Diapositiva 1 - Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie

ALMA MATER STUDIORUM-UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE MEDICHE VETERINARIE
Sistema Nervoso Enterico
Cane sano vs. Cane con problemi gastro-enterici
Dottoranda: Dott. ssa Martina Asti
Dottorato: Scienze Mediche Veterinarie (Neurologia)
Tutors: Prof. Gandini & Prof. Chiocchetti
1)PROGETTO SNE CANE
Le immagini ottenute al microscopio a fluorescenza a seguito di valutazione immunoistochimica permettono di
evidenziare le diverse caratteristiche dei neuroni nel plesso sottomucoso e nel plesso mioenterico dei diversi tratti
indagati. La valutazione morfometrica è stata effettuata nel tratto di Ileo dei sette campioni.
INTRODUZIONE
Il Sistema Nervoso Enterico (SNE) è rappresentato da gangli e
plessi distribuiti nella parete dell’apparato digerente, dall’esofago
allo sfintere anale interno, nel pancreas e nelle vie biliari
extraepatiche. I neuroni sono organizzati in due principali plessi
nervosi: il plesso mioenterico (MP) e il plesso sottomucoso (SMP)
(Furness, 2006).
Questo progetto si inserisce in un filone di ricerca atto a valutare le
caratteristiche neurochimiche del SNE nel cane. Si è voluto
approfondire le conoscenze valutando le caratteristiche
neurochimiche dei neuroni enterici in cani sani e in cani affetti da
patologie gastroenteriche.
FIGURA 3:
1A) ILEO CTR 1 (20x) marcatura di muscolaris
mucosae SP –IR + dapi (Alexa 594)
3A
1B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose SP –IR + dapi (Alexa 594)
FIGURA 4:
4A) ILEO PAT 1 (20x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose CGRP – IR + dapi (FITC)
OBIETTIVI
1) Valutare le caratteristiche morfologiche e neurochimiche di alcune sottoclassi neuronali di MP e SMP
di ileo e stomaco di cani deceduti per patologie non legate all’apparato digerente (soggetti di controllo).
2) Valutare le caratteristiche dei neuroni del SNE di ileo in cani deceduti in seguito a patologie
dell’apparato digerente (soggetti patologici).
3) Comparazione quantitativa tra i soggetti di controllo e soggetti patologici.
Materiali e Metodi
Sono stati utilizzati tessuti provenienti da 7 soggetti adulti (4 controlli; 3 patologici) di media-grossa
taglia. Criosezioni e sezioni ottenute da tessuto incluso in paraffina sono state processate con tecniche
istologiche “classiche” (H&E) e tecniche di immunofluorescenza. Purtroppo l’identificazione di anticorpi
primari con affinità su SNE di cane ha richiesto diverso tempo e l’utilizzo di diverse classi di anticorpi in
quanto gli studi presenti in bibliografia sono riferiti ad animali da laboratorio e non a specie animali
come il cane. Gli anticorpi primari e secondari sono elencati, rispettivamente,nella tabella 1 e 2.
TABELLA 1)
ABBREVIAZIONI
Calb
CGRP
nNos
SP
VIP
VR1
Calbindina
Calcitonin Gene Related Peptide
Neuronal Nitric Oxide
Substance P
Vasoactive intestinal peptide
Vanilloid receptor one
4A
4A
4B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose CGRP – IR + dapi (FITC)
FIGURA 5:
5A) ILEO CTR 1 (20x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura di
cellule nervose Hu – IR e glia
enterica S100-IR + dapi (FITC +
Alexa 594)
5B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura di
cellule nervose Hu – IR e glia
enterica S100-IR + dapi (FITC +
Alexa 594)
5A
5A
Le seguenti TABELLA 3 e TABELLA 4 riportano la valutazione semiquantitativa della densità dei neuroni e delle fibre
peptidergiche (CGRP e SP), nitrergiche (nNOS) (Berezin et all., 94), Calbindina (CALB), Vasoactive Intestinal Peptide
(VIP) e Vanilloid Receptor 1(VR1) (Ward et all., 2003 & Goffer, Cauts 2003) immunoreattive sulla base della
seguente simbologia: - non rilevato, + rilevato in un numero ridotto, ++ in modesto numero, +++ in elevato numero.
La cella vuota sta ad indicare che l’antigene non è stato valutato. Abbreviazioni: plesso mioenterico (MP), plesso
sottomucoso (SMP), muscolatura circolare (CML), muscolatura longitudinale (LML), muscolaris mucosae (mm),
cripte e villi.
TABELLA3)
TABELLA4)
TABELLA2)
È stata eseguita la conta totale per i sette soggetti dei neuroni ileali HU/Calbindina, Hu/Nos, Hu/VIP positivi sia nei
soggetti controllo che patologici, rispettivamente nel plesso mioenterico e sottomucoso (utilizzando l’obiettivo 40x
del microscopio a fluorescenza) su campi contigui per tutta la lunghezza del campione. La percentuale dei neuroni
marcati è di seguito rappresentata con due istogrammi.
