Floris Tesi_2 - OpenstarTs - Università degli studi di Trieste

Risultati Rickettsia
11.3. Presenza di Rickettsia nei campioni di zecca raccolti nel 2006
La presenza di Rickettsia ha dimostrato una distribuzione sul territorio paragonabile nei due
anni di studio, con lievi variazioni in alcune stazioni. Rickettsia è stata individuata in 67 pool
di tre ninfe (15.2%) e 36 adulti (7.5%) di cui 16 maschi e 20 femmine. La prevalenza di
infezione nell’intera area di studio è stata del 6.1%. Il valore più alto è stato riscontrato nella
Zona 3 (8.4%), seguito dalla Zona 4 (6.4%), Zona 2 (5.7%) and Zona 1 (4.8%) (Tabella 11.3 e
Figura 11.2).
89
Risultati Rickettsia
Punte di prevalenza d’infezione sono state registrate nelle località di Clauzetto (ID 26),
seguita da Majano (ID 22) e Preone (ID 36), a cavallo delle aree alpina e prealpina, nella parte
centrale della regione FVG. Questo dato è in linea con i risultati ottenuti nell’ anno 2005 che
hanno indicato Socchieve (ID 5) come la stazione a maggior prevalenza. Al contrario,
nell’anno 2006 la stazione 5 è risultata negativa, mentre un dato di prevalenza simile a quello
registrato nell’anno precedente e stato rilevato nella vicina stazione 36 facendo supporre una
variazione spazio-temporali a livello locale. Lo stesso fenomeno è stato osservato per la
stazione di Kranjska Gora (ID 1): priva di Rickettsia durante l’anno 2005, è risultata tra le
località a maggior prevalenza di infezione pur essendo le vicine stazioni scarsamente infette.
Il microrganismo è apparentemente assente soltanto nelle località situate a quote più elevate
(ID 3 e ID 25) (Figure 11.3).
Anche la percentuale di esemplari adulti coinfetti con Borrelia si è dimostrata costante con un
valore del 2.1%, di cui l’80% erano zecche femmine.
Figura 11.3. Prevalenza annuale (%) di Rickettsia spp nel territorio regionale del FVG e area transfrontaliera
slovena durante l’anno 2006.
90
Risultati Rickettsia
Stazioni
Zona
ID
1
2
3
5
Località (m a. s. l.)
Kranjska gora (947)
Valbruna (836)
Val Pesarina (558)
Socchieve (450)
Fusine in Val Romana
1
(792)
30
31
Tarvisio (805)
33
Val Aupa (599)
34
Campiolo (370)
35
Pluzna (371)
36
Preone (540)
6
Kobarid (293)
7A
Taipana (722)
8A
Inglagna (368)
9
Faedis (242)
10
Costa (346)
20
Bosco Romagno (105)
Savorgnano del Torre
21
(168)
22
Majano (167)
2
23
Valeriano (180)
24
Barcis (475)
25
Cimolais (680)
26
Clauzetto (559)
Lago Di Cavazzo
27
(202)
28
Vedronza (334)
29
Osgnetto (177)
32
S.Giorgio (464)
3
12
Selva d’Arvonchi (3)
0
Padriciano (348)
11
Colle di Medea (101)
13
Marcottini (89)
14A Sveto (319)
15 Borgo Grotta Gigante
4
(212)
16
Ocizla (440)
17
Dobravlje (337)
18
Malchina (163)
19
Panovec (116)
Totale nell’area di studio
Zecche infette/zecche
raccolte, n
Prevalenza d’infezione, %
Infezione
media per
zona, %
Pool di 3
ninfe
Adulti
singoli
Ninfe
singole
Adulti
singoli
Zecca singola
(ninfe + adulti)*
1/3
0/5
0/8
0/4
2/22
1/20
0/7
0/17
12.6
0.0
0.0
0.0
9.1
5.0
0.0
0.0
10.1
2.9
0.0
0.0
0/1
3/29
0.0
10.3
9.4
1/6
0/9
2/10
0/6
3/7
0/7
0/8
1/7
0/1
3/11
0/2
0/12
0/5
0/2
1/13
1/13
1/15
0/8
1/12
2/39
0/12
3/25
5.9
0.0
7.2
0.0
17.0
0.0
0.0
5.0
0.0
3.1
0.0
0.0
0.0
0.0
7.7
7.7
6.7
0.0
8.3
5.1
0.0
12.0
3.5
0.0
6.8
3.2
13.4
2.8
0.0
6.2
4.8
2.3
9.7
0/2
2/24
0.0
8.3
6.7
0/4
2/10
0/8
0/10
4/10
4/18
0/10
1/24
0/11
0/4
0.0
7.2
0.0
0.0
26.3
22.2
0.0
4.2
0.0
0.0
13.3
5.4
2.1
0.0
23.2
3/12
0/5
9.1
0.0
8.0
0/6
0/2
1/9
1/9
1/9
0/6
3/22
18/72
2/15
3/26
0/5
3/21
0/6
3/13
0/3
1/11
0.0
0.0
3.9
3.9
3.9
0.0
4.8
9.1
13.3
11.5
0.0
14.3
0.0
23.1
0.0
9.1
6.1
9.4
3.3
8.4
3.2
9.7
4.6
9.1
4/18
0/4
8.0
0.0
7.4
6.4
6/23
2/21
3/40
2/14
61/402
0/4
0/9
0/5
2/10
36/479
9.6
3.3
2.6
5.0
5.1
0.0
0.0
0.0
20.0
7.5
9.1
2.9
2.5
7.9
6.1
6.1
4.8
5.7
8.4
Tabella 11.3. Prevalenza di Rickettsia spp. nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche della
regione FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.
Nell’anno 2006 è stato osservato un incremento della presenza di Rickettsia in tutta l’area di
studio, più marcato nella fascia prealpina (Zona 2) (Figura 11.4).
91
Risultati Rickettsia
% media annua per ambienti
10
8
6
2005
2006
4
2
0
AMBIENTE
ALPINO
AMBIENTE
PREALPINO
BOSCO
PLANIZIALE
AMBIENTE
CARSICO
Figura 11.4. Prevalenza media annua di Rickettsia: confronto per ambienti tra le raccolte 2005 e 2006.
Idendificazione della specie infettante
Il sequenziamento e l’analisi di omologia dei campioni positivi ha dimostrato che il 55.8% era
identico al gene 16S rRNA di R. helvetica (accession no. L36212), mentre il 43.2%
presentava la stessa sequenza del gene 16S rRNA di R. monacensis (accession no.
DQ100164). Inoltre, in un campione di zecca proveniente dalla località di Valbruna (ID 2), è
stata identificata una specie omologa al 99.8% a R. limoniae (accession no. AF322442). La
Tabella 11.4 riporta nel dettaglio le specie identificate in ogni stazione di campionamento.
La distribuzione delle specie di Rickettsia è risultata anch’essa paragonabile nei 2 anni di
studio con fluttuazioni non superiori al 3%, così come evidenziato dal confronto dei grafici a
torta riportati in Figura 11.5.
R. limoniae
R. monacensis
41,1
41,1
R. monacensis
43,2
58,5
43,2
1
1,0
55,8
55,8
58,5
R. helvetica
R. helvetica
2005
2006
Figura 11.5. Specie di Rickettsia identificate nell’area di studio: confronto tra le raccolte 2005 e 2006.
92
AMBIENTE PREALPINO
AMBIENTE ALPINO
Risultati Rickettsia
AMBIENTE CARSICO
BOSCO
PLANIZIALE
ID
Localita’
Specie Rickettsia
1
2
3
4
5
Kranjska gora
Valbruna
Val Pesarina
Saletto
Socchieve
R. helvetica
30
31
33
34
35
36
Fusine in Val Romana
Tarvisio
Val Aupa
Campiolo
Pluzna
Preone
R. limoniae
/
/
/
R. helvetica
R. helvetica
/
R. monacensis
R. monacensis
R. monacensis
6
Kobarid
R. helvetica
7A
8A
9
10
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
32
Taipana
Inglagna
Faedis
Costa
Bosco Romagno
Savorgnano del Torre
Majano
Valeriano
Barcis
Cimolais
Clauzetto
Lago Di Cavazzo
Vedronza
Osgnetto
S.Giorgio
/
R. monacensis + R. helvetica
R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. helvetica
R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. helvetica
/
R. monacensis
R. monacensis + R. helvetica
R. helvetica
R. helvetica
R. helvetica
12
Selva d’Arvonchi
R. monacensis + R. helvetica
0
11
13
14A
15
16
17
18
19
01*
Padriciano
Colle di Medea
Marcottini
Sveto
Borgo Grotta Gigante
Ocizla
Dobravlje
Malchina
Panovec
Basovizza
R. monacensis
R. monacensis
R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
R. monacensis + R. helvetica
* : stazione non indicata nella mappa di prevalenza d’infezione per Rickettsia.
Tabella 11.4. Specie di Rickettsia evidenziate nelle zecche raccolte durante l’anno 2006 in regione FVG e area
transfrontaliera slovena mediante sequenziamento dei positivi e analisii di omologia.
93
Risultati Anaplasma
12. ANAPLASMA NELLE ZECCHE I. RICINUS
12.1. Identificazione di A. phagocytophilum
Per la ricerca di A. phagocytophilum nei campioni di zecca sono stati utilizzati i primer diretti
verso il gene epank1 del patogeno (Walls et al., 2000). In Figura 12.1 si possono osservare gli
amplificati da circa 450 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati positivi per A.
phagocytophilum.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
450 bp
Figura 12.1. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da 450 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati
positivi all’amplificazione con primer specifici per il gene epank1 di A. phagocytophilum; corsia 1: PM 100 bp,
corsia 2: A. phagocytophilum (controllo positivo), corsie 3-17: DNA estratto da alcuni campioni di zecca, corsia
18: controllo negativo.
12.2. Presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecca
raccolti nel 2005
La presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecche I. ricinus raccolti nel territorio
regionale e transfrontaliero si è dimostrata alquanto bassa. La percentuale annua massima
rilevata è stata del 5.2% nella località di Mersino (ID 7), mentre in 6 delle 15 stazioni
campionate Anaplasma è risultato completamente assente (Figura 12.2 e Tabella 12.1). La
media annuale nell’intera area di studio è risultata di 1.6%.
Coinfezioni con B. burgdorferi e con Rickettsia sono state riscontrate rispettivamente nel
3.4% e nel 0.8% dei campioni di zecche adulte, metà maschi e metà femmine.
94
Risultati Anaplasma
Stazioni
Zo
na
1
2
3
4
ID
Località (m a. s. l.)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
11
13
14
Kranjska Gora (947)
Valbruna (836)
Val Pesarina (558)
Saletto (558)
Socchieve (450)
Kobarid (293)
Mersino (842)
Tridis (425)
Faedis (242)
Costa (346)
Selva D'arvonchi (3)
Colle di Medea (101)
Marcottini (89)
Komen (264)
Borgo Grotta Gigante
(212)
15
Totale nell’area di studio
Zecche infette/zecche
raccolte, n
Prevalenza d’infezione, %
Pools di
3 ninfe
Adulti
singoli
Ninfe
singole
Adulti
singoli
Zecca singola
(ninfe + adulti)*
0/28
1/12
0/11
0/9
1/3
0/28
2/15
0/6
0/1
0/16
1/14
0/12
1/35
0/20
1/10
0/19
1/13
0/2
1/62
0/35
1/15
2/27
0/81
0/32
2/26
0/5
0/9
0/3
0.0
3.1
0.0
0.0
0.0
0.0
4.7
0.0
0.0
0.0
2.6
0.0
0.9
0.0
10.0
0.0
7.7
0.0
1.6
0.0
6.7
7.4
0.0
0.0
7.7
0.0
0.0
0.0
1.1
2.1
2.3
0.0
1.4
0.0
5.2
4.9
0.0
0.0
4.6
0.0
0.8
0.0
5/85
0/16
2.0
0.0
1.9
10/295
8/355
1.2
2.3
1.6
Infezione
media per
zona, %
2.4
3.6
12.2
1.0
1.6
Tabella 12.1. Prevalenza di A. phagocytophilum nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche
del territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.
Figura 12.2. Prevalenza annuale (%) di A. phagocytophilum nel territorio regionale del FVG e area
transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.
95
Risultati Anaplasma
12.3. Presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecca
raccolti nel 2006
La diffusione territoriale di A. phagocytophilum durante l’anno 2006 ha dimostrato un
andamento disomogeneo caratterizzato da una presenza a spot, come nelle stazioni di
Socchieve (ID 5) e Savorgnano del Torre (ID 21), oppure ad area, come nell’area carsica
(Zona 4), dove il microrganismo è stato rilevato in siti poco distanti tra loro (Figura 12.3 e
Tabella 12.2).
La prevalenza di infezione nella località di Selva d’Arvonchi (ID 12), unico rappresentante
del bosco planiziale (Zona 3), ha riportato un valore inferiore rispetto l’anno precedente, ma
comunque maggiore rispetto alle altre zone fitoclimatiche (Tabella 12.2), dato che si può
apprezzare meglio nel confronto tra le prevalenze annuali illustrato in Figura 12.4.
Figura 12.3. Prevalenza annuale (%) di A. phagocytophilum nel territorio regionale del FVG e area
transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.
96
Risultati Anaplasma
Stazioni
Zona
ID
1
2
3
5
30
Località (m a. s. l.)
Kranjska gora (947)
Valbruna (836)
Val Pesarina (558)
Socchieve (450)
Fusine in Val Romana
1
(792)
31
Tarvisio (805)
33
Val Aupa (599)
34
Campiolo (370)
35
Pluzna (371)
36
Preone (540)
6
Kobarid (293)
7A
Taipana (722)
8A
Inglagna (368)
9
Faedis (242)
10
Costa (346)
20
Bosco Romagno (105)
21
Savorgnano del Torre
(168)
22
Majano (167)
2
23
Valeriano (180)
24
Barcis (475)
25
Cimolais (680)
26
Clauzetto (559)
27
Lago Di Cavazzo (202)
28
Vedronza (334)
29
Osgnetto (177)
32
S.Giorgio (464)
3
12
Selva d’Arvonchi (3)
0
Padriciano (348)
11
Colle di Medea (101)
13
Marcottini (89)
14A Sveto (319)
15
Borgo Grotta Gigante
4
(212)
16
Ocizla (440)
17
Dobravlje (337)
18
Malchina (163)
19
Panovec (116)
Totale nell’area di studio
Zecche
infette/zecche
raccolte, n
Pool di
Adulti
3 ninfe
singoli
Prevalenza d’infezione, %
Ninfe
singole
Adulti
singoli
Zecca singola
(ninfe + adulti)*
Infezione
media per
zona, %
0/3
0/5
0/8
1/4
0/22
0/20
0/7
0/17
0.0
0.0
0.0
9.1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
3.9
0/1
0/29
0.0
0.0
0.0
0/6
0/9
0/10
0/6
0/7
0/7
0/8
0/7
0/1
0/11
0/2
0/12
0/5
0/2
0/13
0/13
0/15
0/8
0/12
0/39
0/12
0/25
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0/2
0/24
0.0
0.0
0.0
0/4
0/10
0/8
0/10
0/10
0/12
0/6
0/2
0/9
0/9
0/9
0/6
1/22
1/72
0/18
0/10
0/24
0/11
0/4
0/5
0/15
0/26
0/5
2/21
0/6
0/13
0/3
0/11
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1.5
0.5
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
9.5
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
4.2
0.0
0.0
1.4
0.5
0.0
2/18
1/4
3.9
25.0
5.4
1.0
0/23
0/21
1/40
0/14
6/402
0/4
0/9
0/5
0/10
3/479
0.0
0.0
0.8
0.0
5.1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.6
0.0
0.0
0.8
0.0
0.7
0.7
0.4
4.2
Tabella 12.2. Prevalenza di A. phagocytophilum nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche
del territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.
97
Risultati Anaplasma
In generale, nell’anno 2006 le aree alpina (Zona 1) e prealpina (Zona 2) hanno visto una
diminuzione della prevalenza d’infezione, mentre nell’area del Carso (Zona 4) la prevalenza
d’infezione è risultata immutata (Figura 12.4),.
2005
14,0
2006
% media annua per ambienti
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
AMBIENTE ALPINO
AMBIENTE PREALPINO BOSCO PLANIZIALE
AMBIENTE CARSICO
Figura 12.4. Prevalenza media annua di A. phagocytophilum: confronto per ambienti tra le raccolte 2005 e 2006.
Anche la presenza di esemplari coinfetti è risultata inferiore rispetto l’anno precedente, infatti
è stato riscontrato un valore di 0.2% di zecche adulte contemporaneamente positive anche per
B. burgdorferi.
Identificazione della specie infettante
Infine, tutti i campioni positivi all’amplificazione, sia quelli della raccolta 2005 che 2006,
sono stati sequenziali e identificati come A. phagocytophilum in base alla completa omologia
con le sequenze dei ceppi europei depositate in banca dati GenBank (accession n° AY529488,
AF482759).
98
Risultati virus TBE
13. VIRUS TBE NELLE ZECCHE I. RICINUS
13.1. Identificazione del virus TBE
La ricerca di sequenze specifiche del genoma del virus TBE è stata condotta amplificando la
regione non codificante all’estremità 5’ (5’-NCR) del genoma virale. In Figura 13.1 si
possono osservare le bande da 128 bp di alcuni campioni di zecca risultati positivi.
Figura 13.1. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da 128 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati
positivi all’amplificazione con primer specifici per la regione 5’-NCR del virus TBE: corsia M: PM 100 bp,
corsie 1-2: ceppo IR 454 (controllo positivo), corsie 3-14: DNA estratto da alcuni campioni di zecca, corsia 15:
controllo negativo.
13.2. Presenza di virus TBE nelle zecche raccolte nel 2005
Sequenze specifiche del virus TBE sono state rilevate in tutte le stazioni campionate, eccetto
nella stazione di Komen (ID 14). Sono stati riscontrati valori di prevalenza compresi in un
range molto ampio che va dal 11.5% di Borgo Grotta Gigante (ID 15) fino al 63,6% di Faedis
(ID 9) e 75% di Kobarid (ID 6) (Tabella 13.1).
I dati di prevalenza così ottenuti sono stati integrati con l’abbondanza di zecche al fine di
calcolare l’indice di rischio (IR) per ogni stazione. Dall’elaborazione presentata in Figura
13.2 appare evidente che la distribuzione del rischio per l’infezione da virus TBE è maggiore
nell’area alpina-prealpina, a cavallo del confine italo-sloveno.
99
Risultati virus TBE
Stazioni
Zona
1
2
3
4
ID
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
11
13
14
15
Località (m a. s. l.)
Kranjska Gora (947)
Valbruna (836)
Val Pesarina (558)
Saletto (558)
Socchieve (450)
Kobarid (293)
Mersino (842)
Tridis (425)
Faedis (242)
Costa d’Alviano
Selva d’Arvonchi (3)
Monte di Medea
Marcottini (89)
Komen
Borgo Grotta Gigante (212)
Prevalenza d’infezione per zecca singola
(ninfe + adulti)* , %
annuale
Infezione media per zona, %
22.1
54.6
41.6
34.8
52.5
44.0
75.0
35.3
37.2
50.0
63.6
12.6
32.0
32.0
50.0
38.5
24.7
0.0
11,5
Tabella 13.1: Prevalenza del virus TBE nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche del
territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.
Figura 13.2. Distribuzione del rischio (IR) per il virus TBE nel territorio regionale del FVG e area
transfrontaliera slovena.
100
Risultati virus TBE
Un tasso d’infezione maggiore è stato osservato nelle zecche adulte rispetto alle ninfe, ad un
livello di significatività di p = 0.031 (Figura 13.3).
90
80
% INNINFE
F. N YMINF.
PHS
% INADULTI
F. AD U INF.
LTS
74,7
70
64
58 ,3
60
50
37,7
40
30
27,1
23,0
20
16 ,2
11,1
10
0
ALPINZona
E LAN D1SC APE
Zona
2 SC APE
PR EALPIN
E LAN
ZonaFO3R EST
PLAIN
K ARZona
ST LAN4D SC APE
Figura 13.3. Prevalenza del virus TBE in ninfe ed adulti nelle quattro zone fitoclimatiche.
