificazione del DNA
2.7. Efficacia della RT-PCR come metodo di diagnosi della presenza di TSWV
2.8. Analisi dei campioni di lattuga e pomodoro per diagnosi precoce
2.9. Cycle sequencing
2.9.1. Purificazione dei prodotti della cycle sequencing
2.10. Sequenziamento
2.11. Elaborazione degli elettroferogrammi
2.12. Ricerca di sequenze
2.13. Allineamento delle sequenze
2.14. Analisi filogenetiche
3. RISULTATI
19
20
20
21
22
22
23
23
23
23
24
25
25
25
25
26
26
27
3.1. Efficacia della RT-PCR come metodo di diagnosi della presenza di TSWV
3.1.1. Efficacia dei metodi di estrazione di RNA
3.1.2. Efficacia dei metodi di sintesi di cDNA ed amplificazione tramite PCR (RT-PCR)
3.2. Diagnosi precoce ed epidemiologia
3.2.1. Lattuga
3.2.2. Pomodoro
3.2.3. Evoluzione del numero di piante di pomodoro e lattuga con TSWV (riassunto)
3.3. Monitoraggio degli insetti vettori (dati gentilmente messi a disposizione da M. Jermini)
3.4. Temperatura ed umidità
3.5. Sequenze degli isolati ticinesi
3.5.1. Aplotipi
3.5.2. Analisi filogenetiche
3.5.2.1. Variabilità delle sequenze
3.5.2.2. Dendogrammi basati sulle sequenze nucleotidiche
3.5.2.3. Dendogrammi basati sulle sequenze aminoacidiche
3.6. Sequenze mondiali del gene NP
3.7.Analisi filogenetiche
3.7.1. Variabilità delle sequenze
3.7.2. Dendogrammi basati sulle sequenze nucleotidiche
3.7.3. Dendogrammi basati sulle sequenze aminoacidiche
ii
27
28
28
28
29
30
33
34
35
36
36
39
39
39
40
41
42
42
43
45
4. DISCUSSIONE
47
4.1. Metodologia
4.2. Diagnosi precoce ed epidemiologia
4.3. TSWV in Ticino
4.4. TSWV nel mondo
47
48
50
53
4.5. Outlook
4.5.1. Campioni 2002
4.5.2. Analisi del gene L
4.5.3. Monitoraggio con piante spia
4.5.4. Piante spia e trattamenti insetticidi
4.5.5. Analisi dei tripidi vettori
4.5.6. Analisi di piante infestanti che svernano nei tunnel
54
54
54
54
55
55
55
5. RINGRAZIAMENTI
56
6. LETTERATURA
57
APPENDICE
61
GLOSSARIO
67
iii
RIASSUNTO
Tomato spotted wilt virus (TSWV) è stato rilevato la prima volta in Ticino nel 1997 ed è
divenuto nel corso degli ultimi tre anni un grave problema nelle colture orticole ticinesi.
Al fine di sviluppare una strategia per contenere i danni arrecati da questa malattia è
importante conoscere il modo in cui il virus viene importato nella coltura, sapere come si
diffonde, dove sverna, se una pianta che non mostra sintomi è sicuramente sana e di
individuare la variabilità genetica in Ticino.
Lo scopo di questo lavoro è determinare se è possibile diagnosticare precocemente il virus
in piante di lattuga e pomodoro che non presentano i sintomi dell’infezione e la variabilità
genetica dei ceppi dei virus presenti in Ticino ed il loro collocamento a livello mondiale.
Per la diagnosi precoce di TSWV in piante che non presentano sintomi si è proceduto
all’analisi dei campioni di lattuga e pomodoro provenienti da un tunnel fortemente colpito
dalla malattia nel 2001. È stato dapprima estratto l’RNA totale da campioni di foglia e
successivamente, il gene virale codificante per la proteina nucleocapsidica (NP) è stato
amplificato tramite RT-PCR. Al fine di determinare la diversità genetica del virus presente
in Ticino si è proceduto al sequenziamento di prodotti RT-PCR di questi campioni e di
piante di pomodoro presentanti i sintomi classici della malattia raccolti nel corso del 2001.
Il metodo utilizzato ha permesso di diagnosticare la presenza di TSWV in foglie di lattuga
e pomodoro senza sintomi. Un numero relativamente alto di piante infette è stato
riscontrato in entrambe le colture distribuite casualmente nella parcella, è quindi stato
ipotizzato che i singoli focolai fossero dovuti ad un’infezione primaria probabilmente
imputabile a tripidi vettori provenienti dall’esterno. La presenza di materiale in apparenza
sano, ma tuttavia infetto può rappresentare un’importante fonte di diffusione del virus
nelle colture circostanti e successive. È stata inoltre notata la possibile funzione di piante
infestanti presenti nel tunnel che potrebbero fungere da serbatoio per tripidi e virus tra una
coltura e la successiva.
Il sequenziamento dei prodotti RT-PCR ha permesso di osservare che in Ticino, malgrado
il virus sia presente da soli 5 anni, esiste una notevole diversità genetica. Confrontando gli
aplotipi rilevati nel 2001 con quelli del 2002 sono stati individuati casi in cui era presente
completa identità tra gli aplotipi ed altri in cui essi erano diversi, ma con un numero molto
ridotto di sostituzioni nucleotidiche ed aminoacidiche. Ciò può indicare che gli aplotipi
diversi sono potenzialmente nuovi e derivano da mutazioni degli aplotipi precedenti,
indicando un’evoluzione. Tuttavia è possibile che essi fossero già stati presenti nel 2001 e
non siano stati rilevati, oppure che essi siano stati importati in Ticino con l’acquisto delle
piante ed abbiano subito mutazioni nei luoghi d’origine.
Nel contesto mondiale gli aplotipi ticinesi si suddividono in parte nel clade che comprende
l’isolato italiano ed in parte nel clade che raggruppa gli isolati dall’Olanda, dalla
Germania e dalla Repubblica Ceca. Ciò indica che è possibile ipotizzare una correlazione
tra la provenienza delle piante acquistate (Italia ed Olanda) e l’aplotipo di TSWV
infettante. Questa ipotesi è consolidata dall’osservazione di un aplotipo ticinese, identico
all’isolato olandese, riscontrato più volte in un’azienda le cui piante di pomodoro sono
state acquistate in Olanda. Lo stesso vale per un’azienda con piante di pomodoro
provenienti dall’Italia in cui è stato rilevato un’aplotipo con una sola mutazione
nucleotidica dall’isolato italiano pubblicato.
1
ABSTRACT
Tomato spotted wilt virus (TSWV) was detected in Ticino for the first time in 1997 and
has become in the last three years an important problem in horticultural cultures. To
develop a strategy to control the damages caused by this virus it’s important to know how
the virus arrived in Ticino, how it spreads, were it overwinters, if a plant without
symptoms is surely healthy and its genetic variability in Ticino and worldwide.
The aim of this study was to determine if it’s possible to detect the virus in lettuce and
tomato plants in absence of symptoms of TSWV infection, to detect the genetic variability
of the virus haplotypes present in Ticino and to determine how they are situated
worldwide.
For the detection in plants without symptoms, lettuce and tomato leafs were sampled in a
plastic tunnel, strongly infected in 2001. Total RNA was extracted from leaf samples and
successively the viral gene coding for the nucleocapsid protein (NP) was amplified by RTPCR with specific primers. To define the genetic diversity of the virus present in Ticino,
the RT-PCR products of those samples and of those collected from tomato plants with
classical TSWV symptoms in 2001 were sequenced.
The method used allowed the detection of TSWV in lettuce and tomato leafs without
symptoms. A quite large number of plants were detected in both cultures randomly
distributed in the field. It is therefore hypotized that this single centres of infection were
produced by a primary infection probably by vector insects coming from outside. The
presence of plants in appearance healthy, but infected can represent an important source of
virus spread in the surrounding or following cultures. It was also noted that infesting
weeds in the tunnel could act as reservoir for insect and viruses within a culture and the
following one.
Although the virus is present in Ticino since only 5 years the sequencing of the RT-PCR
product has demonstrated the presence of a great genetic diversity. By the comparison of
the haplotypes detected in 2001 and those of 2002, identical haplotypes and haplotypes
presenting strong similarities were identified. The similar haplotypes could have been
generated by mutation from the haplotype which was previously present. Another
hypothesis is that the haplotype was already present in 2001 but was not detected. A third
hypothesis is that the similar haplotypes were imported in Ticino by plant purchasing and
were already mutated.
At worldwide context the haplotypes from Ticino split part in the clade with the Italian
haplotype and in the clade with the isolates from The Netherlands, Germany and Czech
Republic. Because most of the plants grown in Ticino were buy in Italy or in the
Netherlands it is possible to hypothise a correlation between plant origin (Italy and The
Netherlands) and infecting haplotype.
2
1. INTRODUZIONE
1.1. STORIA DELLA DISPERSIONE DELLA MALATTIA
Sintomi causati dal virus della bronzatura del pomodoro (sinonimi: virus
dell’avvizzimento maculato del pomodoro, tomato spotted wilt virus, TSWV) furono
osservati la prima volta nel 1915 su pomodoro in Australia (Brittlebank, 1919).
Negli anni ’20 il virus fu riscontrato negli Stati Uniti. In Europa esso fu osservato nel 1931
in Gran Bretagna (Smith, 1932) e nel 1933 in Francia su pomodoro in pieno campo. Dopo
la seconda guerra mondiale, l’importanza della malattia divenne secondaria in Europa,
essa non riapparve fino al 1987, anno in cui fu osservata in Francia su peperone (GebreSelassie et al., 1989) e nei Paesi Bassi su pomodoro (Stijger et al., 1989). Successivamente
fu segnalata in Inghilterra (Barker, 1989), Italia (Bellardi & Vicchi, 1990), Portogallo
(Louro, 1990), Spagna (Jordá & Osca, 1991) ed in altre nazioni europee in colture diverse.
La prima osservazione in Svizzera avvenne nel 1994 nel canton Vaud (OCVCM, 1996).
La diffusione di massa di questo virus in Europa è da ricondurre all'introduzione
dall’America, nel 1985, del tripide Frankliniella occidentalis Pergande uno dei maggiori
vettori.
1.1.1. LA SITUAZIONE IN TICINO
Il primo ritrovamento di TSWV in Ticino è avvenuto nel 1997 in un tunnel a Tenero
(Fig. 1-1) su pomodoro innestato di provenienza olandese (Pedrinis, 1998). Nel 1998 non
sono state segnalate colture colpite, mentre nel 1999 sintomi simili a quelli causati dal
virus sono stati osservati in un’azienda orticola di Coldrerio (Fig. 1-2) su insalata di
provenienza italiana. L'anno seguente (2000) il virus della bronzatura del pomodoro è
stato nuovamente riscontrato nell’azienda di Coldrerio colpita nel 1999, su lattuga e
pomodoro di provenienza italiana ed in due altre aziende, una a Muzzano (Fig. 1-3) e
l’altra a Stabio (Fig. 1-4). A Muzzano sono state colpite colture di pomodoro di
provenienza olandese, lattuga, batavia rossa e verde seminate in Ticino. A Stabio il virus è
stato riscontrato in alcuni tunnel con piantine di pomodoro di provenienza italiana, la
pronta estirpazione ed i trattamenti insetticidi hanno contenuto le perdite (Pedrinis, 2001).
Nel 2001 quattro aziende sono state colpite. Nell'azienda di Stabio il virus è stato rilevato
su poche piante di lattuga e su quasi tutte le piante di pomodoro in due tunnel. Le piante di
pomodoro sono state strappate e ripiantate, questa misura non è tuttavia risultata efficace
in quanto esse sono state immediatamente colpite. A Muzzano il virus è stato riscontrato
su pomodoro, inizialmente (maggio) unicamente su di una pianta, in seguito (luglio) su più
piante. Le piante di pomodoro in entrambe le aziende provenivano dalla Sicilia, ma erano
state fornite da ditte diverse. Due nuove aziende, l'una situata nel Sopraceneri, ad Iragna
(Fig. 1-5) e la seconda a Novazzano (Fig. 1-6) sono anch’esse state colpite. In entrambi i
casi il virus è stato rilevato su pomodoro. Le piantine acquistate dall’azienda di Iragna
provenivano dall'Olanda, mentre quelle dell’azienda di Novazzano da germogli italiani.
L'orticoltore di Coldrerio, le cui colture sono state colpite nel 1999 e 2000 ha abbandonato
l'attività (non a causa di TSWV), i terreni vengono probabilmente destinati a colture
viticole (Pedrinis, comunicazione personale).
Nel 2002 il virus è stato riscontrato in aprile in un’azienda di Novazzano (Fig. 1-7) su
colture di lattuga e lattuga foglia di quercia provenienti dall’Olanda, in maggio è apparso
3
su di una pianta di pomodoro proveniente dalla Sicilia nell’azienda di Muzzano colpita nei
due anni precedenti ed in giugno è stato ritrovato su pomodoro a Stabio (Jermini,
comunicazione personale).
Fig. 1: Cartina geografica del Ticino rappresentante la localizzazione delle aziende colpite da TSWV
1. Tenero, primo ed unico rilevamento nel 1997, 2. Coldrerio, primo rilevamento nel 1999, 3. Muzzano,
primo rilevamento nel 2000, 4. Stabio, primo rilevamento nel 2000, 5. Iragna, primo rilevamento nel 2001,
6. Novazzano (Brusata), primo rilevamento nel 2001, 7. Novazzano primo rilevamento nel 2002.
1.2. DIFFUSIONE GEOGRAFICA
TSWV è diffuso mondialmente nelle zone (sub)tropicali ed a clima temperato, eccetto in
alcune regioni o nazioni della penisola araba o confinanti con il Sahara (Peters, 1996). In
Europa esso è presente in Austria, Belgio, Bulgaria, Cechia, Croazia, Francia, Germania,
Gran Bretagna, Grecia, Ungheria, Irlanda, Italia, Lituania, Malta, Moldavia, Norvegia (in
corso di eradicazione), Paesi Bassi, Polonia, Portogallo, Romania, Russia, Slovacchia,
Spagna (Canarie comprese), Svezia, Svizzera, Turchia, Ucraina, Yugoslavia. Il virus è
stato debellato in Danimarca e Finlandia (EPPO, 2001). Non sono state trovate indicazioni
su come ciò sia avvenuto.
1.3. IMPATTO ECONOMICO
Annualmente TSWV causa in tutto il mondo perdite non inferiori ad un miliardo di dollari
(Gallitelli & Davino, 1998). I danni arrecati alle colture sono ingenti e possono in casi
estremi determinare la perdita dell’intero raccolto come riportato da Berling et al. (1992)
per le colture di lattuga, peperoni e melanzane.
4
1.4. SINTOMATOLOGIA
I sintomi causati da TSWV variano a dipendenza della varietà e dello stadio di sviluppo
della pianta ospite, dal periodo d’infezione, dalle condizioni ambientali e dall'isolato
virale. Essi vengono espressi 2-14 giorni dopo l’inoculazione (2 su petunia, 7 su lattuga) e
possono facilmente esser confusi con i sintomi provocati da funghi, batteri o causati da
fitotossicità.
1.4.1. SINTOMI SU POMODORO (Lycopersicon esculentum Mill.)
Le piante colpite presentano bronzatura fogliare, macchie necrotiche ed avvizzimento. I
sintomi compaiono su foglie e frutti nella parte apicale della pianta con conseguente
arresto della crescita ed accartocciamento verso l’alto o il basso del lembo fogliare. Le
foglie più giovani assumono un tipico colore bronzeo mentre su quelle basali compaiono
macchie necrotiche ben marcate, che si estendono fino ad interessare l’intera foglia. Sui
frutti formati appaiono macchie circolari o anulature concentriche, spesso in rilievo e
confluenti tra loro (Vicchi, 1999) (Fig. 2).
A
A
B
B
C
Fig. 2: A. Sintomi di bronzatura su foglie di pomodoro. B. Tacche circolari su frutti acerbi. C. Aree
decolorate su frutti maturi (Servizio fitosanitario cantonale, 2001).
1.4.2. SINTOMI SU LATTUGA (Lactuca sativa L. var. capitata L.)
La pianta infetta presenta sulle foglie macchie necrotiche e/o clorotiche che si estendono
con la crescita. Le foglie ingialliscono, si deformano e possono divenire completamente
necrotiche e disseccare. I sintomi si presentano inizialmente su di un solo lato della pianta,
essi si estendono in seguito verso il centro. Se la pianta viene colpita precocemente, la sua
crescita viene fortemente alterata (Marchoux et al., 2000) (Fig. 3).
5
Fig. 3: Lattuga con foglie cloro-necrotiche (Servizio fitosanitario cantonale, 2001).
1.5. IL VIRUS
1.5.1. TASSONOMIA
TSWV è tassonomicamente collocato nella famiglia Bunyaviridae, genere Tospovirus,
sierogruppo Tomato spotted wilt. Tospovirus è l’unico di cinque generi appartenenti alla
famiglia Buniyaviridae che comprende fitovirus, infatti ai generi Bunyavirus, Phlebovirus,
Hantavirus e Nairovirus appartengono unicamente virus umani ed animali. Il genere
Tospovirus è suddiviso in due sierogruppi. Nel sierogruppo Tomato spotted wilt sono
riunite le specie Tomato spotted wilt virus (TSWV), Groundnut ringspot virus (GRSV) e
Tomato chlorotic spot virus (TCSV). Il sierogruppo Watermelon silver mottle comprende
le specie Watermelon silver mottle virus (WSMV), Watermelon bud necrosis virus
(WBNV) e Groundnut bud necrosis virus (GBNV). Le specie Impatiens necrotic spot
virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CNSV), Iris yellow spot virus (IYSV),
Peanut chlorotic fan-spot virus (PCFV), Peanut yellow spot virus (PYSV), Physalis severe
mottle virus (PSMV) e Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) non appartengono ad alcun
gruppo di sierotipi (Moyer, 2000).
1.5.2. BIOLOGIA
TSWV possiede un virione di forma sferica, il cui diametro varia tra 80 e 100 nm. Ogni
particella virale è composta da un involucro di natura lipidica che racchiude tre RNA a
singolo filamento (ssRNA), chiamati in base alle loro dimensioni, S (small, 2,9 kb), M
(medium, 5,4 kb) e L RNA (large, 8,9 kb) (Fig. 4).
6
Fig. 4: Rappresentazione tridimensionale e schematica di una particella di TSWV (Roselló et al., 1996).
I filamenti M e S RNA hanno strategia codificante ambisense, entrambi dispongono di due
fasi di lettura aperta (ORF) separate da una regione ricca di basi A e U. M RNA codifica
una proteina non strutturale chiamata NSm (33,6 kDa), la quale svolge un ruolo
importante nel trasporto sistemico del virus favorendo il passaggio da una cellula all’altra
di nucleocapsidi non racchiusi da un involucro (Kormelink et al., 1994). In viral
complementary sense M RNA codifica un precursore delle due glicoproteine G1 e G2
(127,4 kDa) le quali si trovano sulla superficie della particella virale. S RNA codifica
anch’esso in viral sense una proteina non strutturale denominata NSs (52,4 kDa), la cui
funzione specifica non è conosciuta, sembra tuttavia essere associata a strutture fibrillari
od alla diffusione nel citoplasma delle cellule infette. In viral complementary sense S
RNA codifica la proteina nucleocapsidica NP (28,8 kDa) strettamente associata a RNA. L
RNA codifica in viral complementary sense la proteina L, una trascrittasi inversa (DNA
polimerasi RNA-dipendente) (Fig. 5).
La strategia di replicazione è tipica dei negative strand RNA viruses.
7
Fig. 5: Strategia di replicazione del genoma di TSWV.
I rettangoli grigi rappresentano le fasi di lettura aperta (ORF). I quadrati neri rappresentano la sequenza non
viral necessaria per iniziare la traslazione di RNA messaggero (mRNA). Le sequenze viral sono indicate con
v, quelle viral complementary con vc (Roselló et al., 1996).
1.6. PIANTE OSPITI
Più di 1050 specie appartenenti a 92 famiglie botaniche sono state riportate come
suscettibili ai Tospovirus, di queste più di 926 possono ospitare TSWV (Peters, 1998). In
Europa le principali specie orticole ed industriali sono pomodoro (Lycopersicon
esculentum), melanzana (Solanum melongena), peperone (Capsicum annuum), lattuga
(Lactuca sativa), cicoria (Cychorim spp.), patata (Solanum tuberosum), tabacco (Nicotiana
tabacum), Cucurbitaceae (compreso cocomero, melone ed anguria), carciofo (Cynara
scolymus) e fava (Vicia faba). Le principali piante ornamentali sono Alstroemeria,
Anemone, Anthirrium, Aracea, Aster, Begonia, Bouvardia, Calceolaria, Callistephus,
Celosia, Cestrum, Columnea, Cyclamen, Dahlia, Dendrathema x grandiflorum, Eustoma,
Fatsia japonica, Gazania, Gerbera, Gladiolus, Hydrangea, Impatiens, Iris, Kalanchoe,
Leucanthemum, Limonium, Pelargonium, Ranunculus, Saintpaulia, Senecio cruentus,
Sinningia, Tagetes, Verbena, Vinca e Zinnia. Piante infestanti o appartenenti alla flora
8
spontanea quali Amaranthus spp., Conyza bonariensis, Galinsoga spp., Polygonium
lapathifolium, Portulaca oleracea, Senecio vulgaris, Solanum nigrum, Sonchus spp.,
Stellaria media, Taraxacum officinale possono rappresentare importanti serbatoi per il
virus (EPPO, 2001).
1.7. GLI INSETTI VETTORI
In passato Thrips tabaci Lindemann era considerato il principale vettore di TSWV.
Successive ricerche hanno dimostrato che il virus può venir trasmesso da Frankliniella
fusca Hinds, F. intonsa Trybom, F. schultzei Trybom, T. palmi Karny, T. setosus Moulton
e che il vettore più efficiente è F. occidentalis Pergande (Wijkamp et al., 1995).
1.7.1. F. OCCIDENTALIS PERGANDE
F. occidentalis appartiene all’ordine Thysanoptera, famiglia Thripidae, subfamiglia
Thripinae. L’insetto è presente in quasi tutte le nazioni europee dal 1985 e del sud degli
USA (zona d’origine), sporadicamente in Asia (Cipro, Corea, Israele, Giappone, e
Turchia), Africa (Kenia, La Rèunion, Sud Africa e Zimbawe), Oceania (Australia e Nuova
Zelanda), Centro (Guatemala e Costa Rica) e Sud America (Argentina, Cile, Colombia,
eradicata nella Guyana Francese) (EPPO, 1998). In un monitoraggio svolto nel 2001 è
risultato che F. occidentalis è presente in gran parte delle aziende orticole senza differenze
regionali (Besomi, 2001).
1.7.1.1. BIOLOGIA
La femmina di F. occidentalis raggiunge 1,2 – 1,4 mm di lunghezza, il maschio è
sensibilmente più piccolo e misura 0,9 – 1,0 mm. F.occidentalis è notevolmente polifaga,
essa è segnalata su piante ortive, floricole, fruttiferi e numerose piante erbacee infestanti.
Oltre a trasmettere TSWV essa provoca danni diretti alle colture tramite l’alimentazione,
la quale avviene mediante immissione di saliva nei tessuti vegetali e successiva suzione
dei contenuti cellulari parzialmente digeriti e l’ovodeposizione. Esse causano
depigmentazioni, disseccamenti, suberificazioni, cicatrici, necrosi e deformazioni su
germogli, foglie, fiori e frutti (Pollini, 1998). Il ciclo biologico di F. occidentalis
comprende sei stadi: uovo, primo (neanide) e secondo stadio larvale, prepupa, pupa ed
adulto. L’insetto si nutre attivamente unicamente nel primo e secondo stadio larvale e da
adulto. L’acquisizione del virus avviene durante il primo stadio larvale con
l’alimentazione su piante infette in un tempo medio di 67 minuti (Wijkamp et al., 1996).
