RICER CA Q UA L IT A T IV A D I HIV1 La sindrome da immunodeficienza acquisita (A IDS) è una condizione patologica ad esito letale deriv ante dall’infezione causata dal Virus dell’Immunodeficienza Umana (HIV). Essa è il risultato della complessa interazione tra i processi di infezione v irale e la risposta del soggetto ed è caratterizzata dalla deplezione di alcune cellule del sistema immunitario, e più specificatamente, dei Linfociti T4. Tale alterazione fav orisce sia l’inv asione da parte di agenti opportunistici (v irus, funghi, batteri, parassiti ecc.) che prov ocano infezioni letali sia lo sv iluppo di neoplasie. La sintomatologia è molto div ersificata e v aria da pazienti apparentemente sani a pazienti che mostrano una rapida progressione della malattia, fino al decesso dov uto a complicanze di tipo infettiv o o tumorale. Secondo una stima dell’OMS, il numero dei soggetti infettati dall’HIV è compreso tra i 15 e i 20 milioni. L’HIV presenta un genoma ad RNA a filamento singolo, la cui replicazione av v iene tramite un doppio filamento di DNA che funge da intermedio, il provirus; la sintomatologia dell’infezione si manifesta nell’arco di un lungo periodo di tempo. Tali caratteristiche hanno portato a classificare l’HIV tra i Lentiv urus, famiglia dei Retrov iridae. Per quanto concerne la struttura v irale, il riv estimento si forma durante la fase di riproduzione della cellula infetta, ed è costituito dalle glicoproteine v irali inglobate nella membrana cellulare e da alcune componenti proteiche di origine cellulare. Le glicoproteine v irali, prodotte dal gene env , sono direttamente coinv olte nell’assorbimento e nella penetrazione del v irus all’interno di cellule suscettibili, grazie alla presenza di un recettore. La struttura interna (core) è costituita da prodotti del gene gag che incapsulano il genoma v irale ad RNA . Tutti i componenti necessari per la replicazione v irale sono presenti all’interno del capside: due copie del genoma, il tRNA-Lys (deriv ante dalla cellula infettata), che innesca la replicazione v irale, e i prodotti del gene pol , coinv olti nella replicazione e nell’integrazione del genoma nei cromosomi dell’ospite. L’HIV ha in comune con altri Retrov irus tre geni di primaria importanza, il gag , il pol e l’env , che codificano per le proteine strutturali e di replicazione. Tuttav ia, l’HIV, si distingue dagli altri Retrov irus per l’alto numero di geni ausiliari che esso codifica. Due geni, in particolare, il tat ed il rev , serv ono per regolare sia il liv ello che la natura dell’espressione genica v irale: il passaggio dalla fase iniziale alla fase tardiv a della replicazione dipende proprio dall’espressione di questi geni. Il gene vif influenza l’infettiv ità v irale, mentre il nef, il vpr ed il vpu sembrano influire sulla crescita del v irus, anche se in modo meno ben definito rispetto ai precedenti. Ampliset V1 kit GD 200 D 220000 GGD virologia V11 KIT MPPLLII SSEETT V AAM gENEDIA L’A mpliset V1 k it, studiato e prodotto per rendere semplice l’esecuzione manuale di pochi campioni al giorno anche da parte di operatori non esperti, comprende il qUALITATIVO necessario per l’amplificazione del Dna target. La coppia di Primers contenuta nel k it amplifica in maniera specifica una porzione della regione “gag“ del v irus dell’ HIV1. Le sequenze corrispondono alla regione indicata dal numero di accesso GenBank K02007, locus HIV-SF2CG. I Primers amplificano una regione di 243 bp per produrre un frammento di 297 bp. Essi v engono purificati utilizzando due tecniche correlate, HPLC e Elettroforesi Capillare, al fine di ottenere un alto grado di purezza. Le frazioni ottenute con una corsa semipreparativ a in HPLC a scambio ionico, v engono, prima di essere riunite, controllate mediante CGE (Elettroforesi Capillare su gel di poliacrilammide lineare). Il k it è corredato di materiali (tampone e magnesio cloruro) e di protocolli per l’ esecuzione della reazione di amplificazione. A LC UNE DELLE SUE C A RA T T ERIST IC H E : • • • Specifico Semplice e riproducibile Rivelazione diretta SP EC IFIC H E T EC NIC H E A PPLICABILITÀ: VOLUME DEL CAMPIONE: NUMERO DI TEST: T EMPI DI ESECUZIONE: SENSIBILITÀ DEL METODO: C ONTENUTO DEL KIT: REAGENTI RICHIESTI: non compresi nel kit MATERIALI RICHIESTI: STRUMENTI RICHIESTI su campioni di DNA estratto e purificato (si raccomanda l’uso del k it GD 205 Total DNA Extra Kit). 5-10 µl di siero 40 amplificazioni circa 4 ore, in funzione del tipo di termociclatore in uso 250 UI (in funzione del numero di linfociti portati in estrazione) tamponi reagenti Primers Controlli DNA TA Q polimerasi e dNTP (k it GD 213 DNA TA Q); Portaprov ette refrigerato, Puntali con barriera anti-aerosol, Tubi NOOil Termociclatore programmabile, Set di pipette pre PCR La rivelazione diretta in Agarosio permette una refertazione rapida e semplice, fornendo informazioni utili inerenti la seduta d’amplificazione quali: specificità, sensibilità, presenza di carry over ed efficienza di reazione. un metodo semplice, rapido ed economico per la ricerca qualitativa di HIV1-Dna Fig:1 Agarosio 3% rivelazione Bromuro di Etidio Rev 1 11-01 GENE DIA SRL : VIA L OMBARDA, 169/ A – 55013 L AMMARI (LU) – TEL./ FAX 0583962672 – E MAIL: [email protected] L AB. R ICERCA E S VILUPPO: TRAV. P IETRAVALLE ,11– 80100 NAPOLI – TEL./ FAX 0815465026 – E MAIL: [email protected]