Come si può osservare nell’istogramma di Figura 13.4, l’elaborazione effettuata in relazione
alle zone fitoclimatiche ha messo in evidenza un incremento della prevalenza del virus dalla
costa (Zona 4) verso l’arco alpino (Zona 1).
50
4 1,6
40
3 7 ,2
3 2 ,0
30
2 4 ,7
20
10
0
ALPIN EZona
LAN D1SC APE
PR EALPIN
E LAN
Zona
2 SC APE
PLAIN
FO R
Zona
3 EST
K AR ST Zona
LAN D4SC APE
Figura 13.4. Prevalenza di infezione media annua per il virus TBE nelle quattro zone fitoclimatiche
101
Risultati virus TBE
Nelle zecche adulte analizzate singolarmente sono state rilevate coinfezioni con B.
burgdorferi nel 7.7%, con Rickettsia nel 1.5% e con A. phagocytophilum nel 0.8%. Inoltre,
sono state evidenziate coinfezioni con 3 patogeni: nel 0.8% dei campioni positivi al virus
TBE erano presenti anche B. burgdorferi e Rickettsia, mentre nel 0.4% erano copresenti B.
burgdorferi e A. phagocytophilum. Da notare che l’83% di tutte le confezioni sono state
riscontrate in zecche femmine adulte.
Un’attenta comparazione tra gli IR del virus TBE e B. burgdorferi nell’area di studio ha
evidenziato una distribuzione contrapposta dei due patogeni: il virus mostra di predominare
ad altitudini maggiori, mentre B. burgdorferi prevale nella zona carsica (Tabella 13.2).
Zona
1
2
3
ID
località
IR B.burgdorferi
IR virus TBE
1
Kranjska gora
8.5
15.9
2
Valbruna
1.0
14.6
3
Val Pesarina
0.0
6.0
4
Saletto
0.0
9.5
5
Socchieve
6.0
12.0
6
Kobarid
7.8
42.0
7
Mersino
0.3
14.1
8
Tramonti di Sotto
2.7
8.0
9
Faedis
5.4
24.6
10
Costa
15.5
1.0
12
Bosco Baredi
10.7
7.2
11
Monte di Medea
2.7
1.0
13
Marcottini
20.7
5.8
N.
Komen
4.3
0.0
15
Borgo Grotta Gigante
18.2
9.1
4
Tabella 13.2: Confronto tra gli indici di rischio per Borrelia e virus TBE nell’area di studio.
102
Risultati virus TBE
13.3 Identificazione del sottotipo del virus TBE
Tutti i campioni risultati positivi sono stati sequenziati e allineati con le sequenze disponibili
in banca dati GenBank al fine di identificare il sottotipo di appartenenza. Nell’analisi è stato
incluso anche il controllo positivo IR 454 isolato nel bellunese.
Le sequenze del virus TBE presenti nelle zecche infette si sono dimostrate identiche al ceppo
IR 454 e differenti dal ceppo Neudoerfl (accession n° U27495), appartenente al sottotipo
Western European TBE, in 2 posizioni (nucleotidi 5 e 110 dell’amplificato) corrispondente ad
una omologia del 98,4%. La Figura 13.5 mostra alcune sequenze rappresentative
dell’allineamento.
Figura 13.5. Allineamento delle sequenze 5’-NCR di 5 campioni di zecca positivi e del ceppo bellunese IR 454
con la sequenza depositata in banca dati GenBank del ceppo Neudoerfl appartenente al sottotipo Western
European TBE virus (U27495).
103
Risultati Babesia
14. BABESIA NELLE ZECCHE I. RICINUS
14.1. Area di studio e campionamento di I. ricinus
Le zecche della specie I. ricinus sono state raccolte nelle località di Padriciano e Basovizza,
sul Carso triestino (Figura 14.1). A Padriciano è stato campionato lo stesso sito (indicato con
il numero 0) in entrambi gli anni di raccolta, mentre nella località di Basovizza i siti
campionati sono stati diversi tra i 2 anni. Con il sito di Padriciano si è voluto verificare la
dinamica della presenza di Babesia nel tempo mantenendo lo stesso punto di raccolta. Invece,
il sito 01 di Basovizza, molto vicino al Sincrotrone, quindi in un’area modificata dall’attività
umana vista la sua importanza per le attività sportive, è stato campionato solo nel 2006; per il
campionamento 2007 si è pensato di individuare altri 3 siti (indicati con 1R, 1V e 1G) sempre
nella località di Basovizza, in una zona considerata più “selvaggia”, caratterizzata da prati non
sfalciati. Lo scopo era quello di campionare un maggior numero di siti in un’area ristretta per
poter valutare la differenza di infettività delle zecche in siti contigui e di fare un confronto tra
aree a diverso impatto ambientale.
Figura 14.1. Foto aerea dell’area di studio localizzata sul Carso triestino. I siti di raccolta delle zecche sono
indicati con le sigle di colore giallo 0, 01, 1R, 1V e 1G. Sono visibili i centri abitati di Padriciano e Basovizza e
il Sincrotrone.
104
Risultati Babesia
La popolazione di zecche I. ricinus raccolta nelle località di Padriciano e Basovizza nel
biennio 2006-2007era composta da 1623 ninfe (85,8%) e da 238 adulti (12,6%), di cui 151
maschi e 87 femmine. L’abbondanza cumulata delle zecche nelle due località campionate ha
evidenziato una costante presenza dello stadio ninfale (85-87%), mentre il numero degli adulti
è raddoppiato nel secondo anno di raccolta.
14.2. Identificazione di Babesia spp.
Dall’esperienza maturata in laboratorio abbiamo verificato che amplificare il DNA
proveniente da estratti di zecca può dare problemi di inibizione, probabilmente dovuti a
sostanze che il protocollo di estrazione non riesce ad eliminare. Prove di amplificazione
eseguite sui controlli positivi e su controllo positivo+estratto di zecca (spike-DNA) hanno
consentito di valutare la sensibilità di alcuni protocolli descritti in letteratura. I metodi di
amplificazione del gene 18S rRNA proposti da Persing et al. (1992) e Herwaldt et al. (2004)
hanno dato prodotti di amplificazione scarsamente visibili e sono stati scartati. Il sistema
migliore è risultato quello creato da Cacciò et al. (2000), ossia, un sistema nested-PCR
specifico per il gene della β-tubulina; abbastanza sensibile si è rivelata anche l’amplificazione
singola del gene 18S rRNA con la coppia di primer disegnata dal Dott. Pleniazek.
Amplificazione del gene per la β-tubulina
Il DNA estratto dai campioni di zecca sono stati amplificati con primer specifici per il gene
che codifica la β-tubulina di Babesia.
Figura 14.2 Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da circa 310-320 bp di alcuni campioni di I. ricinus
amplificati con primer specifici per il gene per la β-tubulina di Babesia: corsia 1: peso molecolare da 100 bp,
corsia 2: SLO1-B. divergens (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4: SLO3-Babesia EU1
(controllo positivo), corsie 5-9: campioni di zecca.
105
Risultati Babesia
Il metodo descritto da Cacciò et al. (2000) non includeva la specie Babesia EU1.
L’amplificazione del controllo positivo SLO3 (Babesia EU1) ha evidenziato un prodotto di
amplificazione di circa 310-320 bp, leggermente più basso rispetto a quello ottenuto per
SLO1 (B. divergens). La Figura 14.2 mostra gli amplificati da circa 310-320 bp dei controlli
positivi SLO 1 (B. divergens), SLO3 (Babesia EU1) e di alcuni campioni di I. ricinus risultati
positivi dopo nested-PCR e visualizzati su gel di agarosio.
Amplificazione del gene 18S rRNA
I campioni risultati positivi all’amplificazione del gene per la β-tubulina di Babesia sono stati
nuovamente amplificati con primer specifici per il gene 18S rRNA di Babesia disegnati dal
Dott. Pleniazek. La figura 14.3 mostra gli amplificati da circa 650 bp dei controlli positivi e di
alcuni campioni di zecca. Questo sistema è risultato meno sensibile rispetto la nested-PCR,
per cui è stato possibile riamplificare soltanto una parte dei campioni positivi.
Figura 14.3. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da circa 650 bp di alcuni campioni di I. ricinus
amplificati con primer specifici per il gene 18S rRNA di Babesia: corsia 1, 6: controlli negativi; corsia 2:
controllo positivo (SLO1-B. divergens), corsie 3: controllo positivo (SLO3-Babesia EU1); corsie 4: controllo
positivo (SLO2-B. microti); corsie 5: controllo positivo (BABDNA1-B. microti); corsia 7-13: campioni di zecca;
corsie 14: peso molecolare da 100 bp.
14.3. Presenza di Babesia nei campioni di zecca raccolti negli
anni 2006-2007
In totale sono risultati positivi 19 campioni, di cui 4 raccolti nel sito 0 di Padriciano nel 2006
e 15 distribuiti tra le zecche provenienti dalle quattro stazioni del 2007 (Tabella 14.1). In tutti
i siti è stato trovato almeno un campione positivo, eccetto nella stazione 01 di Basovizza.
106
Risultati Babesia
ID
0
01
1G
1R
1V
anno 2006
pool di ninfe
adulti
4/112
0/22
0/32
0/10
/
/
/
/
/
/
località
Padriciano
Basovizza
Basovizza
Basovizza
Basovizza
anno 2007
pool di ninfe
adulti
4/359
7/195
/
/
0/8
1/5
2/22
0/4
0/7
1/2
Tabella 14.1. Numero di campioni positivi per Babesia raccolti nelle località di Padriciano e Basovizza nel
biennio 2006-2007, tenendo conto dello stadio di sviluppo.
La prevalenza di infezione annuale ha evidenziato un valore paragonabile tra i 2 anni di
campionamento: 0.8% nel 2006 e 1.1% nel 2007. Per la stazione di Padriciano, l’andamento
annuale si è dimostrato stabile, oscillando tra l’ 1.1% e 0.9% nei 2 anni. Al contrario, nel
campionamento della località di Basovizza nell’anno 2006 (sito 01) non è stata riscontrata la
presenza del patogeno, che invece è stata dimostrata nelle 3 raccolte a spot effettuate nel 2007
(siti 1R, 1V, 1G), ma in un’area a minor impatto ambientale. Le prevalenze nei 3 siti di
Basovizza 2007 sono state decisamente più alte rispetto a Padriciano, con valori tra il 2.5% e
4.3% (Tabella 14.2).
Osservando i dati di prevalenza di Babesia nelle zecche in relazione allo stadio di sviluppo si
può notare che è maggiore il numero di adulti infetti rispetto a quello delle ninfe.
ID
Località
prevalenza anno 2006, %
ninfe
adulti
singola
singole
singoli
prevalenza anno 2007, %
zecca
ninfe
adulti
singola zecca
(ninfe + adulti)
singole
singoli
(ninfe+adulti)
0
Padriciano
1.2
0.0
1.1
0.4
3.6
0.9
01
Basovizza
0.0
0.0
0.0
/
/
/
1G
Basovizza
/
/
/
0
20.0
3.4
1R
Basovizza
/
/
/
2.7
0.0
2.5
1V
Basovizza
/
/
/
0
50.0
4.3
TOTALE
0.8
1.1
Tabella 14.2. Valori di prevalenza per Babesia nei campioni di zecca raccolti nelle località di Padriciano e
Basovizza nel biennio 2006-2007, riportati in base allo stadio di sviluppo e come valore cumulato.
107
Risultati Babesia
14.4. Identificazione della specie di Babesia
Sequenze del gene per la β-tubulina
I campioni risultati positivi all’amplificazione del gene per la β-tubulina di Babesia sono stati
sequenziati. L’analisi di omologia ha permesso di evidenziare 2 gruppi genetici distinti: un
gruppo di 2 sequenze simili tra loro e vicine alla specie B. divergens compongono il gruppo
definito “gruppo B. divergens-like” (Figura 14.4 e 14.6), mentre 12 sequenze identiche tra
loro hanno dimostrato un’alta omologia con la specie Babesia EU1 ed è stato definito
“gruppo Babesia EU1-like” (Figura 14.5 e 14.6). Purtroppo per 5 campioni non è stato
possibile ottenere una sequenza chiara che permettesse l’identificazione della specie; è stato
possibile, però, confermare che le sequenze amplificate allineavano esclusivamente col genere
Babesia.
Gruppo B. divergens-like:
42-0FR5a
36-01FRa
-------------GACATGATTCGTA-GCGTGCACCATAACACATAAGCTACATGACTGC
CTGCCATATGATAGACTGTATGGGCGTGTGTTCACCAAAACACATAAGCTACATGACTGC
42-0FR5a
36-01FRa
GTGGTTTGTGGCAAATGCCATGTCTTGCTTCACAATGTACTTCACCAAAGACTTTTATAT
GTGGTTTGTGGCAAATGCCATGTCTTGCTTCACAATGTACTTCACCAAAGACTTTTATAT
42-0FR5a
36-01FRa
TCAATGCGCTAACAACGACACAGAGCGGAACATACCACGGAGACAGTGACTTGCAACTGG
TCAATGCGCTAACAACGACACAGAGCGGAACATACCACGGAGACAGTGACTTGCAACTGG
42-0FR5a
36-01FRa
AGCGTGTTGATGTATTCTACAATGAAGCCGCTGGTGGGCGCTACGTCCCCCGTGCCATCT
AGCGTGTTGATGTATTCTACAATGAAGCCGCTGGTGGGCGCTACGTCCCCCGTGCCATCT
42-0FR5a
36-01FRa
TGATGGACCTGGAACCTGGAACCATG---------TGATGGACCTGGAACCCGGAACCATGGGACTCAGTA
AGCT: introne
AGCT: esone
Figura 14.4. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene per la β-tubulina di Babesia dei
campioni inclusi nel gruppo B. divergens-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per
Babesia divergens
108
Risultati Babesia
Gruppo Babesia EU1-like:
6-0FR5a
71-0FR4a
40-01FRa
44-01FRa
3-01FRa
37-0FR5a
340-0FR5a
81-0FR4a
384-0FR5a
97-0FR4a
82-0FR4a
29-0FRa
AATATAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
AATATAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
-------------------TAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
-ATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
----TAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
-ATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
-------AGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
-----AGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
---ATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA
6-0FR5a
71-0FR4a
40-01FRa
44-01FRa
3-01FRa
37-0FR5a
340-0FR5a
81-0FR4a
384-0FR5a
97-0FR4a
82-0FR4a
29-0FRa
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC
6-0FR5a
71-0FR4a
40-01FRa
44-01FRa
3-01FRa
37-0FR5a
340-0FR5a
81-0FR4a
384-0FR5a
97-0FR4a
82-0FR4a
29-0FRa
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT
6-0FR5a
71-0FR4a
40-01FRa
44-01FRa
3-01FRa
37-0FR5a
340-0FR5a
81-0FR4a
384-0FR5a
97-0FR4a
82-0FR4a
29-0FRa
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG
ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACC---------
6-0FR5a
71-0FR4a
40-01FRa
44-01FRa
3-01FRa
37-0FR5a
340-0FR5a
81-0FR4a
384-0FR5a
97-0FR4a
82-0FR4a
29-0FRa
GAACCAT--------GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGACTCAGTA
GAACCATGA------GAACCATGA----------------------
AGCT: introne
AGCT: esone
Figura 14.5. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene per la β-tubulina di Babesia dei
campioni inclusi nel gruppo Babesia EU1-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per
Babesia EU-1
109
Risultati Babesia
Le sequenze sono state sottoposte ad analisi filogenetica con il programma Multialin
(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html). Come dimostra la figura
14.6, la sequenza 36-01, che rappresenta il gruppo B. divergens-like fa cluster (gruppo) con la
specie B. divergens, mentre la sequenza 3-01 che rappresenta il gruppo Babesia EU1-like fa
cluster con la specie Babesia EU1 corrispondente al controllo positivo SLO3.
Theileria annulata AJ289245
Theileria annulata EF060268
B. microti AJ289250
B. microti AB083377
B. microti
B. microti AB219803
B. microti AB124587
B. bovis AJ289247
B. bovis
B. bovis XM001611566
B. odocoilei AY144705
B. odocoilei
B. odocoilei AY144706
B. divergens AY144704
SLO1 strain
B. divergens AJ289248
B. divergens
B. divergens AY144703
BABBO strain
36-01 sample
SLO3 strain
B. sp.EU1
3-01 sample
Theileria sergenti AJ289244
Homo sapiens NG002334
10 PAM
3-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. EU1-like
36-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. divergens-like
SLO3 strain= B. EU1 (Controllo positivo)
BABBO strain= B. divergens (Controllo positivo)
SLO1 strain= B. divergens (Controllo positivo)
SIGLA GI= Sequenze in banca dati GenBank
Figura 14.6. Risultato dell’analisi filogenetica eseguita sulle sequenze del gene della β-tubulina di Babesia con
il programma Multialin che utilizza le distanze PAM (Percent Accepted Mutation). Il campione 36-01
rappresenta il gruppo B. divergens-like, mentre il campione 3-01 rappresenta il gruppo Babesia EU1-like.
110
Risultati Babesia
Amplificazione del gene 18S rRNA
Sono stati sequenziati anche gli amplificati del gene 18S rRNA di Babesia di alcuni dei
campioni positivi per la β-tubulina. L’analisi di omologia ha permesso di confermare che il
raggruppamento in “gruppo Babesia EU1-like” e “gruppo B. divergens-like” era corretto,
così come dimostrano le elaborazioni riportate in Figura 14.7, 14.8 e 14.9.
Gruppo Babesia EU1-like:
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
GAGATAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT
---------------------------------CTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT
---------------------------------------GCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT
---------------------------------CTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT
---------------------------------------------------GCTCGAAGT
---------------------------------CTTGTTGCAGTTAAAATAGCTCGTAGT
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA
44-01BABES5a
151-0BABES5a
3-01BABES5a
40-01BABES5a
340-0BABES5a
384-0BABES5a
CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAGGTC
CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCA----CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC
CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC
CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC
CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC
Figura 14.7. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene 18S rRNA di Babesia dei campioni
inclusi nel Gruppo Babesia EU1-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per Babesia
111
Risultati Babesia
Gruppo B. divergens-like:
gi|57472249|B. capreoli
gi|55709804|B. divergens
SLO1-BABES|B. divergens
36-01BABES|
BABBO-BABES|B. div/cap
CACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA
CACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA
-------------------------GTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA
-------------------------GTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-G-TA
-------------------------GTCTGGTGCCAGCGAGCCGCTGGTA
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
AT-TCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCG
AT-TCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCG
AT-TCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCG
AT-TCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCG
ATATCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGATCG
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
TAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTGATGT-CGAGATTGCAC
TAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTAATGT-CGAGATTGCAC
TAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTAATGT-CGAGATTGCAC
TAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTGATGT-CGAGATTGCAC
TAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTGATGTACGAGATTGCAC
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
TTCGCTTTTGGGATTTTTCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTC
TTCGCTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTC
TTCGCTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTC
TTCGCTTTTGGGATTTTTCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTC
TTCGCTTTTGGGATTTTTCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGCTTC
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACT
AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACT
AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACT
AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACT
AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACT
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
TTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACG
TTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACG
TTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACG
TTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACG
TTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAATAATGGTTAATAGGAACG
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
GTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTT
GTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTT
GTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTT
GTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTT
GTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTT
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
AAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAA
AAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAA
AAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAA
AAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAA
AAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAA
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
GAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAAC
GAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAAC
GAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAAC
GAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAAC
GAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAAC
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
CATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTT
CATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTT
CATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTT
CATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTT
CATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTT
gi|57472249|
gi|55709804|
SLO1-BABES|
36-01BABES|
BABBO-BABES|
CAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTC
CAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTC
CAGCACCTTGAGAGAAATCA-----------------------------CAGCACCTTGAGAGAAATCA-----------------------------CAGCACCTTGAGAGAAATCA------------------------------
Figura 14.8. Allineamento multiplo della sequenza corrispondente al gene 18S rRNA di Babesia del campione
positivo 36-01BABES incluso nel Gruppo B. divergens-like con sequenze di controllo (SLO1-BABES =
controllo positivo B. divergen; BABBO-BABES = controllo positivo per B. divergens GI 57472249 e GI
55709804 = sequenze in banca dati GenBank)
112
Risultati Babesia
Con i primer per il gene 18S rRNA è stato possibile amplificare soltanto il campione 36-01
del gruppo B. divergens-like. L’analisi della sequenza 36-01 ha messo in evidenza
un’omologia leggermente più alta con la specie B. capreoli, rispetto alla specie B. divergens,
così come il controllo positivo BABBO (B. divergens) proveniente da Bologna. Il confronto
con il controllo positivo SLO1 (B. divergens) indica che le specie B. divergens e B. capreoli
sono estremamente vicine dal punto di vista genetico (Figura 14.8 e Tabella 14.3).
campione
omologia con le sequenze in GenBank
B. divergens gi|55709804|
B. capreoli gi|57472249|
36-01
99,4 %
99,8 %
SLO1
100 %
99,6 %
BABBO
98,2 %
98,6 %
Tabella 14.3. Analisi di omologia tra le sequenze del gene 18 S rRNA ottenute dal campione 36-01 (gruppo B.
divergens-like) e dai controlli positivi SLO1 (B. divergens) e BABBO (B. divergens).