Dopo un periodo di latenza, durante il quale l’insetto raggiunge il secondo stadio larvale
ed il virus si moltiplica nelle cellule dell’epitelio del canale alimentare, in quelle dei
muscoli che lo circondano e nelle ghiandole salivari (Bandla et al., 1998), esso diventa
vettore del virus. Nei due stadi che seguono (prepupa e pupa) l’insetto si trova nel suolo e
non trasmette il virus. L’adulto, pur nutrendosi di piante infette, non può acquisire il virus
per una particolare conformazione del canale alimentare. Esso trasmette il virus
unicamente se lo ha acquisito nel primo stadio larvale. Il periodo medio di inoculazione è
di 59 minuti. Il virus non viene trasmesso alla prole attraverso le uova (Wijkamp et al.,
1996) (Fig.6).
Il tipo di trasmissione è persistente, circolativo e replicativo (propagativo).
9
Fig. 6: Ciclo biologico di F. occidentalis Pergande (Zitter & Daughtrey, 1989).
Tra parentesi durata del singolo stadio (Pollini, 1998). Rettangolo grigio: stadio in cui l’insetto acquisisce il
virus. Rettangolo nero: stadio in cui l’insetto è in grado di trasmettere il virus
1.8. ALTRI MODI DI TRASMISSIONE
1.8.1. TRASMISSIONE TRAMITE SEME
Gebre-Selassie et al. (1989) indicano che la trasmissione del virus via seme è stata
riportata nel dopoguerra, ma che essa non è mai stata confermata. Marchoux et al. (2000)
riportano che, data la forte frequenza di infezioni in colture di cineraria (Senecio
cineraria), la trasmissione tramite seme sembra essere possibile ma che finora non è stato
possibile provarlo, mentre Reddy (1988) esclude totalmente questa via.
Antignus et al. (1997) indicano che i semi di pomodoro, peperone, celosia e petunia sono
esternamente contaminati da virus, ma che tuttavia non avviene alcuna trasmissione.
Pottorff & Newman (2001) riportano che TSWV può venir trasmesso tramite seme di
Petunia x hybrida e Lycopersicon esculentum.
1.8.2. TRASMISSIONE TRAMITE ATREZZI DI LAVORO
La trasmissione tramite attrezzi di lavoro è aleatoria ed ha molto probabilmente solamente
un'importanza secondaria (Gebre-Selassie et al., 1989).
10
1.9. DIAGNOSI
Diverse tecniche possono essere utilizzate per la diagnosi della presenza di Tospovirus.
-
-
Trasmissione meccanica su piante test (Allen & Matteoni, 1991).
Microscopia elettronica (Peters et al., 1991, Kitajima et al., 1992).
Trasmissione tramite tripidi.
Serologia. Test immunoenzimatico della presenza del virus sia nell’ospite vegetale con
anticorpi policlonali (Gonsalves & Trujillo, 1986) e monoclonali (Sherwood et al.,
1989) sia nell’insetto vettore (Cho et al., 1988, Bandla et al., 1994).
Dot-blot immunoassay (Hsu & Lawson, 1991).
Ibridazione con cloni di cDNA (Ronco et al., 1989).
Ibridazione con ribosonde (Huguenot et al., 1990).
Tecniche basate su Polymerase Chain Reaction (PCR) (Immunocapture Polymerase
Chain Reaction (IC-PCR), Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RTPCR), Immunocapture Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (IC-RTPCR)) (Nolasco et al., 1993, Mumford et al., 1994, Weekes et al., 1996, Adam et al.,
1996, Jain et al., 1998).
1.10.
CONTROLLO DELLA MALATTIA
1.10.1. MISURE PER RIDURRE L’INOCULO
Le misure per ridurre l’inoculo comprendono: (1) il controllo del trasporto di materiale
vegetale per evitare la diffusione del focolaio di infezione e l'introduzione di piante infette
in campi sani, (2) l’eliminazione di piante infestanti e dei resti della coltura precedente che
potrebbero fungere da serbatoio, (3) il controllo protettivo della coltura con reti e (4) la
rimozione delle prime piante infette (Roselló et al., 1996) o dell’intera coltura se
l'incidenza è troppo elevata (Yudin et al., 1990).
1.10.2. MISURE DI CONTROLLO DEL VETTORE
Il controllo del vettore consiste in metodi fisici, chimici e di lotta biologica. I primi
comprendono l’uso di reti a maglie finissime su porte e finestre per colture coperte o di
pacciamatura riflettente (repellente per l’insetto). I metodi chimici sono sovente inefficaci
data la difficoltà nel colpire l’insetto nel ricettacolo florale (luogo principale
d’insediamento), l’elevata velocità di proliferazione, l’accavallarsi di più generazioni con
il rischio di insorgenza di resistenze e non da ultimo l’elevata polifagia dell’insetto che ne
determina la presenza in moltissime specie sia spontanee che coltivate (Vicchi &
Garritano, 1999). La lotta biologica sfrutta antagonisti naturali, quali acari predatori
(Amblyseius spp.), cimici predatrici (Orius spp.) o funghi (Verticillium lecanii) per ridurre
la popolazione di tripidi (UMS, 2002).
11
1.11.
MIGLIORAMENTO GENETICO
La selezione di piante resistenti è il metodo più efficace per evitare la malattia.
Negli ultimi decenni, grandi sforzi orientati verso la ricerca di resistenze in generi vicini di
Lycopersicon e nello sviluppo di piante transgeniche tolleranti o resistenti sono stati
profusi senza tuttavia mostrare risultati positivi mantenuti nel tempo.
1.12.
EVOLUZIONE DEI VIRUS RNA
Virus con RNA come genoma sono i parassiti cellulari conosciuti più diffusi. Lo
straordinario successo evolutivo è da ricondurre alla loro abilità di usare molteplici
strategie riproduttive con un periodo generativo ridotto e di adattarsi facilmente ad una
varietà di nicchie ecologiche. Vi sono diversi fattori che conducono ad una variazione del
genoma: mutazioni, riassortimenti e ricombinazioni (Matthews, 2001).
(1) Le mutazioni (sostituzioni, delezioni ed addizioni) sono dovute alla scarsa fedeltà della
replicazione dei genomi costituiti da RNA ed all’assenza di un meccanismo di riparazione.
I virus RNA possiedono oltre ad un elevato tasso di replicazione (105 replicazioni al
giorno) un elevato tasso di mutazione (10-4-10-5 mutazioni per nucleotide per replicazione)
(Tsimring et al. 1996). (2) I virus RNA dispongono di meccanismi di riassortimento,
attraverso i quali nuove varianti possono essere generate da geni virali preesistenti. (3) Le
ricombinazioni determinano la formazione di molecole di acido nucleico da segmenti
precedentemente separatisi dalla stessa molecola o presenti in molecole parentali diverse.
Avviene normalmente durante la replicazione e può essere un meccanismo di riparazione.
Un ulteriore fattore rilevante è il fenomeno chiamato random genetic drift. Esso si verifica
in modo rilevante nelle piccole popolazioni, dove singoli alleli possono essere eliminati o
aumentare di frequenza, in modo del tutto casuale (senza selezione) in condizioni di
drastiche riduzioni di popolazioni (bottleneck effect) o quando una nuova popolazione
prende avvio da un numero ridotto di individui (founder effect).
Da tutti questi fattori risulta che da un genitore può derivare nel corso del tempo una
moltitudine di mutanti. Sebbene vi sia una grande eterogeneità, questo non significa che si
verifichi una rapida evoluzione. Ci sono infatti condizioni (fattori biotici ed abiotici) per le
quali i virus si riproducono velocemente ed efficientemente e quindi che favoriscono un
accumulo di mutazioni competitive (Steinhauer & Holland, 1987).
1.12.1. EVOLUZIONE DI TSWV
Il genoma tripartito di TSWV, la capacità di replicarsi sia nella pianta sia nell’insetto
vettore e la presenza di ceppi o Tospovirus diversi in infezione mista nella stessa pianta o
in replicazione nello stesso vettore possono facilmente favorire la comparsa di riassortanti
o di ricombinanti (Gallitelli & Davino, 1998).
12
1.13.
ANALISI FILOGENETICHE
Organismi possono essere paragonati e quindi differenziati analizzando le differenze a
livello della sequenza degli acidi nucleici in esso contenuti. Anche una sola base mutata in
un intero genoma può servire da elemento distintivo. Le differenze genomiche possono
essere sondate con diversi tipi di marcatori molecolari come RFLPs, AFLPs, RAPDs,
SSRs o come in questa ricerca sequenziando una parte di un gene (NP).
Un concetto chiave per la sistematica molecolare è quello di distanza genetica, la quale
esprime la divergenza tra unità tassonomiche (operational taxonomic unit, OTU). Le
distanze possono venir calcolate con diversi modelli utilizzati secondo l’analisi da
effettuare. p distance è il più semplice. Jukes-Cantor, Kimura-2 parametri, Tajima-Nei,
Tamura e Tamura-Nei sono modelli matematici che permettono di stimare il numero di
nucleotidi sostituiti. Contrariamente a p distance, considerano sostituzioni parallele e
backward e sono quindi più adatti quando il rapporto p (numero di loci polimorfici diviso
per l’intera lunghezza del genoma) è elevato. Un terzo tipo di modelli (Gamma distance
for the Jukes-Cantor Model, Gamma distance for the Kimura Model, Gamma distance for
the Tamura-Nei Model) basati sulla distribuzione gamma, considera la diversità del tasso
di nucleotidi sostituiti. Rappresentazioni grafiche delle distanze tra OTU vengono
chiamate alberi filogenetici o dendogrammi. Essi consistono in nodi (OTU) e rami
(percorsi che connettono i nodi) e riassumono il percorso evolutivo degli OTU in
questione. Un albero è in scala se la lunghezza dei suoi rami è proporzionale alla distanza
genetica ed è unrooted se privo di un nodo interno che rappresenta un potenziale antenato.
Esistono molteplici algoritmi capaci di calcolare distanze tra OTU e rappresentarne gli
alberi, essi possono essere classificati in distance methods (Neighbor Joining, UPGMA) e
discrete-character methods (Maximum Parsimony, Maximum likelihood). L’algoritmo
Neighbor Joining è basato sul principio di minimum evolution, il quale assume che
l’albero con la minor somma della lunghezza dei rami sia il migliore. Neighbor Joining
non esamina tutte le possibili topologie, ma ad ogni stadio del cladeing applica il principio
di minimum evolution (Nei & Kumar, 2000). L’algoritmo Maximum Parsimony assume
che ogni OTU evolva indipendentemente e calcola il minor numero di sostituzioni che
spiegano l’intero processo evolutivo, la topologia che richiede il minor numero di
sostituzioni è poi ritenuta come migliore albero. Vi sono due classi di metodi di ricerca
degli alberi ottimali: metodi esatti (branch and bound search) ed euristici (heuristic
search). Con un numero di OTU maggiore di 9 è consigliabile utilizzare il metodo di
ricerca heuristic per evitare tempi di calcolazione troppo elevati. Esso non garantisce
affatto che l’albero corretto venga generato, poichè unicamente una piccola parte degli
alberi possibili vengono esaminati. Quale risultato vengono generati una serie di alberi
(equally parsimonius trees), nel caso ottimale uno solo (most parsimonious o optimal
tree), dai quali viene calcolato un consensus tree secondo diversi algoritmi.
Al fine di conferire una sicurezza statistica all’ipotesi di relazione, Felsenstein (1985) ha
sviluppato l’algoritmo bootstrap. Il metodo utilizzato in MEGA differisce lievemente da
quello descritto originariamente da Felsenstein, esso attua una campionatura dei dati
iniziali e genera una serie di replicati casuali che inserisce nelle sequenze originali,
generandone un nuovo set, il quale è utilizzato per creare un nuovo albero. La topologia
dell’albero così ottenuto viene paragonata a quello iniziale. Ad ogni ramo che coincide
viene dato il valore 1 (identity value) mentre agli altri 0. Questo processo viene ripetuto
più volte (generalmente 1000) e la percentuale delle volte in cui il ramo ha valore 1 viene
calcolata. Questo valore è indicarto come bootstrap confidence value o semplicemente
bootstrap value (Nei & Kumar, 2000).
13
1.14.
SCOPO DELLA RICERCA
1. Implementare la tecnica della trascrizione inversa (RT-PCR) come metodo di diagnosi
della presenza di TSWV.
2. Determinare se con questa tecnica è possibile diagnosticare infezioni latenti (senza
presenza di sintomi) e nel caso positivo dopo quanto tempo dall’infezione.
3. Determinare attraverso sequenziamento se in Ticino sono presenti uno o più genotipi
di TSWV.
4. Se più genotipi sono presenti, determinarne la possibile origine.
14
2. MATERIALE E METODI
2.1. PROVENIENZA DEI CAMPIONI 2001
31 campioni di foglia di pomodoro prelevati da 31 piante presentanti i sintomi tipici di
TSWV sono stati raccolti da M. Jermini e T. Pedrinis nei mesi di luglio ed agosto 2001
presso le aziende All’Orto (Muzzano, 7 campioni), Ballerini (Novazzano, Brusata, 6
campioni), Beghelli (Iragna, 9 campioni) e Giorgi (Novazzano, 9 campioni). I campioni
sono stati conservati a –20°C in sacchetti di plastica.
2.2. PROVENIENZA DEI CAMPIONI 2002
Un campione di foglia di pomodoro, uno di lattuga ed uno di lattuga foglia di quercia con i
sintomi tipici di TSWV riscontrati in aziende ticinesi sono stati raccolti e conservati a
–20°C in sacchetti di plastica.
2.3. PRELIEVO DEI CAMPIONI DI LATTUGA E POMODORO PER DIAGNOSI
PRECOCE
Una superficie (tunnel di plastica, 8 m) è stata selezionata presso l’azienda Giorgi a
Novazzano dove il virus ha avuto una forte incidenza nella stagione 2001.
La temperatura e l’umidità all’interno del tunnel sono state rilevate con un termoidrografo.
La popolazione degli insetti vettori (F. occidentalis e T. tabaci) è stata monitorata con
l’ausilio di trappole cromotropiche Rebell blu (Andermatt Biocontrol, Grossdietwil) da M.
Jermini.
2.3.1. CAMPIONI DI LATTUGA (Lactuca sativa L. var capitata L.)
Campioni di foglia sono stati prelevati ad intervalli settimanali (in totale 6 prelievi) da
piante di lattuga varietà Gomera. Le piante non hanno subito alcun trattamento
fitosanitario dopo il trapianto nel tunnel. 50 piante di lattuga sono state scelte casualmente
all’interno della parcella, esse sono state marcate con una bacchetta di plastica posta
vicino alla pianta e numerate in maniera crescente a partire dalle entrate del tunnel (Fig. 7).
10 cm2 ca di tessuto proveniente dalle prime foglie (tra la quinta e l’ottava partendo dal
piede) sono stati staccati, posti singolarmente in sacchetti di plastica e conservati a –20°C.
Il primo prelievo è stato effettuato il 1° marzo 2002, l’ultimo il 5 aprile 2002 quando le
piante erano pronte per la raccolta.
15
Nord
50
49
48
25
46
47
24
22
42
43
21
41
23
39
37
40
45
44
20
19
38
18
36
35
17
16
34
31
15
33
14
12
13
11
9
32
10
28
8
6
4
7
5
3
30
27
2
29
26
1
Sud
Fig. 7: Rappresentazione del tunnel da cui sono stati prelevati i campioni di lattuga. : pianta di lattuga.
2.3.2. CAMPIONI DI POMODORO (Lycopersicon esculentum Mill.)
Campioni di foglia sono stati prelevati ad intervalli settimanali (4 prelievi) da piante di
pomodoro Egeris a due teste. Il tunnel è stato suddiviso in tre sezioni con diverso
trattamento insetticida. Nella prima, posizionata a sud, i trattamenti insetticidi sono stati
eseguiti secondo una soglia di tolleranza di inizialmente 2, in seguito 5 insetti per trappola.
La seconda sezione, situata nel mezzo del tunnel è stata trattata intensivamente, mentre la
terza, posta a nord non è stata trattata (sezione testimone). Sono state scelte 48 piante
disposte vicino alle entrate, esse sono state numerate per fila in modo crescente a partire
dall’entrata del tunnel. I campioni da 1 a 36 provengono dalla superficie testimone, mentre
i campioni da 37 a 48 da piante trattate secondo la soglia di tolleranza, basata sul numero
di catture per trappola (chiamata in questo lavoro: strategia) (Fig. 8).
2 cm2 ca. di tessuto proveniente dalla fogliola all’estremità della terza foglia (dalla testa
verso il basso), sono stati staccati, posti singolarmente in provette Eppendorf da 2 ml e
conservati a –20°C. Il primo prelievo è stato effettuato il 4 maggio 2002, l’ultimo il 25
maggio 2002.
Nord
Testimone
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
29
30
31
32
32
33
34
35
36
28
Trattamento intensivo
…
…
…
…
…
…
Strategia
39
38
37
…
42
41
40
…
45
44
43
48
47
46
Sud
Fig. 8: Rappresentazione del tunnel da cui sono stati prelevati i campioni di pomodoro.
Il tunnel è stato suddiviso in tre sezioni con diverso trattamento insetticida. I campioni sono stati prelevati
nella sezione testimone ed in quella trattata secondo la strategia.
: pianta di pomodoro. ...: altre piante di pomodoro presenti nel tunnel ma non indicate nella
rappresentazione.
16
2.4. ESTRAZIONE DI RNA
Sono stati applicati quattro metodi di estrazione.
2.4.1. ESTRAZIONE CON IL KIT NUCLEOSPIN
(MACHEREY NAGEL, OENSINGEN, SVIZZERA)
MULTI-96
PLANT
È stato seguito il protocollo annesso con le seguenti modifiche:
-
punto 1: non è stata aggiunta RNasi.
punto 2: i campioni sono stati centrifugati per 10 min a 6000 g invece di 20 min.
punto 5: i campioni sono stati centrifugati per 2 min a 6000 g invece di 3 min.
2.4.2. ESTRAZIONE CON RNeasy PLANT MINI KIT (QIAGEN, HILDEN,
GERMANIA)
È stato seguito il protocollo annesso.
2.4.3. ESTRAZIONE CON SV TOTAL RNA ISOLATION SYSTEM (PROMEGA,
MADISON, USA)
È stato seguito il protocollo annesso.
2.4.4. ESTRAZIONE CON IL PROCEDIMENTO DESCRITTO DA Jones et al.,
1998
È stato seguito il procedimento con modifiche.
1. Polverizzare 100-150 mg di foglia (Fast Prep FP 120 BIO 101 Savant) in un
Eppendorf da 2 ml con biglie di vetro di 2,5 mm (Biospec).
2. Aggiungere 400 µl di homogenisation buffer1e mischiare.
3. Aggiungere 30 µl di 10% SDS e 800 µl di cloroformio-alcol isoamilico (24:1).
4. Mischiare le fasi per 10 min e centrifugare per 5 min a 14000 g (5415 C Eppendorf).
5. Trasferire la fase acquosa in un nuovo Eppendorf da 1,5 ml e riestrarre con 400 µl di
cloroformio-alcol isoamilico (24:1), mischiare le fasi per 10 min e centrifugare per 5
min a 14000 g (5415 C Eppendorf).
6. Ripetere il punto 5.
7. Trasferire il supernatante (400 µl) in un nuovo Eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 20
µl di acetato di sodio 3M e 1 ml di etanolo gelido al 100 %.
8. Incubare a –70°C per 15 min e centrifugare per 15 min a 14000 g ed a 4°C (5415 R
Eppendorf).
9. Scartare il supernatante, risospendere il pellet in 100 µl di acetato di sodio 3M.
Incubare su ghiaccio per 15 min, centrifugare per 15 min a 14000 g ed a 4°C (5415 R
Eppendorf).
10. Scartare il supernatante, risospendere il pellet di RNA in 200 µl di TE pH 8,
aggiungere 20 µl di acetato di sodio 3M.
17
11. Estrarre con 200 µl di cloroformio-alcol isoamilico (24:1), mischiare le fasi per 10 min
e centrifugare per 5 min a 14000 g (5415 C Eppendorf).
12. Trasferire il supernatante in un nuovo Eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 500 µl di
etanolo al 100 %. Incubare a –70°C per 15 min.
13. Centrifugare per 15 min a 14000 g ed a 4°C (5415 R Eppendorf).
14. Scartare il supernatante. Lavare il pellet con 200 µl di etanolo al 70%.
15. Essiccare il pellet per 5-10 min (SpeedVac Concentrator Savant).
16. Risospendere il pellet in 50 µl di acqua priva di RNAsi (DEPC treated water).
1
Homogenisation buffer: 0,2 M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M saccarosio, 30 mM acetato di Mg, 60 mM KCl, 1%
PVP, 0,31% β-mercaptoetanolo.
2.5. GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO ESTRATTO (RNA)
5 µl di prodotto estratto sono stati separati su gel di agarosio 1% (Gibco) in 0,5x TBE
contenente tracce di bromuro di etidio.
2.6. SINTESI DI cDNA ED AMPLIFICAZIONE TRAMITE PCR (RT-PCR)
Sono stati applicati quattro sistemi, due utilizzanti la retrotrascrittasi derivata da Avian
Myeloblastosis Virus (AMV), uno Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) ed un
sistema a base di ricombinanti eterodimerci di enzimi espressi in E. coli per la sintesi di
cDNA.
2.6.1. RT-PCR CON ACCESS RT-PCR INTRODUCTORY SYSTEM (PROMEGA
MADISON, USA)
Per l’analisi dei campioni di pomodoro raccolti nel 2001, i quali presentavano sintomi
evidenti di TSWV è stato utilizzato il kit Access RT-PCR Introductory Sytem (Promega,
Madison, USA). Il protocollo annesso è stato seguito utilizzando i primers NP pubblicati
da Jain et al., 1998 (Tab. 1) ed aggiungendo al mix di reazione 2 µl di Template RNA
(Tab. 2). Per l’amplificazione, eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System
(Perkin Elmer Cetus), sono state rispettate le condizioni descritte in Tab. 3.
Tab. 1: Primer specifici per gene NP di TSWV (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera).
Primer
Coordinate1
Sequenza
Referenza
NP for
154 - 171
5’- ATGTCTAAGGTTAAGCTC - 3’
Jain et al., 1998
NP rev
912 - 930
5’- TTAAGCAAGTTCTGTGAG - 3’
Jain et al., 1998
1
Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991)
18
Tab. 2: Mix di reazione per RT – PCR.
Reagenti
ddH2O
AMV/Tfl 5x Reaction Buffer
dNTP Mix (10mM di ogni dNTP)
Primer For (10 µM)
Primer Rev (10 µM)
25 mM MgSO4
AMV Reverse Trancsriptase (5u/µl)
Tfl DNA Polymerase (5u/µl)
RNA totale
Volume totale
Mix
Concentrazione finale
23 µl
1x
10 µl
0,2 mM
1 µl
5 µl
1 µM
5 µl
1 µM
2 µl
1 µM
1 µl
0,1 u/µl
1 µl
0,1 u/µl
2 µl
50 µl
Tab. 3: Condizioni per RT-PCR.
First strand cDNA Synthesis (1 ciclo)
Temperatura
Reverse transcription
48°C
AMV RT inactivation and RNA/cDNA/primer
94°C
denaturation
Second strand Synthesis e amplificazione tramite PCR (40 cicli)
Temperatura
Denaturazione
94°C
Annealing
60°C
Estensione
68°C
Estensione finale
68°C
2.6.2. RT-PCR
CON
REVERSE
MANNHEIM, GERMANIA)
Durata
45 min
2 min
Durata
30 s
1 min
2 min
7 min
TRANSCRIPTASE
AMV
(ROCHE,
Per l’analisi dei bulks dell’esperimento di diagnosi precoce di lattuga e pomodoro senza
sintomi è stata utilizzata, per la sintensi di cDNA la retrotrascriptasi AMV (Roche,
Mannheim, Germania). Il prodotto ottenuto è stato successivamente amplificato mediante
PCR, seguita da un’ulteriore amplificazione con nested primers.
