ETANOLO (ALCOOL ETILICO) SIERICO E/O PLASMATICO in UV – Codice Z05810 BIOCHIMICA E METABOLISMO L’alcol etilico è un alcool alifatico di PM=46,07. Di solito viene assunto per via orale ed assorbito rapidamente da stomaco, piccolo intestino e colon. Il tempo necessario per completare il processo di assorbimento varia da 2 a 6 ore, in funzione di fattori quali la presenza di cibo e di altri liquidi, il tempo impiegato per l’ingestione della bevanda, la variabilità biologica fra individui. L’alcol, vista la solubilità in acqua ed il basso peso molecolare, appena assorbito si distribuisce rapidamente in tutti i tessuti e fluidi dell’organismo, superando anche la barriera encefalica e quella placentare. L’andamento della concentrazione di alcol in alcuni liquidi biologici è stato determinato sperimentalmente da vari autori, anche recentemente (Fig. 1). I risultati mostrano che la massima concentrazione plasmatica viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall’assunzione e che saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell’alcolemia, mentre nelle urine si raggiunge la massima concentrazione dopo circa due ore dall’assunzione. Fig. 1. Alcol etilico: concentrazione nei liquidi biologici Dopo l’assorbimento, l’Etanolo viene prevalentemente metabolizzato (90-98 %) per via ossidativa, ad una velocità direttamente proporzionale al peso corporeo e costante nel tempo. La prima reazione di ossidazione avviene nel fegato, per azione dell’enzima Alcol Deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di Idrogeno con produzione di Acetaldeide; questa viene successivamente ossidata ad Acido acetico, per azione dell’enzima Aldeide Deidrogenasi. La cinetica di eliminazione non ha un andamento esponenziale, come la maggior parte delle sostanze esogene, ma pseudolineare; dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione, quando la concentrazione raggiunge il valore massimo C0, la relazione fra concentrazione ematica Ct e tempo t, è data dall’equazione: Ct = C0 - kt, con k compresa fra 10 e 25 mg/dL/h (Fig.2). Fig.2. Urine ed aria espirata rappresentano anche le principali vie di eliminazione dell’alcol e dei suoi prodotti di ossidazione. La cinetica d’eliminazione, complessivamente regolata dall’equazione di Michaelis Menten, assume tuttavia un andamento pseudolineare dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione. 1 L’escrezione di alcol non modificato, di solito, interessa il 2% della quantità assunta ed avviene prevalentemente attraverso reni e polmoni, anche se piccole quantità si ritrovano anche nella saliva ed in altri liquidi organici; può salire fino al 10 % in caso di ingestione massiva. La concentrazione urinaria è di poco superiore a quella ematica; quella alveolare è circa lo 0,05%. La concentrazione nel plasma è superiore a quella del sangue intero di circa il 10%. INTOSSICAZIONE ACUTA L’assunzione eccessiva di alcol provoca, in tempi rapidi, situazioni cliniche di varia gravità che possono richiedere l’intervento del medico del Pronto Soccorso, sia per gli effetti diretti dell’ebbrezza sia per quelli indiretti (incidenti stradali). In tali casi il medico si può rivolgere al Laboratorio con vari obiettivi: - accertare una possibile causa di coma, in paziente senza trauma cranico; - accertare la causa di coma in paziente con trauma cranico (per es. a seguito di incidente stradale); - diagnosticare uno stato di ebbrezza in paziente con sintomatologia dubbia. Esiste, ed ormai è largamente accettata, una relazione tra l’alcolemia (Blood Alcool Concentration - BAC) e l’ebbrezza di una persona. Ricordiamo soltanto che la Legislazione Italiana non considera reato il consumo di alcol, a meno che il bevitore non debba porsi alla guida di un autoveicolo (Legge 1 Agosto 2003, n. 214 - Art. 186). Il sospetto di tale reato autorizza gli organi di polizia stradale ad effettuare l’accertamento di “alterazione psico-fisica” dovuta all’alcol; accertamento che deve essere effettuato con strumenti e procedure determinati dal regolamento (DPR 16 Dicembre 1992, n. 495 - Art. 379). Le procedure degli esami dell’alcolemia sono dettate dall’articolo n°186 del Codice della Strada. Il livello di concentrazione ematica di etanolo a partire dal quale viene dichiarato lo stato di ebbrezza è stato fissato, in Italia, a 0,5 g/l. CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC Il presente metodo determina le concentrazioni sieriche e/o plasmatiche dell’Etanolo derivatizzandolo e leggendolo in HPLC a λ=385 nm . EUREKA srl – LAB DIVISION VAT N° 01547310423 E-mail:[email protected] www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N° 005 Etanolo sierico in UV 2 Febbraio 2010 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Il campione viene diluito e trattato a 40 °C per 30 minuti. Dopo raffreddamento, viene aggiunto il deproteinizzante e al surnatante viene aggiunto il derivatizzante. La soluzione viene posta a 70 °C per 15 minuti. Dopo raffreddamento la soluzione viene diluita e iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : < 0,02 g/l Range dinamico del metodo : 0,02 - 3,16 g/l Valori di riferimento del tasso alcolemico: Valore eccedente gli 0,5 g/l e non superiore agli 0,8 g/l: ammenda da 500,00 a 2.000,00 euro e arresto fino a un mese - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 3 a 6 mesi; Rif. Articolo n° 186 del Codice della Strada: Guida in stato di ebrezza valore eccedente gli 0,8 g/l e non superiore a 1,5 g/l: ammenda da 800,00 a 3.200,00 euro e arresto fino a tre mesi - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 6 mesi ad 1 anno; Valore superiore a 1,5 g/l: ammenda da 1.500,00 a 6.000,00 euro e arresto fino a 6 mesi - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 1 a 2 anni. Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2 – 8 °C. Contenuto della confezione : Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 20 ml Reagente B – Reagente B, 1 x 5 ml Reagente C - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml Reagente D - Soluzione Deproteinizzante, 1 x 10 ml Reagente E - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml Reagente F - Soluzione Test/Std Chimico, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente G - Soluzione Diluente, 1 x 100 ml Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 o 100 µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=385 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer e software gestionale Modalità per il prelievo ematico : Non devono essere usati disinfettanti alcolici. Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con K3EDTA+NaF come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a –20 °C. Stabile 4 settimane. La provetta deve essere conservata ben tappata. 3 PROCEDURA PREANALITICA Diluizione della Soluzione Test 3,16 g/l In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare : • 800 µl di H2O di grado HPLC • 200 µl di Reagente F – Soluzione Test In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare nell’ordine: • 200 µl di Reagente A - Sol. Tampone 1 • 50 µl di Reagente B • 50 µl di Sol. Test precedentemente diluita Al vortex per 10 secondi • Incubare a 40 °C per 30 minuti Raffreddare Aggiungere nell’ordine: • 100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2 • 100 µl di Reagente D – Sol. Deproteinizzante • 100 µl di Reagente E – Sol. Derivatizzante Al vortex per 10 secondi • Incubare a 70 °C per 15 minuti Raffreddare e agitare al vortex per 10 secondi Trasferire 100 µl del derivatizzato in una provetta e aggiungere 900 µl del Reagente G - Soluzione Diluente. Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : • Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 3. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Release N° 005 Etanolo sierico in UV 4 Febbraio 2010 PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Diluizione dei Campioni, del Calibratore e degli eventuali Controlli Campione Standard di calibrazione 800 µl 800 µl 200 µl Acqua di grado HPLC Campione Reagente F – Std di Calibrazione Controllo Controllo 800 µl 200 µl 200 µl IMPORTANTE : La soluzione standard di calibrazione va preparata di volta in volta FASE 2 : Preparazione dei Campioni, del Calibratore e dei Controlli Dispensare in provette da 1,5 ml con tappo: Reagente A – Sol. Tampone 1 Reagente B Acqua di grado HPLC Campione Standard chimico Controllo Bianco Campione Standard Controllo 200 µl 50 µl 50 µl 200 µl 50 µl 200 µl 50 µl 200 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Al vortex per 10 secondi FASE 3 : Porre la serie di provette a 40 °C per 30 minuti Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi FASE 4 : Procedura di deproteinizzazione Aggiungere in ciascuna provetta nell’ordine: • • 100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2 100 µl di Reagente D – Sol. Deproteinizzante Agitare vortex per 10 secondi e centrifugare a 5000 rpm per 5 minuti FASE 5 : Trasferire 400 µl di surnatante in provette da 1,5 ml con tappo e aggiungere: • 100 µl di Reagente E – Sol. Derivatizzante FASE 6 : Porre la serie di provette in stufa a 70 °C per 15 minuti Release N° 005 Etanolo sierico in UV 5 Febbraio 2010 Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi FASE 7 : Procedura di diluizione In una provetta idonea pipettare nell’ordine: • • 900 µl di Reagente G – Sol. Diluente 100 µl di campione precedentemente derivatizzato. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 °C INIEZIONE : • Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N° 005 Etanolo sierico in UV 6 Febbraio 2010 ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO - Avvertenze REAGENTE F : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST Etanolo 3,16 g/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 385 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ), è tassativo l’uso del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005.. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ). Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H2O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E’ possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 °C si consiglia di conservare a 2-8 °C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l’altra. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H2O e scaricare. Flussare una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H2O prima di condizionarla con la Fase Mobile. PARAMETRI HPLC LOOP Flusso di lavoro consigliato Pressione corrispondente 50 µl o 100 µl 1,2 ml/minuto Circa 80 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP – 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7 o 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z05820 Standard chimico per Etanolo sierico e/o plasmatico ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 PZ 7 2 x 5 ml 1 PZ ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 : Soluzione Test R.T. 10.330 Etanolo 3,16 g/l Fig. 4 : 8 Campione di plasma di soggetto sobrio ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 5 : Fig. 6 : Campione di plasma di medio bevitore R.T. 10.135 Etanolo 0,79 g/l 9 Campione di plasma di forte bevitore R.T. 10.143 Etanolo 3,16 g/l