Le sequenze sono state sottoposte ad analisi filogenetica con il programma Multialin
(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html).
Come dimostra la Figura 14.9, la sequenza 36-01, che rappresenta il gruppo B. divergenslike, fa cluster (gruppo) con la specie B. divergens, ma nel cluster c’è anche B. capreoli, a
conferma del fatto che queste due specie sono filogeneticamente molto simili tra loro. La
sequenza 3-01, che rappresenta il gruppo Babesia EU1-like, fa indubbiamente cluster con il
controllo positivo SLO3 (Babesia EU1) e con le sequenze della specie Babesia EU1
depositate in banca dati GenBank.
113
Risultati Babesia
B. odocoilei AY046577
B. odocoilei AY237638
B. odocoilei
B. odocoilei AY339761
3-01 sample
B. sp. EU1 AY046575
B. sp. EU1 EF185818
B. sp. EU1
B. sp. EU1 AY553915
SLO3 strain
B. sp. EU1 AY572457
BABBO strain
SLO1 strain
B. divergens
36-01 sample
B. capreoli AY726010
B. capreoli
B. capreoli AY726009
B. divergens EF458229
B. divergens AY046576
B. divergens
B. divergens AY789076
G1 strain
G2 strain
B. microti AY693840
B. microti
B. microti AY144700
B. microti AY144701
B. bovis EF643472
B. bovis EF458213
B. bovis
B. bovis L31922
10 PAM
3-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. EU1-like
36-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. divergens-like
SLO3 strain= B. EU1 (Controllo positivo)
BABBO strain= B. divergens (Controllo positivo)
SLO1 strain= B. divergens (Controllo positivo)
G1 strain= B. microti (Controllo positivo)
G2 strain= B. microti (Controllo positivo)
SIGLA GI= Sequenze in banca dati GenBank
Figura 14.9. Risultato dell’analisi filogenetica eseguita sulle sequenze del gene 18S rRNA di Babesia con il
programma Multialin che utilizza le distanze PAM (Percent Accepted Mutation). Il campione 36-01 rappresenta
il gruppo B. divergens-like, mentre il campione 3-01 rappresenta il gruppo Babesia EU1-like.
114
Risultati multiplex PCR
15. MULTIPLEX PCR
La tecnica multiplex PCR consente di amplificare due o più bersagli genetici con coppie di
primer specifiche per ogni singolo bersaglio, in un’unica reazione di amplificazione. Lo
sviluppo di un protocollo specifico per l’identificazione simultanea di Borrelia, Rickettsia,
Anaplasma e Babesia risulta di particolare utilità nel far risparmiare tempo e denaro quando si
effettuano screening su grandi numeri oppure, nel caso di un’applicazione diagnostica,
accelerare la risposta di laboratorio, soprattutto per quei casi che presentano una
sintomatologia atipica difficilmente riconducibile, in tempi brevi, ad una specifica malattia
trasmessa da zecche.
15.1. Creazione dei primer
Le sequenze dei patogeni depositate in banca dati GenBank sono state allineate con il
software ChromasPro Version 1.41. (Figura 15.1) al fine di individuare le regioni costanti
presenti nelle diverse specie di ogni singolo patogeno.
Figura 15.1. Parte dell’allineamento delle sequenze di diverse specie di Borrelia depositate in banca dati
GenBank con il software ChromasPro Version 1.41.
115
Risultati multiplex PCR
Su queste regioni costanti sono state disegnate le sequenze dei primer utilizzando il
programma
Primer
3
(http://frodo.wi.mit.edu/)
disponibile
in
rete.
Un
esempio
dell’elaborazione viene presentata in Figura 15.2.
Figura 15.2. Elaborazione dei primer specifici per il gene epank1 di A. phagocytophilum nel sistema multiplex
PCR
In base all’elaborazione ottenuta con il programma Primer 3 sono stati scelti 4 set di primer di
diverso peso molecolare del prodotto di amplificazione (Tabella 15.1), al fine di distinguerli
su gel di agarosio. L’altra caratteristica che ha condizionato la scelta di queste 4 coppie è stata
la temperatura di appaiamento di circa 58°C - 60°C, in modo da poter applicare un comune
ciclo di amplificazione, in particolare, una temperatura di appaiamento egualmente favorevole
alle 4 coppie di primer del sistema multiplex PCR.
patogeno
B. burgdorferi s. s.
Babesia spp.
bersaglio
nome primer
Sequenza primer 5’→3’
spazio intergenico 5S-23S
gene
18S
rRNA
BORMUL1
BORMUL2
BABMUL1
BABMUL2
ANAMUL1
ANAMUL2
RICMUL1
RICMUL2
GAGTTCGCGGGAGAGTAAGTT
TTTGCCAATTTGTTTATGCAAC
GACGAACTACTGCGAAAGCA
GTGCTGAAGGAGTCGGAAAA
CTGTCGGCCACTCTCTTCTC
ACGGACGAGCTTTCAATGAT
GAGGATGATCAGCCACACTG
AATTAAACCGCATGCTCCAC
A. phagocytophilum
gene epank1
Rickettsia spp.
gene
rRNA
Tabella 15.1.
16S
Peso dell’
amplificato
200 bp
153 bp
311 bp
638 bp
Nomi e caratteristiche delle coppie di primer del sistema multiplex PCR disegnati con il
programma Primer 3.
116
Risultati multiplex PCR
15.2.Verifica dell’efficienza dei primer
Amplificazione con coppia singola di primer
La verifica dell’efficienza delle singole coppie di primer è stata effettuata applicando il
seguente protocollo: 2.5 o 5 µl del DNA estratto, 1X tampone di reazione per Taq polimerasi
(New England Biolabs), 0.3 µM di ogni primer (Sigma-Genosys Ltd), 200 µM di ogni
desossinucleotide (Eppendorf), 0.8 U di Taq polimerasi (New England Biolabs), e acqua
ultrapura fino a un volume finale di 25 µl.
Sono state effettuate diverse prove di amplificazione variando sia la temperatura e il tempo di
appaiamento, che il tempo di allungamento. Le condizioni di PCR del ciclo riportato di
seguito sono quelle che hanno dimostrato di favorire al meglio tutti e quattro i set di primer
portando ad un prodotto di amplificazione ben visibile su gel di agarosio:
PROGRAMMA “MULTIPLEX“
n° di cicli
denaturazione T / t
1
95°C / 3’
40
94°C / 1’
appaiamento T / t
allungamento T / t
58°C / 1’
72°C / 1’
1
72°C / 15’
La valutazione della specificità di ogni coppia di primer verso quel patogeno per il quale è
stata disegnata è stata effettuata includendo nelle analisi:
1) il DNA degli altri patogeni al fine di rilevare eventuali amplificazioni in comune con un
patogeno che quella coppia di primer non doveva amplificare,
2) il DNA estratto da alcuni campioni di zecca al fine di accertare che nessuna delle 4 coppie
fosse in grado di amplificare il genoma di I. ricinus.
La coppia di primer BORMUL ha dimostrato un’elevata specificità di amplificazione per B.
burgdorferi amplificando soltanto il DNA di Borrelia, anche nei campioni di zecca (Figura
15.3). Infatti, uno degli estratti di zecca è risultato positivo per il microrganismo, perciò è
stato possibile dimostrato che BORMUL è in grado di amplificare in maniera specifica anche
il DNA di Borrelia presente nelle zecche senza subire evidente inibizione (Figura 15.3A,
corsia 5).
117
Risultati multiplex PCR
1
2
3
4
5
6
1
500 bp
500 bp
200 bp
200 bp
2
3
A)
4
5
6
B)
Figura 15.3. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 200 bp ottenuto con la coppia di primer
BORMUL specifica per B. burgdorferi s. l. A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Borrelia afzelii (controllo
positivo), corsia 3: Borrelia garinii (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, lane 4, 5: DNA estratto da
campioni di zecca. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: controllo negativo; corsia 3: Borrelia garinii (controllo
positivo), corsia 4: Rickettsia helvetica, corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: Babesia EU1.
Anche la coppia di primer BABMUL ha dimostrato di essere specifica appaiandosi soltanto
con le sequenze genomiche di Babesia. Infatti, come si può osservare in Figura 15.4 le corsie
contenenti le amplificazioni del DNA degli altri patogeni e di zecca sono completamente
negative.
1
2
3
4
5
6
1
2 3 4 5
6 7
500 bp
500 bp
200 bp
200 bp
A)
B)
Figura 15.4. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 153 bp ottenuto con la coppia di primer
BABMUL specifica per Babesia spp. (foto in contrasto) A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Babesia EU1
(controllo positivo); corsia 3: controllo negativo, lane 4, 5: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 6:
controllo negativo. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Babesia EU1 (controllo positivo); corsia 3: controllo
negativo, corsia 4: Rickettsia helvetica, corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: Borrelia afzelii, corsia
7: Borrelia garinii.
118
Risultati multiplex PCR
L’amplificazione con la coppia ANAMUL ha dimostrato che i genomi di Babesia, Borrelia e
zecca non vengono amplificati, mentre ha evidenziato una banda positiva per il DNA di
Rickettsia (Figura 15.5, corsia 10). Un’analisi di omologia effettuata con il database di
GenBank ha fatto supporre che la coppia ANAMUL sia in grado di amplificare una parte del
gene fusA di Rickettsia. Comunque, questa ipotesi verrà verificata in seguito tramite il
sequenziamento e l’analisi di omologia del prodotto di amplificazione.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 bp
200 bp
Figura 15.5. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 311 bp ottenuto con la coppia di primer
ANAMUL specifica per A. phagocytophilum. Corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Anaplasma phagocytophilum
(controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4-6: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 7:
controllo negativo, corsia 8: Borrelia afzelii, corsia 9: Borrelia garinii, corsia 10: Rickettsia helvetica, corsia 11:
Babesia EU1, corsia 12: controllo negativo.
Estremamente deludente è stata l’amplificazione con il set RICMUL dal momento che è stato
in grado di amplificare anche il genoma degli altri procarioti, oltre a quello previsto di
Rickettsia (Figura 15.6). Questa coppia di primer è stata scartata vista la sua eccessiva
aspecificità. Dal momento che questa coppia di primer non riconosce il DNA di zecca, la sua
unica applicazione può essere quella di evidenziare un qualsiasi DNA procariota in un esame
preliminare del vettore.
119
Risultati multiplex PCR
1
2
3
4
500 bp
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9
500 bp
200 bp
200 bp
A)
B)
Figura 15.6. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 638 bp ottenuto con la coppia di primer
ANAMUL specifica per Rickettsia spp. A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Rickettsia helvetica (controllo
positivo), corsia 3: Rickettsia monacensis (controllo positivo - estratto di zecca), corsia 4: controllo negativo;
lane 5, 6: DNA estratto da campioni di zecca. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Rickettsia helvetica (controllo
positivo), corsia 3: Rickettsia monacensis (controllo positivo - estratto di zecca), corsia 4: controllo negativo,
corsia 5: Borrelia afzelii, corsia 6: Borrelia garinii, corsia 7: Anaplasma phagocytophilum, corsia 8: Babesia
EU1, corsia 9: controllo negativo.
Amplificazione con il sistema multiplex PCR
Per l’ottimizzazione del sistema multiplex PCR con le coppie BORMUL, BABMUL e
ANAMUL sono state effettuate varie prove a differenti concentrazioni di ogni coppia di
primer simulando coinfezioni e valutando, anche in questo caso, la specificità del sistema. Le
seguenti concentrazioni sono risultate ottimali per la produzione di amplificati ben visibili su
gel di agarosio:
0.16 µM di ogni primer BORMUL,
0.12 µM di ogni primer BABMUL,
0.34 µM di ogni primer ANAMUL,
in un volume finale di 25 µl contenente 2.5 µl del DNA estratto, 1X tampone di reazione per
Taq polimerasi (New England Biolabs), 200 µM di ogni desossinucleotide (Eppendorf), 0.8 U
di Taq polimerasi (New England Biolabs), acqua ultrapura.
Il primo risultato positivo è stata l’osservazione che la contemporanea amplificazione del
DNA di Anaplasma e Rickettsia da parte della coppia ANAMUL ha portato a 2 prodotti di
amplificazione di peso molecolare diverso, quindi ben distinguibili su gel di agarosio: 311 bp
per Anaplasma e circa 250 bp per Rickettsia (Figura 15.7A).
120
Risultati multiplex PCR
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8 9
500 bp
200 bp
500 bp
200 bp
A)
B)
Figura 15.7. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con il sistema multiplex PCR: A) corsia
1: controllo negativo, corsia 2: Borrelia garinii+Rickettsia helvetica, corsia 3: controllo negativo, corsia 4:
Borrelia garinii+Rickettsia helvetica+ Anaplasma phagocytophilum, corsia 5: controllo negativo, corsia 6:
Borrelia garinii+Anaplasma phagocytophilum, corsia 7: controllo negativo, corsia 8: PM 100 bp. B) corsia 1:
PM 100 bp, corsia 2: Borrelia garinii, corsia 3: controllo negativo, corsia 4: Babesia EU1, corsia 5: controllo
negativo, corsia 6: Babesia EU1+ Borrelia garinii, corsia 7: controllo negativo, corsie 8, 9: DNA estratto da
campioni di zecca.
D’altro canto, come si può osservare nella Figura 15.7B, l’amplificazione multiplex PCR con
tutte e tre le coppie di primer ha portato alla sintesi di una banda inattesa di circa 300 bp
riferita al DNA di Babesia. Come mostra la Figura 15.8, questa banda inattesa si è dimostrata
riproducibile quando nella soluzione di amplificazione erano contemporaneamente presenti le
coppie BABMUL e BORMUL. Infatti, l’amplificazione del DNA di Babesia con la
contemporanea presenza di BABMUL e ANAMUL, senza BORMUL, nella soluzione di
reazione non ha prodotto la banda da 300 bp (Figura 15.9).
121
Risultati multiplex PCR
1
2
3
4
5
6
500 bp
200 bp
Figura 15.8. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con sistema BABMUL + BORMUL:
corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Borrelia garinii, corsia 3: controllo negativo, corsia 4: Babesia EU1, corsia 5:
controllo negativo, corsia 6: Babesia EU1+ Borrelia garinii.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
500 bp
200 bp
Figura 15.9. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con il sistema BABMUL +ANAMUL:
corsia 1: Babesia EU1, corsia 2: controllo negativo, corsia 3: Rickettsia helvetica, corsia 4: controllo negativo,
corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: controllo negativo, corsia 7: Babesia EU1+Rickettsia helvetica,
corsia 8: controllo negativo, corsia 9: Babesia EU1+Anaplasma phagocytophilum, corsia 10: controllo negativo,
corsia 11, 12: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 13: PM 100 bp, corsia 14: Babesia EU1+Rickettsia
helvetica+ Anaplasma phagocytophilum.
In ogni caso questo problema non compromette l’uso di questo sistema multiplex PCR dal
momento che Babesia ha dimostrato una prevalenza sul territorio di circa l’1% (vedi pag.
107). Ciò significa che i pochi campioni positivi per Babesia possono venir riamplificati con
singole PCR specifiche per Babesia e Anaplasma, dato che la banda inattesa copre il segnale
di quest’ultima. Questa multiplex PCR è un sistema di screening che apporta un’enorme
risparmio di tempo e denaro nell’analisi di campioni su vasta scala, anche nel caso venga
riamplificato l’1% di essi.
122
Risultati pazienti
16. ANALISI DI CAMPIONI BIOLOGICI DA PAZIENTI
I sistemi di amplificazione impiegati per lo screening dei patogeni in zecca sono stati testati
anche su alcuni campioni biologici di pazienti allo scopo di verificare la loro specificità di
amplificazione anche partendo da estratti di campioni clinici e, quindi, considerare la loro
applicazione in campo diagnostico. Innanzitutto era fondamentale verificare che questi sistemi
non fossero in grado di amplifica il DNA umano.
Le prove sono state effettuate su un estratto da sangue del paziente 52 e su un estratto da
sangue e uno da CSF del paziente 53. Entrambi i pazienti riportavano una storia pregressa di
borreliosi, seguita da trattamenti farmacologici con antibiotici.
Il sistema nested-PCR specifico per il gene plasmidico ospA di B. burgdorferi, già impiegato
con successo dal nostro laboratorio nella diagnosi di Lyme di numerosi pazienti (Floris et al.,
2007), è stato usato per verificare l’infezione da Borrelia dei pazienti 52 e 53. Come si può
vedere in Figura 16.1, entrambi i pazienti sono risultati completamente negativi.
1
2
3
4
5
6
7
400 bp
Figura 16.1. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato (nested-PCR) da 391 bp ottenuto con primer
specifici per il gene plasmidico ospA di B. burgdorferi; corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: B. burgdorferi (controllo
positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4: DNA estratto da sangue (paziente 52), corsia 5: controllo
negativo, corsia 6: DNA estratto da sangue (paziente 53), corsia 7: DNA estratto da CSF (paziente 53).
Le amplificazioni con primer specifici per il gene epank1 di A. phagocytophilum e per il gene
16S rRNA di Rickettsia hanno dimostrato di non amplificare il DNA umano: i controlli
positivi presenti nelle corse elettroforetiche di Figura 16.2 sono particolarmente intensi perchè
è stato caricato l’intero volume di PCR dei campioni al fine di visualizzazione ogni possibile
banda aspecifica nelle corsie 4, 6 e 7 corrispondenti ai campioni biologici. In ogni
amplificazione è stato inserito anche un esperimento di spike DNA (corsie 9, Figura 16.2 A e
B) che dimostra come il sistema non subisca inibizioni in presenza di DNA estratto da
campioni di sangue.
123
Risultati pazienti
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9
500 bp
500 bp
200 bp
200 bp
A)
B)
Figura 16.2. Visualizzazione su gel di agarosio: A) amplificato da 311 bp di A. phagocytophilum ottenuto
primer specifici per il gene epank1; corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Anaplasma phagocytophilum (controllo
positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4: DNA estratto da sangue (paziente 52); corsia 5: controllo
negativo, corsia 6: DNA estratto da sangue (paziente 53), corsia 7: DNA estratto da CSF (paziente 53), corsia 8:
controllo negativo, corsie 9: DNA estratto da sangue (paziente 52)+Anaplasma phagocytophilum (controllo
positivo). B) amplificato da 757 bp di Rickettsia spp. ottenuto primer specifici per il gene 16S rRNA; corsia 1:
PM 100 bp, corsia 2: Rickettsia helvetica (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4: DNA
estratto da sangue (paziente 52); corsia 5: controllo negativo, corsia 6: DNA estratto da sangue (paziente 53),
corsia 7: DNA estratto da CSF (paziente 53), corsia 8: controllo negativo, corsie 9: DNA estratto da sangue
(paziente 52)+Rickettsia helvetica (controllo positivo).