2.6.2.1. SINTESI DEL cDNA
Non trattandosi di un kit one step, è stato dapprima sintetizzato cDNA utilizzando
l’enzima AMV (Roche, Mannheim, Germania). Il protocollo annesso è stato seguito
utilizzando i primers NP pubblicati da Jain et al., 1998 (Tab. 1) ed aggiungendo al mix di
reazione 5 µl di RNA totale (Tab. 4). Per la sintesi di cDNA, eseguita in un termocycler
Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus), sono state rispettate le condizioni
descritte in Tab. 5.
19
Tab. 4: Mix di reazione per sintesi del cDNA.
Reagenti
5x Incubation Buffer
dNTP Mix
Primer NP rev (10 µM)
AMV Reverse Trancsriptase (5u/µl)
RNA totale
Volume totale
Mix
4 µl
10 µl
0,5 µl
0,5 µl
5 µl
20 µl
Tab. 5: Condizioni per reverse transcriptase (Dewey et al., 1996).
First strand cDNA Synthesis (1 ciclo)
Sintesi di cDNA
AMV RT inactivation
Temperatura Durata
42°C
60 min
94°C
2,5 min
2.6.2.2. AMPLIFICAZIONE SPECIFICA TRAMITE PCR
In un secondo passaggio cDNA sono stati amplificati mediante PCR.
5 µl di soluzione di sintesi di cDNA sono stati aggiunti al mix di reazione di PCR (Tab. 6).
Per l’amplificazione, eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin
Elmer Cetus), sono state rispettate le condizioni descritte in Tab. 7.
Tab. 6: Mix di reazione per PCR specifica.
Reagenti
ddH2O
10 x Buffer
dNTP Mix
Primer NP rev (10 µM)
Primer NP for (10 µM)
Taq
cDNA
Volume totale
Mix
34,80 µl
5,00 µl
2,50 µl
1,00 µl
1,00 µl
0,70 µl
5 µl
50 µl
Concentrazione finale
0,10 mM
0,20 µM
0,20 µM
0,07 u/µl
Tab. 7: Condizioni per PCR specifica (40 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Temperatura Durata
94°C
30 s
53°C
30 s
72°C
1 min
68°C
7 min
2.6.2.3. NESTED PCR
Nested primers sono stati disegnati sulla sequenza TI01TOA allineata con altre sequenze
di isolati ticinesi (TI01TOB – TI01TOC) (Tab. 8).
20
Tab. 8: Primers per nested PCR (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera).
Primer
Coordinate1
Sequenza
NPnest for
213 - 235
5’- CCTTGAGTTTGAGGAAGATCAGA - 3’
NPnest rev
823 - 836
5’- CCTTTAGCATTAGGATTGCTGG - 3’
1
Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991)
Referenza
questa ricerca
questa ricerca
2 µl di prodotto PCR della prima amplificazione sono stati aggiunti al mix di reazione
(Tab. 9). Per l’amplificazione, eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System
(Perkin Elmer Cetus), sono state rispettate le condizioni descritte in Tab. 10.
Tab. 9: Mix di reazione per PCR specifica.
Reagenti
ddH2O
10 x Buffer
dNTP Mix
Primer NPnest rev (10 µM)
Primer NPnest for (10 µM)
Taq
Template DNA
Volume totale
Mix
Concentrazione finale
21,88 µl
3,00 µl
0,10 mM
1,50 µl
0,60 µl
0,20 µM
0,60 µl
0,20 µM
0,42 µl
0,07 u/µl
2 µl
30 µl
Tab. 10: Condizioni per PCR specifica (35 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Temperatura
94°C
55°C
72°C
68°C
Durata
30 s
30 s
1 min
7 min
2.6.3. RT-PCR CON ONE STEP RT-PCR KIT (QIAGEN, HILDEN, GERMANIA)
Il protocollo annesso è’ stato seguito utilizzando i primers NP pubblicati da Jain et al.,
1998 (Tab. 1) ed aggiungendo al mix di reazione 2 µl di RNA totale (Tab. 11). Per
l’amplificazione, eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer
Cetus), sono state rispettate le condizioni descritte in Tab. 12.
Tab. 11: Mix di reazione per RT – PCR.
Reagenti
RNAse free Water
5 x QIAGEN One Step RT-PCR Buffer
dNTP Mix
Primer NP rev (10 µM)
Primer NP for (10 µM)
QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix
Template RNA
Volume totale
Mix
Concentrazione
finale
28 µl
1x
10 µl
2 µl 400 µl di ogni dNTP
3 µl
0,6 µΜ
3 µl
0,6 µΜ
2 µl
2 µl
50 µl
21
Tab. 12: Condizioni per RT-PCR.
First strand cDNA Synthesis (1 ciclo)
Temperatura
Durata
Reverse transcription
50°C
30 min
Initial PCR activation step
95°C
15 min
Second strand Synthesis e amplificazione tramite PCR (35 cicli)
Temperatura Durata
Denaturazione
94°C
30 s
Annealing
52°C
30 s
Estensione
72°C
1 min
Estensione finale
72°C
10 min
2.6.4. RT-PCR CON ROBUST II RT-PCR KIT (FINNZYMES, ESPOO,
FINLANDIA)
Il protocollo annesso è stato seguito utilizzando i primers NP pubblicati da Jain et al.,
1998 (Tab. 1) ed aggiungendo al mix di reazione 3 µl di RNA totale (Tab. 13). Per
l’amplificazione, eseguita in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer
Cetus), sono state rispettate le condizioni descritte in Tab. 14.
Tab. 13: Mix di reazione per RT – PCR.
Reagenti
RNase free Water
10 x RobusT Reaction buffer
50 mM MgCl2
dNTP Mix
Primer NP rev (10 µM)
Primer NP for (10 µM)
M-MuLV RT RNase H- 5u/µl
DyNAzyme EXT 1u/µl
RNA totale
Volume totale
Mix
33.5 µl
5 µl
1.5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
2 µl
2 µl
3 µl
50 µl
Tab. 14: Condizioni per RT-PCR.
First strand cDNA Synthesis (1 ciclo)
Temperatura Durata
Reverse transcription
48°C 45 min
Initial PCR activation step
94°C 2,5 min
Second strand Synthesis eD amplificazione tramite PCR (40 cicli)
Temperatura Durata
Denaturazione
94°C
30 s
Annealing
53°C
30 s
Estensione
72°C
1 min
Estensione finale
72°C
7 min
2.6.5. GEL ELETTROFORESI DEL PRODOTTO RT-PCR
5 µl di prodotto RT-PCR sono stati separati su gel di agarosio 1% (Gibco) in 0,5x TBE
contenente tracce di bromuro di etidio.
22
2.6.6. PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO RT-PCR
E’ stato utilizzato il QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germania) seguendo
il protocollo annesso, eluendo con 30 µl di tampone d’eluizione.
2.6.7. QUANTIFICAZIONE DEL DNA
La stima della quantità di DNA purificato è stata effettuata confrontando la luminosità
delle bande di DNA con le bande degli standard 5 ng, 25 ng e 50 ng su gel di agarosio.
2.7. EFFICACIA DELLA RT-PCR COME METODO DI DIAGNOSI DELLA
PRESENZA DI TSWV
L’efficacia della diagnosi di TSWV tramite RT-PCR è stata testata analizzando 12
campioni di foglia di pomodoro in cui la presenza del virus è stata precedentemente
accertata, 3 campioni provenienti da piante sane ed 1 di acqua (controlli negativi).
RNA è stato estratto con il kit Nucleospin Multi-96 Plant (Macherey-Nagel, Oensingen,
Svizzera) e la sintesi di cDNA e successiva amplificazione tramite PCR è stata eseguita
con il kit Access RT-PCR Introductory System (Promega, Madison, USA) utilizzando i
primers L indicati in Tab. 15.
Tab. 15: Primer specifici per gene L di TSWV (sintetizzati da Mycrosynth, Belgach, Svizzera).
Primer Coordinate 1 Sequenza
Referenza
L1
4102 - 4121
5’- AATTGCCTTGCAACCAATTC - 3’
Mumford et al., 1994
L2
4397 - 4416
5’- ATCAGTCGAAATGGTCGGCA - 3’
Mumford et al., 1994
1
Coordinate sulla mappa dei nucleotidi dell’isolato BR-01 (De Haan et al., 1991)
2.8. ANALISI DEI CAMPIONI DI LATTUGA E POMODORO PER DIAGNOSI
PRECOCE
RNA è stato estratto utilizzando il kit NucleoSpin Multi-96 Plant (Macherey Nagel,
Oensingen, Svizzera). La presenza di RNA è stata controllata su gel (cap. 2.4.5.). Dai
Template RNA estratti, disposti su 8 righe (A-H) in 6 (1-6) colonne in una piastra da
microtitrazione, sono stati prelevati 5 µl di ogni campione e sono stati mescolati per linea
e per colonna ottenendo 14 bulk, 8 di RNA presenti nelle righe (A-H) e 6 nelle colonne (1-6).
23
A
B
C
D
E
F
G
H
1
1
2
3
4
5
6
7
8
2
9
10
11
12
13
14
15
16
3
17
18
19
20
21
22
23
24
4
25
26
27
28
29
30
31
32
5
33
34
35
36
37
38
39
40
6
41
42
43
44
45
46
47
48
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6
Fig. 9: Schema rappresentante la costruzione dei bulk per diagnosi precoce.
2.9. CYCLE SEQUENCING
Per determinare la sequenza delle basi nella molecola di DNA è stato utilizzato ABI
PRISM® Big DyeTM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems, 2001).
Ogni DNA è stato sequenziato nelle due direzioni utilizzando i primers NP for e NP rev
pubblicati da Jain et al., 1998. Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite come
descritto in Tab. 16 in un termocycler Gene Amp 9600 PCR System (Perkin Elmer Cetus),
rispettando le condizioni descritte in Tab. 17.
Tab. 16: Mix per cycle sequencing.
Big dye
5x rxn buffer1
Primer NP for o NP rev (1,6 µΜ) (nested per insalata)
ddH2O
DNA (5-20 ng)
Volume totale
1
5x rxn buffer: 400 mM Tris HCl, 10mM MgCl2, pH 9,0
Tab. 17: Condizioni per cycle sequencing (35 cicli).
Denaturazione
Annealing
Estensione
Temperatura
96°C
50°C
60°C
Durata
10 s
5s
4 min
24
Mix
1 µl
0,5 µl
0,5 µl
Y
X
5 µl
2.9.1. PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DELLA CYCLE SEQUENCING
Con questa procedura vengono eliminati sali, primers e altri oligonucleotidi di lunghezza
leggermente superiore, ddNTPs e dNTP non integrati.
1. In una piastra per filtrazione MAHVN 45 (ABI PRISM) aggiungere ad un volume di
45 µl di DNA Grade Sephadex G-50 Fine (Amersham Pharmacia Biotech), 290 µl di
ddH2O. Lasciar equilibrare a temperatura ambiente per 3 ore o più a lungo in
refrigerante. Le piastre equilibrate possono venir sigillate con un foglio di pellicola per
alimenti (Saran) e conservate a 4°C in refrigerante per più settimane.
2. Porre la piastra per filtrazione su una piastra per titolazione (microtiter plate) e
centrifugare a 900 g per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen). Gettare il tampone raccolto
nella piastra per titolazione.
3. Aggiungere 145 µl di ddH2O per purificare il Sephadex e centrifugare a 900 g per 5
min (Sigma 4-15 C Qiagen).
4. Aggiungere 15 µl di acqua al prodotto di reazione. Pipettare il tutto nella colonna di
Sephadex.
5. Porre la piastra per filtrazione su una piastra (Beckman CEQ) e centrifugare a 900 g
per 5 min (Sigma 4-15 C Qiagen).
6. Ricoprire con 20 µl di olio minerale il prodotto purificato.
2.10.
SEQUENZIAMENTO
Il sequenziamento del prodotto PCR è stato eseguito con il sequenziatore 3100 Genetic
Analyzer (ABI PRISM) secondo i parametri descritti in Tab. 18.
Tab. 18: Parametri di lettura delle sequenze.
Lunghezza dei capillari
Run
Run temperature
Run voltage
Injection
Injection voltage
2.11.
50 mm
6500 s
50°C
12,2 kV
15 s
1,5 kV
ELABORAZIONE DEGLI ELETTROFEROGRAMMI
Per ogni campione è stata ottenuta la sequenza FORWARD e REVERSE. Il programma
GCG (Genetics Computer Group of the University of Winsconsion, Devereux et al., 1984)
è stato utilizzato per allineare la sequenza della matrice e la sequenza del suo
complementare. Il programma fa risaltare eventuali incongruenze tra le sequenze e
permette una correzione. Dal confronto delle due sequenze (FORWARD e REVERSE),
viene creata la sequenza “consensus”.
2.12.
RICERCA DI SEQUENZE
Sequenze del gene NP di TSWV di isolati mondiali sono state ottenute dalla letteratura
(Heinze et al. 2001) e con ricerca in banca dati (GenBank).
25
2.13.
ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE
Le sequenze sono state allineate utilizzando il programma CLUSTAL W (Thompson et
al., 1994) messo a disposizione nel sito web www.ddbj.nig.jp/E-mail/clustalW-e.html.
2.14.
ANALISI FILOGENETICHE
Le analisi filogenetiche sono state effettuate con i programmi PAUP* (Phylogenetic
Analysis Using Parsimony and Other Methods) versione 4.0 (Swofford, 1998) in GCG
(Genetics Computer Group of the University of Winsconsion, Devereux et al. 1984) e
MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Anlysis), versione 2.1 (Kumar et al., 2001).
Una serie di cladogrammi basati sull’algoritmo di maximum parsimony è stata calcolata
con il metodo di ricerca heuristic search in PAUPSearch, da essi è stato generato un
consensus tree secondo la 50% majority rule ed esso è stato rappresentato graficamente in
PAUPDisplay. Le analisi di distanza sono state effettuate in MEGA con l’algoritmo
Neighbour Joining (NJ) ed il modello Jukes-Cantor. Per l’analisi statistica bootstrap sono
state scelte 1000 ripetizioni. Il cladogramma ottenuto in PAUP* è stato confrontato con il
filogramma ottenuto con MEGA e quindi rappresentato. Le biforcazioni con valore
bootstrap inferiore al 50% (non significanti) sono state eliminate ed i rami fusi.
Il numero di sostituzioni sinonime e non sinonime è stato calcolato con il metodo di NeiGojobori in MEGA.
Per le sequenze di 518 nucleotidi, rispettivamente 172 aminoacidi sono state effettuate
unicamente analisi di distanza in MEGA come precedentemente descritto, per mancanza
di tempo.
26
3. RISULTATI
3.1. EFFICACIA DELLA RT-PCR COME METODO DI DIAGNOSI DELLA
PRESENZA DI TSWV
TSWV è divenuto nel corso degli ultimi tre anni un importante problema nelle colture
orticole ticinesi. Lo scopo di questo primo esperimento era di determinare la possibilità di
utilizzare la RT-PCR come metodo di diagnosi della presenza di TSWV.
Sono stati analizzati 12 campioni di foglia di pomodoro in cui la presenza del virus è stata
precedentemente accertata, 3 campioni provenienti da piante sane ed 1 di acqua (controlli
negativi). L’RNA è stato estratto con il kit Nucleospin Multi-96 Plant (Macherey-Nagel,
Oensingen, Svizzera) e su gel è stata controllata la presenza di RNA per tutti i campioni
provenienti da foglia di pomodoro (con e senza virus). La sintesi di cDNA e la successiva
amplificazione tramite PCR è stata eseguita con il kit Access RT-PCR Introductory
System (Promega, Madison, USA).
Su gel sono state osservate 12 bande (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15) di
approssimativamente 300 bp corrispondenti al gene L di TSWV unicamente per il
prodotto RT-PCR sintetizzato da RNA estratto da foglie di piante con TSWV. La banda
ottenuta per il campione 11 è risultata molto debole. Non è stata ottenuta
un’amplificazione nè per il prodotto RT-PCR sintetizzato da RNA estratto da foglie di
piante sane nè per il controllo negativo con acqua (Fig.10).
M 1* 2 3
4
5 6
7
8 9* 10 11 12* 13 14 15 W S1 S5 S10
Fig. 10: Gel elettroforesi del prodotto RT-PCR sintetizzato da RNA estratto da foglie di pomodoro di piante
con presenza accertata di TSWV, da foglie di piante sane e controllo negativo con acqua.
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15: prodotto RT-PCR sintetizzato da RNA estratto da foglie di piante con
TSWV. 1*, 9*, 12*: prodotto RT-PCR sintetizzato da RNA estratto da foglie di piante sane. W: acqua
(controllo negativo). M: 100 bp ladder. S1, S5, S10: Standard 5, 25, 50 ng DNA.
I risultati positivi di questo esperimento hanno dimostrato la possibilità di identificare la
presenza di TSWV tramite RT-PCR. Si è quindi proceduto alla scelta dei metodi
d’estrazione dell’RNA e di trascrizione inversa (sintesi di cDNA e successiva
amplificazione tramite PCR) più veloci, economici ed efficaci per i vari tipi di
esperimento.
27
3.1.1. EFFICACIA DEI METODI DI ESTRAZIONE DI RNA
I quattro metodi di estrazione di RNA da foglia di pomodoro ed insalata utilizzati (Kit
Nucleospin Multi-96 Plant (Macherey-Nagel, Oensingen, Svizzera), RNeasy Plant Mini
Kit (Qiagen, Hilden, Germania), SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison,
USA) e Jones et al., 1998) sono risultati tutti ugualmente efficaci, la quantità di RNA
estratto è risultata approssimativamente uguale.
Si è optato per il kit Nucleospin Multi-96 Plant (Macherey-Nagel, Oensingen, Svizzera)
perchè permette di svolgere contemporaneamente un elevato numero di estrazioni in
tempo relativamente breve.
3.1.2. EFFICACIA DEI METODI DI SINTESI DI cDNA ED AMPLIFICAZIONE
TRAMITE PCR (RT-PCR)
I quattro metodi di sintesi di cDNA ed amplificazione tramite PCR (RT-PCR) hanno dato
risultati diversi.
Il kit RT-PCR Introductory System (Promega, Madison, USA) ha dato risultati ottimali
per RNA estratto da foglie di pomodoro con evidenti sintomi di TSWV, mentre non ha
sintetizzato DNA da RNA estratto da foglie di insalata (lattuga e lattuga foglia di quercia)
con sintomi. Una successiva riamplificazione specifica con primers NP del prodotto
ottenuto ha mostrato su gel la presenza di più bande di grandezze diverse, lo stesso
risultato è stato ottenuto con l’uso di nested primers.
La sintesi di cDNA e successiva amplificazione tramite PCR con Reverse Transcriptase
AMV (Roche, Mannheim, Germania) come descritta nel protocollo annesso non ha dato
risultati positivi, in alcuni casi erano presenti bande di intensità molto debole ed in altri
esse erano totalmente assenti. L’aumento da 35 a 40 cicli della prima amplificazione e la
successiva riamplificazione con nested primers ha permesso di ottenere bande di forte
intensità, corrispondenti ad una concentrazione di più di 10 ng di DNA per µl sia per
l’RNA dei singoli campioni che per i miscugli di RNA di insalata e pomodoro in assenza
di sintomi (v. cap. 3.2).
Il kit One Step RT-PCR (Qiagen, Hilden, Germania) ha dato risultati positivi mentre
l’efficacia del kit RobustII RT-PCR (Finnzymes, Espoo, Finlandia) non è risultata
soddisfacente per RNA estratto da foglie di pomodoro con sintomi di TSWV.
Per l’analisi di diagnosi precoce da lattuga e pomodoro è stato scelto il metodo con
Reverse Transcriptase AMV (Roche, Mannheim, Germania) con 40 cicli di amplificazione
e successiva riamplificazione (35 cicli) con nested primers.
3.2. DIAGNOSI PRECOCE ED EPIDEMIOLOGIA
Le analisi di diagnosi precoce su lattuga e pomodoro sono state svolte allo scopo di
determinare se attraverso RT-PCR è possibile diagnosticare infezioni latenti di TSWV
(senza presenza di sintomi).
Dapprima sono stati analizzati i campioni dell’ultimo prelievo per determinare se TSWV
fosse presente in piante senza sintomi. Per le piante positive è stato analizzato il campione
del prelievo precedente, risalendo fino a ritrovare campioni privi di TSWV.
28
3.2.1. LATTUGA
50 campioni di foglia di lattuga sono stati prelevati ad intervalli settimanali dalle stesse
piante dal 1 marzo al 5 aprile 2002 (in totale 6 prelievi) presso l’azienda Giorgi a Stabio in
un tunnel fortemente colpito nella stagione 2001. RNA è stato estratto da 48 campioni di
foglia di lattuga provenienti dall’ultimo prelievo.
Allo scopo di ridurre il numero di reazioni, RNA estratto dai singoli campioni è stato
mescolato per riga (bulk A-H) e per colonna (bulk 1-6), ottenendo 14 miscugli. Ai bulk A
ed 1 è stato aggiunto RNA estratto da lattuga foglia di quercia (BRE150402FQ1) in cui la
presenza di TSWV è stata precedentemente accertata ottenendo i miscugli di controllo
positivi (CA e C1). Acqua (W) è stata utilizzata come controllo negativo.
La sintesi di cDNA è stata eseguita utilizzando Reverse Transcriptase AMV (Roche,
Mannheim, Germania), oltre ai bulk ed ai miscugli di controllo sono stati trascritti ed
amplificati singolarmente RNA estratto da lattuga (L, BRE150402LE1) e due provenienti
da lattuga foglia di quercia (FQ, BRE150402FQ1) come controlli positivi singoli.
Per 9 dei 14 bulk (A, C, F, G, 1, 2, 3, 4 e 6), per i miscugli di controllo (CA e C1) e per i
controlli positivi singoli (L, FQ) è stata ottenuta su gel una banda di 600 bp corrispondente
a parte del gene NP di TSWV (Fig. 11).
M A B C D E
F G
H
1
2
3
4
5 6 CA W C1
L FQ FQ S1 S5 S10
Fig. 11: RT-PCR test di bulks di RNA estratto da foglie di lattuga senza sintomi raccolte il 5 aprile 2002
(ultimo prelievo) presso l’azienda Giorgi a Stabio. M: 100 bp ladder. A-H, 1-6: miscugli (bulks). CA, C1:
miscugli di controllo (BRE140402FQ1). L, FQ: controlli positivi singoli (BRE150402LE1,
BRE150402FQ1). S1, S5, S10: Standard 5, 10, 50 ng DNA.
Dalle amplificazioni ottenute è quindi ipotizzabile la presenza di almeno un campione con
TSWV in ognuno dei bulk per i quali è stata ottenuta su gel una banda (Fig. 12).
A
B
C
D
E
F
G
H
1
1
2
3
4
5
6
7
8
2
9
10
11
12
13
14
15
16
3
17
18
19
20
21
22
23
24
4
25
26
27
28
29
30
31
32
5
33
34
35
36
37
38
39
40
6
41
42
43
44
45
46
47
48
Fig. 12: Schema rappresentante in grigio i bulk contenenti almeno un campione di lattuga con TSWV. In
grassetto sono indicati i campioni potenzialmente infetti, in bianco i bulks ed i campioni in cui la presenza di
TSWV non è stata riscontrata.
29
Al fine di determinare il numero esatto di piante con TSWV, si è proceduto all’analisi dei
20 campioni potenzialmente infetti (1, 3, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 19, 22, 23, 25, 27, 30, 31,
41, 43, 46 e 47, indicati in grassetto nella figura 12). Questa analisi ha permesso di
determinare che 14 di essi (1, 6, 9, 11, 14, 15, 22, 23, 27, 31, 41, 43, 46 e 47) su 48
(29,2%) piante provenienti dall’ultimo prelievo sono effettivamente infetti dal virus.
