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RICER CA Q UA L IT A T IV A D I HIV1
La sindrome da immunodeficienza acquisita (A IDS) è una condizione patologica ad esito letale deriv ante
dall’infezione causata dal Virus dell’Immunodeficienza Umana (HIV). Essa è il risultato della complessa
interazione tra i processi di infezione v irale e la risposta del soggetto ed è caratterizzata dalla deplezione di
alcune cellule del sistema immunitario, e più specificatamente, dei Linfociti T4. Tale alterazione fav orisce sia
l’inv asione da parte di agenti opportunistici (v irus, funghi, batteri, parassiti ecc.) che prov ocano infezioni
letali sia lo sv iluppo di neoplasie. La sintomatologia è molto div ersificata e v aria da pazienti apparentemente
sani a pazienti che mostrano una rapida progressione della malattia, fino al decesso dov uto a complicanze
di tipo infettiv o o tumorale. Secondo una stima dell’OMS, il numero dei soggetti infettati dall’HIV è
compreso tra i 15 e i 20 milioni.
L’HIV presenta un genoma ad RNA a filamento singolo, la cui replicazione av v iene tramite un doppio
filamento di DNA che funge da intermedio, il provirus; la sintomatologia dell’infezione si manifesta nell’arco
di un lungo periodo di tempo. Tali caratteristiche hanno portato a classificare l’HIV tra i Lentiv urus, famiglia
dei Retrov iridae.
Per quanto concerne la struttura v irale, il riv estimento si forma durante la fase di riproduzione della cellula
infetta, ed è costituito dalle glicoproteine v irali inglobate nella membrana cellulare e da alcune componenti
proteiche di origine cellulare. Le glicoproteine v irali, prodotte dal gene env , sono direttamente coinv olte
nell’assorbimento e nella penetrazione del v irus all’interno di cellule suscettibili, grazie alla presenza di un
recettore. La struttura interna (core) è costituita da prodotti del gene gag che incapsulano il genoma v irale
ad RNA . Tutti i componenti necessari per la replicazione v irale sono presenti all’interno del capside: due
copie del genoma, il tRNA-Lys (deriv ante dalla cellula infettata), che innesca la replicazione v irale, e i
prodotti del gene pol , coinv olti nella replicazione e nell’integrazione del genoma nei cromosomi dell’ospite.
L’HIV ha in comune con altri Retrov irus tre geni di primaria importanza, il gag , il pol e l’env , che codificano
per le proteine strutturali e di replicazione. Tuttav ia, l’HIV, si distingue dagli altri Retrov irus per l’alto
numero di geni ausiliari che esso codifica. Due geni, in particolare, il tat ed il rev , serv ono per regolare sia il
liv ello che la natura dell’espressione genica v irale: il passaggio dalla fase iniziale alla fase tardiv a della
replicazione dipende proprio dall’espressione di questi geni. Il gene vif influenza l’infettiv ità v irale, mentre il
nef, il vpr ed il vpu sembrano influire sulla crescita del v irus, anche se in modo meno ben definito rispetto ai
precedenti.
Ampliset V1 kit
GD 200
D 220000
GGD
virologia
V11 KIT
MPPLLII SSEETT V
AAM
gENEDIA
L’A mpliset V1 k it, studiato e prodotto per rendere semplice
l’esecuzione manuale di pochi campioni al giorno anche
da parte di operatori non esperti, comprende il
qUALITATIVO
necessario per l’amplificazione del Dna target. La
coppia di Primers contenuta nel k it amplifica in maniera
specifica una porzione della regione “gag“ del v irus dell’ HIV1. Le
sequenze corrispondono alla regione indicata dal numero di accesso GenBank K02007, locus
HIV-SF2CG. I Primers amplificano una regione di 243 bp per produrre un frammento di 297
bp. Essi v engono purificati utilizzando due tecniche correlate, HPLC e Elettroforesi Capillare, al
fine di ottenere un alto grado di purezza. Le frazioni ottenute con una corsa semipreparativ a in
HPLC a scambio ionico, v engono, prima di essere riunite, controllate
mediante CGE
(Elettroforesi Capillare su gel di poliacrilammide lineare). Il k it è corredato di materiali (tampone e
magnesio cloruro) e di protocolli per l’ esecuzione della reazione di amplificazione.
A LC UNE DELLE SUE C A RA T T ERIST IC H E :
•
•
•
Specifico
Semplice e riproducibile
Rivelazione diretta
SP EC IFIC H E T EC NIC H E
A PPLICABILITÀ:
VOLUME DEL CAMPIONE:
NUMERO DI TEST:
T EMPI DI ESECUZIONE:
SENSIBILITÀ DEL METODO:
C ONTENUTO DEL KIT:
REAGENTI RICHIESTI:
non compresi nel kit
MATERIALI RICHIESTI:
STRUMENTI RICHIESTI
su campioni di DNA estratto e purificato (si raccomanda l’uso del k it
GD 205 Total DNA Extra Kit).
5-10 µl di siero
40 amplificazioni
circa 4 ore, in funzione del tipo di termociclatore in uso
250 UI (in funzione del numero di linfociti portati in estrazione)
tamponi
reagenti
Primers
Controlli
DNA TA Q polimerasi e dNTP (k it GD 213 DNA TA Q);
Portaprov ette refrigerato, Puntali con barriera anti-aerosol, Tubi NOOil
Termociclatore programmabile, Set di pipette pre PCR
La rivelazione diretta in Agarosio permette una refertazione rapida e semplice, fornendo informazioni utili
inerenti la seduta d’amplificazione quali: specificità, sensibilità, presenza di carry over ed efficienza di reazione.
un metodo
semplice,
rapido ed
economico per la
ricerca qualitativa
di
HIV1-Dna
Fig:1 Agarosio 3% rivelazione Bromuro di Etidio
Rev 1 11-01
GENE DIA
SRL : VIA L OMBARDA, 169/ A – 55013 L AMMARI (LU) – TEL./ FAX 0583962672 – E MAIL: [email protected]
L AB. R ICERCA E S VILUPPO: TRAV. P IETRAVALLE ,11– 80100 NAPOLI – TEL./ FAX 0815465026 – E MAIL: [email protected]