L’analisi tramite nested-PCR con il set di primer specifico per il gene che codifica la βtubulina di Babesia ha evidenziato delle bande positive negli estratti da sangue (Figura 16.3).
1
2 3
4
5
6
7 8
500 bp
200 bp
Figura 16.3. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato del genoma di Babesia spp. ottenuto primer
specifici per il gene che codifica la β-tubulina; corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Babesia EU1 (controllo positivo),
corsia 3: controllo negativo, corsie 4: DNA estratto da sangue (paziente 52); corsia 5: controllo negativo, corsia
6: DNA estratto da sangue (paziente 53), corsia 7: controllo negativo, corsia 8: DNA estratto da CSF (paziente
53).
124
Risultati pazienti
Gli amplificati sono stati sequenziali e l’analisi di sequenza ha dimostrato che corrispondono
a un frammento di DNA umano (accession n° XR041042). Purtroppo questo sistema di
amplificazione non può essere applicato su campioni biologici umani.
Anche il nuovo sistema di amplificazione multiplex PCR è stato testato sui campioni
biologici dei pazienti 52 e 53. L’analisi di spike DNA effettuata sui controlli positivi (Figura
16.4, corsie 2-5) non ha evidenziato alcuna particolare inibizione sul prodotto specifico
dell’amplificazione; in più, sembra ci sia una parziale inibizione della banda aspecifica
ottenuta nel set-up del sistema multiplex PCR con il DNA di Babesia (vedi pag. 121). Nella
Figura 16.4 si osservano anche delle bande non attese nei due campioni di sangue dei pazienti
52 e 53, evidentemente dovute all’amplificazione del DNA umano. Visto che l’altezza delle
bande non interferisce con la visualizzazione delle bande specifiche per i quattro agenti
patogeni, queste potrebbero essere utili come controllo interno dell’efficienza di estrazione
del DNA totale nei casi in cui si ottiene un risultato negativo, in cui, cioè, non si può
escludere che l’estrazione del DNA sia fallita. Inoltre, sembra che queste bande specifiche per
il DNA umano non vengono prodotte, o prodotte in parte, nei casi in cui c’è un risultato
positivo per un agente patogeno.
Futuri approfondimenti e verifiche su un più alto numero di campioni potranno portare
maggiori conferme a questi primi risultati.
1
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11
500 bp
200 bp
Figura 16.4. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con il sistema multiplex PCR; corsia 1:
PM 100 bp, corsia 2: Borrelia garinii+ DNA estratto da sangue (paziente 52), corsia 3: Rickettsia helvetica+
DNA estratto da sangue (paziente 52), corsie 4: Anaplasma phagocytophilum +DNA estratto da sangue (paziente
52), corsia 5: Babesia EU1+ DNA estratto da sangue (paziente 52), corsia 6: controllo negativo, corsie 7: DNA
estratto da sangue (paziente 52); corsia 8: controllo negativo, corsia 9: DNA estratto da sangue (paziente 53),
corsia 10: DNA estratto da CSF (paziente 53), corsia 11: controllo negativo.
125
Discussione e conclusioni
DISCUSSIONE
CONCLUSIONI
Discussione e conclusioni
17. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Questo studio ha permesso di valutare la distribuzione e la prevalenza d’infezione da B.
burgdorferi, Rickettsia, A. phagocytophilum, virus TBE e Babesia nel vettore zecca I. ricinus
in regione FVG e area transfrontaliera slovena. Va sottolineato che per la prima volta è stata
dimostrata la circolazione del virus TBE, Rickettsia e Babesia nelle zecche presenti sul
territorio regionale.
Abbondanza delle zecche I. ricinus
Il rischio di malattie trasmesse da zecche, ossia la borreliosi di Lyme, encefalite TBE,
anaplasmosi HGA, rickettsiosi e babesiosi, dipende dalla prevalenza dell’infezione e
dall’abbondanza delle zecche. Quest’ultima caratteristica viene influenzata da molti fattori,
comprese le condizioni climatiche ed ecologiche e quindi dalle caratteristiche del territorio. In
questo studio si è quindi suddiviso il territorio esaminato in 4 aree biogeografiche omologhe
dal punto di vista climatico e vegetazionale: area alpina (Zona 1), prealpina (Zona 2), bosco
planiziale (Zona 3) e Carso (Zona 4).
Le zecche raccolte nelle quattro aree biogeografiche hanno dimostrato una dinamica di
abbondanza unimodale, simile a quello riscontrato nella Provincia di Belluno (Piccolini et al.,
2006), ovvero, un solo picco in primavera, seguito da un progressivo calo, e non bimodale
come riportato da altri studi in zone endemiche (Manilla, 1998). Questo potrebbe esser
dovuto ad un aumento della piovosità rilevato nelle stagione autunnale, accompagnato da
brevi, ma bruschi cali di temperatura avvenuti ad intervalli intermittenti tra ottobre e
novembre. Inoltre, una diversa circolazione degli animali ospiti in questa stagione potrebbe
aver influenzato l’abbondanza e attività delle zecche. L’area biogeografica che ha mostrato
una netta prevalenza nell’abbondanza di I. ricinus è risultata essere il Carso (Zona 4). Questo
dato sembra essere correlato alle caratteristiche ambientali favorevoli al ciclo biologico del
vettore. Già in precedenza, infatti, era stato dimostrato come gli ecotopi caratteristici del
Carso, in particolare le doline, tipiche depressione del terreno con alta umidità relativa,
escursione termica elevata e ricca vegetazione, fornissero un ambiente favorevole alla
sopravvivenza e all’attività del vettore (Cinco et al., 1998c; Altobelli et al., 2001).
126
Discussione e conclusioni
Identificazione di B. burgdorferi in I. ricinus
La prevalenza d’infezione annuale per B. burgdorferi è risultata del 23 % circa, molto vicina
al valore massimo europeo che è del 25% (Randolph, 2001), con un incremento dalla zona
montagnosa verso il litorale: è risultata minore nell’area alpina (Zona 1) e massima nelle
stazioni dell’area carsica (Zona 4). Infatti, sul Carso è stato registrato un valore medio di
prevalenza annuale superiore al 40 % sia nelle zecche raccolte nel 2005 che nel 2006. Questi
risultati rispecchiano quelli riportati in uno studio condotto nel 1998 in una ristretta area del
Carso che stimava un’infezione media del 37% (Cinco et al., 1998b) e dimostrano
chiaramente che questa deve essere considerata una zona ad alto rischio per la borreliosi di
Lyme. L’elaborazione tramite GIS di una mappa del rischio di infezione da B. burgdorferi nel
Friuli Venezia Giulia ha confermato che l’area a maggior rischio è proprio il Carso, in
particolare il Carso goriziano.
L’altipiano carsico differisce dalle altre aree biogeografiche anche per l’alta presenza d’ospiti
rientranti nel ciclo biologico di I. ricinus, in particolare i caprioli (Capreolus capreolus), sui
quali la zecca può effettuare il pasto di sangue (Chemini et al., 1997). I caprioli
contribuiscono al mantenimento di Borrelia in natura permettendo la trasmissione del
microrganismo da esemplari di I. ricinus infetti ad altri esemplari non infetti durante il pasto
di sangue tramite il fenomeno del cofeeding. I dati forniti dall’Istituto Regionale per la
Salvaguardia dell’Ambiente e della Fauna riportano sul Carso un numero medio di 11
caprioli/100 ha, con punte di 30 esemplari/100 ha in ambiente suburbano. D’altro canto,
nell’area prealpina (Zona 2) ed alpina (Zona 1) il numero di caprioli/100 ha scende a 4,02 e
2,74 rispettivamente. L’elaborazione tramite GIS ha confermato che i dati di densità dei
caprioli correlano con l’abbondanza di zecche e perciò, indirettamente, influenzano la
circolazione di Borrelia (Altobelli et al., 2008).
Inoltre, è stata osservata una percentuale maggiore di zecche adulte infette da B. burdorferi
rispetto alle ninfe: questo può essere legato al maggiore numero di pasti di sangue effettuati
dagli adulti. Tale andamento è sovrapponibile a quello di un altro studio italiano effettuato
nella regione Toscana (Bertolotti et al., 2006) e perfettamente in linea con quanto riportato da
una analisi comparata eseguita a livello europeo (Rauter et al., 2005).
L’identificazione delle genospecie di B. burgdorferi in un dato territorio è molto
importante dal momento che ogni genospecie porta a manifestazioni cliniche peculiari in
relazione al diverso tropismo tissutale. La genotipizzazione dei campioni di zecca risultati
positivi per l’infezione da B. burgdorferi ha dimostrato che B. afzelii è la specie più diffusa,
seguita da B. garinii, mentre B. burgdorferi s.s. è presente soltanto in minima parte, così come
riscontrato a livello europeo (Rauter et al., 2005). La netta prevalenza di B. afzelii nell’area di
127
Discussione e conclusioni
studio suggerisce una maggior circolazione del microrganismo tra roditori vista l’associazione
tra B. afzelii e questi piccoli ospiti vertebrati (Piesman and Gern, 2004).
I nostri risultati, invece, sono alquanto diversi da quelli ottenuti da uno studio in Toscana in
cui l’ 82.9% degli esemplari di I. ricinus era infetto da B. lusitanie, assente nelle zecche
raccolte in FVG. La differenze è probabilmente da imputarsi alla diversa presenza d’ospiti
serbatoio in Toscana, in particolare la lucertola (Tomassone et al., 2005).
La genotipizzazione di Borrelia nelle zecche supporta i risultati di alcuni studi effettuati su
pazienti affetti da borreliosi di Lyme residenti in regione FVG. In tutti questi studi è stato
dimostrato che la specie infettante era generalmente B. afzelii, meno frequenti le infezioni da
B. garinii e ancor meno da B. burgdorferi s. s. (Cinco et al.1989; Ciceroni et al., 2001; Floris
et al., 2007).
Molto interessante il fatto di aver trovato nelle zecche alcuni pattern atipici non osservati nei
pazienti, e che dall’analisi di omologia sono risultati essere delle varianti genetiche di B.
garinii e B. afzelii; uno dei pattern atipici, denominato P1, ha dimostrato di formare
addirittura un cluster a se stante (Menardi et al., 2008). Queste differenze tra pazienti e zecche
potrebbe indicare la circolazione di varianti genetiche di Borrelia con scarsa infettività verso
l’uomo, evento già riscontrato per alcuni serotipi del patogeno (Hu et al., 2001).
Le pluriinfezioni con differenti specie di Borrelia sono comuni nelle zecche raccolte in
Europa e in passato sono state riscontrate anche nella nostra regione (Cinco et al., 1998b;
Ciceroni and Ciarrocchi, 1998; van Dam, 2002). La conferma riportata in questo lavoro della
presenza di zecche pluriinfette suggerisce la necessità di valutare le coinfezioni nella
popolazione residente. Un recente studio effettuato dal nostro laboratorio su un piccolo
gruppo di pazienti con diagnosi di Lyme ha dimostrato che i pazienti con una sintomatologia
ancora più complessa di quella causata dal morbo di Lyme, risultavano infetti da più specie di
Borrelia suggerendo un legame tra manifestazione clinica e plurinfezione (Floris et al., 2007).
Identificazione di Rickettsia in I. ricinus.
Questo studio dimostra che Rickettsia è presente in maniera omogenea nelle zecche di tutta
l’area di studio e che i picchi di prevalenza si trovano nella parte centrale della regione FVG,
a cavallo delle aree alpina e prealpina. La prevalenza di Rickettsia osservata in questa
indagine (4.5% - 6.1%), è simile a quella riportata nella vicina regione Veneto (1.6%–6%) e
negli stati confinanti della Slovenia e dell’Austria, dove la percentuale di infezione delle
zecche è di 4.6% e 4.8%, rispettivamene (Rehacek et al. 1997; Prosenc et al. 2003; Piccolin et
al. 2006).
128
Discussione e conclusioni
Nell’anno 2006 la stazione di Socchieve (ID 5) è risultata negativa, mentre un dato di
prevalenza simile a quello registrato nell’anno precedente è stato rilevato nella vicina stazione
36; la stazione di Kranjska Gora (ID 1), priva di Rickettsia durante l’anno 2005, è risultata tra
le località a maggior prevalenza di infezione pur essendo le vicine stazioni scarsamente
infette. Questa osservazione dimostra che la presenza di Rickettsia sul territorio è suscettibile
di variazioni spazio-temporali.
Il sequenziamento dei campioni risultati positivi per Rickettsia ha rivelato la presenza di R.
helvetica, specie potenzialmente patogena per l’uomo, in tutte le aree biogeografiche,
associata a R. monacensis soprattutto nell’area carsica (Zona 4) e nel bosco planiziale (Zona
3). La genotipizzazione ha confermato i risultati di uno studio precedente che documenta la
presenza di
R. helvetica in Slovenia (Prosenc et al. 2003). Nel 2006, Cinco et al.
dimostrarono la presenza di anticorpi contro R. helvetica in guardie forestali della regione
FVG, suggerendo che questa specie è presente nelle zecche a livello locale. Ad oggi, in
regione sono stati descritti soltanto due casi di rickettsiosi, ma non è stata identificata la
specie (Ciceroni et al. 2006). La presenza di forme lievi di rickettsiosi (senza rash cutaneo)
causate da R. helvetica nel nord-est d’Italia fanno supporre che forme cliniche lievi o
subcliniche di rickettsiosi sfuggano alla diagnosi, soprattutto in aree non endemiche (Fournier
et al. 2004) come lo è la regione FVG.
Nell’area di studio abbiamo rilevato la presenza di R. monacensis, identificata per la prima
volta in un campione di I. ricinus raccolto in Germania e recentemente riconosciuta come la
causa di una forma di rickettsiosi in Spagna (Simser et al. 2002, Jado et al. 2007). Questo è il
primo rapporto sulla presenza di R. monacensis nelle zecche raccolte in FVG e area
transfrontaliera slovena, e il secondo rilevamento fatto nella parte nord-orientale dell’Italia
dopo quello descritto da Beninati et al. (2002) in Trentino. La presenza di R. monacensis
nell’area di studio indica che forme lievi di rickettsiosi potrebbero essere dovute all’infezione
con questa specie. L’evidenza clinica di rickettsiosi viene generalmente validata da analisi
sierologiche, principalmente tramite immunofluorescenza (MIF), ma questo metodo non è in
grado di distinguere tra le varie specie di Rickettsia del gruppo SFG (Fournier et al. 2000).
L’analisi di sequenza del gene 16S rRNA di un campione positivo raccolto nell’area alpina
(ID 2) ha dimostrato un’alta omologia con la specie R. limoniae descritta in Belgio (accession
no. AF322443) di cui non si conosce l’eventuale ruolo patogeno (Perlman et al. 2006).
Identificazione di A. phagocytophilum in I. ricinus
I primi due casi umani di anaplasmosi HGA in Italia sono stati descritti proprio in regione
FVG (Ruscio et al., 2003) seguiti da poche casistiche (Beltrame et al., 2006), suggerendo una
129
Discussione e conclusioni
scarsa circolazione del microrganismo che si correla perfettamente con i bassi livelli di
prevalenza per A. phagocytophilum nelle zecche rilevati in questa indagine. Ricerche
precedenti hanno riportato prevalenze ben più alte comprese tra l’8% e il 24% (Cinco et al.,
1998b), il che suggerisce che in realtà la prevalenza annuale di Anaplasma potrebbe essere
ben più variabile dei valori di 1.6% e 0.7% riscontrati nel biennio 2005-2006. Nella vicina
provincia di Trento è stata riportata una prevalenza di Anaplasma nelle zecche del 9.87%, con
un picco addirittura del 57.14% (Mantelli et al., 2006) che potrebbe esser correlato alla
densità, in quel territorio, di piccoli roditori e caprioli, che si sono dimostrati validi ospiti
serbatoio per Anaplasma (Beninati et al., 2006).
Le anaplasmosi sintomatiche in Europa sembrano rare; fino al 2005 sono stati riportati 66
casi, a differenza di una seroprevalenza media del 6,2%, con punte del 21% in alcuni stati
europei, mentre la prevalenza media nelle zecche infette è risultata del 3% (Dumler et al.,
2005). Studi siero-epidemiologici suggeriscono che molte infezioni non vengono
riconosciute, e in aree endemiche la popolazione infettata varia tra il 15 % e 36% (Bakken et
al., 1998; Aguero-Rosenfeld et al., 2002). In uno studio condotto in Slovenia, tra il gennaio
1996 e dicembre 2004, a 24 pazienti adulti è stata confermata la diagnosi da HGA (LotricFurlan et al., 2006). In Austria sono stati diagnosticati 5 casi consecutivi di HGA nel biennio
2003-2004 (Walder et al., 2006), mentre il 9% dei donatori sani è risultato positivo alla
sierologia per A. phagocytophilum (Walder et al., 2003a).
Uno studio serologico condotto da questo laboratorio (Cinco et al., 2004) su un gruppo di
forestali del FVG ha evidenziato la presenza di anticorpi anti- A. phagocytophilum compreso
tra 0.6% e 8.8%; questo valore massimo è paragonabili a quelli riportati per la stessa categoria
di lavoratori a rischio operanti in Slovenia (11.4% - 10.7% ) (Rojko et al., 2006) e in altri
paesi europei (7.2%-15.0%) (Grzeszczuk et al., 2004). La discrepanza tra la seroprevalenza e
numero di casi sintomatici potrebbe esser dovuta una certa difficoltà nell’effettuare una
diagnosi corretta di HGA, per cui alcuni casi potrebbero sfuggire.
Identificazione del virus TBE in I. ricinus
I nostri risultati dimostrano, per la prima volta la presenza del virus TBE nelle zecche I.
ricinus raccolte in regione FVG. L’analisi della prevalenza in relazione alle zone
fitoclimatiche evidenzia un andamento crescente dalla costa verso l’arco alpino. Il virus è
stato rilevato in tutte le stazioni campionate nel 2005, eccetto in una, con una prevalenza più
elevata nell’area alpina (Zona 1), seguita dall’area prealpina (Zona 2), da entrambi i lati del
confine italo-sloveno. Queste località corrispondono a quelle in cui sono stati diagnosticati la
maggior parte dei casi di TBE e dove la seroprevalenza per il virus arriva al 11.7% nella
130
Discussione e conclusioni
popolazione residente (Beltrame et al., 2005), alquanto alta se confrontata con la prevalenza
tra lo 0.5% e 5% riscontrata in aree endemiche in Europa (Charrel et al., 2004).
La prevalenza di infezione da virus TBE è stata maggiore nelle zecche adulte rispetto alle
ninfe probabilmente dovuto al fenomeno del cofeeding, favorito dal maggiore numero di pasti
di sangue effettuati dagli adulti.
L’analisi di sequenza della regione non codificante all’estremità 5’ (5’-NCR) del genoma
virale ha dimostrato un’omologia del 98.4% con il sottotipo Western European TBE (Floris et
al., 2006). Questi dati sono in linea con quelli ottenuti in precedenza da Hudson et al., 2001, il
quale riporta che alcuni isolati di virus TBE provenienti dalle province di Trento e Belluno
appartengono al sottotipo Western European. Inoltre, la totale omologia tra il ceppo IR 454
isolato nel bellunese e le sequenze presenti nelle zecche provenienti dalla nostra regione
dimostrano una leggera mutazione rispetto al ceppo europeo Neudoerfl, suggerendo una
microevoluzione del virus TBE che circola nel nord-est d’Italia.
L’alta prevalenza di virus TBE riscontrato nell’area di studio appare inaspettata se
consideriamo la bassa incidenza di casi umani di TBE diagnosticati in regione: questo può
essere dovuto ad una sottodiagnosi dei casi clinici di TBE considerando che l’infezione può
decorrere in forma asintomatica nel 70% dei casi (Kaiser et al.,1999). Infatti, studi di
sorveglianza serologica suggeriscono che nelle zone endemiche le infezioni umane
asintomatiche o sub-cliniche oscillano tra il 70% e il 95% dei casi (Gritsun et al., 2003). In
realtà, in zone quali la regione FVG, considerate non-endemiche per l’encefalite TBE, non è
stato attuato alcun screening routinario della presenza di anticorpi in pazienti con infezioni
non-batteriche del liquido cerebrospinale. Inoltre, altri fattori che possono marcatamente
influenzare il reale quadro epidemiologico dell’encefalite TBE in regione, quali differenza
nella ospedalizzazione e notifica dei casi meno gravi, non sono ancora stati stimati. I nostri
dati suggeriscono la possibilità di casi non diagnosticati tra la popolazione residente in aree
considerate non endemiche.