Successivamente si è proceduto al sequenziamento dei campioni allo scopo di determinare
il loro aplotipo (vedi 3.5.1.). La loro distribuzione è rappresentata nella figura 13.
Nord
50
49
48
46
25
47
24
22
43
42
21
41
23
39
37
40
45
44
20
19
38
18
36
35
17
16
31
14
12
15
34
33
13
11
9
32
10
28
8
6
4
7
5
3
30
27
29
26
2
1
Sud
Fig. 13: Rappresentazione del tunnel da cui sono stati prelevati i campioni di lattuga e distribuzione degli
aplotipi. : pianta di lattuga. ,
, ,
e : Aplotipi di TSWV presenti in piante di lattuga senza
sintomi ( : TI01TOD, : TI01TOC, : TI01TOG, : TI02TOLEI, : TI02LEL, : TI02LEM, vedi 3.5.1.).
Per mancanza di tempo non sono stati analizzati i campioni dei prelievi precedenti il sesto.
3.2.2. POMODORO
48 campioni di foglia di pomodoro sono stati prelevati ad intervalli settimanali dal 4 al 25
maggio 2002 (in totale 4 prelievi) presso l’azienda Giorgi a Stabio nel tunnel fortemente
colpito nel 2001 dal quale sono stati prelevati i campioni di lattuga (cap. 3.2.1). Per
l’analisi dei campioni si è proceduto come per la lattuga.
RNA è stato estratto dai 48 campioni di foglia di pomodoro provenienti dall’ultimo
prelievo. Allo scopo di ridurre il numero di reazioni, RNA estratto dai singoli campioni è
stato mescolato per riga (bulk A-H) e per colonna (bulk 1-6), ottenendo 14 bulk. Ai bulk
RNA A ed 1 è stato aggiunto RNA estratto da pomodoro (BEG030701TO10) in cui la
presenza di TSWV è stata precedentemente accertata ottenendo i miscugli di controllo
(CA e C1). Acqua (W) è stata utilizzata come controllo negativo.
Per 7 dei 14 bulk (A, B, D, G, H, 5, 6) e per i bulk di controllo (CA e C1 è stata ottenuta su
gel una banda di 600 bp corrispondente a parte del gene NP di TSWV. Non è stata
visualizzata su gel alcuna banda per il controllo negativo con acqua (W) (Fig. 14).
30
M
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6 CA C1 W
S1 S5 S10
Fig. 14: RT-PCR test dei bulks di RNA estratto da foglie di pomodoro raccolte il 25 maggio 2002 (ultimo
prelievo) presso l’azienda Giorgi a Stabio. M: 100 bp ladder. A-H, 1-6: bulk. CA, C1: miscugli con
controllo positivo (BEG030701TO10). W: controllo negativo (acqua). S1, S5, S10: Standard 5, 25, 50 ng
DNA.
Dalle amplificazioni è ipotizzabile la presenza di almeno un campione con TSWV in
ognuno dei bulk per i quali è stata ottenuta su gel una banda (Fig. 15).
A
B
C
D
E
F
G
H
1
1
2
3
4
5
6
7
8
2
9
10
11
12
13
14
15
16
3
17
18
19
20
21
22
23
24
4
25
26
27
28
29
30
31
32
5
33
34
35
36
37
38
39
40
6
41
42
43
44
45
46
47
48
Fig. 15: Schema rappresentante in grigio i miscugli contenenti almeno un campione di pomodoro con
TSWV. In grassetto sono indicati i campioni potenzialmente infetti, in bianco in bianco i bulks ed i campioni
in cui la presenza di TSWV non è stata riscontrata.
RNA estratto dai campioni 33, 34, 36, 39, 40, 41, 42, 44, 47 e 48 è stato retrotrascritto ed
amplificato singolarmente. Attraverso l’analisi su gel del prodotto RT-PCR ottenuto è
stata visualizzata una banda di 600 bp, corrispondente a parte del gene NP di TSWV per i
campioni 39, 40, 41 e 47, indicando che queste piante sono infette da TSWV.
Sorprendentemente nessuno dei campioni 34, 36, 42 e 44, presenti nei bulk B e D (indicati
come bulks contenenti almeno un campione potenzialmente infetto) è risultato positivo.
Per verificare l’efficacia del metodo sono quindi stati successivamente amplificati
singolarmente i campioni presenti nelle righe B e D. Non è stata ottenuta nessuna banda
per i campioni 2, 10, 18, 26, 34 e 42 della riga B, mentre i campioni 4, 20 e 44 di D hanno
mostrato su gel una banda corrispondente a parte del gene NP. Il segnale ottenuto per il
campione 4 è risultato molto debole. Successivamente si è proceduto al sequenziamneto
dei campioni allo scopo di determinare il loro aplotipo (vedi 3.5.1.). La distribuzione delle
piante infette è rappresentata nella figura 16.
31
Nord
Testimone
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
29
30
31
32
32
33
34
35
36
28
Trattamento intensivo
…
…
…
…
Strategia
…
…
39
38
37
*
…
42
41
40
O
…
45
44
43
48
47
46
Sud
Fig. 16: Rappresentazione del tunnel da cui sono stati prelevati i campioni di pomodoro. Il tunnel è stato
suddiviso in tre sezioni con diverso trattamento insetticida. I campioni sono stati prelevati nella sezione
testimone ed in quella trattata secondo la strategia.
: pianta di pomodoro. , *: Aplotipi di TSWV presenti in piante di pomodoro senza sintomi ( :
TI01TOD, *: TI01TOH, vedi 3.5.1.). O: non sequenziato. ..: altre piante di pomodoro presenti nel tunnel ma
non indicate nella rappresentazione.
5 dei 7 campioni in cui è stata rilevata tramite RT-PCR la presenza di TSWV nel prelievo
del 25 maggio 2002 sono stati prelevati dalla sezione con la strategia di trattamento
secondo la soglia di tolleranza. Il 41,7% dei campioni prelevati in questa sezione è
risultata positiva a TSWV contro il 5,6% dei campioni prelevati nella sezione testimone.
Per determinare quando le piante sono state infettata eseguendo il minor numero di analisi,
è stato estratto RNA dai campioni 39, 40, 41 e 47 provenienti dal prelievo effettuato l’11
maggio 2002 (secondo prelievo) ed esso è stato trascritto ed amplificato. Non è stato
analizzato il campione 44, in quanto esso è stato diagnosticato come positivo solamente in
un secondo tempo (nel corso dell’analisi per verificare l’efficacia del metodo).
Unicamente i campioni 39 e 41 sono risultati positivi. Sono quindi stati analizzati i
campioni numero 39 e 41 prelevati il 4 maggio 2002 (primo prelievo), con il presupposto
che se i campioni del secondo prelievo sono risultati positivi, essi lo sono anche nel terzo.
Non essendo stati rilevati nell’analisi dei campioni dell’11 maggio (secondo prelievo),
sono stati analizzati i campioni 40, 47 del 18 maggio 2002 (terzo prelievo). Unicamente
per il campione numero 40 è stata ottenuta una banda.
Si è quindi è proceduto al sequenziamento dei campioni 39, 40, 41, 47 del quarto prelievo
allo scopo di determinare il loro aplotipo (vedi 3.5.1.).
L’evoluzione dell’epidemia nella sezione di tunnel trattata secondo strategia secondo la
soglia di tolleranza è riassunta nella tabella 19.
32
Tab. 19: Campioni in cui è stata diagnosticata tramite PCR la presenza di TSWV e posizione all’interno del
tunnel (sezione con trattamento secondo strategia).
: pianta di pomodoro. , *: Aplotipi di TSWV presenti in piante di pomodoro senza sintomi ( :
TI01TOD, *: TI01TOH, vedi 3.5.1.). O: non sequenziato.
Campioni positivi
Posizione
1
04.05.02
1° prelievo
-
11.05.02
2° prelievo
39, 41
18.05.02
3° prelievo
39, 40, 41
25.05.02
4° prelievo
1
39, 40, 41, 44 , 47
39
42
45
48
39
42
45
48
39
42
45
48
39
42
45
48
38
41
44
47
38
41
44
47
38
41
44
47
38
* 41
44
47
37
40
43
46
37
40
43
46
37
40
43
46
37
40
43
46
*
*
O
Non sono stati analizzati i campioni dei prelievi precedenti il 25 maggio 2002
3.2.3. EVOLUZIONE DEL NUMERO DI PIANTE DI POMODORO E LATTUGA
CON TSWV (RIASSUNTO)
In 14 dei 48 campioni di lattuga (29,2%) prelevati il 5 aprile 2002 (ultimo prelievo) è stata
riscontrata tramite RT-PCR la presenza di TSWV, i campioni dei 5 prelievi precedenti non
sono stati analizzati per mancanza di tempo (Fig. 17).
Nei campioni di foglia di pomodoro prelevati il 4 maggio 2002 (primo prelievo) non è
stata rilevata la presenza di TSWV. 2 dei 48 campioni (4,2%) dell’11 maggio 2002
(secondo prelievo) sono risultati positivi, un ulteriore campione positivo è stato riscontrato
la settimana successiva (18 maggio, terzo prelievo). In 7 dei 48 campioni (14,6%) del 25
maggio è stata riscontrata la presenza di TSWV (Fig. 17).
14/48
14
No. di campioni positivi
12
10
8
7/48
6
4
3/48
2/48
2
Campioni non analizzati
25.05.02
21.05.02
18.05.02
14.05.02
11.05.02
07.05.02
30.04.02
05.04.02
29.03.02
22.03.02
15.03.02
08.03.02
01.03.02
Lattuga
04.05.02
0/48
0
Pomodoro
Fig. 17: Numero di campioni di lattuga e pomodoro (su 48 analizzati) in cui è stata diagnosticata tramite
PCR la presenza di TSWV in funzione del tempo.
33
3.3. MONITORAGGIO DEGLI INSETTI VETTORI (dati gentilmente messi a
disposizione da M. Jermini)
Dal 1 (inizio del monitoraggio) al 15 marzo 2002 non è stato riscontrata la presenza di F.
occidentalis all’interno del tunnel presso l’azienda Giorgi a Stabio dal quale sono stati
prelevati i campioni di lattuga e pomodoro. A partire da metà marzo 0,7 F. occidentalis
sono state catturate per trappola e fino al 5 aprile 2002 il numero è rimasto costante. Nella
settimana dal 5 al 12 aprile il numero di tripidi è calato, raggiungendo le 0 catture. In
questo periodo nel tunnel la quasi totalità delle piante di lattuga è stata raccolta ed esso è
rimasto senza colture fino all’ultima settimana di aprile, quando i pomodori sono stati
messi a dimora. Nella settimana dal 7 al 14 maggio, il numero di catture ha subito un forte
aumento, raggiungendo nella zona testimone un massimo di 7 catture per trappola. Dopo
aver raggiunto la punta massima, il numero di F. occidentalis catturate ha subito un calo in
tutte e tre le sezioni. Questo andamento è risultato ritardato di una settimana, rispetto a
quello osservato per la sezione testimone e con trattamento intensivo nella sezione trattata
secondo strategia.
I dati relativi alle catture del periodo dal 12 al 30 aprile mancano.
8
Individui/Trappola/Settimana
7
6
5
4
3
2
1
Intero
Testimone
Intensivo
28.05.02
21.05.02
14.05.02
07.05.02
30.04.02
12.04.02
05.04.02
29.03.02
22.03.02
15.03.02
08.03.02
01.03.02
0
Strategia
Fig. 18: Monitoraggio della presenza di F. occidentalis all’interno delle sezioni del tunnel sottoposte a
diversi tipi di strategia di trattamento, da cui sono stati prelevati i campioni di foglia di lattuga e pomodoro
analizzati. Le frecce indicano il momento in cui è avvenuto il trattamento insetticida. I dati delle catture dal
12 al 30 aprile 2002 mancano (dati messi gentilmente a disposizione da M. Jermini).
Un andamento analogo è stato osservato per la popolazione di T. tabaci (Fig. 19). La data
di inizio delle catture è ritardata di una settimana rispetto a quelle di F. occidentalis.
Anche per questo insetto il numero di catture è diminuito nella settimana dal 5 al 12 aprile
2002. L’aumento delle catture è sfasato di una settimana rispetto a quello osservato per F.
occidentalis.
I dati relativi alle catture del periodo dal 12 al 30 aprile mancano.
34
14
Individui/Trappola/Settimana
12
10
8
6
4
2
Intero
Testimone
Intensivo
28.05.02
21.05.02
14.05.02
07.05.02
30.04.02
12.04.02
05.04.02
29.03.02
22.03.02
15.03.02
08.03.02
01.03.02
0
Strategia
Fig. 19: Monitoraggio della presenza di T. tabaci all’interno delle sezioni del tunnel sottoposte a diversi tipi
di strategia di trattamento, da cui sono stati prelevati i campioni di foglia di lattuga e pomodoro analizzati.
Le frecce indicano il momento in cui è avvenuto il trattamento insetticida. I dati delle catture dal 12 al 30
aprile 2002 mancano. L’esattezza dei dati non è totale, date le difficoltà nel distinguere esattamente T. tabaci
da altre speci di Thrips (dati messi gentilmente a disposizione da M. Jermini).
3.4. TEMPERATURA ED UMIDITÀ
La temperatura all’interno del tunnel ha raggiunto picchi massimi il 19 e 24 di maggio
2002 (38°C), e minimi il 3-4 marzo ed il primo aprile (0°C). A partire dal mese di maggio
le temperature hanno subito un aumento. I dati dal 6 all’ 8 e dal 14 al 16 maggio 2002
mancano (Fig. 20).
40
35
30
Tempeatura (°C)
25
20
15
10
5
Temperatura Minima
28.05.02
24.05.02
20.05.02
16.05.02
12.05.02
08.05.02
04.05.02
11.04.02
07.04.02
02.04.02
29.03.02
25.03.02
21.03.02
17.03.02
13.03.02
09.03.02
05.03.02
01.03.02
0
Temperatura Massima
Fig. 20: Temperatura minima e massima rilevate all’interno del tunnel presso l’azienda Giorgi a Stabio da
cui sono stati prelevati i campioni di foglia di lattuga e pomodoro analizzati.
I dati dal 6 all’ 8 e dal 14 al 16 maggio 2002 mancano.
L’umidità relativa rilevata all’interno del tunnel ha seguito un andamento altalenante con
variazioni più marcate per il valore minimo (Fig. 21).
35
100
90
Umidità relativa (%)
80
70
60
50
40
30
20
Umidità Minima
28.05.02
24.05.02
20.05.02
16.05.02
12.05.02
08.05.02
04.05.02
11.04.02
07.04.02
02.04.02
29.03.02
25.03.02
21.03.02
17.03.02
13.03.02
09.03.02
05.03.02
01.03.02
10
Umidità Massima
Fig. 21: Umidità minima e massima rilevate all’interno del tunnel presso l’azienda Giorgi a Stabio da cui
sono stati prelevati i campioni di foglia di lattuga e pomodoro analizzati.
I dati dal 6 all’ 8 e dal 14 al 16 maggio 2002 mancano.
3.5. SEQUENZE DEGLI ISOLATI TICINESI
Le sequenze ottenute dai campioni prelevati nel 2001 hanno una lunghezza massima
comune di 638 nucleotidi, il che rappresenta l’82,11% del gene NP (777 nt). Il primo
nucleotide della sequenza corrisponde al nucleotide 59 di BR-01 (de Haan et al., 1991) ed
il 638esimo al 696esimo.
La lunghezza delle sequenze ottenute dai campioni 2002 (eccetto la sequenza ottenuta da
campione di pomodoro prelevato presso l’azienda All’Orto) è ridotta dato l’uso di nested
primers, esse hanno una sequenza comune di 518 nucleotidi (66,67% del gene NP). Il
primo nucleotide della sequenza corrisponde al nucleotide 123 di BR-01 (de Haan et al.,
1991) ed il 518esimo al 640esimo.
Per verificare l’affidabilità dei dati, il sequenziamento del DNA ottenuto da un campione
di foglia di pomodoro prelevato presso l’azienda Beghelli il 3 luglio 2001 è stato
sequenziato tre volte, in tutti e tre i casi la sequenza ottenuta è stata la stessa.
3.5.1. APLOTIPI
In Ticino sono presenti 11 aplotipi di TSWV (10 se si considera come un nuovo aplotipo
una sequenza con una sostituzione non certa) (Tab. 20). La sigla dei diversi aplotipi si
compone della sigla del canton Ticino (TI), dell’anno in cui è stato ritrovato la prima volta
l’aplotipo, della coltura (TO = pomodoro, LE = lattuga) e di un’ indicazione partendo
dalla lettera A.
36
Tab. 20: Aplotipi di TSWV presenti in Ticino, azienda e data in cui sono stati ritrovati.
Sequenze corrette ottenute - Aplotipi
All'Orto
Data
10.08.01
Ballerini
0
0
0
Data
Beghelli
0
Campioni
2002
1
05.07.01
10.08.01
10.08.01
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
8
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
6
7 (6) 2
18
05.04.02
25.05.02
05.04.02
05.04.02
05.04.02
1
7
03.07.01
0
6
7
6
05.04.02
0
03.07.01
10.08.01
0
05.04.02
25.05.02
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
7
24
10 (11) 2
20
Data
Totale
campioni
Totale
aziende
Aplotipi
2002
1
03.07.01
Data
Brevi
10.08.01
14.05.02
1
Aplotipi Campioni
2001
2001
5
7
10.08.01
Data
Giorgi
Totale
TI01TOA TI01TOB TI01TOC TI01TOD TI01TOE TI01TOF TI01TOG TI02TOH TI02TOL TI02TOL TI02TOL
EI
EL
EM *
2 (0)1
0
0
3 (5)1
1
1
1
0
0
0
0
1
15.04.02
2
7
15
10 (12) 1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
3
3
1
1
2
1
1
1
1
1
Tra parentesi il numero di aplotipi se si considera l’aplotipo TI01TOD uguale a TI01TOA (identico nel confronto di 518 nucleotidi)
Tra parentesi il numero di aplotipi se si considera errata la sostituzione che porta alla mutazione (TI02LEM = TI01TOB)
* esistenza non certa dell’aplotipo, data la presenza di una sostituzione dubbia
2
Nel 2001 sono stati ritrovati in 24 campioni di foglia di pomodoro analizzati provenienti
da 4 aziende agricole, 7 aplotipi diversi per il gene NP di TSWV.
Presso l’azienda All’Orto a Muzzano sono stati prelevati 7 campioni dai quali sono state
ottenute 7 sequenze di parte del gene NP di TSWV. 2 sequenze identiche, provenienti da
campioni prelevati su piante diverse, sono stati denominati aplotipo TI01TOA, altre due
TI01TOD e le rimanenti tre TI01TOE, TI01TOF e TI01TOG. Dai 6 campioni prelevati
presso l’azienda Ballerini a Novazzano (Brusata) è stata ottenuta un'unica sequenza, la
quale corrisponde all’aplotipo TI01TOD già ritrovato presso l’azienda All’Orto. Le 8
sequenze (di un campione non è stato possibile ottenere la sequenza) ottenute dai 9
campioni prelevati presso l’azienda Beghelli ad Iragna si suddividono in due gruppi. 7
sequenze identiche sono state chiamate TI01TOB, la rimanente TI01TOC. Presso
l’azienda Giorgi a Stabio sono stati prelevati 9 campioni, le 6 sequenze ottenute
appartengono tutte all’aplotipo TI01TOB rilevato anche presso l’azienda Beghelli ad
Iragna.
I primi aplotipi di TSWV apparsi nel 2001 sono stati TI01TOB, TI01TOC e TI01TOE (3 e
5 luglio 2001).
Nel 2002 (fino al 24 giugno) è stata rilevata la presenza di TSWV in tre aziende ticinesi,
due delle quali già colpite negli anni precedenti.
Presso l’azienda Giorgi a Stabio, è stata rilevata in 14 campioni di lattuga e 4 di pomodoro
senza sintomi visibili la presenza di TSWV (campioni dell’esperimento di analisi precoce,
vedi 3.2.1.-2.). In questi 18 campioni sono stati ritrovati 7 aplotipi diversi (6 se non si
considera l’aplotipo incerto TI02TOLEM), di cui 4 nuovi. 7 sequenze, provenienti da
campioni di lattuga, sono risultate identiche all’aplotipo TI01TOC. Tre provenienti
anch’esse da campioni di lattuga e tre da campione di pomodoro sono state classificate
come appartenenti a TI01TOD. 4 sequenze sono risultate diverse da quelle degli aplotipi
già rilevati e sono quindi state classificate come nuovi aplotipi: TI02TOH è stato rilevato
su pomodoro, TI02TOLEI, TI02TOLEL e TI02TOLEM su lattuga. La distinzione
dell’aplotipo TI02LEM è incerta, dal confronto delle sequenze ottenute (forward e
reverse) non è possibile affermare con certezza l’esistenza delle mutazione che determina
il nuovo aplotipo.
37
La base G (413esimo nucleotide) indicata potrebbe in realtà essere A, se così fosse, la
sequenza sarebbe identica (sulla base del confronto dei 518 nucleotidi analizzati)
all’aplotipo TI01TOB. Anche la sequenza dell’aplotipo TI02TOLEL non è esattamente
determinata. Il nucleotide 304 potrebbe essere T invece di A, questo cambiamento non
sarebbe tuttavia comune ad alcun aplotipo conosciuto. Le altre due sostituzioni dubbie (T
in posizione 466 potrebbe essere A, mentre la base A in posizione 605 potrebbe essere G)
sarebbero, se l’interpretazione della base indicata è sbagliata, uguali alle basi delle
sequenze di tutti gli altri aplotipi. Per motivi di tempo non è stato possibile determinare le
sequenze esatte e confermare o smentire l’esistenza di questi nuovi aplotipi.
Presso l’azienda Brevi a Novazzano sono stati prelevati il 15 aprile due campioni, uno da
lattuga ed uno da lattuga foglia di quercia, unicamente per il secondo il prodotto RT-PCR
ottenuto è risultato sequenziabile ed è risultato identico a TI01TOC. La sequenza ottenuta
da foglia di pomodoro dell’unica pianta colpita da TSWV presso l’azienda All’Orto a
Muzzano il 14 maggio 2002 appartiene a TI01TOD, aplotipo già riscontrato nella azienda
nel 2001.
Dato il numero ridotto di basi delle sequenze 2002 ottenute con nested primers (518
nucleotidi), la sequenza dell’aplotipo TI01TOD risulta identica a quella di TO01TOA.
Gli aplotipi più frequenti sono TI01TOD e TI01TOC, presenti entrambi in 3 aziende.
TI01TOB e TI01TOG sono stati rilevati in due aziende, mentre TI01TOA, TI01TOE,
TI01TOF, TI02TOH, TI02TOLEI, TI02TOLEL e TI02TOLEM in una sola.
La distribuzione degli aplotipi nelle aziende nel 2001 e 2002 è rappresentata in figura 22.
2001
2002
BC
-
D
ADEFG
B
C D G H I L M*
D
-
C
Fig. 22: Distribuzione degli aplotipi di TSWV nelle aziende ticinesi colpite nel 2001 e 2002.
1. Canevascini (Tenero) TSWV solo nel 1997, nessun campione a disposizione, 2. Squillace (Coldrerio)
TSWV nel 1999 e 2000, nessun campione a disposizione, 3. All’Orto (Muzzano), 4. Giorgi (Stabio), 5.
Beghelli (Iragna), 6. Ballerini (Novazzano, Brusata), 7. Brevi (Novazzano). A: TI01TOA, B: TI01TOB, C:
TI01TOC, D: TI01TOD, E: TI01TOE, F: TI01TOF, G: TI01TOG, H: TI02TOH, I: TI02TOLEI, L:
TI02TOLEL, M*: TI02TOLEM* (aplotipo incerto), -: non è stato ritrovato TSWV fino al 24 di giugno
2002.