Marcatura MP
80
INDAGINI IMMUNOISTOCHIMICHE
Marcatura SMP
Serie1
Serie2
60
Serie1
Serie2
70
FIGURA 0 :
0A) ILEO CTR 2 (40x) marcatura di MP VR1- IR
0B) ILEO CTR 2 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura VR1–
IR + dapi
50
60
40
50
40
30
30
20
20
FIGURA 1:
1A) ILEO CTR 1 (40x) marcatura di neuroni di
MP, HU –IR +
1B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura delle
fibre nervose Calbindina –IR
FIGURA 2:
2A) ILEO CTR 1 (40x) marcatura di neuroni di
MP, HU –IR +
2B) ILEO CTR 1 (40x) a livello di plesso
mioenterico è apprezzabile la marcatura dei
neuroni HU-IR e VR1- IR alcuni
dei quali colocalizzati + dapi
10
10
0
0
Hu/nNOS
Hu/Calb
Hu/VIP
Hu/nNos
Hu/calb
Hu/vip
E ’ evidente come la percentuale dei neuroni del plesso mioenterico Hu/Calbindina immunoreattivi sia
sovrapponibile tra controlli e patologici nel plesso MP, mentre, la stessa marcatura sia notevolmente ridotta a livello
di plesso sottomucoso nel gruppo patologico. La marcatura dei neuroni nitrergici (nNos) è nettamente superiore nei
cani controllo a livello di MP e risulta invece solo di poco superiore nel SMP. Per quanto riguarda la marcatura
Hu/Vip si evidenzia una maggiore reattività nei soggetti patologici sia nel plesso MP che SMP. L’aumento del
peptide vasoattivo intestinale (VIP) è un dato interessante da comparare con ulteriori approfondimenti su cani
patologici. Questo peptide è implicato infatti nell’inibizione della muscolatura circolare (Wang et all.,1997; Lars Ny
et all., 1997).
Si nota come sia presente un andamento di tipo inverso della percentuale dei neuroni nNos rispetto ai neuroni Vip
che risultano inferiori nei patologici rispetto ai controlli a differenza della percentuale dei neuroni Vip nettamente
aumentata nei soggetti patologici rispetto ai controlli.
2)PROGETTO DIABETE CANE E GATTO: ALTERAZIONI DELLA MOTILITA’ GASTROENTERICA E DEL SISTEMA NERVOSO ENTERICO
Un secondo progetto sul Sistema Nervoso Enterico, in collaborazione con il Dott. Fracassi del Servizio di Medicina Interna dell’Ospedale Didattico Veterinario, ha preso forma negli ultimi mesi. Il fine del progetto è di valutare le
caratteristiche dei neuroni del plesso mioenterico e sottomucoso prelevando campioni di tessuto in particolare di stomaco (che sembra essere il tratto gastrointestinale più sofferente) di cani affetti da diabete, comparando i risultati
ottenuti con cani privi di questa affezione endocrina. La bibliografia riporta come, soggetti malati di diabete mellito siano sottoposti a variazioni della motilità gastroenterica ed alterazioni del sistema nervoso enterico che includono
danni ai neuroni, alle cellule gliali, alle cellule interstiziali di Cajal alla muscolatura liscia ed ai neuro-trasmettitori (S. S. Yarandi & S. Srinivasan, 2014; Rivera et al 2011). Al momento sono stati prelevati i campioni di stomaco in tre
punti (antro, fondo e corpo) di tre cani controllo (non affetti da diabete mellito) e di due cani patologici, portatori di questa patologia endocrina. Su questi campioni verranno eseguiti studi immunoistochimici per valutare le
caratteristiche delle sottoclassi di neuroni presenti nei due plessi; gli anticorpi che verranno utilizzati saranno nNos e Hu.
BIBLIOGRAFIA
•Berezin et all. (1994) Ultrastructural localization of nitric oxide synthase in canine small intestine and colon.
•Chiocchetti et all. (2006) Extrinsic and intrinsic sources of cgrp IR in the lamb ileum:morphometric and neurochemical investigation.
•Furness (2006) The Enteric Nervous System.
•Larysa et all. (1994) Nitric Oxide (NO) Inhibits Release of Acetylcholine from Nerves of Isolated Circular Muscle of the Canine Ileum: Relationship to Motility and Release of Nitric Oxide1.
•Lars Ny et all. (1997) Morphological relations between haem oxygenases, NO-synthase and VIP in the canine and feline gastrointestinal tracts.
•Wang et all. (1997) Colocalization of Inhibitory Mediators, NO, VIP and Galanin, in Canine Enteric Nerves..
•Ward et all (2003) Distribution of the Vanilloid Receptor (VR1) in the Gastrointestinal Tract
•Goffer, Cauts (2003) Cellular distribution of vanilloid VR1 receptor immunoreactivity in the guinea-pig myenteric plexus
•Rivera et al (2011) NOS The involvement of nitric oxide synthase neurons in diabetics dogs
• S. S. Yarandi & S. Srinivasan, (2014) Diabetic gastrointestinal motility disorders and the role of enteric nervous system: Current status and future directions
PUBBLICAZIONI E PARTECIPAZIONI A CONGRESSI:
-Pubblicazione sulla rivista PLOS ONE dell’articolo “The KIT gene is associated with the English spotting coat color locus and congenital megacolon in Checkered Giant rabbits (Oryctolagus cuniculus)”;-Relatrice al congresso nazionale Scivac
“Patologie chirurgiche toraciche: dalla diagnosi alla terapia”, 16-17 Novembre Padova, di un caso clinico di nome “Formazione bollosa polmonare nel cane: approccio chirurgico toracoassistito”; -Coautore dell’abstract “Lesioni
dell’ileopsoas” presentato all’incontro Siovet –Ortopedia e traumatologia del cane sportivo, 23-24 Novembre, Cremona.-Coautore dell’abstract “Fratture-lussazioni cervicali nel cane e gatto: mezzi di fissazione a stabilità angolare” che
verrà esposto al congresso trentennale Scivac all’interno della sessione specialistica di ortopedia, Rimini (28/05-02/06-2014).