Identificazione di Babesia in I. ricinus
In questo lavoro è stata dimostrata, per la prima volta, la presenza di Babesia nelle zecche
raccolte sul Carso triestino. L’analisi della prevalenza di Babesia nei due anni di
campionamento ha riportato un valore paragonabile (0.8% e 1.1%) suggerendo una
distribuzione relativamente bassa e costante sul territorio. I siti 1R, 1G, 1V localizzati ad una
certa distanza dal centro abitato, hanno evidenziato valori di prevalenza decisamente superiori
rispetto a quelli ottenuti a Padriciano, mentre nel sito 01, molto vicino al centro abitato,
Babesia è risultata del tutto assente. Ciò può esser dovuto alla presenza o meno di adeguati
131
Discussione e conclusioni
animali ospiti che hanno limitato la diffusione del patogeno, come dimostrano studi condotti
in Slovenia e in Francia dove la presenza di Babesia è stata rilevata nella maggior parte dei
caprioli analizzati evidenziando il loro ruolo cruciale nel mantenimento e diffusione del
patogeno in un determinato territorio (Duh et al., 2005 e Bonnet et al., 2007).
Riguardo la genospecie di Babesia, mediante amplificazione del gene della β-tubulina, è stato
possibile ipotizzare che l’amplificato apparteneva alla specie B. divergens o a specie
geneticamente correlate. Il sequenziamento degli amplificati del gene per la β-tubulina e del
gene 18S rRNA ha permesso di identificare i campioni positivi come omologhi alle specie B.
divergens e Babesia EU1. Questo è un risultato molto importante dal momento che B.
divergens è la specie prevalente nei casi umani di babesiosi europea (Genchi, 2007).
Geneticamente correlata a quest’ultima è la specie Babesia EU1, confermata come specie
patogena per l’uomo dopo il suo isolamento in due pazienti affetti da babesiosi, residenti in
Emilia Romagna e in Austria (Herwaldt et. al., 2003). Si è inoltre scoperto che la medesima
specie Babesia EU1 circola negli ungulati selvatici (Pietrobelli et al., 2007).
Nonostante l’esiguo numero di campioni positivi, è interessante notare come la maggior parte
di questi appartenga alla specie Babesia EU1. Simili proporzioni vengono riportate anche in
altri studi, come ad esempio in campioni di zecche raccolte dal bestiame nella vicina Svizzera
(Schmid et al., 2008; Hipertshauser et al., 2006), oppure in territori più lontani come in
Olanda, dall’analisi delle zecche raccolte da animali domestici (Nijhof et al., 2007).
L’evidente prevalenza di Babesia EU1 rispetto a B. divergens riportata nei lavori di recente
pubblicazione fa sorgere il sospetto che in passato non sia stata fatta una corretta e
approfondita identificazione delle specie infettanti vista 1) la scarsità di sequenze di Babesia
isolate da casi umani depositate in banca dati, 2) l’alta omologia genetica tra le specie
Babesia EU1 e B. divergens (Duh et al., 2001) e 3) la cross-reattività tra queste due specie che
le rende indistinguibili (Duh et al., 2007).
In generale, i valori di prevalenza di Babesia nei campioni di zecche raccolte sul Carso sono
più bassi rispetto ai valori riportati in territori confinanti con la nostra regione: 9,6% in
Slovenia (Duh et al., 2001) e 1,6% - 6% nella provincia di Belluno (Piccolin et al., 2006), e
rispecchiano il valore minimo registrato a livello europeo (circa 1.5%). Ciò probabilmente
spiega perché fino ad oggi non sono stati segnalati casi umani di babesiosi in FVG; comunque
non si può escludere che qualche caso sia passato inosservato, visto che la diagnosi per questo
patogeno non viene effettuata. Va tenuto presente che il Carso è considerato una zona
endemica per il morbo di Lyme, perciò va considerata la possibilità che il morso di una zecca
pluriinfetta possa trasmettere entrambi i patogeni nonostante la bassa prevalenza di Babesia
sul territorio: ciò potrebbe spiegare le complicanze cliniche osservate in alcuni casi di
132
Discussione e conclusioni
borreliosi a livello locale. La coinfezione di Babesia con B. burgdorferi in alcuni casi di Lyme
atipici è stata riportata come la causa delle anomalie cliniche manifestate dai pazienti
(Mitchell et al. 1996; Krause et al. 2002; Steere et al. 2003) e la dimostrazione della
copresenza di Babesia EU1–B. burgdorferi s. s. e Babesia EU1–B. afzelii nella stessa zecca
(Casati et al., 2006) supporta l’ipotesi di una possibile trasmissione simultanea all’uomo di
entrambi questi patogeni.
Coinfezioni di patogeni diversi nelle zecche
Come già accennato in precedenza, I. ricinus è il vettore di importanti patogeni trasmessi da
zecche che possono infettare simultaneamente e portare ad una varietà di sintomi clinici
(Swanson et al. 2006). La conoscenza della possibilità di coinfezione del vettore in un
determinato territorio permette di orientare le analisi cliniche nella ricerca di più eziologie
nello stesso paziente e, quindi, contribuire alla comprensione di quei casi umani con
sintomatologia atipica non riconducibile ad un unico agente infettante. In letteratura vengono
riportati alcuni esempi che dimostrano come la coinfezione con Babesia e/o A.
phagocytophilum possa spiegare una varietà di sintomi particolari osservati in pazienti affetti
da morbo di Lyme, con un aggravamento del quadro clinico (Mitchell et al. 1996; Krause et
al. 2002; Steere et al. 2003). Inoltre, un caso di coinfezione tra A. ghagocytophilum e virus
TBE è stato osservato in un paziente sloveno che presentava una sovrapposizione dei sintomi
di entrambe le patologie (Lotric-Furlan et al., 2005).
In questo lavoro è stata dimostrata la circolazione, nell’area di studio, di zecche pluriinfette da
due o addirittura da tre patogeni, in particolare con il virus TBE. Ciò suggerisce che la
trasmissione simultanea all’uomo di più di un agente patogeno con un unico morso è possibile
anche in regione FVG
Messa a punto della multiplex PCR
L’amplificazione contemporanea di più agenti patogeni con un’unica reazione di PCR è uno
degli strumenti molecolari su cui puntano molti ricercatori, in particolare in campo
diagnostico. Due esempi sono l’individuazione contemporanea dei batteri patogeni coinvolti
nelle infezioni miste delle vie aeree (Stralin et al., 2005) e delle vie urinarie (Lee et al., 2007).
Il sistema multiplex PCR progettato in questo lavoro si propone come uno strumento rapido
ed economico nel valutare le coinfezione di agenti patogeni trasmessi da zecche in I. ricinus,
ma anche in campioni biologici di pazienti con sintomatologia atipica e sospetta
pluriinfezione. In questi casi una diagnosi tempestiva è sicuramente fondamentale per adottare
la terapia più adatta ed evitare complicazioni.
133
Discussione e conclusioni
CONCLUSIONE
I risultati della ricerca di agenti patogeni nelle zecche I. ricinus presentata in questa tesi di
dottorato hanno dimostrato che:
- La prevalenza annuale di B. burgdorferi nell’area di studio è del 23% circa. La zona
biogeografia a più alto rischio d’infezione è risultata la zona del Carso goriziano, dato
confermato anche da un modello matematico presuntivo del rischio per B. burgdorferi
elaborato tramite GIS. Inoltre, la genotipizzazioe ha rilevato che B. afzelii è la specie
prevalente.
- Il virus TBE, la cui dimostrazione in I. ricinus viene qui dimostrata per la prima volta
in FVG, è distribuito sul territorio con una prevalenza più elevata nell’area alpina, seguita
dall’area prealpina, da entrambi i lati del confine italo-sloveno. Il sequenziamento ha
consentito di identificarlo come appartenente al sottotipo Westrn European TBE, poco
virulento.
- Confrontando la distribuzione di Borrelia e virus TBE si nota un andamento inverso delle
prevalenze: è evidente un incremento di infettività per Borrelia da nord a sud est, mentre,
al contrario, la presenza del virus TBE è massima nelle valli del FVG settentrionale e tende
a diminuire avvicinandosi al sud est della regione.
- Rickettsia appare distribuita uniformemente nelle zecche di tutta l’area di studio con una
prevalenza annuale di 4.5% - 6.1%; i picchi di prevalenza sono stati rilevati nella parte
centrale della regione FVG, a cavallo delle aree alpina e prealpina. Per la prima volta è
stata dimostrata la presenza delle specie R. helvetica e R. monacensis in regione FVG
e nel territorio sloveno dell’area transfrontaliera. Queste due specie sono equamente
distribuite ed entrambe patogene per l’uomo. Inoltre, è stata identificata per la prima volta
in Italia la specie R. limoniae in un campione proveniente dall’area alpina.
- E’ stata riscontrata una distribuzione disomogenea di Anaplasma con valori di prevalenza
compresi tra 0.7% e 1.6% .
- Questo è il primo studio che dimostra la presenza di Babesia nel territorio regionale
del Carso. L’analisi filogenetica ha identificato le specie B. divergens e Babesia EU1,
entrambe patogene per l’uomo. Nonostante la bassa prevalenza riscontrata (0.8 % - 1.1%),
va considerata la possibilità di coinfezioni con Borrelia.
- La circolazione, di zecche pluriinfette nell’area di studio, dimostra il problema della
trasmissione simultanea all’uomo di più di un agente patogeno attraverso un unico morso.
134
Discussione e conclusioni
- Il sistema multiplex PCR, che consente l’amplificazione contemporanea di Borrelia,
Rickettsia, Anaplasma e Babesia, ha dimostrato di essere uno strumento rapido e specifico
nell’individuare le coinfezione di agenti patogeni in I. ricinus e in campioni biologici di
pazienti.
In conclusione possiamo affermare che i risultati di questa indagine hanno permesso di
valutare il rischio di malattie trasmesse da I. ricinus, ossia borreliosi di Lyme, encefalite TBE,
anaplasmosi HGA, rickettsiosi, babesiosi, e fornito un quadro della situazione epidemiologica
in regione FVG e area transfrontaliera slovena. Inoltre, è stato possibile fornire una
panoramica delle specie presenti, alcune identificate per la prima volta in queste aree.
Crediamo che questi dati potranno essere utili nell’applicare normative di sorveglianza per
coadiuvale la prevenzione nella popolazione residente, come già si sta facendo per la
vaccinazione contro il virus TBE nelle località ad alto rischio.
I risultati di questo studio sono pubblicati sul sito del laboratorio “Rischio d’infezione per
borreliosi di Lyme ed altre malattie trasmesse da zecca: creazione di mappe di rischio”
(dfp.units.it/spirochete/indice.html) e sulle pubblicazioni riportate in “Prodotti della ricerca”.
135
Bibliografia
BIBLIOGRAFIA
Bibliografia
18. BIBLIOGRAFIA
Aberer E, Kersten A, Klade H, Poitschek C, Jurecka W (1996) Heterogeneity of Borrelia burgdorferi in the
skin. Am. J. Dermatopathol. 18:571-579
Aberle JH, Aberle SW, Allison SL, Stiasny K, Ecker M, MandlCW, Berger R and Heinz FX (1999) A
DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein
E in different physical forms. J. Immunol. 163:6756–6761.
Aguero-Rosenfeld ME, Donnarumma L, Zentmaier L, Jacob J, Frey M, Noto R, Carbonaro CA, Wormser
GP (2002) Seroprevalence of antibodies that react with Anaplasma phagocytophila, the agent of human
granulocytic ehrlichiosis, in different populations in Westchester County. New York. J Clin Microbiol.
40(7):2612-5.
Aguero-Rosenfeld ME, Horowitz HW, Wormser GP, McKenna DF, Nowakowski J, Muñoz J, Dumler JS
(1996) Human granulocytic ehrlichiosis: a case series from a medical center in New York State. Ann Intern
Med. 125(11):904-8.
Alberti A, Addis MF, Sparagano O, Zobba R, Chessa B, Cubeddu T, Parpaglia ML, Ardu M, Pittau M
(2005) Anaplasma phagocytophilum, Sardinia, Italy. Emerg Infect Dis. 11(8):1322-4.
Allison SL, K Stiasny K, Stadler K, Mandl CW and F.X. Heinz FX (1999) Mapping of functional elements in
the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J. Virol. 73:5605–5612.
Altobelli A, Feoli E, Napoletano R and Cinco M (2001) Remote Sensing/GIS technique for risk assessment of
Borrelia burgdorferi infection. The Geomatics Workbook, N. 2, Autumn.
Altobelli A, Boemo B, Mignozzi K, Bamdi M, Floris R, Menardi G, Cinco M (2008) Spatial risk assessment for
Lyme borreliosis in Friuli Venezia Giulia (Italy). Int J Med Microbiol. 298 (Suppl 1):125-128.
Amaducci L, Inzitari D, Paci P, Balducci M, Verani P, Lopes MC (1978) L’encefalite da zecche (TBE) in
Italia. Indagini clinico-virologiche. Giorn. Mal. Infett. Parass. 30;693-9.
Andersson SG, Zomorodipour A, Andersson JO, Sicheritz-Pontén T, Alsmark UC, Podowski RM, Näslund
AK, Eriksson AS, Winkler HH, Kurland CG (1998) The genome sequence of Rickettsia prowazekii and
the origin of mitochondria. Nature. 396(6707):133-40.
Andersson JO, Andersson SG (1999) Genome degradation is an ongoing process in Rickettsia. Mol Biol Evol.
16(9):1178-91.
Angerami RN, Resende MR, Feltrin AF, Katz G, Nascimento EM, Stucchi RS, Silva LJ (2006) Brazilian
spotted fever: a case series from an endemic area in southeastern Brazil: clinical aspects.. Ann N Y Acad Sci.
1078:252-4.
Armstrong PM, Katavolos P, Caporale DA, Smith RP, Spielman A, Telford SR 3rd (1998) Diversity of
Babesia infecting deer ticks (Ixodes dammini); Am J Trop Med Hyg 58: 739–742
Bakken JS, Aguero-Rosenfeld ME, Tilden RL, Wormser GP, Horowitz HW, Raffalli JT, Baluch M,
Riddell D, Walls JJ, Dumler JS (2001) Serial measurements of hematologic counts during the active phase
of human granulocytic ehrlichiosis. Clin Infect Dis. 32(6):862-7.
Bakken JS, Dumler JS, Chen SM, Eckman MR, Van Etta LL, Walker DH (1994) Human granulocytic
ehrlichiosis in the upper Midwest United States. A new species emerging? JAMA. 272(3):212-8.
Bakken JS, Krueth J, Wilson-Nordskog C, Tilden RL, Asanovich K, Dumler JS (1996) Clinical and
laboratory characteristics of human granulocytic ehrlichiosis. JAMA. 275(3):199-205.
136
Bibliografia
Bakken JS, Goellner P, Van Etten M, Boyle DZ, Swonger OL, Mattson S, Krueth J, Tilden RL, Asanovich
K, Walls J, Dumler JS ( 1998) Seroprevalence of human granulocytic ehrlichiosis among permanent
residents of northwestern Wisconsin Clin Infect Dis. 27(6):1491-6.
Bakken JS, Dumler JS (2000) Human granulocytic ehrlichiosis. Clin Infect Dis. 31(2):554-60.
Bakken JS, Haller I, Riddell D, Walls JJ, Dumler JS (2002) The serological response of patients infected with
the agent of human granulocytic ehrlichiosis. Clin Infect Dis. 34(1):22-7.
Balmelli T, Piffaretti J C (1995) Association between different clinical manifestations of Lyme disease and
different species of Borrelia burgdorferi sensu lato. Res. Microbiol. 146: 329-340
Bannister L, Mitchell G (2003) The ins, outs, and roundabouts of malaria. Trends Parasitol. 19: 209-213
Baranton G, Marti Ras N, Postic D (1998) Molecular epidemiology of the aetiological agents of Lyme
borrelosis. Wien Klin. Wochenschr 110: 850-855
Barbour A. G. (1984) Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J. Biol. Med. 57: 521-525
Barbour A. G., Hayes S. F. (1986) Biology of Borrelia species. Microbiol. Rev. 50: 381-400
Barrett PM, Dorner F, Plotkin SA (1999) Tick-borne encephalitis vaccine. In: Plotkin, S.A., Orenstein, W.A.
(Eds.), Vaccines. W.B. Saunders Company, Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo, A
Division of Harcourt Brace and Company (Chapter 32), 767–780.
Bertolotti L, Tomassone L, Tramuta C, Grego E, Amore G, Ambrogi C, Nebbia P, Mannelli A (2006)
Borrelia lusitaniae and spotted fever group rickettsiae in Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in Tuscany, central
Italy. J Med Entomol. 43(2):159-65.
Bauer J, Leitz G, Palmedo G, Hugel H (2003) Anetoderma: another facet of Lyme disease? J. Am. Acad.
Dermatol. 48: S86-S88
Beltrame A, Cruciatti B, Ruscio M, Scudeller L, Cristini F, Rosato F, Gigli G, Viale P (2005) Tick-borne
encephalitis in Friuli Venezia Giulia. North-eastern Italy. Infection, 33:158-159.
Beltrame A, Ruscio M, Arzese A, Rorato G, Negri C, Londero A, Crapis M, Scudeller L, Viale P (2006)
Human granulocytic anaplasmosis in northeastern Italy. Ann N Y Acad Sci. 1078:106-9.
Benach JL, Habicht GS (1981) Clinical characteristics of human babesiosis. J Infect Dis 144:481
Benezra D, Brown AE, Polsky B, Gold JW, Armstrong D (1987) Babesiosis and infection with human
immunodeficiency virus (HIV). Ann Intern Med 107:944
Beninati T, Genchi, C Torina A, Caracappa S, at al. (2005) Rickettsiae in ixodid ticks, Sicily. Emerg Infect Dis
11:509-511.
Beninati T, Lo N, Noda H, Esposito F, et al. ( 2002) First detection of spotted fever group rickettsiae in Ixodes
ricinus from Italy. Emerg Infect Dis 8:983-986.
Beninati T, Piccolo G, Rizzoli A, Genchi C, Bandi C (2006) Anaplasmataceae in wild rodents and roe deer from
Trento Province (northern Italy). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 25:677-8.
Bergstrom S, Garon C F, Barbour A G, MacDougall J (1992) Extra cromosomal elements of Spirochetes.
Res. Microbiol. 143: 623-628
Bernabeu-Wittel M, del Toro MD, Nogueras MM, Muniain MA, Cardeñosa N, Márquez FJ, Segura F,
Pachón J ( 2006) Seroepidemiological study of Rickettsia felis, Rickettsia typhi, and Rickettsia conorii
infection among the population of southern Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 25(6):375-81
Bisin Z (2004) Manifestazioni neurologiche nella malattia di Lyme. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano
per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
137
Bibliografia
Bjöersdorff A, Bergström S, Massung RF, Haemig PD, Olsen B (2001) Ehrlichia-infected ticks on migrating
birds. Emerg Infect Dis. 7(5):877-9.
Blanco JR, Oteo JA (2002) Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Clin Microbiol Infect. 8(12):763-72.
Bonnet S, Jouglin M, L’Hostis M, Chauvint A (2007) Babesia sp. EU1 from Roe Deer and Trasmission within
Ixodes ricinus. Emerg Infect Dis 13:1208-1210
Bonnet S, Jouglin M, Malandrin L, Becker C, Agoulon A, L’hostis M, Chauvin A (2006) Transstadial and
transovarial persistence of Babesia divegens in a new skin- feeding technique. Parasitology 134:197-207
Bown KJ, Begon M, Bennett M, Woldehiwet Z, Ogden NH ( 2003) Seasonal dynamics of Anaplasma
phagocytophila in a rodent-tick (Ixodes trianguliceps) system, United Kingdom. Emerg Infect Dis. 9(1):63-70.