38
3.5.2. ANALISI FILOGENETICHE
3.5.2.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE
La differenza tra le sequenze dei vari aplotipi ticinesi varia tra 1 e 20 nucleotidi e 1 e 5
aminoacidi codificati (Tab. 21).
Gli aplotipi TI01TOA e TI01TOD hanno nomi diversi perchè dal confronto delle
sequenze di 638 nucleotidi essi risultano essere due aplotipi distinti.
La maggior parte delle sostituzioni sono sinonime, esse non portano quindi ad un
cambiamento dell’amminoacido codificato (Tab. 21).
Tab. 21: Numero di nucleotidi (su 518) (in basso a sinistra) e di aminoacidi (su 172) diversi (in alto a destra)
tra aplotipi ticinesi. Tra parentesi è indicato il numero di sostituzioni sinonime tra aplotipi ticinesi calcolato
con il metodo di Nei-Gojobori (Nei & Gojobori, 1986).
TI01TOD
TI01TOD
TI01TOA
TI02TOH
TI02LEL**
TI01TOF
TI01TOG
TI01TOC
TI02TOI
TI01TOE
TI01TOB
TI02LEM*
0 (0)
3 (0)
4 (3)
2 (2)
3 (2)
3 (3)
4 (3)
17 (17)
17 (16)
18 (16)
TI01TOA
0
3 (0)
4 (3)
2 (2)
3 (2)
3 (3)
4 (3)
17 (17)
17 (16)
18 (16)
TI02TOH TI02LEL** TI01TOF
3
1
0
3
1
0
4
3
7 (3)
1
5 (2)
6 (5)
6 (2)
7 (5)
1 (0)
6 (3)
7 (6)
1 (1)
7 (3)
8 (6)
2 (1)
20 (17)
21 (20)
17 (17)
20 (16)
21 (19)
17 (16)
21 (16)
22 (19)
18 (16)
TI01TOG
1
1
4
2
1
2 (1)
3 (1)
18 (17)
18 (16)
19 (16)
TI01TOC
0
0
3
1
0
1
1 (0)
18 (18)
18 (17)
19 (17)
TI02LEI
1
1
4
2
1
2
1
19 (18)
19 (17)
20 (17)
TI01TOE
0
0
3
1
0
1
0
1
10 (9)
11 (9)
TI02TOB
1
1
4
2
1
2
1
2
1
TI02LEM*
2
2
5
3
2
3
2
3
2
1
1 (0)
* esistenza non certa dell’aplotipo, data la presenza di una sostituzione dubbia
** sequenza non esattamente determinata, presenza di tre sostituzioni dubbie
3.5.2.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE
Sono stati calcolati tre dendogrammi basati sulle sequenze nucleotidiche, uno con gli
aplotipi 2001 (sequenze di 638 basi) (dendogramma in appendice, Fig. 1A), uno con gli
aplotipi esattamente determinati, escludendo quindi TI02LEL e TI02LEM (dendogramma
in appendice, Fig. 2A) ed un terzo comprendente tutti gli aplotipi rilevati in Ticino nel
2001 e 2002 basato su 518 basi (Fig. 23). I tre dendogrammi ottenuti sono simili.
39
TI02LEL **
66
TI02TOH
TICINO1
TI01TOD
TI01TOA
100
64 TI01TOF
TI01TOG
67
TICINO2
TI01TOC
TI02LEI
TI01TOE
99
TI01TOB
TICINO3
TI02LEM *
0.005
Fig. 23: Dendogramma basato sulla sequenza di 516 nucleotidi del gene NP di TSWV di tutti gli aplotipi
ticinesi rilevati nel 2001 e 2002. I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla statistica
bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
* esistenza non certa dell’aplotipo, data la presenza di una sostituzione dubbia, ** sequenza non esattamente
determinata, presenza di tre sostituzioni dubbie.
Gli aplotipi di TSWV presenti in Ticino possono essere suddivisi, in base alle sequenze di
nucleotidi analizzate, in 2 clades principali (Fig. 23). Il primo fortemente supportato dalla
statistica bootstrap (100% su 1000 ripetizioni) comprende gli aplotipi TI01TOA,
TI01TOC, TI01TOD, TI01TOF, TI01TOG, TI02TOH, TI02TOLEI e TI02TOLEL), il
secondo TI01TOB e TI01TOE e TI02TOLEM, esso è stato chiamato TICINO3.
Un’ulteriore suddivisione è possibile all’interno del primo clade, gli aplotipi ad esso
appartenenti sono stati suddivisi in TICINO1 (TI01TOA, TI01TOD, TI02TOH e
TI02TOLEL) e TICINO2 (TI01TOF, TI01TOG, TI01TOC e TI02TOLEI).
3.5.2.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SQUENZE AMINOACIDICHE
Sono stati calcolati tre dendogrammi, uno con gli aplotipi 2001 (sequenze tradotte di 212
aminoacidi, dendogramma in appendice), un secondo con gli aplotipi esattamente
determinati, escludendo quindi TI02LEL e TI02LEM (dendogramma in appendice) ed un
terzo comprendente tutti gli aplotipi rilevati in Ticino nel 2001 e 2002 (Fig. 24). I tre
alberi ottenuti sono simili.
La traslazione delle sequenze degli aplotipi ticinesi riduce il numero di aplotipi diversi da
11 (basati sulle sequenze nucleotidiche) a 7 (basati sulle sequenze aminoacidiche). Le
sequenze di aminoacidi codificati sono identiche per TI01TOA, TI01TOC, TI01TOD,
TI01TOE e TI01TOF. Gli aplotipi TI01TOG, TI02TOLEI, TI02TOLEL, TI01TOB e
TI02TOLEM differiscono dai primi in maniera minore di TI02TOH.
40
68
TI01TOB
TI02LEM *
TI02LEI
TI01TOG
TI02LEL *
TI01TOA
TI01TOC
TI01TOD
TI01TOE
TI01TOF
TI02TOH
0.002
Fig. 24: Dendogramma basato sulla sequenza di 212 aminoacidi del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi. I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di
1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
* esistenza non certa dell’aplotipo, data la presenza di una sostituzione dubbia, ** sequenza non esattamente
determinata, presenza di tre sostituzioni dubbie.
3.6. SEQUENZE MONDIALI DEL GENE NP
Attraverso la ricerca in banca dati (GenBank) e nella letteratura sono state trovate 37
sequenze del gene NP di TSWV (Tab 22).
Tab. 22: Sequenze NP di TSWV depositate in GenBank..
Nome
TSWVL3
Nazione
Bulgaria
Ceppo
Isolato
Ospite
Tabacco
DH37
8Hip9612
BS97
20 Da961
GD98
Bulg971
C27084
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
Bulgaria
Cechia
TSWV
DH37
8Hip 96 12
BS97
20 Da 96/1
GD98
97
C27084
Tabacco
Hippeastrum
Tabacco
Dalia
Tabacco
Pomodoro
Zantdeschia
LE 98527
TSWVD
TSWVIT
980472
TSWVGAAC
TSWVGAPP
TSWVGACC
TSWVGAMC
TSWVGATO
TSWVGAPT
TSWVGAGC
TSWVGAWC
TSWVGATC
TSWV10
TSWVBR01
Germania
Olanda
Italia
Sud Africa
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
Georgia
USA5
Brasile
LE 98/527
Lysimachia
Dalia
Pomodoro
Patata
Tabacco
Peperone
Tabacco
Tabacco
Pomodoro
Arachide
Tabacco
Tabacco
Tabacco
Arachide
Tabacco
JAP
TSWVHI 2
TSWVBL
TSWV10W
Austral#873
LP2
Giappone
Hawaii
Hawaii
Hawaii
Australia
Argentina
TSWV
TSWV
TSWV
TSWVD
Italy
T304
98 / 0472
AC
CC
MC
GC
WC
TC
TSWV10
CPNH9
L
TSWVBL
TSWV10W
873
LP2
?
?
Lattuga
?
Peperone
Pomodoro
41
Referenza
Maiss et al., 1991
de Haan et al.,1990
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Adam et al., 1996
Heinze et al., 2001
Heinze et al., 2001
Qiu et al., 1998
Vaira et al., 1995
Heinze et al., 2001
Pappu et al ,1998
Jain et al., 1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Jain et al., 1998
Jain et al., 1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Pappu et al ,1998
Qiu et al., 1998
de Haan et al., 1991
de Haan 1989, 1990
Tsuda et al., 1994
Jain et al., 1998
Jain et al., 1998
Jain et al., 1998
Roberts, 2000
Dewey et al., 1997
Accession number
D 13926
AJ297608
AJ296601
AJ297610
AJ297602
AJ297609
AJ296598
AJ296599
AJ297611
AF 020660
Z 36882
AJ296600
AF 064469
AF 048716
AF 064470
AF 064472
AF 048714
AF 048715
AF 064471
AF 064474
AF 064473
AF 020669
D 00645
AB 010997
X61799
L20953
L20887
AJ242774
U49703
LP87
Argentina
LP940
Argentina
LP941
Argentina
ER30
Argentina
TOSPOG
Taiwan2
TOSPOC
Taiwan
Spain3
Spagna
TSWVH
Hawaii
1
Citato anche come 97To97
2
Citato anche come hiL e TSWVL
3
Anonimo in GeneBank
4
Non pubblicato
5
Nessuna indicazione ulteriore
LP87
LP940
LP941
Pomodoro
Chrysanthemum
Chrysanthemum
Pomodoro
?
?
?
?
TOSPOG
TOSPOC
LC
Dewey et al., 1997
Dewey et al., 1997
Dewey et al., 1997
Dewey et al., 1997
Kato, 20004
Kato, 20004
Guerra-Sanz4
Gubba, 20004
U49704
U49705
U49706
U49708
AB038342
AB038341
X94550
AF306490
? Non conosciuto
Per l’analisi filogenetica non sono state considerate le sequenze argentine, quella
australiana ed una bulgara. Le prime (LP2, LP87, LP940, LP941 e ER30) e quella
australiana (Austral#837) sono considerevolmente più corte (rispettivamente 441 bp e 587
bp) di quelle mondiali, mentre la sequenza DH37 dalla Bulgaria termina con uno stop
codon 31 aminoacidi prima di tutte le altre sequenze mondiali.
3.7. ANALISI FILOGENETICHE
3.7.1. VARIABILITÀ DELLE SEQUENZE
Il numero di sostituzioni tra le sequenze varia tra 1 e 35 nucleotidi e 1 e 11 aminoacidi. La
maggior parte delle sostituzioni sono sinonime e non portano quindi ad un cambiamento
dell’aminoacido codificato (Tab.23).
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
0
0
0
0
0
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
6(4)
21(18)
16(13)
18(15)
17(14)
16(13)
20(17)
23(20)
18(15)
24(20)
17(13)
22(18)
17(13)
19(14)
19(14)
20(15)
21(15)
21(13)
25(17)
25(18)
21(18)
16(13)
18(15)
17(14)
16(13)
20(17)
23(20)
18(15)
24(20)
17(13)
22(18)
17(13)
19(14)
19(14)
20(15)
21(15)
21(13)
25(17)
25(18)
42
16(16)
16(16)
17(17)
16(16)
18(18)
2(2)
16(16)
9(8)
17(16)
11(10)
19(18)
19(17)
19(17)
20(18)
21(18)
19(14)
25(20)
18(14)
2(2)
1(1)
0(0)
4(4)
18(18)
2(2)
19(18)
1(0)
17(16)
5(4)
5(3)
7(5)
6(4)
7(4)
7(2)
13(8)
20(16)
3(3)
2(2)
4(4)
18(18)
2(2)
19(18)
3(2)
17(16)
7(6)
7(5)
9(7)
8(6)
9(6)
9(4)
15(10)
20(16)
1(1)
5(5)
19(19)
3(3)
20(19)
2(1)
18(17)
6(5)
6(4)
8(6)
7(5)
8(5)
8(3)
14(9)
21(17)
4(4)
18(18)
2(2)
19(18)
1(0)
17(16)
5(4)
5(3)
7(5)
6(4)
7(4)
7(2)
13(8)
20(16)
20(20)
2(2)
21(20)
5(4)
19(18)
9(8)
9(7)
11(9)
10(8)
11(8)
11(6)
15(10)
22(18)
1818)
11(10)
19(18)
13(12)
21(20)
21(19)
21(19)
22(20)
23(20)
21(16)
27(22)
20(16)
19(18)
3(2)
17(16)
7(6)
7(5)
9(7)
8(6)
9(6)
9(4)
13(8)
20(16)
20(18)
14(12)
22(20)
22(19)
22(19)
23(20)
24(20)
22(16)
26(20)
21(16)
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
2
18(16)
6(4)
6(3)
8(5)
7(4)
8(4)
8(2)
14(8)
21(16)
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
6
6
6
6
6
6
7
7
8
7
7
5
5
3
3
4
5
5
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
20(18)
20(17)
20(17)
21(18)
22(18)
22(16)
26(20)
19(14)
4(3)
6(5)
7(6)
6(4)
8(4)
14(10)
21(18)
6(4)
7(5)
4(1)
8(3)
14(9)
21(17)
6
6
6
6
6
6
7
7
8
7
7
5
5
3
3
4
5
5
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
2
6
6
6
6
6
6
7
7
8
7
7
5
5
3
3
4
5
5
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
2
2
9(7)
8(5)
10(5)
16(11)
23(19)
7
7
7
7
7
7
8
8
9
8
8
6
6
4
4
5
6
6
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
2
3
3
3
9
9
9
9
9
9
10
10
11
10
10
8
8
6
6
7
8
8
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
6
4
5
5
5
6
8
8
8
8
8
8
9
9
10
9
9
7
7
5
5
6
7
7
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
3
4
4
4
5
7
9(6)
9(4) 10(4)
15(10) 16(10) 16(18)
22(18) 23(18) 23(16) 27(20)
TSWVBR01
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
0
0
0
0
980472
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
0
0
0
Bulg97
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
0
0
20Da961
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
0
BS97
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
0
GD98
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
0
8Hip9612
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
2
3
3
TSWVL3
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
2
Spain
TI01TOB
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
6
4
4
2
2
3
C27084
TI01TOF
13(10)
15(12)
19(17)
16(14)
16(14)
17(15)
16(14)
18(16)
21(19)
16(14)
22(19)
17(14)
20(17)
19(16)
19(15)
19(15)
20(16)
21(16)
21(14)
25(18)
25(19)
TI01TOE
15(14)
17(15)
17(15)
17(16)
3(2)
3(2)
4(3)
3(2)
3(2)
19(18)
1(0)
20(18)
4(2)
18(16)
8(6)
8(5)
10(7)
9(6)
10(6)
10(4)
14(8)
21(16)
TI01TOC
12(12)
14(13)
16(14)
16(14)
7(6)
13(12)
13(12)
14(13)
13(12)
15(14)
9(8)
13(12)
10(8)
14(12)
8(6)
16(14)
16(13)
16(13)
15(12)
18(14)
18(12)
22(16)
15(10)
TI01TOD
7(4)
17(14)
19(15)
19(14)
21(16)
12(8)
18(14)
18(14)
19(15)
18(14)
20(16)
14(10)
18(14)
15(10)
19(14)
13(8)
21(16)
21(15)
21(15)
22(16)
23(16)
23(14)
27(18)
20(12)
4
4
4
4
4
4
5
5
6
5
5
3
3
1
1
TI01TOA
6(3)
5(3)
15(13)
17(14)
17(13)
19(15)
10(7)
16(13)
16(13)
17(14)
16(13)
18(15)
12(9)
16(13)
13(9)
17(13)
11(7)
19(15)
19(14)
19(14)
20(15)
21(15)
21(13)
25(17)
16(9)
3
3
3
3
3
3
4
4
5
4
4
2
2
0
JAP
TSWVBL
TSWV10W
8(4)
10(5)
9(5)
17(13)
21(16)
20(14)
22(16)
14(9)
18(13)
18(13)
19(14)
18(13)
20(15)
16(11)
18(13)
17(11)
19(13)
15(9)
21(15)
21(14)
23(16)
22(15)
23(15)
23(13)
27(17)
19(10)
3
3
3
3
3
3
4
4
5
4
4
2
2
LE98/257
20(12)
16(10)
18(11)
13(9)
23(19)
25(20)
27(21)
27(21)
14(9)
24(19)
24(19)
25(20)
24(19)
26(21)
14(9)
24(19)
19(13)
25(19)
19(13)
27(21)
27(20)
27(20)
28(21)
29(21)
27(17)
33(23)
24(17)
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
4
2
TSWVD
14(11)
22(13)
18(11)
20(12)
15(10)
25(20)
27(21)
29(22)
29(22)
18(12)
26(20)
26(20)
27(21)
26(20)
28(22)
20(14)
26(20)
21(14)
27(20)
21(14)
29(22)
29(21)
29(21)
30(22)
31(22)
29(18)
35(24)
26(18)
5
5
5
5
5
5
6
6
7
6
4
TSWVIT
8(5)
12(10)
20(12)
16(10)
18(11)
13(9)
21(17)
25(20)
25(19)
25(19)
16(11)
20(15)
22(17)
21(16)
20(15)
24(19)
18(13)
22(17)
19(13)
21(15)
19(13)
23(17)
23(16)
23(16)
24(17)
25(17)
23(13)
31(21)
24(17)
6
6
6
6
6
6
7
7
8
7
TOSPOG
10(8)
14(11)
12(10)
20(12)
16(10)
18(11)
13(9)
21(17)
25(20)
25(19)
23(17)
16(11)
20(15)
22(17)
21(16)
20(15)
24(19)
18(13)
22(17)
19(13)
21(15)
19(13)
23(17)
23(16)
23(16)
24(17)
25(17)
23(13)
29(19)
24(17)
1
1
1
1
1
1
2
2
3
TOSPOC
10(9)
4(3)
8(6)
10(9)
18(11)
14(9)
16(10)
11(8)
19(16)
23(19)
25(20)
25(20)
14(10)
20(16)
20(16)
21(17)
20(16)
22(18)
16(12)
20(16)
17(12)
21(16)
17(12)
23(18)
23(17)
23(17)
24(18)
25(18)
23(14)
29(20)
22(16)
2
2
2
2
2
2
3
3
TI01TOG
0(0)
10(9)
4(3)
8(6)
10(9)
18(11)
14(9)
16(10)
11(8)
19(16)
23(19)
25(20)
25(20)
14(10)
20(16)
20(16)
21(17)
20(16)
22(18)
16(12)
20(16)
17(12)
21(16)
17(12)
23(18)
23(17)
23(17)
24(18)
25(18)
23(14)
29(20)
22(16)
1
1
1
1
1
1
2
TSWVHI
1(1)
1(1)
9(8)
3(2)
7(5)
9(8)
17(10)
13(8)
15(9)
10(7)
18(15)
22(18)
24(19)
24(19)
13(9)
19(15)
19(15)
20(16)
19(15)
21(17)
15(11)
19(15)
16(11)
20(15)
16(11)
22(17)
22(16)
22(16)
23(17)
24(17)
22(13)
30(21)
21(15)
1
1
1
1
1
1
TSWVH
4(4)
5(5)
5(5)
9(8)
7(6)
9(7)
9(8)
17(10)
13(8)
15(9)
10(7)
20(17)
22(18)
24(19)
24(19)
13(9)
21(17)
21(17)
22(18)
21(17)
23(19)
13(9)
21(17)
16(11)
22(19)
16(11)
24(19)
24(18)
24(18)
25(19)
26(19)
24(15)
30(21)
21(15)
0
0
0
0
0
TSWVGATC
0
0
0
0
TSWV10
0
0
0
TSWVGACC
0
0
6(6)
6(6)
7(7)
7(7)
7(6)
9(8)
11(9)
9(8)
17(10)
13(8)
15(9)
10(7)
18(15)
22(18)
24(19)
22(17)
13(9)
19(15)
19(15)
20(16)
19(15)
21(17)
15(11)
19(15)
16(11)
20(15)
16(11)
20(15)
20(14)
20(14)
23(17)
22(15)
22(13)
28(19)
21(15)
TSWVGATO
TSWVGAWC
0
TSWVGAPP
TSWVGAMC
6(6)
4(4)
0(0)
1(1)
1(1)
9(8)
3(2)
7(5)
9(8)
17(10)
13(8)
15(9)
10(7)
18(15)
22(18)
24(19)
24(19)
13(9)
19(15)
19(15)
20(16)
19(15)
21(17)
15(11)
19(15)
16(11)
20(15)
16(11)
22(17)
22(16)
22(16)
23(17)
24(17)
22(13)
30(21)
21(15)
TSWVGAPT
TSWVGAGC
TSWVGAAC
TSWVGAPT
TSWVGAMC
TSWVGAWC
TSWVGAPP
TSWVGATO
TSWVGACC
TSWV10
TSWVGATC
TSWV10W
TSWVBL
TSWVH
TSWVHI
TI01TOG
JAP
TOSPOC
TOSPOG
TSWVIT
TSWVD
LE98/257
TI01TOA
TI01TOD
TI01TOC
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOB
C27084
Spain
TSWVL3
8Hip9612
GD98
BS97
20Da961
Bulg97
980472
TSWVBR01
TSWVGAAC
TSWVGAGC
Tab. 23: Numero di nucleotidi (in basso a sinistra) e di aminoacidi diversi (in alto a destra) di sequenze di
TSWV (30 sequenze mondiali ottenute in GenBank e 7 ticinesi). Tra parentesi è indicato il numero di
sostituzioni sinonime tra le sequenze calcolato con il metodo di Nei-Gojobori (Nei & Gojobori, 1986).
6
6
6
6
6
6
7
7
8
7
8
7
7
5
5
6
7
7
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
3
4
4
4
5
7
6
3.7.2. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE
Sono stati calcolati un dendogramma con 37 sequenze con lunghezza massima comune di
638 nucleotidi (7 aplotipi ticinesi e 30 sequenze mondiali ottenute in GenBank, Fig. 25) ed
uno con 41 sequenze di 518 nucleotidi (11 aplotipi ticinesi e 30 sequenze mondiali,
dendogramma in appendice). Entrambe le rappresentazioni sono simili.
Il dendogramma basato sulle sequenze di 638 nucleotidi è stato rappresentato in quanto
esso permette di osservare una più grande variabilità nelle sequenze ed è quindi più
completo. Sono quindi stati tralasciati gli aplotipi TI02TOH, TI02TOLEI, TI02TOLEL e
TI02TOLEM.
Il dendogramma calcolato (Fig. 25) si suddivide in due clades principali e comprende
inoltre l’isolato TSWVBR01 non raggruppato. Il raggruppamento delle sequenze
all’interno del clade principale non corrisponde con la vicinanza geografica delle nazioni
di provenienza. Il primo clade principale supportato dalla statisica bootstrap con un valore
di 62%, raggruppa tre clades di secondo ordine. Il primo dei quali ha un valore bootstrap
del 93% e comprende unicamente isolati provenienti dagli Stati Uniti, 9 dei quali dallo
stato della Georgia ed uno di cui non è nota la provenienza. Gli isolati sono stati rinvenuti
su colture diverse (tabacco, peperone, pomodoro ed arachide). Un secondo cladodi
secondo ordine con valore bootstrap del 79% raggruppa due aplotipi ticinesi ed uno
italiano. TI01TOE risulta più vicino all’isolato italiano (TSWVIT) di TI01TOB. Tre
(TSWV10W, TSWVBL e TSWVH) dei 4 isolati hawaiani vengono raggruppati in un
terzo clade di secondo ordine supportato da un valore bootstrap del 74%. L’isolato
TSWVHI (Hawaii) e Spain (Spagna) appartengono al clade principale, ma non vengono
associati ad alcuno dei clades precedentemente descritti.