Brandt F, Healy GR, Welch M (1977) Human babesiosis: the isolation of Babesia microti in golden hamsters. J
Parasitol 63:934–937
Breitner F., Khanakah G., Stanek G., Kunz G., Aberer E., Schmidt B., Tappeiner G. (2001) Isolation and
polymerase chain reaction typing of Borrelia afzelii from a skin lesion in a seronegative patient with
generalized ulcerating bullous lichen sclerosus et atrophicus. Br. J. Dermatol. 144: 387-392
Brinkley C, Nolskog P, Golovljova I, Lundkvist Aand Bergström T (2008) Tick-borne encephalitis virus
natural foci emerge in western Sweden. Int J Med Microbiol 298 (Suppl. 1):73-80
Brodie TA, Holmes PH, Urquhart GM (1986) Some aspects of tick-borne diseases of British sheep. Vet
Rec.118(15):415-8.
Brorson O., Brorson S. H. (1997) Transformation of cystic forms of Borrelia burgdorferi to normal, mobile
spirochetes. Infection 25: 240-246
Brouqui P, Parola P, Fournier PE, Raoult D (2007) Spotted fever rickettsioses in southern and eastern Europe.
FEMS Immunol Med Microbiol. 49(1):2-12
Brouqui P., Bacellar F., Baranton G., Birtles R. J., Bjoërsdorff A., Blanco J. R., Caruso G., Cinco M.,
Fournier P. E., Francavilla E., Jensenius M., Kazar J., Laferl H., Lakos A., Lotrič-Furlan S., Maurin
M., Oteo J. A., Parola P., Perez-Eid C., Peter O., Postic D., Raoult D., Tellez A., Tselentis Y., Wilske B.
(2004) Guidelines for the diagnosis of tick-borne disease in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 10: 1108-1132
Burgdorfer W., Barbour A. G., Hayes S. F., Benach J. L., Grunwaldt E., Davis J. P. (1982) Lyme disease: a
tick borne spirochetosis? Science 216: 1317-1319
Burgdorfer W., Lane R. S., Barbour A. G., Gressbrink R. A., Anderson J. R. (1985) The western blacklegged tick, Ixodes pacificus: a vector of Borrelia burgdorferi. Am. J. Trop. Med. Hyg. 34: 925-930
Caccio S, Camma C, Onumac M, Severinia C (2000) The b-tubulin gene of Babesia and Theileria parasites is
an informative marker for species discrimination Int J Parasitol 30:1181-1185
Cacciò SM, Antunovic B, Moretti A, Mangili V, Marinculic A, Baric RR, Slemenda SB, Pieniazek NJ
(2002) Molecular characterisation of Babesia canis canis and Babesia canis vogali from naturally infected
European dogs. Vet Parasitol 106: 285-292
Cane P.A. and E.A. Gould (1988) Reduction of Yellow fever virus mouse neurovirulence by immunization with
a bacterially synthesized non-structural protein (NS1) fragment. J. Gen. Virol. 69 :1241–1246.
Canning EU, Winger CM (1987) Babesiidae, In A. E. R. Taylor and J. R. Baker (ed.), In vitro methods for
parasite cultivation. Academic Press, New York, N.Y. 199–229
Carlyon JA, Abdel-Latif D, Pypaert M, Lacy P, Fikrig E (2004) Anaplasma phagocytophilum utilizes
multiple host evasion mechanisms to thwart NADPH oxidase-mediated killing during neutrophil infection.
Infect Immun. 72(8):4772-83.
138
Bibliografia
Carlyon JA, Chan WT, Galán J, Roos D, Fikrig E (2002) Repression of rac2 mRNA expression by Anaplasma
phagocytophila is essential to the inhibition of superoxide production and bacterial proliferation. J Immunol.
169(12):7009-18.
Caruso G (2003) TBE (Tick-borne encephalitis) in Italy. In Proceeding VII International Potsdam Symposium
on Tick-borne Diseases. Berlin; 13-14 March 2003.
Casati S, Sager H, Gern L, Piffaretti JC (2006) Presence of potentially pathogenic Babesia sp. for human in
Ixodes ricinus in Switzerland; Ann Agric Environ Med 13: 65–70
Cascio A, Di Liberto C, D'Angelo M, Iaria C, Scarlata F, Titone L, Campisi G (2004) No findings of dental
defects in children treated with minocycline. Antimicrob Agents Chemother. 48(7):2739-41.
Caturegli P, Asanovich KM, Walls JJ, Bakken JS, Madigan JE, Popov VL, Dumler JS. ( 2000) AnkA: an
Ehrlichia phagocytophila group gene encoding a cytoplasmic protein antigen with ankyrin repeats. Infect
Immun. 68(9):5277-83.
Centeno-Lima S, do Rosario V, Parreira R, Maia AJ, Freudenthal AM, Nijhof AM, Jongejan F (2003) A
fatal case of human babesiosis in Portugal: molecular and phylogenetic analysis. Trop Med Int Health 8: 760–
764
Charrel, R.N., Attoui, H., Butenko, A.M., et al. (2004) Tick-borne virus diseases of human interest in Europe.
Clin Microbiol Infect, 10(12):1040-55.
Chemini C, Rizzoli A, Merler S, Furlanello C, Genchi C (1997) Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) infestation on
roe deer (Capreolus capreolus) in Trentino, Italian Alps. Parassitologia. 39(1):59-63.
Chen HW, C.H. Pan, M.Y. Liau, R. Jou, C.J. Tsai, H.J. Wu, Y.L. Lin and M.H. Tao (1999) Screening of
protective antigens of Japanese encephalitis virus by DNA immunization: a comparative study with
conventional viral vaccines. J. Virol. 73:10137–10145.
Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, Walker DH (1994) Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as
the etiologic agent of human disease. J Clin Microbiol. 32(3):589-95.
Choi KS, Dumler JS (2003a) Early induction and late abrogation of respiratory burst in A. phagocytophiluminfected neutrophils. Ann N Y Acad Sci. 990:488-93.
Choi KS, Garyu J, Park J, Dumler JS (2003b) Diminished adhesion of Anaplasma phagocytophilum-infected
neutrophils to endothelial cells is associated with reduced expression of leukocyte surface selectin. Infect
Immun. 71(8):4586-94.
Choi KS, Grab DJ, Dumler JS (2004)Anaplasma phagocytophilum infection induces protracted neutrophil
degranulation. Infect Immun. 72(6):3680-3
Chumakov M.P., N.A. Zyaitlenok and M.S. Vorob’eva (1944) The studies of virus encephalitis. Report II. The
geographical distribution and epidemiological characteristics of tick-borne encephalitis in European part of
Soviet Union, Siberia and Kazachstan. Neuropathol. Psychiatry 13:20–23.
Ciceroni L, Ciarrocchi S (1998) Lyme disease in Italy, 1983-1996. New Microbiol. 21(4):407-18.
Ciceroni, L., Ciarrocchi, S., Cervo, A., Mondardini, A., Guzzo, F., Caruso, G., Murgia, R., Cinco, M.
(2001). Isolation and characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato strains in an Area of Italy Endemic
for Lyme Borreliosis. J. Clin. Microbiology, 39, 2254-60
Ciceroni, L, Pinto, A, Ciarrocchi, S, Ciervo, A (2006) Current knowledge of rickettsial diseases in Italy. Ann N
Y Acad Sci 1078:143-149.
Cinco, M., Banfi, E., Trevisan, G., Stanek, G. (1989) Isolation and characterization of the first tick isolate of
Borrelia burgdorferi in Italy. APMIS. 97, 381-382.
139
Bibliografia
Cinco M. (1998) La borreliosi di Lyme. Caleidoscopio italiano: 122. Medical Systems.
Cinco M, Padovan D, Murgia R, Frusteri L, Maroli M, van de Pol I, Verbeek- De Kruif N, Rijpkema S,
Taggi F (1998a) Prevalence of Borrelia burgdorferi infection in Ixodes ricinus in central Italy. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 17:134-135
Cinco M, Padovan D, Murgia R, Heldtander M, Engvall EO (1998b) Detection of HGE agent-like Ehrlichia
in Ixodes ricinus ticks in northern Italy by PCR. Wien Klin Wochenschr 110: 898-900
Cinco M., Padovan D., Murgia R., Poldini L., Frusteri L., van de Pol I., Verbeek-De Kruif N., Rijpkema S.,
Maroli M. (1998c) Rate infection of Ixodes ricinus ticks with Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia
garinii, Borrelia afzelii and group VS116 in an endemic focus of Lyme disease in Italy. Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis. 17: 90-94.
Cinco M, Barbone RF, Ciufolini MG, Mascioli M, Aguero Rosenfeld M, Stefanel P Luzzati R. (2004)
Seroprevalence of tick-borne infections in forestry rangers from northeastern Italy. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis. 10;1056-61.
Cinco M., Floris R., Bressan R., Ortenzio S., Trevisan G. (2004b) Valutazione di nuove tecniche diagnostiche
in pazienti affetti da morbo di Lyme. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano per lo Studio della Malattia
di Lyme-Grado
Cinco M, Luzzati R, Mascioli M, Floris R, Brouqui P (2006) Serological evidence of Rickettsia infections in
forestry rangers in north-eastern Italy. Clin Microbiol Infect. 12:493-5.
Cinco M, Floris R, Menardi G, Boemo B, Mignozzi K, Altobelli A (2008) Spatial risk assessment to tick I.
ricinus transmitted infections in North-eastern Italy and transborder Italia/Slovenia territory. Int J Med
Microbiol. 298 (Suppl 1): 211-217.
Ciufolini MG, Verani P, Nicoletti I, Fiorentini C, Bassetti D, Mondardini V (1999) Recent advances on the
ecoepidemiology of tick-borne encephalitis in Italy. Alpe Adria Microbiol J. 81-83.
Civen R, Ngo V (2008) Murine typhus: an unrecognized suburban vectorborne disease. Clin Infect Dis.
46(6):913-8.
Clarke D.H. (1960) Antigenic analysis of certain group B arthropod-borne viruses by antibody absorption. J.
Exp. Med. 111:25–36.
Collares-Pereira M., Couceiro S., Franca I., Kurtenbach K., Schäfer S. M., Vitorino L., Gonçalves L.,
Baptista S., Vieira M. L., Cunha C. (2004) First isolation of Borrelia lusitaniae from a human patient. J.
Clin. Microbiol. 42: 1316-1318
Craft J. L., Fisher D. K., Shimamoto G. T., Steere A. C. (1986) Antigens of Borrelia burgdorferi recognized
during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin M responce and expansion of immunoglobulin G
late in the illness. J. Clin. Invest: 72: 504-515
Crippa M, Rais O, Gern L (2002) Investigations on the mode and dynamics of transmission and infectivity of
Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii in Ixodes ricinus ticks. Vector Borne Zoonotic Dis. 2:39.
Crovato F., Nazzari G., Fumarola D., Rovetta G., Cimmino M. A., Bianchi G. (1985) Lyme disease in Italy:
first reported case. Ann. Rheum. Dis. 44: 570-571
Dantas-Torres F (2007) Rocky Mountain spotted fever. Lancet Infect Dis. 7(11):724-32.
Dattwyler R. J. (1989) Immunodiagnosis of Lyme borreliosis. Rheum. Dis. Clin. N. Am. 15: 727-734
Dattwyler R. J. (1990) Lyme borreliosis: an overview of clinical manifestation. Lab. Med. 21: 290-292
Dawson JE, Fishbein DB, Eng TR, Redus MA, Green NR (1990) Diagnosis of human ehrlichiosis with the
indirect fluorescent antibody test: kinetics and specificity. J Infect Dis. 162(1):91-5.
140
Bibliografia
de Koning J., Hoogkamp-Korstanje J. A. (1986) Diagnosis of Lyme disease by demonstration of spirochetes in
tissue biopsies. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 263: 179-188
Dowling SC, Perryman LE, Jasmer DP (1996) A Babesia bovis 225- Kilodalton spherical-body protein:
localization to the cytoplasmic face of infected erythrocytes after merozoite invasion. Infect Immun 64: 26182626
Duh D, Jelovsek M, Avsic-Zupanc T (2007) Evaluation of an indirect fluorescence immunoassay for the
detection of serum antibodies against Babesia divergens in humans. Parasitol 134:179-185
Duh D, Miroslav Petrovec, Bidovec A., Avsic-Zupanc T. (2005) Cervids as Babesiae Hosts, Slovenia. Emerg
Infect Dis 11:1121-1123
Duh D, Petrovec M, Avsic-Zupanc T (2001) Diversity of Babesia Infecting European Sheep Ticks (Ixodes
ricinus). J Clin Microbiol 39: 3395-3397
Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, Rikihisa Y, Rurangirwa FR (2001)
Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales:
unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with
Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent'
as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int J Syst Evol Microbiol. 51(Pt 6):2145-65.
Dumler JS, Choi KS, Garcia-Garcia JC, Barat NS, Scorpio DG, Garyu JW, Grab DJ, Bakken JS (2005)
Human granulocytic anaplasmosis and Anaplasma phagocytophilum. Emerg Infect Dis. 11(12):1828-34.
Dumler JS, Madigan JE, Pusterla N, Bakken JS (2007) Ehrlichioses in humans: epidemiology, clinical
presentation, diagnosis, and treatment. Clin Infect Dis. 45 Suppl 1:S45-51.
Dumler JS ( 2005)Anaplasma and Ehrlichia infection. Ann N Y Acad Sci. 1063:361-73.
Ecker M., S.L. Allison, T. Meixner and F.X. Heinz (1999) Sequence analysis and genetic classification of tickborne encephalitis viruses from Europe and Asia. J. Gen. Virol. 80:179–185.
Eiffert H., Hanefeld F., Thomssen R., Christen H. J. (1996) Reinfection in Lyme borreliosis. Infection 24:
437-439
Escudero R., Barral M., Pérez A., Mar Vitutia M., García-Pérez A. L., Jiménez S., Sellek R. E., Anda P.
(2000) Molecular and pathogenic characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates from Spain. J.
Clin. Microbiol. 38: 4026-4033
Estrada-Peña A, Jongejan F (1999) Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea
with special reference to pathogen transmission. Exp Appl Acarol. 23(9):685-715
Favia G, Cancrini G, Carfì A, Grazioli D, Lillini E, Iori A (2001) Molecular identification of Borrelia
valaisiana and HGE-like Ehrlichia in Ixodes ricinus ticks sampled in north-eastern Italy: first report in Veneto
region. Parassitologia. 43(3):143-6.
Feng HM, Whitworth T, Popov V, Walker DH (2004) Effect of antibody on the rickettsia-host cell interaction.
Infect Immun. 72(6):3524-30.
Floris R, Altobelli A, Boemo B, Mignozzi K, Cinco M (2006) First detection of TBE virus sequences in Ixodes
ricinus from Friuli Venezia Giulia (Italy). New Microbiol. 29:147-50
Floris R, Menardi G, Bressan R, Trevisan G, Ortenzio S, Rorai E, Cinco M (2007) Evaluation of a
genotyping method based on ospA gene to detect Borrelia burgdorferi sensu lato in multiple samples of Lyme
borreliosis patients. New Microbiol. 30:399-410.
141
Bibliografia
Foppa IM, Krause PJ, Spielman A , Goethert H , Gern L, Brand B, Telford SR 3rd (2002) Entomologic and
Serologic Evidence of Zoonotic Transmission of Babesia microti, Eastern Switzerland Emerg Infect Dis 8:
722-726
Fournier PE, Dumler JS, Greub G, Zhang J, Wu Y, Raoult D ( 2003) Gene sequence-based criteria for
identification of new rickettsia isolates and description of Rickettsia heilongjiangensis sp. nov. J Clin
Microbiol. 41(12):5456-65
Fournier, PE, Allombert, C, Supputamongkol, Y, Caruso, G, et al. ( 2004) Aneruptive fever associated with
antibodies to Rickettsia helvetica in Europe and Thailand. J Clin Microbiol 42:816-818.
Fournier, PE, Grunnenberger, F, Jaulhac, B, Gastinger, G, et al. ( 2000) Evidence of Rickettsia helvetica
infection in humans, eastern France. Emerg Infect Dis 6:389-392.
Fox LM, Wingerter S, Ahmed A, Arnold A, Chou J, Rhein L, Levy O (2006) Neonatal Babesiosis Case
Report and Review of the Literature. Pediatr Infect Dis J 25: 169-73
Fraser C. M., Casjens S., Huang W. M., e 35 autori. (1997) Genomic sequence of a Lyme disease spirochete,
Borrelia burgdorferi. Nature 390: 580-586
Furlanello C, Neteler M, Merler S, Menegon S, Montanan S, Dorini A, Rizzoli A, Chemini C (2003) GIS
and the random forest prediction integration in R for tick-borne disease risk assessment. Proc. Of the 3rd
International Workshop on Distribution Statistical Computing. March, 20-22, Wien Austria
Gagnon S.J., W. Zeng, I. Kurane and F.A. Ennis (1996) Identification of two epitopes on the dengue 4 virus
capsid protein recognized by a serotype-specific and a panel of serotype-cross-reactive human CD4+
cytotoxic T-lymphocyte clones. J. Virol. 70:141–147.
Gao G.F., M.H. Hussain, H.W. Reid and E.A. Gould (1994) Identification of naturally occurring monoclonal
antibody escape variants of louping ill virus. J. Gen. Virol. 75:609–614.
Garcia R., Gusmani L., Murgia R., Guarnaccia C., Cinco M., Rottini G. (1997) Elastase in the human
neutrophil granule pritein responsible for the in vitro killing of the Lyme disease spirochete B. burgdorferi.
Infect. Immun. 66: 1408-1412
Garyu JW, Choi KS, Grab DJ, Dumler JS (2005) Defective phagocytosis in Anaplasma phagocytophiluminfected neutrophils. Infect Immun. 73(2):1187-90.
Ge Y, Yoshiie K, Kuribayashi F, Lin M, Rikihisa Y (2005) Anaplasma phagocytophilum inhibits human
neutrophil apoptosis via upregulation of bfl-1, maintenance of mitochondrial membrane potential and
prevention of caspase 3 activation. Cell Microbiol. 7:29-38.
Genchi C (2007) Human babesiosis, an emerging zoonosis. Parassitologia 49 suppl.11: 29-31
Goff WL, Yunker CE (1988) Effects of pH, buffers and medium storage on the growth of Babesia bovis in
vitro. Int J Parasitol 18:775–778
Goldstein S. F., Buttle K. F., Charon N. W. (1996) Leptospiraceae and Borrelia burgdorferi by high voltage
electron microscopy. J. Bacteriol. 178: 6539-6545
Goodman J. L., Jurkovich P., Kramber J. M., Johnson R. C. (1991) Molecular detection of persistent
Borrelia burgdorferi in the urine of patients with active Lyme disease. Infect. Immun. 59: 269-278
Goodman JL, Nelson C, Vitale B, Madigan JE, Dumler JS, Kurtti TJ, Munderloh UG (1996) Direct
cultivation of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis. N Engl J Med. 334(4):209-15.
Gorenflot A, Moubri K, Precigout E, Carcy B, Schetters TP (1998) Human babesiosis. Ann Trop Med
Parasitol 92:489–501
142
Bibliografia
Gouin E, Gantelet H, Egile C, Lasa I, Ohayon H, Villiers V, Gounon P, Sansonetti PJ, Cossart P (1999)
Acomparative study of the actin-based motilities of the pathogenic bacteria Listeria monocytogenes, Shigella
flexneri and Rickettsia conorii. J Cell Sci. 112 ( Pt 11):1697-708.
Gould E.A., A. Buckley, A.D.T. Barrett and N. Cammack (1986) Neutralizing (54-kilodalton) and nonneutralizing (54-kilodalton and 48-kilodalton) monoclonal antibodies against structural and non-structural
Yellow fever virus proteins confer immunity in mice. J. Gen. Virol. 67:591–595.
Graves S, Unsworth N, Stenos J (2006) Rickettsioses in Australia. : Ann N Y Acad Sci. 1078:74-9.
Gray J, von Stedingk LV, Gürtelschmid M, Granström M. (2002) Transmission Studies of Babesia microti in
Ixodes ricinus Ticks and Gerbils. J Clin Microbiol 40:1259–1263
Gritsun T.S. and E.A. Gould (1995) Infectious transcripts of tick-borne encephalitis virus, generated in days by
RT-PCR. Virology 214: 611–618.
Gritsun T.S., K. Venugopal, P.M. Zanotto, M.V. Mikhailov, A.A. Sall, E.C. Holmes, I. Polkinghorne, T.V.
Frolova, V. Pogodina, A. Lashkevich and E.A. Gould (1997) Complete sequence of two tick-borne
flaviviruses isolated from Siberia and the UK: analysis and significance of the 5′ and 3′-UTRs. Virus Res.
49:27–39.
Gritsun T.S., T.V. Frolova, V. Pogodina, A. Lashkevich, K. Venugopal and E.A. Gould (1993a) Nucleotide
and deduced amino acid sequence of the envelope gene of the Vasilchenko strain of TBE virus; comparison
with other flaviviruses. Virus Res. 27 :201–209.
Gritsun TS, Lashkevich VA, Gould EA (2003) Tick-borne encephalitis. Antiviral Res. 57(1-2):129-46.
Grzeszczuk A, Puzanowska B, Miegoć H, Prokopowicz D (2004) Incidence and prevalence of infection with
Anaplasma phagocytophilum. Prospective study in healthy individuals exposed to ticks. Ann Agric Environ
Med. 11(1):155-7.
Halos L, Jamal T, Maillard R, Beugnet F, Le Menach A, Boulouis HJ, Vavssier-Taussat M. (2005)
Evidence of Bartonella sp. in questing adult and nymphal Ixodes ricinus tick from France and co-infection
with Borrelia burgdorferi sensu lato and Babesia sp. Vet Res 36: 79-87
Hammarsten JE (1983) The contributions of Idaho physicians to knowledge of Rocky Mountain Spotted Fever.
Trans Am Clin Climatol Assoc. 94:27-43.
Han X, Aho M, Vene S, Peltomaa M, Vaheri A, and Vapalathi O (2001) Prevalence of tick-borne encephalitis
Virus in Ixodes ricinus ticks in Finland. J Med Virol. 64;21-28.
Han X, Juceviciene A, Uzcategui NY, Brummer-Korvenkontio H, Zygutiene M, Jääskeläinen A, Leinikki
P, Vapalahti O (2005) Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus in Ixodes ricinus ticks in
Lithuania. J Med Virol. 77(2):249-56.
Hardalo CJ, Quagliarello V, Dumler JS (1995) Human granulocytic ehrlichiosis in Connecticut: report of a
fatal case. Clin Infect Dis. 21(4):910-4.
Hartelt K, Oehme R, Frank H, Brockmann SO, Hassler D, Kimming P. (2004) Pathogens and symbionts in
ticks: prevlence of Anaplasma phagocytophilum (Erlichia sp.) Wolbachia sp., Rickettsia sp., and Babesia sp.
in Southern Germany. Int J Med Microbiol 37: 86-92
Haselbarth K, Kurz M, Hunfeld KP, Krieger G (2008) Babesiosis in an immunocompromised German patient.
Med Klin (Munich) 103(2): 104-107
Hawley JR, Shaw SE, Lappin MR (2007) Prevalence of Rickettsia felis DNA in the blood of cats and their fleas
in the United States. J Feline Med Surg. 9(3):258-62.
143
Bibliografia
Hayes SF, Burgdorfer W, Aeschlimann ( 1980) A Sexual transmission of spotted fever group rickettsiae by
infected male ticks: detection of rickettsiae in immature spermatozoa of Ixodes ricinus. Infect Immun.
27(2):638-42
Heinz F.X., S.L. Allison, K. Stiasny, J. Schalich, H. Holzmann, C.W. Mandl and C. Kunz (1995)
Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogens for vaccination against tick-borne
encephalitis. Vaccine 13:1636–1642.
Heinz FX, Collett MS, Purcell RH, Gould EA, Howard CR, Houghton M, Moormann RJM, Rice CM,
Thiel JJ (2000) Family Flaviviridae. Virus taxonomy. Van Regenmortel CM, Fauquet CM, Bishop DHL,
Carstens E, Estes MK, Lemon S, Manilogg J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB, eds.
Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego, CA: Academic Press,
859–878.
Heinz FX, Kunz C(2004) Tick-borne encephalitis and the impact of vaccination. Arch Virol Suppl. (18):201-5
Heinz FX (1986)Epitope mapping of flavivirus glycoproteins.Adv Virus Res. 31:103-68.
Herpe B, Schuffenecker I, Pillot J, Malvy D, Clouzeau B, Bui N, Vargas F, Gruson D, Zeller H, Lafon ME,
Fleury H, Hilbert G (2007) Tickborne encephalitis, southwestern France. Emerg Infect Dis. 13(7):1114-6.
Herwaldt BL, Cacciò S, Gherlinzoni F, Aspöck H, Slemenda SB, Piccaluga P, Martinelli G, Edelhofer R,
Hollenstein U, Poletti G, Pampiglione S, Löschenberger K, Tura S, Pieniazek NJ (2003) Molecular
Characterization of a Non–Babesia divergens Organism Causing Zoonotic Babesiosis in Europe. Emerg
Infect Immun 70: 1599-1603.
Hildebrandt A, Hunfeld KP, Baier M, Krumbholz M, Fricke HJ, Straube E (2007) First confirmed
autochthonous case of human Babesia microti infection in Europe. Eur Clin Microbiol Infect Dis. 26: 595-601
Hilpertshauser H, Deplazes P, Schnvder M, Gern L, Mathis A (2006) Babesia spp. Identified by PCR in ticks
collected from domestic and wild ruminants in southern Swizerland. Appl Environ Microbiol 72: 6503-6507
Hines SA, Palmer GH, Brown WC, McElwain TF, Suarez CE, Vidotto O, Rice-Ficht AC (1995a) Genetic
and antigenic characterization of Babesia bovis merozoite spherical body protein Bb-1. Mol Biochem
Parasitol 69: 149-159
Holzer G.W., G. Remp, G. Antoine, M. Pfleiderer, O.M. Enzersberger, W. Emsenhuber, T. Hammerle, F.
Gruber, C. Urban, F.G. Falkner and F. Dorner (1999) Highly efficient induction of protective immunity
by a vaccinia virus vector defective in late gene expression. J. Virol. 73:4536–4542.
Holzmann H (2003) Diagnosis of tick-borne encephalitis. Vaccine. 21 Suppl 1:S36-40.
Homer MJ, Aguilar- Delfin I, Telford SR 3rd, Krause PJ, Persing DH (2000) Babesiosis. Clin Microbiol Rev
13: 451-469
Horowitz HW, Aguero-Rosenfeld ME, McKenna DF, Holmgren D, Hsieh TC, Varde SA, Dumler SJ, Wu
JM, Schwartz I, Rikihisa Y, Wormser GP (1998) Clinical and laboratory spectrum of culture-proven
human granulocytic ehrlichiosis: comparison with culture-negative cases. Clin Infect Dis. 27(5):1314-7.
Hu C. M., Wilske B., Fingerle V., Lobet Y., Gern L. (2001) Trasmission of Borrelia garinii OspA serotype 4
to BALB/c mice by Ixodes ricinus ticks collected in the field. J. Clin. Microbiol. 39: 1169-1171
Hudson PJ, Rizzoli A, Rosa R, Chemini C, Jones LD, Gould EA (2001) Tick-borne encephalitis virus in
Northern Italy; molecular analysis, relatioships with density and seasonal dynamics of Ixodes ricinus. Med
Vet Entomol. 15:304-313.
144
Bibliografia
Hulinská D., Basta J., Murgia R., Cinco M. (1995) Intracellular morphological events observed by electron
microscopy o neutrophil phagocytisis of Borrelia garinii. Journal of Spirochetal and Tick Borne Disease 2:
82-91
Infect Dis 9:942-948
International Scientific Working group on TBE (http//www.tbe-info.com).
Jacobs S.C., J.R. Stephenson and G.W. Wilkinson (1992),High-level expression of the tick-borne encephalitis
virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: protection elicited in a murine model. J. Virol. 66
:2086–2095.
Jado, I, Oteo, JA, Aldámiz, M, Gil, H, et al. (2007)Rickettsia monacensis and Human Disease, Spain. Emerg
Infect Dis 13:1405-1407.
Johnson R. C., Schmid G. P., Hyde F. W., Steigerwald A. G., Brenner D. J. (1984) Borrelia burgdorferi sp.
nv.: etiologic agent of Lyme disease. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 496-497
Jones L.D., M. Gaunt, R.S. Hails, K. Laurenson, P.J. Hudson, H. Reid, P. Henbest and E.A. Gould ,(1997)
Transmission of louping ill virus between infected and uninfected ticks co-feeding on mountain hares. Med.
Vet. Entomol. 11:172–176
Kaiser R (1999) The clinical and epidemiological profile of tick-borne encephalitis in southern Germany 199498: a prospective study of 656 patients. Brain. 122:2067-78.
Kaiser R (2008) Tick-borne encephalitis. Infect Dis Clin North Am. 22(3):561-75.
Kakoma I, Mehlhorn H (1993) Babesia of domestic animals. In J P Kreier (ed.) Parasitic protozoa. Academic
Press, San Diego, Calif. , 2nd ed. vol 7:141–216
Kamarasu K, Malathi M, Rajagopal V, Subramani K, Jagadeeshramasamy D, Mathai E (2007) Serological
evidence for wide distribution of spotted fevers & typhus fever in Tamil Nadu. Indian J Med Res. 126(2):12830.
Karakashian SJ, Rudzinska MA, Spielman A, Lewengrub S, Piesman J, Shoukrey N (1983) Ultrastructural
studies on sporogony of Babesia microti in salivary gland cells of the tick Ixodes dammini. Cell Tissue Res
231:275–287
Khozinskaya G.A., S.P. Chunikhin, V. Khozinsky and L.F. Stefutkina (1985) Variability of Powassan virus
cultured in tissue explants and organism of Hyalomma anatolicum ticks. Acta Virol. 29:305–311.
Kjemtrup AM, Conrad PA (2000) Human Babesiosis: an emerging disease. Int J Parasitol 30: 1323-1337
Kraiczy P., Skerka C., Kirschfink M., Brade V., Zipfel P. F. (2001) Immune evasion of Borrelia burgdorferi
by acquisition of human complement regulators FHL-1/reconectin and Factor H. Eur. J. Immunol. 31:16741684.
Krause PJ (2003) Babesiosis Diagnosis and Treatment. Vector-Borne Zoonotic Dis. 3: 45-51
Krause PJ, Corrow CL, Bakken JS (2003) Successful treatment of human granulocytic ehrlichiosis in children
using rifampin. Pediatrics. 112(3 Pt 1):e252-3.
Krause PJ, Spielman A, Telford SR 3rd, Sikand VK, McKay K, Christianson D, Pollack RJ, Brassard P,
Magera J, Ryan R, Persing DH (1998) Persistent parasitemia after acute babesiosis. N Engl J Med 339:160–
165
Krause, PJ, McKay, K, Thompson, CA, Sikand et al. (2002) Disease-specific diagnosis of coinfecting
tickborne zoonoses: babesiosis, human granulocytic ehrlichiosis, and Lyme disease. Clin Infect Dis 34:11841191
145
Bibliografia
Kulkarni A.B., A. Mullbacher, C.R. Parrish, E.G. Westaway, G. Coia and R.V. Blanden (1992) Analysis of
murine major histocompatibility complex class II-restricted T-cell responses to the flavivirus Kunjin by using
vaccinia virus expression. J. Virol. 66:3583–3592.
Kunz C., H. Hofmann and A. Stary (1976) Field studies with a new tick-borne encephalitis (TBE) vaccine.
Zentralbl. Bakteriol. Orig. A. 234:141–144.
Kunz C., H. Hofmann, F.X. Heinz and H. Dippe (1980) Efficacy of vaccination against tick-borne encephalitis.
Wien. Klin. Wochenschr. 92:809–813.
La Scola B, Raoult D (1997) Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and
new rickettsial diseases. J Clin Microbiol 35:2715-2727.
Labuda M., J.M. Austyn, E. Zuffova, O. Kozuch, N. Fuchsberger, J. Lysy and P.A. Nuttall (1996)
Importance of localized skin infection in tick-borne encephalitis virus transmission. Virology 219:357–366.
Labuda M., L.D. Jones, T. Williams, V. Danielova and P.A. Nuttall (1993) Efficient transmission of tickborne encephalitis virus between cofeeding ticks. J. Med. Entomol. 30:295–299.
Labuda M., O. Kozuch, E. Zuffova, E. Eleskova, R.S. Hails and P. Nutall (1997) Tick-borne encephalitis
virus transmission between ticks cofeeding on specific immune natural hosts. Virology 235:138–143.
Labuda M., W.R. Jiang, M. Kaluzova, O. Kozuch, P.A. Nuttall, P. Weismann, E. Eleckova, E. Zuffova and
E.A. Gould (1994) Change in phenotype of tick-borne encephalitis virus following passage in Ixodes ricinus
ticks and associated amino acid substitution in the envelope protein. Virus Res. 31:305–315.
Lakos A (2002) Tick-borne lymphoadenopathy (TIBOLA). Wien Klin Wochenschr 114: 648-654.
Lee SR, Chung JM, Kim YG (2007) Rapid one step detection of pathogenic bacteria in urine with sexually
transmitted disease (STD) and prostatitis patient by multiplex PCR assay (mPCR). J Microbiol. 45(5):453-9
Leiby A (2006) Babesiosis and blood transfusion: flying under the radar. Vox Sang 90: 157–165
Lepidi H, Bunnell JE, Martin ME, Madigan JE, Stuen S, Dumler JS (2000) Comparative pathology, and
immunohistology associated with clinical illness after Ehrlichia phagocytophila-group infections. Am J Trop
Med Hyg. 62(1):29-37.
Levine J. F., Wilson M. L., Spielman A. (1985) Mice as reservoirs of the Lyme disease spirochete. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 34: 355-360
Li H, Walker DH (1998) rOmpA is a critical protein for the adhesion of Rickettsia rickettsii to host cells. Microb
Pathog. 24(5):289-98.
Lin M, Rikihisa Y(2003) Ehrlichia chaffeensis and Anaplasma phagocytophilum lack genes for lipid A
biosynthesis and incorporate cholesterol for their survival. Infect Immun. 71(9):5324-31.
Lindenbach, B.D., Rice, C.M. (2001) Flaviviridae. The viruses and their replication. In: Knippe, D.M., Howley,
P.M. (Eds.), Fields Virology, vol. 1. Lippincott Williams & Wilkins, London, New York, Tokyo, 991–1042.
Lindgren E. and R. Gustafson (2001), Tick-borne encephalitis in Sweden and climate change. Lancet 358:16–
18.
Littman MP (2003) Canine Borreliosis. Vet Clin North Am Small Anim Pract 33: 827-862
Logar M, Bogovic P, Cerar D, Avsic-Zupanc T, Strle F (2006)Tick-borne encephalitis in Slovenia from 2000
to 2004: comparison of the course in adult and elderly patients.. Wien Klin Wochenschr. 2006 118(2122):702-7.
Lotric-Furlan S, Petrovec M, Avsic-Zupanc T, Strle F (2005) Concomitant tickborne encephalitis and human
granulocytic ehrlichiosis. Emerg Infect Dis. 11(3):485-8.
146
Bibliografia
Lotric-Furlan S, Rojko T, Petrovec M, Avsic-Zupanc T, Strle F (2006) Epidemiological, clinical and
laboratory characteristics of patients with human granulocytic anaplasmosis in Slovenia. Wien Klin
Wochenschr. 118(21-22):708-13.
Mahara F (2006) Rickettsioses in Japan and the far East.. Ann N Y Acad Sci. 1078:60-73.
Mandl C.W., F.X. Heinz, E. Stockl and C. Kunz (1989) Genome sequence of tick-borne encephalitis virus
(Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. Virology
173:291–301.
Mandl C.W., H. Kroschewski, S.L. Allison, R. Kofler, H. Holzmann, T. Meixner and F.X. Heinz
(2001)Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple
heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo. J. Virol. 75: 5627–5637.
Manilla G (1998) Fauna d’Italia: acari Ixodida; Edizione Calderoni Bologna.
Mantelli, B., Pecchiolo, E., Hauffe, H.C., Rosa, R., Rizzoli, A. (2006) Prevalence of Borrelia burgdorferi s.l.
and Anaplasma phagocytophilum in the wood tick Ixodes ricinus in the Province of Trento, Italy. Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis. Nov. 25:737-9.
Maroli M, Khoury C, Frusteri L Diffusione di Ixodes ricinus (acari Ixodidae) in Italia. Ecobiologia e ruolo
della specie nella trasmissione di patogeni. Giorn It Mal Inf 1: 269-278.
Marrero M, Raoult D (1989) Centrifugation-shell vial technique for rapid detection of Mediterranean spotted
fever rickettsia in blood culture. Am J Trop Med Hyg. 40(2):197-9.
Menardi G, Floris R, Bandi M, Mignozzi K, Boemo B, Altobelli A, Cinco M (2008) Detection and genotyping
of Borrelia burgdorferi in the trans-border area between Italy and Slovenia and evaluation of co-infection
with Anaplasma phagocytophilum in tick. Int J Med Microbiol. 298 (Suppl 1): 121-124.
Michel H., Wilske B., Hettche G., Göttner G., Heimerl C., Reischl U., Schulte-Spechtel U., Fingerle V.
(2003) An ospA-polymerase chain reaction/restriction fragment lenght polymorphism-based method for
sensitive detection and reliable differentiation of all European Borrelia burgdorferi sensu lato species and
OspA types. Med. Microbiol. Immunol. 193: 219-226
Mitchell PD, Reed KD, Hofkes JM (1996) Immunoserologic evidence of coinfection with Borrelia burgdorferi,
Babesia microti, and human granulocytic Ehrlichia species in residents of Wisconsin and Minnesota. J Clin
Microbiol 34:724-727
Montgomery R. R., Nathanson M. H., Malawista S. E. (1993) The fate of Borrelia burgdorferi, the agent for
Lyme disease, in mouse macrophages. Destruction, survival, recovery. J. Immunol. 150: 909-915
Moter S. E., Hofmann H., Wallich R., Simon M. M., Kramer M. D. (1994) Detection of Borrelia burgdorferi
sensu lato in lesional skin of patients with erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans by
ospA-specific PCR. J. Clin. Microbiol. 32: 2980-2988
Murgia R., Piazzetta C., Cinco M. (2002) Cystic forms of Borrelia burgdorferi sensu lato: induction,
development, and the role of RpoS. Wien Klin. Wochenschr. 114: 574-579
Nangara R., Duray P. H., Schumacher H. R. Jr. (1996) Ultrastructural demonstration of spirochetal antigens in
synovial fluid and synovial membrane in chronic Lyme disease: possible factors contributing to persistence of
organism. Human Pathology 27: 1025-1034
National Center for Biotechnology Information - www.ncbi.hlm.nih.gov/
Nefedova VV, Korenberg EI, Gorelova NB, Kovalevskii YV (2004) Studies on the transovarial transmission of
Borrelia burgdorferi sensu lato in the taiga tick Ixodes persulcatus. Folia Parasitol (PrahaMar) 51(1):67-71.
147
Bibliografia
Nielsen S. L., Younk K. J., Barbour A. G. (1990) Detection of Borrelia burgdorferi by the polymerase chain
reaction. Mol. Cell. Probes 4: 73-79
Nijhof AM, Bodaan C, Postigo M, Nieuwenhuijs H, Opsteegh M, Franssen L, Jebbink F, Jongejan F (2007)
Tichs and associated pathogens collected from domestic animals in the Netherlands. Vector-Borne Zoonotic
Dis 7:585 595
Nilsson K, Lindquist O, Påhlson C. (1999b) Association of Rickettsia helvetica with chronic perimyocarditis in
sudden cardiac death. Lancet. 354(9185):1169-73.
Nilsson K, Liu A, Påhlson C, Lindquist O (2005a) Demonstration of intracellular microorganisms (Rickettsia
spp., Chlamydia pneumoniae, Bartonella spp.) in pathological human aortic valves by PCR. J Infect. 50(1):4652.