Il secondo clade principale, supportato da un valore bootstrap dell’87%, si compone di un
clade di secondo ordine con un isolato dal Giappone (JAP) e due da Taiwan (TOSPOC e
TOSPOG e di un secondo, supportato da un valore bootstrap del 93%, comprendente un
isolato proveniente dal Sud Africa (980472) e due clades di terzo ordine debolmente
supportati dal valore bootstrap. Il primo dei quali comprende esclusivamente isolati dalla
Bulgaria (8Hip9612, 20Da961, TSWVL3, GD98, Bulg97 e BS97). Il secondo raggruppa
isolati dalla Repubblica Ceca (C27084), dalla Germania, dall’Olanda (TSWVD) ed
aplotipi ticinesi (TI01TOA, TI01TOD, TI01TOC, TI01TOF e TI01TOG).
L’aplotipo TI01TOD è identico all’isolato olandese su 638 nucleotidi analizzati.
43
TSWVGAGC
63
TSWVGAMC
69 TSWVGAPP
64
59
TSWVGAWC
TSWV10
56
USA
TSWVGACC
54
TSWVGAPT
93
TSWVGATC
TSWVGAAC
TSWVGATO
TICINO
TI01TOB
79
62
TI01TOE
95
ITALIA
TSWVIT
Spain
SPAGNA
TSWVHI
TSWV10W
74
HAWAII
TSWVBL
64
TSWVH
BRASILE
TSWVBR01
TOSPOG
96
95
TAIWAN
TOSPOC
GIAPPONE
JAP
980472
78
87
S. AFRICA
8Hip9612
20Da961
59
96
TSWVL3
51
BULGARIA
GD98
Bulg97
BS97
REP. CECA
C27084
TI01TOA
58
54
TICINO
TI01TOD
OLANDA
TSWVD
LE98/257
60
TI01TOG
TI01TOC
58
GERMANIA
TICINO
TI01TOF
0.005
Fig. 25: Dendogramma basato sulla sequenza di 638 nucleotidi del gene NP di TSWV delle sequenze
mondiali e ticinesi. I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su
un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
44
3.7.3. DENDOGRAMMI BASATI SULLE SEQUENZE AMINOACIDICHE
È stato calcolato un dendogramma con 37 sequenze con lunghezza massima comune di
212 aminoacidi (7 aplotipi ticinesi e 30 sequenze mondiali ottenute in GenBank, Fig. 26)
ed secondo con 41 sequenze di 172 aminoacidi (11 aplotipi ticinesi e 30 sequenze
mondiali ottenute in GenBank, dendogramma in appendice). Entrambe le rappresentazioni
sono simili. E’stato rappresentato il dendogramma basato sulle sequenze di 212 nucleotidi,
perchè esso permette di osservare una più grande variabilità nelle sequenze ed è quindi più
completo.
Per effetto della traslazione, il numero di isolati diversi si riduce da 35 (basati sulla
sequenza nucleotidica) a 24 (basati sulla sequenza aminoacidica).
L’albero ottenuto si suddivide in un clade, con valore bootstrap relativamente basso (56%
su 1000 ripetizioni) comprendente tutti gli isolati provenienti dalla Bulgaria (8Hip9612,
20Da961, TSWVL3, GD98, Bulg97 e BS97), i quali presentano un’elevata variabilità.
Esso raggruppa inoltre l’isolato spagnolo (Spain), ceco (C27084) e 5 dei 6 aplotipi
ticinesi. La sequenza di aminoacidi degli aplotipi TI01TOA, TI01TOC, TI01TOD,
TI01TOE e TI01TOF è identica a quella dell’isolato italiano (TSWVIT), olandese
(TSWVD) e germanico (LE98/257). Un secondo clade, fortemente supportato dalla
statistica bootstrap (93% su 1000 ripetizioni), comprende tutti gli isolati americani.
TSWVGAGC, TSWVGAAC, TSWVGAPT, TSWVGAMC, TSWVGAWC e
TSWVGAPP hanno identica composizione di aminoacidi. TASWVGATO, TSWVGACC,
TSWVGATC e TSWV10 presentano differenze. Un terzo clade raggruppa tre isolati
hawaiani (TSWV10W, TSWVH e TSWVBL). Il quarto isolato proveniente dalle Hawaii
(TSWVHI) non viene è incluso nel clade precedentemente descritto. La sequenza
aminoacidica dell’isolato è identica a quella dell’aplotipo ticinese TI01TOG. Il quarto
clade (valore bootstrap 69%) comprende i due isolati provenienti da Taiwan (TOSPOC e
TOSPOG). L’isolato giapponese (JAP) non viene incluso in nessun clade.
Il raggruppamento delle sequenze aminoacidiche corrisponde, al contrario di quanto
ottenuto con le sequenze nucleotidiche, con la vicinanza geografica delle nazioni di
provenienza delle sequenze. I clade coincidono quasi esattamente con i continenti. Il
primo clade descritto raggruppa tutte le sequenze europee (eccetto TI01TOG), la sequenza
proveniente dal Sud Africa (980472) e dal Brasile (TSWVBR01). Il secondo ed il terzo
clades comprendono sequenze provenienti dall’America ed il quarto dall’Asia.
45
980472
SUD AFRICA
BRASILE
TSWVBR01
AFRICA
S. AMERICA
GD98
20Da961
BS97
Bulg97
BULGARIA
TSWVL3
8Hip9612
56
SPAGNA
Spain
C27084
REP. CECA
EUROPA
TI01TOB
TI01TOA
TI01TOC
TI01TOD
TI01TOE
TI01TOF
TSWVIT
TSWVD
LE98/257
TICINO
ITALIA
OLANDA
GERMANIA
TSWVGAGC
TSWVGAAC
93 TSWVGAPT
TSWVGAMC
TSWVGAWC
GEORGIA
TSWVGAPP
USA
TSWVGATO
TSWVGACC
TSWVGATC
TSWV10
TSWV10W
63
TSWVH
HAWAII
TSWVBL
TSWVHI
TICINO *
TI01TOG
GIAPPONE
JAP
69
ASIA
TOSPOC
TAIWAN
TOSPOG
0.005
Fig. 26: Dendogramma basato sulla sequenza di aminoacidi del gene NP di TSWV delle sequenze mondiali
e ticinesi. I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di
1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. La presenza dell’aplotipo
ticinese tra gli isolati asiatici è stata indicata con *.
46
4. DISCUSSIONE
4.1. METODOLOGIA
Il metodo utilizzato è risultato molto sensibile nel diagnosticare la presenza di TSWV in
foglie di pomodoro ed insalata (lattuga e lattuga foglia di quercia) in presenza di sintomi.
L’estrazione di RNA con il kit Nucleospin Multi-96 Plant (Macherey-Nagel, Oensingen,
Svizzera), il quale permette di estrarre più campioni contemporaneamente e la successiva
sintesi di cDNA con Reverse Transcriptase AMV (Roche, Mannheim, Germania) e
riamplificazione con nested primers sono risultati i metodi più efficaci.
Le bande osservate su gel, di grandezza corrispondente alle dimensioni attese e l’elevata
identità delle loro sequenze determinate con le sequenze mondiali pubblicate, indicano che
il prodotto ottenuto è il risultato della trascrizione inversa e successiva amplificazione del
genoma virale.
Il metodo dei miscugli (bulks) applicato per ridurre il numero di analisi è risultato molto
efficace per lattuga e meno per pomodoro. Il numero di reazioni RT-PCR è stato ridotto
(l’analisi dei singoli campioni avrebbe comportato per ciascuna coltura 48 reazioni),
tuttavia non in maniera così importante come ipotizzato al momento dello sviluppo della
metodologia, quando però si supponeva la presenza di un numero inferiore di piante
infette. Per la lattuga sono state effettuate 34 reazioni RT-PCR, 14 dei bulk e 20 per
determinare i singoli campioni positivi. Per il pomodoro sono state necessarie 36 reazioni
(14 dei bulk, 10 dei singoli campioni potenzialmente positivi e 12 per il controllo dei bulk
B e D).
Attraverso l’analisi dei singoli campioni di pomodoro presenti nel bulk B risultato
positivo, non è stato ottenuta alcuna banda, indicando che nessun campione era infetto.
Inoltre dall’analisi dei campioni del bulk D è risultato che in due di essi (4 e 20) TSWV
era presente, sorprendentemente l’analisi dei bulks 1 e 3 (dove erano presenti i campioni) è
risultata negativa. Se si esclude un errore metodologico, queste discordanze potrebbero
essere determinate dalla differenza di concentrazione di RNA dei singoli campioni o dei
bulk, la quale fa sì che in quelli delle righe sia presente RNA sufficiente (0,83 µl di RNA
totale di ogni campione per reazione), mentre in quelli delle colonne no (0,63 µl di RNA
totale di ogni campione per reazione).
Se si considera che il metodo applicato non sempre rileva la presenza di campioni positivi
nei bulks, e che quindi il numero di piante ritenute positive è unicamente il numero
minimo, si può concludere che la sua efficacia non è completamente soddisfacente.
Il metodo potrebbe quindi non essere adatto per l’analisi di campioni in cui le
concentrazioni del virus sono molto basse. Esso potrebbe inoltre non rivelarsi efficace, in
casi in cui si supponga che vi sia un grande numero di piante infette, in quanto si
renderebbe comunque necessario un elevato numero di analisi singole.
47
4.2. DIAGNOSI PRECOCE ED EPIDEMIOLOGIA
In nessuno dei campioni di lattuga e pomodoro raccolti per l’esperimento di diagnosi
precoce presso l’azienda Giorgi sono stati osservati sintomi della presenza di TSWV.
Tuttavia, a riprova della sensibilità (ridotta per pomodoro) del metodo di diagnosi
applicato, 14 (29,2%) campioni di foglia di lattuga e 7 (14,6%) di pomodoro (su 48
campioni analizzati per ciascuna coltura) sono risultati positivi.
La disposizione delle piante di lattuga in cui è stata diagnosticata tramite RT-PCR la
presenza di TSWV all’interno del tunnel non sembra seguire alcuna logica, è però presente
un numero leggermente maggiore di piante infette nella metà sud (8 su 14 piante totali) e 3
piante sono vicine (9, 11 e 15) (Fig.13). La ripartizione delle piante infette (singole
infezioni e non un focolaio che si è esteso nel tempo) lascia ipotizzare che l’infezione sia
primaria e che sia avvenuta tramite insetti viruliferi provenienti dall’esterno o da materiale
vegetale con TSWV al momento della messa a dimora delle piante. L’analisi dei campioni
positivi dei prelievi precedenti il sesto, non permetterebbe di smentire con certezza
quest’ultima ipotesi, dato che il primo prelievo non coincide con la data di messa a dimora
delle piante. Essa permetterebbe comunque di osservare la ripartizione delle piante infette
nel tempo e di formulare quindi un’ipotesi più fondata sulla possibile fonte.
Attraverso il sequnziamento dei 14 campioni di lattuga sono stati ritrovati 6 aplotipi di
TSWV. Il numero di catture di F. occidentalis e T. tabaci conferma la presenza di più
insetti all’interno del tunnel, inoltre è possibile che nell’insetto vettore siano presenti
contemporaneamente più ceppi del virus (Gallitelli & Davino, 1998), questa potrebbe
essere una possibile spiegazione della presenza delle tre piante vicine con aplotipi diversi.
Gli aplotipi più frequentemente osservati sono TI01TOC (7 campioni) e TI01TOD (3
campioni), essi sono distribuiti casualmente all’interno del tunnel (Fig. 13). Gli aplotipi
TI01TOG, TI02LEI, TI02TOLEL e TI02TOLEM sono stati ritrovati ognuno in un unico
campione. Unicamente l’aplotipo TI02TOLEM è simile (se non identico) ai campioni
2001
Le piante di pomodoro infette sono risultate 7 (14,6%) su 48 campioni provenienti
dall’ultimo prelievo. 2 piante con TSWV sono state rilevate nella sezione testimone (dove
rappresentano il 5,6% delle 36 piante presenti). Le altre 5 piante infette si trovano nella
zona trattata secondo la strategia basata sulla soglia di tolleranza, esse rappresentano il
31,3% delle piante analizzate nella sezione (Fig. 16). Esse sono vicino all’entrata sud,
tuttavia quest’ osservazione non è indicativa in quanto sono stati prelevati unicamente 12
campioni (Fig.16). Le altre piante della sezione non sono state analizzate dato che la
formulazione iniziale dell’esperimento prevedeva unicamente l’analisi di campioni della
sezione testimone e che questi campioni sono stati prelevati unicamente perchè il numero
di piante non trattate era insufficiente. Tuttavia è possibile ipotizzare che la maggior parte
degli insetti viruliferi sia entrato dalla parte sud, dove è presente un altro tunnel (colpito in
maniera più forte nella stagione 2001). Attraverso l’analisi dei prelievi precedenti l’ultimo,
è stata determinata l’evoluzioni del numero di piante infette nel tempo (Tab. 19). In
nessuna delle piante del primo prelievo è stata rilevata la presenza di TSWV, ciò indica
che, se si escludono concentrazioni di TSWV non detettabili, le piantine erano prive di
TSWV al momento del trapianto. I campioni 39 e 41 sono risultati positivi nell’analisi del
secondo prelievo, essi appartengono rispettivamente agli aplotipi TI01TOD e TI02TOH.
La settimana seguente, una terza pianta (40) è risultata infetta da TSWV appartenente
all’aplotipo TI01TOD, essa non si trova nelle immediate vicinanze della pianta infetta
dallo stesso aplotipo bensì in quella infetta da TI02TOH. Il 25 maggio 2002 (ultimo
prelievo) le piante con TSWV nella sezione secondo strategia erano 5, tre delle quali
48
appartenenti a TI01TOD (39, 40 e 47) una a TI02TOH ed una quinta (44) di cui non è
stata determinata la sequenza, perchè essa è risultata positiva unicamente in un’analisi
successiva e non è più stata sequenziata per mancanza di tempo. Le piante 44 e 47, si
trovano l’una di fianco all’altra vicino a 41 (Fig.19). Come descritto in precedenza sono
risultati positivi anche due campioni (4 e 20) della sezione testimone, di cui tuttavia non è
stata determinata la sequenza per mancanza di tempo. La conoscenza del tipo di aplotipo
di questi campioni avrebbe potuto permettere di capire se i tripidi si sono mossi all’interno
del tunnel, malgrado le reti di separazione (poste per evitare appunto questo) o se essi
siano venuti da fuori (parte nord) portando aplotipi diversi. Un dicorsco completo sulla
ripartizione degli aplotipi non è possibile, in quanto, come indicato in precedenza, le
piante scelte non sono indicative. Ignorando il campione 44, si potrebbe supporre che un
tripide si sia nutrito successivamente su tre piante diverse (39, 40 e 47, Tab.19)
infettandole. Mentre l’insetto che ha infetto la pianta 41, si è nutrito solo di questa e poi è
migrato o è morto. Si può concludere che, come osservato per la lattuga, si tratta di
un’infezione primaria, data la presenza di più aplotipi (TI01TOA e TI02TOH) in piante
che non formano un cluster distinto all’interno della sezione.
L’aplotipo più frequentemente ritrovato su pomodoro nel tunnel è TI01TOD, il quale era
stato già riscontrato in tre campioni su 14 di lattuga con TSWV. Questo sembrerebbe
indicare che Stellaria media (trattata con diserbante ed insetticida e presente ai bordi
interni del tunnel ed in particolare vicino alla pianta 39), possa aver funto da serbatoio nel
passaggio tra le due colture. Tuttavia non è stata riscontrata la presenza di TI01TOC
fortemente presente nella lattuga (in 7 campioni) e neppure degli altri aplotipi, indicando
che i tripidi vettori sono migrati in altre parcelle o che TSWV non sia ancora detettabile.
Piante infestanti come S. media, potrebbero avere un ruolo importante durante l’inverno o
nel periodo tra una coltura e l’altra quando la parcella resta vuota. Groves et al. (2001)
riporta che il 75% delle piante di S. media mantiene l’infezione durante l’inverno ed indica
che la trasmissione tramite tripidi (studio svolto con F. fusca) sviluppatisi su piante infette
raggiunge il 18% (gli insetti sono stati prelevati da piante sulle quali hanno svernato, e la
capacità di infettare è stata determinata su petunia, petunia leaf assay). L’importanza dei
tripidi presenti nel suolo al di sotto delle piante infette sembra essere di importanza ridotta.
Lo sviluppo della popolazione durante l’inverno su piante serbatoio e la successiva
diffusione non sono ancora pienamente compresi (Groves et al., 2001). Liberare
completamente il tunnel dalle piante infestanti tra due colture ospiti di TSWV potrebbe
essere una misura importante per prevenire la diffusione di TSWV da una coltura alla
successiva. L’aumento del numero delle piante di pomodoro infette segue l’andamento
della popolazione di insetti vettori. Tuttavia il numero di catture con le trappole
cromotropiche non è completamente indicativo, in quanto tra queste sono presenti tripidi
viruliferi che hanno acquisito il virus nello stadio larvale e tripidi che lo hanno ingerito
nello stadio adulto e non sono quindi in grado di trasmetterlo (van de Wetering et al.,
1996). Il problema della determinazione della virulenza o avirulenza dell’insetto vettore
può venir risolto tramite l’uso di piante spia come varietà di Petunia x hybrida “Summer
Madness”, “Super Magic Coral” e “Red Cloud”. In queste piante l’infezione da TSWV si
evidenzia con la comparsa di lesioni necrotiche a contorni scuri intorno alla cicatrice di
alimentazione pochi giorni dopo l’infezione (Gallitelli & Davino, 1998).
L’assenza di sintomi sulla lattuga potrebbe essere attribuibile al fatto che le piante siano
state infette da meno di una settimana (tempo necessario a partire dall’infezione per
osservare i sintomi su lattuga indicato da Yudin et al. (1990)), l’analisi dei prelievi
precedenti premetterebbe di verificare l’ipotesi. Per i campioni di pomodoro questa ipotesi
non è valida in quanto è stato dettato TSWV in due campioni prelevati tre settimane
49
prima, le cui piante non hanno finora (24 giugno 2002) mostrato sintomi. Nell’azienda
sono stati rilevati il 14 giugno 2002, in due tunnel relativamente vicini a quello da cui
sono stati prelevati i campioni, circa 30 piante di pomodoro con sintomi evidenti di
TSWV. Le piante dell’esperimento di diagnosi precoce sono state messe a dimora più
tardi (approssimativamente due settimane) e sono quindi meno sviluppate delle prime,
questo fattore potrebbe determinare l’assenza di sintomi (Jermini, comunicazione
personale).
Data l’impossibilità di determinare quando l’insetto si è nutrito della pianta analizzata
infettandola, non è possibile indicare dopo quanto tempo dall’infezione la presenza del
virus è rilevabile attraverso RT-PCR.
4.3. TSWV IN TICINO
In Ticino è presente un’elevata variabilità di TSWV. In campioni prelevati in 5 aziende
orticole sull’arco di soli due anni sono stati riscontrati 11 diversi aplotipi di TSWV (Tab.
20). Le differenze osservate nelle sequenze nucleotidiche variano da minimo 1 a massimo
20 basi mutate. Le sequenze tradotte differiscono da 0 a 5 aminoacidi (Tab. 21) (7 diversi
aplotipi basati sulle sequenze aminoacidiche) indicando un’elevata conservazione come
osservato da de Àvila et al. (1993) e Vaira et al. (1994) per isolati virali provenienti da
diverse zone distanti del mondo. Ciò sembra riflettere una limitazione della variazione sia
dell’RNA che degli aminoacidi (Vaira et al., 1994).
Gli aplotipi si suddividono in tre gruppi principali di sequenze con sostituzioni simili (Fig.
23). Il primo (TICINO1) raggruppa due aplotipi rilevati la prima volta nel 2001
(TI01TOA e TI01TOD, risultano identiche dal confronto di sequenze di 516 nucleotidi) e
due apparsi nel 2002 ognuno in un unico campione (TI02LEL su lattuga e TI02TOH su
pomodoro) (Tab. 20). Vista la similitudine di TI02LEL e TI02TOH (rispettivamente 4 e 3
nucleotidi e 1 e 3 aminoacidi differenti. Tab.21) con gli aplotipi TI01TOA e TI01TOD,
questi aplotipi potrebbero essere stati generati da mutazioni delle sequenze osservate
l’anno precedente (TI01TOA e TI01TOD). Il secondo gruppo, indicato come TICINO2, è
evolutivamente vicino al gruppo TICINO1. Esso comprende tre aplotipi riscontrati la
prima volta nel 2001 su pomodoro (TI01TOC, TI01TOF, TI01TOG) ed uno apparso nel
2002 su lattuga (TI02LEI). Anche in questo caso si può supporre che esso sia stato
generato da una singola mutazione da TI01TOC visto che i due aplotipi si differenziano
per un singolo nucleotide ed un singolo aminoacido (Tab. 21). Il terzo gruppo, diverso dai
primi due, raggruppa anch’esso due aplotipi osservati la prima volta nel 2001 (TI01TOB e
TI01TOE) ed uno l’anno seguente (TI02LEM, che potrebbe essere identico a TI01TOB) il
quale si differenzia da TI01TOB in un base ed in un aminoacido (Tab 21).
Gli aplotipi più frequenti in Ticino sono TI01TOC e TI01TOD entrambi sono presenti in
tre delle 5 aziende, rispettivamente in 15 e 12 campioni su di un totale di 44 campioni
(Tab. 20). TSWVD è identico all’isolato olandese (Fig.25), il quale è indicato da Qiu et al.
(1998) come aplotipo con S RNA dominante su S RNA di TSWV10 (USA). Nel lavoro
descritto da Qiu et al. (1998) è stato sviluppato un metodo per associare specifici segmenti
genomici a fenotipi virali e studiare i fattori che influenzano il riassortimento in TSWV.
Gli isolati riassortanti sono stati generati inoculando coppie di isolati di TSWV (TSWVD,
TSWV10 o TSWVMD, non è presente alcuna ulteriore indicazione sull’ultimo isolato).
L’origine parentale di ogni segmento ottenuto tramite l’inoculazione doppia è stata
50
determinata tramite segment specific RFLPs. In questo modo è stato determinato che i
segmenti virali vengono scambiati in modo non aleatorio e che S RNA di TSWV è
dominante su S RNA di TSWV10. La lunghezza dell’IGR (intergenic region) di S RNA è
correlata con la competitività di questo segmento. Questa dominanza potrebbe essere un
fattore che determina l’elevata frequenza dell’aplotipo in Ticino.
Dal confronto delle sequenze nucleotidiche degli aplotipi ticinesi con quelle degli isolati
mondiali (Fig. 25), risulta che gli aplotipi appartenenti al gruppo TICINO1 sono vicini
all’isolato della Repubblica Ceca C27084, prelevato da Zantdeschia (calla) e TI01TOD è
identico (sulla base del confronto di 638 nucleotidi) all’isolato olandese TSWVD isolato
da dalia. Gli aplotipi del gruppo TICINO2 sono vicini all’isolato germanico, LE98/257
isolato da Lysimachia. Gli aplotipi del gruppo TICINO3 sono simili all’isolato italiano
TSWVIT prelevato da pomodoro. Dall’analisi della nazione di provenienza delle piantine
colpite, è ipotizzabile un collegamento con l’aplotipo ritrovato (Tab. 24).
Tab. 24: Anno, azienda, località, coltura e nazione di provenienza delle piante colpite da TSWV
Anno
1997
1999
2000
2001
2002
Azienda
Canevascini
Squillace
All’Orto
Squillace
Squillace
Giorgi
All’Orto
All’Orto
Giorgi
Giorgi
Beghelli
All’Orto
Ballerini
Giorgi
Brevi
Brevi
All’Orto
Giorgi
Località
Tenero
Coldrerio
Muzzano
Coldrerio
Coldrerio
Stabio
Muzzano
Muzzano
Stabio
Stabio
Iragna
Muzzano
Novazzano
Stabio
Novazzano
Novazzano
Muzzano
Stabio
Coltura
Pomodoro
Lattuga
Pomodoro
Pomodoro
Lattuga
Pomodoro
Lattuga
Batavia
Lattuga
Pomodoro
Pomodoro
Pomodoro
Pomodoro
Lattuga
Lattuga foglia di quercia
Lattuga
Pomodoro
Pomodoro
Provenienza
Olanda
Italia
Olanda
Italia
Italia
Italia
Ticino
Ticino
Italia
Italia
Olanda
Italia
Italia
Italia
Olanda
Olanda
Italia
Italia
Nell’azienda All’Orto sono stati osservati nel 2001 in 7 campioni analizzati 5 diversi
aplotipi (TI01TOA, TI01TOD, TI01TOE, TI01TOF e TI01TOG), nell’unico campione del
2002 è stato ritrovato l’aplotipo TI01TOD (Tab. 20). Questa grande variabilità potrebbe
venir spiegata dall’acquisto di materiale da diverse nazioni (Olanda ed Italia. Tab. 24),
dallo scambio di prodotti orticoli e piantine con Beghelli e dalla presenza di TSWV
nell’azienda da tre anni.
E’ ipotizzabile che nel 2000, tramite l’acquisto di piantine di pomodoro di provenienza
olandese, sia stato importato nell’azienda TSWV appartenente all’isolato olandese
TSWVD (identico a TI01TOD). L’aplotipo TI01TOA, molto simile a TI01TOD potrebbe
essere una mutazione del primo. Con l’acquisto di piantine italiane nel 2001 potrebbe
essere stato importato l’aplotipo TI01TOE, il quale si distingue da TSWVIT (Italia) in
solamente 2 nucleotidi e le cui sequenze aminoacidiche sono identiche (su 212
aminoacidi) (Tab.23). Gli aplotipi TI01TOF e TI01TOG potrebbero essere stati introdotti
nell’azienda da materiale infetto o tripidi viruliferi provenienti da Beghelli, presso il quale
è presente l’aplotipo simile TI01TOC (Tab. 20). Anche TI01TOE potrebbe provenire da
Beghelli.
51
Presso l’azienda Giorgi è stato ritrovato nel 2001, in 7 campioni analizzati, unicamente
l’aplotipo TI01TOB (Tab. 20), simile all’isolato italiano TSWVIT (Tab.24). Dato che le
piantine erano state acquistate in Italia (Tab. 24) è ipotizzabile l’introduzione della
malattia tramite quest’ultime. Nel 2002, in 18 campioni di lattuga e pomodoro analizzati,
sono stati ritrovati 7 aplotipi, di cui 5 nuovi (se si considera TI02LEM diverso da
TI01TOB). La presenza di così tanti aplotipi molto diversi (TI01TOC, TIOITOG e
TI02LEI appartenenti al gruppo TICINO2 e TI01TOD, TI02TOH e TI02TOLEL
appartenenti al gruppo TICINO1) da quello riscontrato la stagione precedente è
sorprendente. Praticamente solo in un campione è stato ritrovato un aplotipo simile
(TI02LEM). Sono possibili più ipotesi per spiegare ciò. È possibile che nel 2001 fossero
presenti aplotipi che non sono stati ritrovati nei campioni analizzati o che il materiale
acquistato nel 2002 fosse infetto. È anche possibile che l’introduzione di nuovi aplotipi sia
avvenuta tramite insetti vettori provenienti da un’azienda con TSWV nelle vicinanze o che
le distanze percorse dai tripidi trasportati dal vento siano estremamente grandi (e che gli
aplotipi provengano quindi dall’azienda All’Orto, distante ca 16 km). È anche possibile
che esista un’altra via di trasmissione sconosciuta. La prima ipotesi sembra essere la più
probabile, essa non spiega comunque l’esistenza di aplotipi così diversi (appartenenti ai tre
gruppi di aplotipi ticinesi). Le piante acquistate nel 2001 provenivano dall’Italia, è quindi
curioso che esse fossero infette da TSWV appartenenti ad aplotipi simili all’isolato
olandese e tedesco. Tuttavia, dato che il venditore delle piantine commercia anche piante
ornamentali (non è possibile sapere se il materiale venduto sia esclusivamente di
produzione propria o venga importato) e dato che anche in Italia è ipotizzabile la presenza
di più isolati diversi, è possibile l’importazione di TSWV con sequenze simili a quelle
degli isolati stranieri. Per la terza ipotesi, va notato che il 15 aprile 2002 sono state
ritrovate presso l’azienda Brevi (situata a circa 3 km di distanza), piante di lattuga e
lattuga foglia di quercia di provenienza olandese, presentanti i sintomi di TSWV. La loro
distribuzione all’interno del tunnel era condensata vicino alle entrate, lasciando supporre
che la trasmissione si avvenuta tramite tripidi vettori provenienti dall’esterno. Ciò lascia
supporre che essi fossero presenti nella zona. Dall’analisi dell’unica sequenza ottenuta, è
stata determinata la presenza dell’aplotipo TI01TOC. Non è stata ritrovata nella letteratura
alcuna indicazione sulle distanze massime percorse dai tripidi trasportati dal vento e non è
quindi possibile accettare o smentire l’ipotesi che i tripidi viruliferi (infetti da TSWV
appartenente agli aplotipi TI01TOD, TI01TOF e TI01TOG) siano stati trasportati dal
vento. È anche possibile che i nuovi aplotipi siano stati introdotti nell’azienda tramite altri
vettori, come ad esempio l’uomo.
Presso l’azienda Ballerini è stata rinvenuta la presenza nel 2001 di più piante presentanti i
sintomi di TSWV. Dall’analisi dell’unica sequenza ottenuta, essa è risultata appartenere
all’aplotipo TI01TOD. Ciò potrebbe indicare che tripidi infetti siano stati trasportati dal
vento dall’azienda Ballerini a Giorgi (esse si trovano a soli 2 km di distanza). Ciò può
anche significare che in Italia (nazione di provenienza delle piantine) siano presenti più
aplotipi diversi. Va inoltre notato che nelle vicinanze dell’azienda si trova un centro di
giardinaggio, il quale potrebbe essere stato la fonte dell’infezione. Al momento del
rilevamento delle piante infette, è stato notato sul composto in un orto privato nelle
vicinanze dei tunnel dell’azienda, una pianta di pomodoro estirpata con sintomi che con
quasi certezza possono essere imputati a TSWV (Jermini, comunicazione personale). Non
è possibile determinare se questa pianta sia stata l’inoculo dell’infezione o se essa è stata
colpita successivamente.
52
Fino al 24 giugno 2002 non è stato segnalato nessun nuovo caso di TSWV nell’azienda, lo
stesso vale per Beghelli.
Dalle osservazioni fatte risulta che l’introduzione del virus tramite l’acquisto di materiale
infetto è ipotizzabile, risulta quindi inspiegabile il fatto che esso non sia stato riscontrato il
altre aziende che si sono fornite presso la stessa ditta.
4.4. TSWV NEL MONDO
Eterogeneità e rapida adattabilità sono due caratteristiche fenotipiche importanti che
distinguono TSWV da altri fitovirus (Heinze et al., 2001).
La variabilità degli isolati di TSWV riportati nella letteratura è grande, mantenendo
tuttavia un elevato livello di conservazione (de Àvila et al., 1993, Vaira et al., 1994). Le
differenze tra gli isolati variano da 0 a 35 nucleotidi (su di un totale di 638 basi) (Tab. 23).
Le sequenze aminoacidiche si differenziano per un minimo di 0 ed un massimo di 11
aminoacidi (Tab. 23).
Come già riscontrato da Jain et al. (1998), il dendogramma degli isolati mondiali ottenuto
con le sequenze nucleotidiche riflette quello ottenuto per le sequenze aminoacidiche. In
entrambe le rappresentazioni risulta evidente una suddivisione per nazione di provenienza,
mentre non si nota alcuna correlazione con la pianta ospite da cui è stato prelevato
l’isolato (Fig. 25 e 26). Questa suddivisione geografica degli isolati è ancora più evidente
nelle sequenze traslate di aminoacidi. Infatti in esso si nota che i clades raggruppano gli
isolati oltre che per nazione anche per continente di provenienza, sebbene ciò non è
sempre supportato da un elevato valore bootstrap (Fig. 26). Questa correlazione tra
similitudine delle sequenze ed origine geografica è stato riportato da Tsompana et al.
(2001). Lo stesso è stato osservato da Bhat et al. (1999) confrontando sequenze dalla
Georgia e dalla Florida con sequenze dell’isolato TSWVBR01 (Brasile) e JAP
(Giappone). La forte omologia delle sequenze aminoacidiche di C27084 (Repubblica
Ceca), TSWVD (Olanda) e TSWVIT (Italia) potrebbe essere determinata, secondo Heinze
et al. (2000), dal vettore o dalle piante ospiti simili o essere dovuto ad un antenato
comune. Un’eccezione è rappresentata dall’aplotipo ticinese TI01TOG, la cui sequenza
nucleotidica è simile a quella ticinese del gruppo TICINO2, mentre la sequenza
aminoacidica è identica a quella dell’isolato hawaiano TSWVHI, indicando che mutazioni
delle sequenze sono possibili ma che esse devono sempre riflettere un certo pattern
aminoacidico.
Dal confronto serologico degli isolati TSWVBR01 (Brasile) e TSWVL3 (Bulgaria),
relativamente distanti nel dendogramma dei nucleotidi (Fig. 25), ma presenti nello stesso
clade basato sulle sequenze aminoacidiche (Fig. 26), è stato rilevato che essi sono
serologicamente simili (Maiss et al., 1991). Mentre Qiu et al. (1998), ha osservato
attraverso il confronto degli isolati TSWVD (Olanda) e TSWV10 (USA), distanti in
entrambi i dendogrammi, una sintomatologia diversa su Cucumis sativum cv. National
Pickling. I sintomi causati dall’isolato olandese infatti si presentano come lesioni locali di
0,3 mm di diametro, mentre quelli di TSWV10 come lesioni di 1,2 mm. Una diversa
sintomatologia è stata osservata anche da Antignus et al. (1997) nel confronto di isolati
israeliani, serologicamente identici tra loro (di cui non è presente alcuna ulteriore
53
indicazione di letteratura), con l’isolato TSWVBR01. I sintomi causati dagli isolati
israeliani sono simili a quelli provocati dagli isolati europei.
Attraverso l’analisi delle sequenze IGR di M RNA (Bhat et al., 1999) e delle sequenze del
gene NSm (Silva et al., 2001) è risultato un quadro simile a quello ottenuto con NP,
suggerendo che le proteine codificate riflettono l’evoluzione del virus. Inoltre l’analisi
delle sequenze IGR di S RNA conferma il clade georgiano (Qiu, non pubblicato, citato in
Tsompana et al., 2001).
4.5. OUTLOOK
4.5.1. CAMPIONI 2002
L’analisi di piante ritrovate infette nel corso del 2002 permetterebbe di determinare se in
Ticino sono presenti ulteriori nuovi aplotipi di TSWV e di comprendere in maniera più
precisa come avviene la loro distribuzione nelle varie aziende. Attraverso l’osservazione e
la descrizione dei sintomi osservati e la successiva analisi del materiale prelevato, si
potrebbe tramite RT-PCR, determinare se anche in Ticino esista una correlazione tra
aplotipo e sintomi manifestati, come indicato da Qiu et al. (1998).
Una conseguenza diretta delle mutazioni delle sequenze potrebbe essere la capacità di
infettare altre specie orticole, come indicato nella letteratura (cetriolo, melanzana,
peperone, patata,…). L’osservazione visiva di colture che non siano pomodoro ed insalata
nelle aziende in cui TSWV è presente permetterebbe di determinare se c’è un’ evoluzione
in questo senso.
4.5.2. ANALISI DEL GENE L
L’analisi delle sequenze del gene L permetterebbe di determinare se oltre alle sostituzioni
avvenute in Ticino, sono avvenuti anche dei riassortimenti genetici come indicato da
Moyer & Qiu (1996). Quest’ulteriore informazione permetterebbe di comprendere in
maniera più precisa la distribuzione dei vari aplotipi. La combinazione dei primers NP ed
L nella stessa reazione (come eseguito da Mumford et al. (1996) con primers S specifici
per INSV e primers L per TSWV) permetterebbe di ridurre considerevolmente il numero
di reazioni ciò renderebbe però necessaria una purificazione dei due prodotti da gel.
Il numero di sequenze del gene L in GenBank non è elevato come per NP, un confronto
con altri isolati mondiali risulterebbe quindi più difficile.
4.5.3. MONITORAGGIO CON PIANTE SPIA
Piante spia, come varietà di Petunia x hybrida “Summer Madness”, “Super Magic Coral”
e “Red Cloud”, indicate da Gallitelli & Davino (1998) potrebbero venir utilizzate per
monitorare la presenza di tripidi viruliferi all’interno dei tunnel. Bisognerebbe innanzitutto
determinare se queste piante mostrano realmente i sintomi descritti (lesioni necrotiche a
contorni scuri intorno alla cicatrice di alimentazione pochi giorni dopo l’infezione) se
infette con gli aplotipi presenti in Ticino. E si dovrebbe inoltre verificare tramite RT-PCR
se si tratta realmente di TSWV. Per determinare le preferenze dei tripidi si potrebbero
54
mettere contemporaneamente in una parcella piante spia appartenenti a diverse varietà
indicate e piante ospiti di TSWV. Attraverso l’analisi di prelievi di foglie effettuati ad
intervalli regolari si potrebbe determinare in quale pianta viene detettata prima tramite RTPCR la presenza di TSWV. Questa informazione potrebbe indicare la preferenza del
vettore o una più rapida replicazione del virus nella pianta ospite.
Gallitelli & Davino (1998) indicano che l’attrattività delle piante può essere migliorata
dotando il tutore di strisce cromotropiche azzurre, non adesive.
Per determinare una relazione numerica tra il numero di insetti presenti ed il numero di
lesioni si potrebbe inizialmente monitorare contemporaneamente la presenza dell’insetto
con piante spia e trappole cromotropiche.
L’analisi delle singole lesioni riscontrate sulle piante spia, permetterebbe di osservare un
numero più elevato di aplotipi con la certezza di analizzare materiale infetto, facendo
quindi un numero inferiore di analisi. Inoltre posando più piante in più parcelle
dell’azienda si potrebbe determinare la diffusione del virus nello spazio e nel tempo.
Le piante spia permetterebbero di conoscere il momento in cui gli insetti infetti sono
presenti nel tunnel, questa informazione permetterebbe di determinare esattamente dopo
quanto tempo dall’infezione è possibile rilevare la presenza di TSWV tramite RT-PCR.
4.5.4. PIANTE SPIA E TRATTAMENTI INSETTICIDI
Si potrebbe sviluppare una strategia di trattamento insetticida basata sul monitoraggio con
le piante spia. Essa permetterebbe un intervento più mirato, in quanto si procederebbe al
trattamento unicamente in presenza di tripidi infetti.
4.5.5. ANALISI DEI TRIPIDI VETTORI
Attraverso l’estrazione di RNA dai tripidi [metodi descritti da Boonham et al. (2002)]
delle prime catture delle trappole cromotropiche (2001 e 2002) e successiva RT-PCR si
potrebbe determinare di quale aplotipo l’insetto fosse vettore e comprendere quindi la sua
provenienza. Questa informazione non sarebbe tuttavia completamente indicativa, in
quanto il prodotto amplificato potrebbe essere stato assunto dall’insetto in stadio adulto e
l’insetto non sarebbe in questo caso vettore.
4.5.6. ANALISI DI PIANTE INFESTANTI CHE SVERNANO NEI TUNNEL
Attraverso l’analisi di RNA estratto da piante infestanti che restano nei tunnel durante
l’inverno o tra una coltura e l’altra, si potrebbe determinare la loro importanza come
inoculo del virus. In Groves et al. (2001) è presentata una lista di esperimenti fatti in
questa direzione.
55
5. RINGRAZIAMENTI
-
Cesare Gessler per avermi dato la possibilità di svolgere il lavoro di diploma su di un
tema estremamente interessante ed attuale.
-
Andrea Patocchi per il grandissimo e prezioso aiuto, i consigli e la disponibilità.
-
Mauro Jermini per i campioni 2001 e 2002, i dati sulle catture dei tripidi e per l’aiuto
nel prelievo dei campioni.
-
I fratelli Giorgi per aver messo a disposizione un intero tunnel per il prelievo dei
campioni di insalata e pomodoro.
-
Tiziano Pedrinis per i campioni 2001 e le informazioni sulla diffusione del virus in
Ticino e la provenienza del materiale.
-
Davide Gobbin per gli utilissimi suggerimenti e consigli.
-
Alban Ramette per le spiegazioni filogenetiche.
-
Roberto Brunetti e Luigi Colombi per le fotografie dei sintomi di TSWV e la
letteratura italiana e francese.
-
Marcello Zala per avermi sempre fatto pervenire rapidamente i preziosi kit.
-
Dafne Gianettoni e Luca Lafranchi per la lettura del lavoro.
-
Giorgia Valsesia , Giovanni Broggini, Fabio Rezzonico, Eve Dilworth e tutto il gruppo
di fitopatologia.
56
6. LETTERATURA
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A. A. V. V., 2002. Manuel des lègumes. VSGP/UMS, 147-152.
Adam, G., Peters, D., Goldbach, R.W., 1996. Serological comparison of tospoviruses
isolates using polyclonal and monoclonal anribodies. Acta Horticulturae, 431:135-159.
Allen, W.R., Matteoni, J.A., 1991. Petunia as an indicator plant for use by growers to
monitor for thrips carrying the tomato spotted wilt virus in greenhouse. Plant Disease,
75:78-82.
Antignus, Y., Lapidot, M., Ganaim, N., Cohen, J., Lachman, O., Pearlsman, M.,
Raccah, B., Gera, A., 1997. Biological and molecular characterization of tomato
spotted wilt virus in Israel. Phytoparasitica, 25(4):319-330.
Bandla, M.D., Westcott, D.M., Chenault, K.D., Ullman, D.E., German, T.L.,
Sherwood, J.L., 1994. Use of monoclonal antibody to the nonstructural protein
encoded by the small RNA of tomato spotted wilt tospovirus to identify viruliferous
thrips. Phytopathology, 84:1427-1431.
Barker, I., 1989. Beware spotted wilt. Grower, 2:17-19.
Berling, A., Gebre-Selassie, K, Marchoux, G., 1992. El virus del bronceado del
tomate. Situación-Perspectivas. In: Jornadas tècnicas sobre Trips/Virus del bronceado
(tSWV). Consejería de agricultura ganadería y pesca de Murcia, 41-46.
Besomi, K., 2001. Monitoraggio 2001 thrips vettori TSWV. RAC Cadenazzo.
Bhat, A.I., Pappu, S.S., Pappu, H.R., Deom, C.M., Culbreath, A.K., 1999. Analysis of
the intergenic region of tomato spotted wilt Tospovirus medium RNA segment. Viral
Research, 61:161-170.
Brittlebank, C.C., 1919. Tomato diseases. J. Agric. Victoria, 17:213-235.
Cho, J.J., Mau, R.F.L., Hamasaki, R.T., Gonsalves, D., 1988. Detection of tomato
spotted wilt virus in individual thrips by enzyme-linked immunosorbent assay.
Phytopathology, 78:1348-1352.
De Àvila, A.C., de Haan, P., Kormelink, R., Resende, R. de O, Goldbach, R.W.,
Peters, D., 1993. Classification of tospoviruses based on phylogeny of nucleoprotein
gene sequences. Journal of General Virology, 74:153-159.
De Haan, P., Kormelink, R., de Oliveira Resende, R., van Poelwijk, Peters, D.,
Goldbach, R., 1991. Tomato spotted wilt virus L RNA encodes a putative RNA
polymerase, 71:2207-2216.
de Haan, P., Wagemakers, L., Peters, D., Goldbach, R., 1990. The S RNA segment of
tomato spotted wilt virus has an ambisense character. Journal of General Virology,
71:1001-1007.
Dewey, R.A., Semorile, L.C., Grau, O., 1996. Detection of Tospovirus by RT_PCR of
the N-gene and restriction enzyme digestion of the products. Journal of Virological
Methods, 56:19-26.
EPPO, 2001
www.eppo.org/QUARANTINE/Data_sheets/tswv/dstmswxx.html
EPPO/ CABI, 1998. Distribution maps of quarantine pests for Europe. CABI, Map 72,
Map 342.
Gallitelli, D., Davino, M., 1998. Gravi malattie da virus delle colture ortive in serra e
relativi mezzi di difesa, Informatore fitopatologico, 10: 42-47.
Gebre-Selassie, K., Chabrière, C., Marchoux, G., 1989. Un virus qui se rèveille- Le
Tomato Spotted Wilt sur cultures lègumières et florales. Phytoma, 410.
Gognalons P., Gèbrè-Sèlassiè K., Marchoux G., 1999. La gamme d'hôtes du TSWV
continue à s'ètendre. Des nouvelles solanacèes sont touchèes. Phytoma la Dèfense des
Vègètaux, 512:47-50.
57
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Gonsalves, D. & Trujillo, E.E., 1986. Tomato spotted wilt virus in papaya and
detection of the virus by ELISA. Plant Disease. 70:501-506.
Groves, R. L., Walgenbach, J. F., Moyer, J. W., Kennedy, G. G., 2001. Owervintering
of Frankliniella fusca (Thysanoptera: Thripidae) on Winter Annual Weeds Infected
with Tomato Spotted Wilt Virus and Patterns of Virus Movement Between Susceptible
Weed Hosts. Phytopathology, 91:891-899.
Heinze,C., Letschert,B., Hristova,D., Yankulova,M., Kauadjouor,O., Willingmann,P.,
Atanassov,A. and Adam,G., 2001. Variability of the N-protein and the intergenic
region of the S RNA of tomato spotted wilt tospovirus (TSWV). The new
microbiologica, 24 (2):175-187.
Hsu, H.T., Lawson, R.H., 1991. Direct tissue blotting for detection of tomato spotted
wilt virus in Impatiens. Phytopatology, 75: 292-295.
Huguenot, C., van den Dobblesteen, G., de Haan, P., Wagemakers. C.A.M., Drost,
G.A., Osterhaus, A.D.M.E., Peters, D., 1990. Detection of tomato spotted wilt virus
using monoclonal antibodies and riboprobes. Arch. Virol., 110:47-62.
Jain, R.K., Pappu, S.S., Pappu, H R., Culbreath, A.K., Todd, J.W., 1998. Molecular
Diagnosis of tomato spotted wilt Tospovirus infection of peanut and other field and
greenhouse crops. Plant Disease, 82(8):900-904.
Jones, T.D., Buck, K.W., Plumb, R.T., 1991. The detection of beet western yellows
virus and beet mild yellowing virus in crop plants using the polymerase chain reaction.
Journal of virological methods, 35:287-296.
Jordá, C., Osca, J.M., 1991. Un nuevo virus en España: El TSWV. In: Consejería de
agricultura, industría y comercio de Badajoz, Estudios de Fitopatología, 35-40.
Kitajima, E.W., Resende, R. de O., de Àvila, A.C., Goldbach, R.W., Peters, D., 1992.
Immuno-electron microscopical detection of tomato spotted wilt virus and its
nucleocapsids in crude plant extracts. J. Virol. Methods, 38:313-322.
Kormelink, R., Storms, M., van Lent, J., Peters, D., Goldbach, R., 1994. Expression
and subcellular location of the NSm protein of tomato spotted wilt virus (TSWV), a
putative viral movement protein. Virology, 200:56-65.
Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, J.B, Nei, M., 2001. MEGA2: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics.
Louro, D., 1990. Occurrence and identification of tomato spotted wilt virus in
Portogal. I colóquio franco-ibèrico de microscopia electrónica, Barcelona ES, 127.
Maiss, E., Ivanova, L., Breyel, E., Adam, G., 1991. Cloning and sequencing of the S
RNA from a Bulgarian isolate of tomato spotted wilt virus. Journal of General
Virology, 72:461-464.
Marchoux, G., Hostachy, B., Gebre-Selassie, K., Gognalons, P., 2000. Tomato Spotted
Wilt Virus: hôtes et mèthodes de lutte. PHM-Revue horticole, 418:46-52.
Matthews Plant Virology, Fouth Edition, by Roger Hull, 2001.
Moyer, J.W., 2000. Tospoviruses. Encyclopedia of Microbiology, 4:592-597.
Mumford, R.A., Barker, I., Wood, K.R., 1994. The detection of tomato spotted wilt
virus using the polymerase chain reaction. Journal of virological methods, 46:303-311.
Nei, M., Gojobori, T., 1986. Simple methods for estimatine the numbers of
synonimous and nonsynonimous nucleotide substitutions. Molecular Biology and
Evolution, 3:418-426
Nei, M., Kumar, S., 2000. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford.
Nolasco, G., de Blas, C., Torres, V., Ponz, F., 1993. A method combinig imunocapture
and PCR amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and
subviral pathogens. Journal of Virological methods, 45: 201-218.
58
-
-
-
-
-
-
-
-
-
OCVCM, Office central vaudois de la culture maraichère, 1996. Rapport
phytosanitaire 1995.
Pappu, H., Pappu, S., Jain, R., Bertrand, P., Culbreath, A., McPherson, R., Csinos, A.,
1998. Sequence characteristics of natural populations of tomato spotted wilt tospovirus
infecting flue-cured tobacco in Georgia. Virus Genes, 17:169-177.
Pedrinis, T., 1998 e 2001. Rapporto fitosanitario del Canton Ticino 1997 e 2000.
Peters, D., 1998. An updated list of plant species susceptible to tospoviruses. In:
Peters, D., Goldbach, R.W. [Eds.] Recent Progress in Tospovirus and Thrips Research.
Wageningen Agricultural University, Wageningen, the Netherlands: 107-110.
Peters, D., Wijkamp, I., van de Wetering, F., Goldbach, R., 1996. Vector Relation in
the transmission and epidemiology of Tospoviruses. Acta Horticulturae, 431:29-43.
Pollini, A., 1998. Manuale di entomologia applicata. Edagricole, 81-90.
Pottorff L.P., Newman S. E., Colorado State University Greenhouse Plant Viruses
no.2947 www.colostate.edu/Depts/CoopExt 2001
Qiu, W.P., Geske, S.M, Hickey, C.M., Moyer, J.W., 1998. Tomato spotted wilt
Tospovirus Genome reassortment and genome segment-specific adaptation, Virology,
244:186-194.
Reddy, D.V.R., Wightman, J.A., 1988. Tomato spotted wilt virus: Thrips transmission
and control. Adv. Dis. Vector Res. 5: 203-220.
Roberts, C.A., Dietzgen, R.G., Heelan, L.A., Maclean, D.J., 2000. Real-time RT-PCR
fluorescent detection of tomato spotted wilt virus. Journal of Virological Methods,
88:1-8.
Ronco, A.E., Dal Bo, E., Ghiringhelli, P.D., Medrano, C., Romanowski, V., Sarachu,
A.N., Grau, O., 1989. Cloned cDNA probes for detection of tomato spotted wilt virus.
Phytopathology, 79:61-74.
Roselló S., Díez M. J., Nuez F., 1996. Viral diseasee causing the greatest economic
losses to the tomato crop. I. The Tomato spotted wilt virus - a review. Scientia
Horticulturae, 67:117-150.
Sherwood, J.L., Sanborn, M.R., Keyser, G.C., Myers, L.D., 1989. Use of monoclonal
antibodies in detection of tomato spotted wilt virus. Phytopathol. 79:61-64.
Silva, M.S., Martins, C.R.F., Bezerra, I.C., Nagata, T., de Ávila, A.C., Resende, R.O.,
2001. Arch. Virol, 146:1267-1281.
Smith, K. M., 1932. Studies on plant virus diseases. XI. Further experiments with a
ringspot virus. Its identification of spotted wilt of the tomato. Ann. Appl. Biol., 19:
305-330.
Steinhauser, D., Holland, J., 1987. Rapid evolution of RNA viruses. Ann.rev.
microbiol, 41: 409-433.
Stijger, C.C.M.M., Simmonse, M.P., Verhoeven, J.T.K., 1989. California thrips and
tomato spotted wilt virus. Discrimination from cucumber mosaic virus is difficult.
Weekblad groenten en fruit, 45:30-31.
Swofford, D.L., 1998. PAUP*. Phylogentetic analysis using parsimony (*and other
methods), Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, MA.
Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J., 1994. CLUSTAL W, Nucleic Acids Res.
22:4673-4680.
Tsimring, L.S., Levine, H., Kessler, D.A., 1996. RNA virus evolutzion via a fitnessspace model. The american physical society, 4440-4443.
Tsompana, M., Sin, S.-H., Moyer, J.W. 2001. Evolutionary Biology of Tospovirus.
59
-
-
-
-
Vaira, A.M, Semeria, L., Crespi, S., Lisa, V., Allavena, A., Accotto, G.P., 1995.
Resistance to Tospoviruses in Nicotiana benthamiana transformed with the N gene of
tomato spotted wilt virus: correlation between transgene expression and protection in
primary transformants. Molecular Plant-Microbe Interactions, 8(1):66-73.
Van de Wetering, F., Goldbach, R., Peters, D, 1996. Transmission of tomato spotted
wilt virus by Frankliniella occidentalis after viral acquisition during the first larval
stage. Acta Horticulturae, 431.
Vicchi, V., 1999. Scheda 4: Tomato Spotted Wilt Virus, Servizio Fitosanitario,
Regione Lombardia.
Weekes, R., Barker, I., Wood, K.R., 1996. An RT-PCR test for the detection of tomato
spotted wilt virus incorporating immunocapture and colorimetric estimation. Journal
of Phytopathology, 144:575-580.
Wijkamp, I., Almarza, N., Goldbach, R., Peters, D. , 1995. Distinct levels of
specificity in thrips transmission of tospoviruses. Phytopathology, 85, 1069-1074.
Wijkamp, I., van de Wetering, F., Goldbach, R., Peters, D., 1996. Transmission of
Tomato spotted wilt virus by Frankliniella occidentalis, median acquisition and
inoculation access period.
60
APPENDICE
Tab. 1A: Nomi delle singole sequenze appartenenti agli aplotipi di TSWV presenti in Ticino.
Le sequenze ottenute dai campioni ticinesi 2001 e 2002 sono state chiamate con una sigla che comprende il
nome dell’azienda di provenienza del campione (ALL = All’Orto, Muzzano; BAL = Ballerini, Novazzano
(Brusata), BEG = Beghelli, Iragna, BRE = Brevi, Novazzano e GIO = Giorgi, Stabio), la data del prelievo
(giorno, mese, anno), il tipo di coltura (TO = pomodoro, LE = lattuga, FQ = lattuga foglia di quercia) ed una
numerazione progressiva per distinguere i campioni prelevati dalle diverse piante della stessa coltura.
Sequenze corrette ottenute - Gruppi
Azienda
TI01TOA
All'Orto
ALL100801TO05
TI01TOB
TI01TOC
ALL100801TO08
TI01TOD
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOG
ALL100801TO06
ALL050701TO04
ALL0100801TOB
ALL0100801TO07
TI02TOH
TI02LEI
TI02LEL*
TI02LEM*
GIO250502TO41
GIO050402LE11
GIO050402LE15
GIO050402LE22
ALL100801TOA
ALL140502TO01
BAL100801TOC
Ballerini
Beghelli
BEG030701TO06
BEG030701TO01
BEG030701TO03
BEG030701TO05
BEG030701TO07
BEG030701TO08
BEG030701TO09
BEG030701TO10
Giorgi
GIO030701TO01
GIO050402LE01
GIO050402LE06
GIO100801TO02
GIO050402LE09
GIO050402LE31
GIO030701TO11
GIO050402LE14
GIO050402LE41
GIO030701TO12
GIO050402LE23
GIO250502TO39
GIO030701TO13
GIO050402LE27
GIO250502TO40
GIO100801TO15
GIO050402LE43
GIO250502TO47
GIO050402LE47
GIO050402LE46
Brevi
BRE150402FQ01
TI01TOC
56
65
100
TI01TOG
TI01TOF
TI01TOA
64 TI01TOD
TI01TOE
TI01TOB
0.005
Fig. 1A: Dendogramma basato sulla sequenza nucleotidica (638 basi) del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi 2001 I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un
totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica.
61
68 TI01TOC
TI02LEI
63
TI01TOG
TI01TOF
100
65
TI01TOA
TI01TOD
TI02TOH
TI01TOE
TI01TOB
0.005
Fig. 2A: Dendogramma basato sulla sequenza nucleotidica (518 basi) del gene NP di TSWV degli aplotipi
ticinesi esattamente determinati, escludendo quindi TI02LEL e TI02LEM. I valori posti al di sopra dei rami
sono percentuali generate dalla statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami
corrisponde alla distanza filogenetica.
TI01TOG
TI01TOF, TI01TOA, TI01TOD, TI01TOC, TI01TOE
TI01TOB
0.001
Fig. 3A: Dendogramma basato sulla sequenza aminoacidica (212 aminoacidi) del gene NP di TSWV degli
aplotipi ticinesi 2001. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza filogenetica. Il valore bootstrap non è
indicato in quanto è inferiore al 50%.
TI01TOA
TI02LEI
TI01TOG
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOB
TI01TOD
TI01TOC
TI02TOH
0.002
Fig. 4A: Dendogramma basato sulla sequenza aminoacidica (172 aminaocidi) del gene NP di TSWV degli
aplotipi ticinesi esattamente determinati, escludendo quindi TI02LEL e TI02LEM. La lunghezza dei rami
corrisponde alla distanza filogenetica. Il valore bootstrap non è indicato in quanto è inferiore al 50%.
62
C27084
TI02TOH
TI01TOD
TI02LEL
57
TSWVD
TI01TOA
LE98/257
TI01TOG
58
TI01TOF
74
52
TI01TOC
TI02LEI
980472
TSWVL3
91
Bulg97
BS97
8Hip9612
70
85
20Da961
GD98
JAP
86
TOSPOG
96
TOSPOC
TSWVBR01
88 TSWVIT
TI01TOE
61
99
TI01TOB
TI02LEM
Spain
TSWVHI
70
TSWV10W
75
TSWVBL
62
TSWVH
TSWVGATO
TSWVGAAC
63
TSWVGATC
TSWVGAPT
62
TSWVGACC
60
64 TSWVGAPP
TSWVGAWC
TSWVGAGC
TSWV10
TSWVGAMC
0.005
Fig. 5A: Dendogramma basato sulla sequenza nucleotidica (518 basi) del gene NP di TSWV di 41 sequenze
(11 aplotipi ticinesi e 30 sequenze mondiali I valori posti al di sopra dei rami sono percentuali generate dalla
statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza
filogenetica.
63
20Da961
GD98
TSWVL3
Bulg97
64
8Hip9612
TSWVBR01
BS97
980472
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOA
TI01TOD
TI01TOC
LE98/257
C27084
TSWVD
TSWVIT
TI02LEL
TI02LEI
Spain
65
TI01TOB
TI02LEM
TI02TOH
TSWVHI
JAP
TI01TOG
TSWVBL
66
TSWV10W
64
TSWVH
TOSPOG
65
TOSPOC
TSWVGAMC
TSWVGAWC
TSWVGAPP
64 TSWVGAGC
TSWVGAAC
TSWVGAPT
TSWVGACC
TSWVGATC
TSWV10
TSWVGATO
0.005
Fig. 6A: Dendogramma basato sulla sequenza aminoacidica (172 aminoacidi) del gene NP di TSWV di 41
sequenze (11 aplotipi ticinesi e 30 sequenze mondiali). I valori posti al di sopra dei rami sono generati dalla
statistica bootstrap su un totale di 1000 replicazioni. La lunghezza dei rami corrisponde alla distanza
filogenetica.
64
Tab. 2A: Posizione e aminoacidi sostituiti nelle sequenze di 41 isolati (11 aplotipi ticinesi e 30 sequenze
mondiali).
Posizione dell’aminoacido / Aminoacido più frequente
26 33 38 39 40 42 47 49 50 58 60 62 63 64 84 88 99 100 110 116 127 133 138 148 149 154 159 161 174 175 184 187 192 198 199 200 201 205 206 212 230 232
Isolato
TSWVGAGC
TSWVGAAC
TSWVGAPT
TSWVGAMC
TSWVGAWC
TSWVGAPP
TSWVGATO
TSWVGACC
TSWV10
TSWVGATC
TSWV10W
TSWVBL
TSWVH
TSWVHI
TI01TOG
JAP
TOSPOC
TOSPOG
TSWVIT
TSWVD
LE98/257
TI01TOA
TI01TOD
TI02TOH
TI01TOC
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOB
C27084
Spain
TSWVL3
8Hip9612
GD98
BS97
20Da961
Bulg97
980472
TSWVBR01
TI02TOLEI
TIO2TOLEL=*
TI02TOLEM*
D
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
N
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
N
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
D
.
.
-
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
L
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Q
.
-
E
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
L
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
I
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
N
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
H
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
.
.
.
.
.
M
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
D
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
N
N
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
L
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
M
.
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
.
.
.
.
.
N
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
D
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
I
.
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
P
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
E
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
F
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
L
.
.
.
.
.
.
.
.
.
M
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Y
.
.
.
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Y
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
K
K
K
K
K
K
K
K
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
.
.
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Q
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
R
R
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Q
.
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
N
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
E
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
R
.
.
I
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
V
-
M
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
Tab. 3A: Codoni codificanti sostituiti nelle sequenze di 41 isolati (30 sequenze mondiali e 11 aplotipi
ticinesi). I codoni non sinonimi sono indicati con caratteri italici.
Posizione dell’aminoacido codificato / Codone più frequente
26 33 38 39 40 42 47 49 50 58 60 62 63 64 84 88 99 100 110 116 127 133 138 148 149 154 159 161 174 175 184 187 192 198 199 200 201 205 206 212 230 232
Isolato
GAT AAC TGT CTG GAA CTT AAG AGC GTT AAG CGT AGT ATA ATG GAC GCC TTG ATC AAT ACT ATT CCT AAG GGT AGC GCT TTT ATG TAC AAG TAT AGG AAA AAA AGC AAA GCA AAT GAA GGG ATT ATG
TSWVGAGC
TSWVGAAC
TSWVGAPT
TSWVGAMC
TSWVGAWC
TSWVGAPP
TSWVGATO
TSWVGACC
TSWV10
TSWVGATC
TSWV10W
TSWVBL
TSWVH
TSWVHI
TI01TOG
JAP
TOSPOC
TOSPOG
TSWVIT
TSWVD
LE98/257
TI01TOA
TI01TOD
TI02TOH
TI01TOC
TI01TOE
TI01TOF
TI01TOB
C27084
Spain
TSWVL3
8Hip9612
GD98
BS97
20Da961
Bulg97
980472
TSWVBR01
TI02TOLEI
TIO2TOLEL=*
TI02TOLEM*
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AAT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GTC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GAC .
.
.
.
.
- -
CTA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
TTG
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CTA
CTA
CTA
.
CTA
.
CAG
.
-
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CTC
.
.
.
CTC
.
.
.
.
CTC
CTC
CTC
CTC
CTC
CTC
.
CTC
.
CTC
.
CTC
CTC
CTC
CTC
CTC
CTC
CTC
ATC
CTC
CTC
.
AAA .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT
.
.
.
AGG .
.
.
.
CGC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
ATT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AAC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CAT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
.
.
GGT
.
.
.
.
.
.
.
.
AGC
.
AGC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GTA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ATA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GAT
.
.
.
.
.
.
.
AAC
AAC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
TTA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GCT .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ATG
.
GGC .
.
.
.
.
AGC .
ATT
.
.
ATT
ATT
ATT
.
ATT
ATT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GTC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GAT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
65
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ATT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ACT
CCC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GAG .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GGC .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
TCT
AGT .
.
.
AGT .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGT .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CTT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GTG
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
TGC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGG .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AAA .
AAA .
AAA .
.
.
.
.
AAA .
AAA .
AAA .
AAA .
AAA .
AAA .
.
.
AAA .
.
.
AAA .
.
.
AAA .
AAA .
AAA .
AAA .
AAA TGT
AAA .
AAA .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGA
.
.
.
.
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
.
AGA
.
AGA
.
AAG
AAG
AAG
AAG
AAG
AAG
AAG
AAG
AGA
AGA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AAG
.
AAG
.
.
.
.
.
AGA
.
.
.
.
AAG
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CAA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AGA
AGA
AGA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
CAA
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
ACT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GGA .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GTT
.
.
GTT
.
.
GTT
.
.
GTT
.
.
GTT
.
.
GTT
.
GGA GTT
.
GGA GTT
.
.
GTT
.
.
GTT
ACT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GGA .
GGA GGA .
.
.
.
.
GGA .
.
.
.
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
GGA .
.
.
.
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
.
GGA .
GTT
.
.
.
GGA .
GGA .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ATT
.
.
.
.
.
.
.
.
.
-
Tab. 4A: Proprietà degli aminoacidi più frequenti e degli aminoacidi sostituiti nelle sequenze di 41 isolati
(30 sequenze mondiali e 11 aplotipi ticinesi).
Posizione
Aminoacido più frequente
Aminoacido sostituito
Isolato
aa Proprietà
aa Proprietà
26
D
N polare (idrofilo, neutro)
33
N
polare (idrofilo, neutro)
D polare (idrofilo, acido)
Bulg97
38
C
polare
V non polare (idrofobico)
TSWVH
39
L
non polare (idrofobico)
Q polare (idrofilo, neutro)
980472
40
E
polare (idrofilo, acido)
G non polare
42
L
non polare (idrofobico)
I
TSWVGA(GC, AC, PT , MC, WC , PP, TO, CC, TC)
TSWV10
TSWVBR01
47
K
polare (idrofilo, basico)
R polare (idrofilo, basico)
TI01TO0B
49
S
polare
R polare (idrofilo, basico)
Spain
50
V
non polare (idrofobico)
I
58
K
polare (idrofilo, basico)
N polare (idrofilo, neutro)
TSWVGA(GC, AC, PT , MC, WC , PP, TO, CC, TC)
TSWV(10, 10W, BL, H, HI)
TI01TOG, JAP, TOSPO(C, G)
TSWVGATO
60
R
polare (idrofilo, basico)
H polare (idrofilo, basico)
TSWV10W
62
S
polare
G non polare
TOSOPC
63
I
non polare (idrofobico)
V non polare (idrofobico)
Bulg97
64
M non polare (idrofobico)
I
GD98
84
D
polare (idrofilo, acido)
N polare (idrofilo, neutro)
TOSPO(G, C)
88
A
non polare (idrofobico)
G non polare
TSWVBR01
99
L
non polare (idrofobico)
M non polare (idrofobico)
980472
100
I
non polare (idrofobico)
V non polare (idrofobico)
Bulg97
110
N
polare (idrofilo, neutro)
D polare (idrofilo, acido)
TI02TOH
116
T
polare
I
127
I
non polare (idrofobico)
S polare
TSWVBL
133
P
non polare
T polare
TSWV10
polare (idrofilo, acido)
non polare (idrofobico)
non polare (idrofobico)
non polare (idrofobico)
non polare (idrofobico)
JAP
980472
138
K
polare (idrofilo, basico)
E polare (idrofilo, acido)
TI02LEM
148
G
non polare
S polare
20Da961
149
S
polare
G non polare
TSWV10
154
A
non polare (idrofobico)
S polare
TI02TOH
159
F
non polare (idrofobico)
L non polare (idrofobico)
8Hip9612
161
M non polare (idrofobico)
V non polare (idrofobico)
TI02TOH
174
Y
polare
C polare
TSWVGATC
175
K
polare (idrofilo, basico)
R polare (idrofilo, basico)
TSWVGACC
184
Y
polare
C polare
20Da961
187
R
polare (idrofilo, basico)
K polare (idrofilo, basico)
192
K
polare (idrofilo, basico)
R polare (idrofilo, basico)
8Hip9612 , GD98, BS97, 20Da961, Bulg97
980472
TSWVBR01
BS97
198
K
polare (idrofilo, basico)
Q polare (idrofilo, neutro)
TSWV10W
199
S
polare
R polare (idrofilo, basico)
TSWV10W, BL, H
200
K
polare (idrofilo, basico)
Q polare (idrofilo, neutro)
TI02TOLEL
Bulg97
201
A
non polare (idrofobico)
G non polare
205
N
polare (idrofilo, neutro)
T polare
206
E
polare (idrofilo, acido)
G
non polare
212
G
non polare
R
polare (idrofilo, basico)
TI02TOLEI
230
I
non polare (idrofobico)
V
non polare (idrofobico)
230
I
non polare (idrofobico)
T
polare
TSWVGA(GC, AC, PT , MC, WC , PP, TO, CC, TC)
TSWVBR01
TSWV10W
232
M non polare (idrofobico)
I
non polare (idrofobico)
C27084
TSWVGA(GC, AC, PT , MC, WC , PP, TO, CC, TC)
TOSPOG
66
GLOSSARIO
Clade
Gruppo comprendente un antenato comune (rappresentato dal nodo da cui dipartono i
rami) e tutti i suoi discendenti (www.ujf-grenoble.fr/JAL/Choler/BEV/glossaire.html).
Cladogramma
1. Diagramma di ramificazione gerarchica che contiene affermazioni sulle somiglianze
tra i taxa inclusi nel diagramma stesso.
2. Diagramma di ramificazione che mostra il pattern gerarchico delle somiglianze
evolutive (omologie) dei taxa inclusi nel diagramma stesso.
Un cladogramma è un ipotesi di relazioni di somiglianza evolutiva tra taxa basata
sull'analisi dei caratteri primitivi e derivati. Tali ipotesi di somiglianza sono esprimibili sia
mediante grafici ramificati, sia mediante codificazioni non grafiche.
I cladogrammi non hanno un connotato temporale vincolante e non rappresentano la
filogenesi
degli
organismi
in
esso
analizzati
(modificato
da
http://utenti.tripod.it/Paleo2000).
Dendogramma
Termine generale che indica un diagramma ad albero (Clewley, J.P., 1998. A user’s guide
to producing and interpreting tree diagrams in taxonomy and phylogenetics. Part I.
Introduction and naming of parts. Communicable disease and publich health, 1:64-66.)
Filogramma (o albero filogenetico)
Diagramma (non necessariamente ramificato nè rappresentato graficamente) che esprime
in forma schematica le relazioni genealogiche tra un insieme di taxa.
Esso esprime unicamente relazioni genealogiche, indipendentemente dal particolare tipo di
sistematica adottata (modificato da http://utenti.tripod.it/Paleo2000).
Omologia
Caso in cui caratteri tra loro simili vengono ereditati da un antenato comune (www.ujfgrenoble.fr/JAL/Choler/BEV/glossaire.html).
Taxa
Insieme di organismi presenti in un livello di una classificazione (www.ujfgrenoble.fr/JAL/Choler/BEV/glossaire.html).
Topologia
Insieme di elementi che definiscono la struttura di un dendogramma (posizione dei nodi,
lunghezza dei rami, …) (www.ujf-grenoble.fr/JAL/Choler/BEV/glossaire.html).
Valore bootstrap
Valore utilizzato per determinare la significanza statistica di un dendogramma.
Nuovi set di dati vengono generati partendo dall’allineamento di più sequenze, scegliendo
casualmente delle colonne e combinandole in modo da ottenere un nuovo allineamento,
questo procedimento viene ripetuto più volte. Il valore bootstrap indica la percentuale di
replicazioni in cui è stato osservato lo stesso raggruppamento. Un clade è considerato
significante quando il valore bootstrap è superiore a 50%.
67