Nilsson K, Lukinius A, Påhlson C, Moron C, Hajem N, Olsson B, Lindquist O (2005b) Evidence of
Rickettsia spp. infection in Sweden: a clinical, ultrastructural and serological study. APMIS. 113(2):126-34.
Nilsson K, Påhlson C, Lukinius A, Eriksson L, Nilsson L, Lindquist O (2002) Presence of Rickettsia
helvetica in granulomatous tissue from patients with sarcoidosis. J Infect Dis. 185(8):1128-38.
Nilsson, K, Lindquist, O, Liu, AJ, Jaenson, TG, et al. (1999a) Rickettsia helvetica in Ixodes ricinus ticks in
Sweden. J Clin Microbiol 37:400-3.
Nuti M, Serafini DA, Bassetti D, Ghionni A, Russino F, Rombolà P, Macri G, Lillini E (1998) Ehrlichia
infection in Italy. Emerg Infect Dis. 4(4):663-5.
Nuttall P.A., L.D. Jones, M. Labuda and W.R. Kaufman (1994) Adaptations of arboviruses to ticks. J. Med.
Entomol. 31:1–9.
Ohashi N, Zhi N, Lin Q, Rikihisa Y (2002) Characterization and transcriptional analysis of gene clusters for a
type IV secretion machinery in human granulocytic and monocytic ehrlichiosis agents. Infect Immun.
70(4):2128-38.
Olano JP, Walker DH (2002) Human ehrlichioses. Med Clin North Am. 86(2):375-92.
Ong KR, Stavropoulos C, Inada Y (1990) Babesiosis, asplenia, and AIDS. Lancet 336: 112
Oporto B, Gil H, Barral M, Hurtado A, Juste RA, Garcia-Perez AL (2003) A survey on Anaplasma
phagocytophila in wild small mammals and roe deer (Capreolus capreolus) in Northern Spain. Ann N Y Acad
Sci. 990:98-102.
Ormaasen V., A.B. Brantsaeter and E.W. Moen (2001) Tick-borne encephalitis in Norway. Tidsskr. Nor
Laegeforen 121:807–809.
Ortenzio S., Trevisan G. (2004) Sindromi correlate al Lyme: la nostra esperienza clinica. 4° Congresso
Nazionale del Gruppo Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Oschmann P., Kraiczy P., Halperin J., Brade V. (1999) Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis.
Science UNI-MED
Padovan C., Scaini M. T., Rorai E., Bonin S, Trevisan G. (2004) Anetodermia associata a borreliosi di Lyme:
caso clinico. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Park J, Kim KJ, Choi KS, Grab DJ, Dumler JS (2004) Anaplasma phagocytophilum AnkA binds to
granulocyte DNA and nuclear proteins. Cell Microbiol. 6(8):743-51.
Parodi A. (2004) Malattia di Lyme: epidemiologia. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano per lo Studio
della Malattia di Lyme-Grado
Parola P, Davoust B, Raoult D (2005) Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses. Vet Res. 36(3):46992.
148
Bibliografia
Parola P. (2006) Rickettsioses in sub-Saharan Africa. Ann N Y Acad Sci. 1078:42-7
Parola, P, Raoult D (2001a) Tick-borne bacterial diseases emerging in Europe. Clin Microbiol Infect 7:80-83.
Parola, P, Raoult, D (2001b) Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat.
Clin Infect Dis 32:897-928.
Pausa M., Pellis V., Cinco M., Giulianini P. G., Presani G., Perticarari S., Murgia R., Tedesco F. (2003)
Serum resistant strains of Borrelia burgdorferi evade complement-mediated killing by expressing a CD59like complement inhibitory molecule. J. Immunol. 170: 3214-3222
Perlman, SJ, Hunter, MS, Zchori-Fein, E. (2006) The emerging diversity of Rickettsia. Proc Biol Sci
273:2097-2106.
Persing D. H., Telford III S. R., Rys P. N., Dodge D. E., White T. J., Malawista S. E., Spielman A. (1990)
Detection of Borrelia burgdorferi DNA in museum specimens of Ixodes damminii ticks. Science 249: 14201423
Persing DH, Conrad PA (1995) Babesiosis: new insights from phylogenetic analysis. Infect Agents Dis 4:182–
195
Persing DH, Mathiesen D, Marshall WF, Telford SR, Spielman A, Thomford JW, Conrad PA (1992)
Detection of Babesia microti by Polymerase Chain Reactiont. J Clin Microbiol 30:2097-2103
Petrovec M, Lotric Furlan S, Zupanc TA, Strle F, Brouqui P, Roux V, Dumler JS (1997) Human disease in
Europe caused by a granulocytic Ehrlichia species. J Clin Microbiol. 35(6):1556-9.
Petrovec M, Sixl W, Schweiger R, Mikulasek S, Elke L, Wüst G, Marth E, Strasek K, Stünzner D, AvsicZupanc T (2003) Infections of wild animals with Anaplasma phagocytophila in Austria and the Czech
Republic. Ann N Y Acad Sci. 990:103-6.
Piccolin G, Benedetti G, Doglioni C, Lorenzato C, Mancuso S, Papa N, Pitton L, Ramon MC, Zasio C,
Berciato G (2006) A Study of the Presence of B.burgdorferi, Anaplasma (Previously Ehrlichia)
phagocytophilum, Rickettsia, and Babesia in Ixodes ricinus Collected within the Territory of Belluno, Italy.
Vector- Borne Zoonotic Dis. 6:24-31
Piesman J., Gern L. (2004) Lyme borreliosis in Europe and North America. Parasitology 129: S191-S220
Pietrobelli M, Cancrini G, Moretti A, Tampieri MP (2007) Animal babesiosis: an emerging zoonosi also
Italy?. Parassitologia 49 suppl.1: 33-38
Pleniazek N, Sawczuk M, Skotarczak B. (2006) Molecular identification of Babesia parasites isolated from
Ixodes ricinus tick collected in northwestern Poland. J Parasitol 92: 32-35
Pletnev A.G., V.F. Yamshchikov and V.M. Blinov (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete
amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology 174:250–263.
Poldini L, Feoli E. (2001) Model for the potential natural vegetation mapping of Friuli Venezia-Giulia (NE Italy)
and its application for a biogeographic classification of the region Plant Biosyst 135: 319-335.
Postic D., Assous M. V., Grimont P. A. D., Baranton G. (1994) Diversisty of Borrelia burgdorferi sensu lato
evidenced by restriction fragment lenght polymorphism of rrf (5S)-rrl (23S) intergenic spacer amplicons. Int.
J. Sys. Bacteriol. 44: 743-752.
Preac-Mursic V., Wilske B., Reinhardt S. (1991) Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. Eur. J.
Microbiol. Infect. Dis. 10: 1076-1079.
Priem S., Rittig M. G., Kamradt T., Burmester G. R., Krause A. (1997) An optimized PCR lead to rapid and
highly sensistive detection of Borrelia burgdorferi in patients with Lyme boreliosis. J. Clin. Microbiol. 35:
685-690.
149
Bibliografia
Prosenc, K, Petrovec, M, Trilar, T, Duh, D, et al. (2003) Detection of rickettsiae in Ixodes ricinus ticks in
Slovenia. Ann N Y Acad Sci 990:201-204.
Proutski V., E.A. Gould and E.C. Holmes (1997b) Secondary structure of the 3′ untranslated region of
flaviviruses: similarities and differences. Nucleic Acids Res. 25:1194–1202.
Pruthi RK, Marshall WF, Wiltsie JC, Persing DH (1995) Human babesiosis. Mayo Clin Proc 70:853–862
Puchhammer-Stöckl E, Kunz C, Mandl CW, Heinz FX (1995) Identification of tick-borne encephalitis virus
ribonucleic acid in tick suspensions and in clinical specimens by a reverse transcription-nested polymerase
chain reaction assay. Clin Diagn Virol. 4(4):321-6.
Randolph SE, Gern L, Nuttall PA (1996) Co-feeding ticks: epidemiological significance for tick-borne
pathogen transmission. Parasitol Today 12:472-479.
Randolph, S. (2001) The shifting landscape of tick-borne zoonoses: tick-borne encephalitis and Lyme borreliosis
in Europe. Phil. Trans. R. Soc. B356, 1045-1056.
Raoult, D. and Maurin M (2002) Rickettsia species (R. africae,R. australis, R. conori, R. felis, R. helvetica, R.
honei, R. japonicam, R. mongolotimonae, R. slovaca, R. sibirica Antimicrobial Therapy and Vaccines. 1.
Microbes, pp. 913-921. Apple Trees Production, LLC, New York .
Raoult D, Roux V (1997) Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases. Clinical
Microbiology Review 10:694-719.
Rauscher S., C. Flamm, C.W. Mandl, F.X. Heinz and P.F. Stadler (1997) Secondary structure of the 3′noncoding region of flavivirus genomes: comparative analysis of base pairing probabilities. RNA 3:779–791.
Rauter C, Hartung T (2005) Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes ricinus ticks in
Europe: a metaanalysis Appl Environ Microbiol. 71(11):7203-16.
Rehácek, J, Kocianová, E, Lukácová, M, Stanek, G, et al. (1997) Detection of spotted fever group (SFG)
rickettsia in Ixodes ricinus ticks in Austria. Acta Virol 41:355-356.
Richter D., Schlee D., Allgöwer R., Matuschka F.-R. (2004) Relationship of a novel Lyme disease spirochete,
Borrelia spielmani sp. nov., with its hosts in central Europe. Appl. Envir. Microbiol. 70: 6414- 6419.
Ricketts HT (1991) Some aspects of Rocky Mountain spotted fever as shown by recent investigations. 1909. Rev
Infect Dis. 13(6):1227-40.
Rijpkema S. G. T., Molkenboer M. J. C. H., Schouls L. M., Jongejan F., Schellekens J. F. P. (1995)
Simulataneous detection and genotyping of three genomic groups of in Dutch Ixodes ricinus ticks by
characterization of the amplified intergenic spacer region between 5S and 23S rRNA genes. J. Clin.
Microbiol. 33: 3091-3095
Roggendorf M., E. Goldhofer, F.X. Heinz, C. Epp and F. Deinhardt (1981) Epidemiology of tick-borne
encephalitis in Southern Germany. MMW Munch. Med. Wochenschr. 123:1407–1411.
Rojko T, Ursic T, Avsic-Zupanc T, Petrovec M, Strle F, Lotric-Furlan S (2006) Seroprevalence of human
anaplasmosis in slovene forestry workers. Ann N Y Acad Sci. 1078:92-4.
Rorai E. (2004) Malattia di Lyme precoce e sierologia: è ancora utile? 4° Congresso Nazionale del Gruppo
Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Rosa P. A., Schwan T. G. (1989) A specific and sensitive assay for the Lyme disease spirochete Borrelia
burgdorferi using the polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 160: 1018-1029
Rovery C, Raoult D (2008) Mediterranean spotted fever. Infect Dis Clin North Am. 22(3):515-30.
Rovetta G. (2004) Diagnostica clinica differenziale dell’artrite di Lyme. 4° Congresso Nazionale del Gruppo
Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
150
Bibliografia
Rudenko N., Golovchenko M., Němec J., Volkaert J., Mallatova N., Grubhoffer L. (2005) Improved method
of detection and molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in clinical samples by polymerase chain
reaction without DNA purification. Folia Microbiol. 50: 31-39
Rudolf I, Golovchenko M, Sikutova S, Rudenko N, Grubhoffer L, Hubalek Z. (2005) Babesia microti
(Piroplasmida: Babesia) in nymphal Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in the Czech Republic. Folia Parasitol
(Praha) 52: 274-276
Rudzinska MA, Spielman A, Lewengrub S, Trager W, Piesman J (1983) Sexuality in piroplasms as revealed
by electron microscopy in Babesia microti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2966–2970
Ruebush, T. K., P. B. Cassaday, H. J. Marsh, S. A. Lisker, D. B. Voorhees, E. B. Mahoney, and G. R. Healy
(1977). Human babesiosis on Nantucket Island: clinical features. Ann. Intern. Med. 86:6–9
Ruef BJ, Dowling SC, Conley PG, Perryman LE, Brown WC, Jasmer DP, Rice-Ficht AC (2000) A unique
Babesia bovis spherical body protein is conserved among geographic isolates and localizes to the infected
erythrocyte membrane. Mol Biochem Parasitol 105: 1-12
Ruscio, M., & Cinco, M. (2003) Human Granulocytic Ehrlichiosis in Italy. First report on two confirmed cases.
Ann. New York Acad. Sciences; 990, 350-353.
Safronov P.F., S.V. Netesov, T.P. Mikriukova, M. Blinov, E.G. Osipova, N.N. Kiseleva and L.S.
Sandakhchiev (1991) Nucleotide sequence of genes and complete amino acid sequence of tick-borne
encephalitis virus strain 205. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 4:23–29.
Saini R, Pui JC, Burgin S (2004) Rickettsialpox: report of three cases and a reviewJ Am Acad Dermatol. 51(5
Suppl):S137-42
Sam-Yellowe TY (1996) Rhoptry organelles of the apicomplexa: their role in host cell invasion and intracellular
survival. Parasitol 105: 1-12
Sanogo YO, Parola P, Shpynov S, Camicas JL, Brouqui P, Caruso G, Raoult D (2003) Genetic diversity of
bacterial agents detected in ticks removed from asymptomatic patients in northeastern Italy. Ann N Y Acad
Sci. 990:182-90
Sanogo, YO, Davoust, B, Parola, P, Camicas, JL, et al. (2003a)Prevalence of Rickettsia spp. in Dermacentor
marginatus ticks removed from game pigs (Sus scrofa) in Southern France. Ann NY Acad Sci 990:191-195.
Scaini M., Trevisan G. (2004) Manifestazoni cutanee nella Late Lyme disease. 4° Congresso Nazionale del
Gruppo Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado.
Schmaljohn C., D. Custer, L. VanderZanden, K. Spik, C. Rossi and M. Bray (1999) Evaluation of tick-borne
encephalitis DNA vaccines in monkeys. Virology 263:166–174.
Schmaljohn C., L. Vanderzanden, M. Bray, D. Custer, B. Meyer, D. Li, C. Rossi, D. Fuller, J. Fuller, J.
Haynes and J. Huggins (1997) Naked DNA vaccines expressing the prM and E genes of Russian spring
summer encephalitis virus and Central European encephalitis virus protect mice from homologous and
heterologous challenge. J. Virol. 71: 9563–9569.
Schmid N, Deplazes P, Hoby S, Ryser-Degiorgis MP, Edelhofer R, Mathis A (2008) Babesia divergens-like
organism from free-ranging chamois (Rupicaprar.rupicapra) and roe deer (Capreolus c.capreolus) are distinct
from B.divergens of cattle origin – An epidemiolgical and molecular genetic investigation. Vet Parasitol
(Epub ahead of print)
Schmidt B. L. (1997) PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. Clin. Microbiol.
Rev. 10: 185-201
151
Bibliografia
Schwartz I., Wormser G. P., Schwartz J. J., Cooper D., Weissensee P., Gazumyan A., Zimmermann E.,
Goldberg N., S., Bittker S., Campbell G. L., Pavia C. S. (1992) Diagnosis of early Lyme disease by
polymerase chain reaction amplification and culture of skin biopsies from erythema migrans lesions. J. Clin.
Microbiol. 30: 3082-3088
Sexton DJ, Kaye KS (2002) Rocky mountain spotted fever. Med Clin North Am. 86(2):351-60.
Shapiro ED (2008) Lyme disease. Adv Exp Med Biol. 609:185-95.
Simser, JA, Palmer, AT, Fingerle, V, Wilske, B, et al. (2002) Rickettsia monacensis sp. nov., a spotted fever
group Rickettsia, from ticks (Ixodes ricinus) collected in a European city park. Appl Environ Microbiol
68:4559-4566.
Sinagra G. (2004) Manifestazioni cardiologiche della malattia di Lyme. 4° Congresso Nazionale del Gruppo
Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Skarphédinsson S, Jensen PM, Kristiansen K (205) Survey of tickborne infections in Denmark. Emerg Infect
Dis. 11(7):1055-61.
Sréter-Lancz Z, Sréter T, Széll Z, Egyed L (2005) Molecular evidence of Rickettsia helvetica and R.
monacensis infections in Ixodes ricinus from Hungary. Ann Trop Med Parasitol. 99(3):325-30.
Stańczak J. (2006) The occurrence of Spotted Fever Group (SFG) Rickettsiae in Ixodes ricinus ticks (Acari:
Ixodidae) in northern Poland. Ann N Y Acad Sci. 1078:512-4.
Steere A. C. (1989) Medical progress – Lyme disease. N. Engl. J. Med. 321: 586-596
Steere A. C., Malawista S. E., Snydman D. R., Shope R. E., Andiman M. R., Ross M. R., Steele F. M. (1977)
Lyme arthritis. An epidemic of oligoarticular arthritis in children and adults in three Connecticut
communities. Arthr. Rheum. 20: 7-17
Steere AC, McHugh G, Suarez C, Hoitt J, Damle N, Sikand VK (2003) Prospective study of coinfection in
patients with erythema migrans. Clin Infect Dis 36:1078-1081
Stinco G. (2004) Acrodermatitis chronica atrophicans di Pick-Herxheimer. 4° Congresso Nazionale del Gruppo
Italiano per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Stralin K, Backman A, Holmberg H, Fredlund H, Olcen P (2005) Design of a multiplex PCR for Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used
on sputum samples. APMIS. 113(2):99-111
Strle F. (2004) Neuroborreliosis. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano per lo Studio della Malattia di
Lyme-Grado
Strle F. (2004b)Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Int J Med Microbiol. 293 Suppl 37:27-35.
Swanson, SJ, Neitzel, D, Reed, KD, Belongia, EA (2006) Coinfections acquired from ixodes ticks. Clin
Microbiol Rev 19:708-727.
Tarasevich IV, Mediannikov OY (2006) Rickettsial diseases in Russia. Ann N Y Acad Sci. 1078:48-59.
Telford SR 3rd, Spielman A (1998) Babesiosis of humans In L. Collier, A. Balows, and M. Sussman (ed.),
Topley and Wilson’s microbiology and microbial infections, Arnold, London, England. 9th ed, vol 5:349–359
Tilly K, Rosa PA, Stewart PE (2008) Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infect Dis Clin North Am.
22(2):217-34.
Tomao P., Papaleo B., Vonesch N., D’Ovidio M. C., Iavicoli S., Signorini S., De Rosa M. (1999) Manuale
informativo: la malattia di Lyme. Rischi per i lavoratori e misure di prevenzione. ISPESL.
152
Bibliografia
Tomassone L, Bertolotti C, Tramuta P, Nebbia P et al., (2005) Bacterial Tick-borne pathogens in ticks and
vertebrate hosts in Tuscany. (Italy). 220-222, in Proceedings, 5° International Conference on Ticks and TickBorne Pathogens, 29 August-2 September 2005, Neuchatel, Switzerland.
Trevisan G. (1986) Malattia di Lyme (a proposito di un caso). Ann. Ital. Derm. Clin. Sperim. 40: 91-95
Trevisan G. (2004) Manifestazioni cutanee della malattia di Lyme. 4° Congresso Nazionale del Gruppo Italiano
per lo Studio della Malattia di Lyme-Grado
Tringali, G, Intonazzo, V, Perna, AM, Mansueto, S, et al. (1986) Epidemiology of Boutonneuse fever in
western Sicily. Distribution and prevalente of spotted fever group rickettsial infection in dog ticks
(Rhipicephalus sanguineus). Am J Epidemiol 123:721-727.
Uilenberg G (2006) Babesia-A historical overview. Vet Parasitol 138: 3-10.
van Dam AP (2002) Diversity of Ixodes-borne Borrelia species--clinical, pathogenetic, and diagnostic
implications and impact on vaccine development. Vector Borne Zoonotic Dis. 2(4):249-54.
Verani P, Ciufolini MG, Nicoletti I.(1979) Circulation of TBE virus in Italy: seroepidemiological and
ecovirological studies. In Abstract of the International Symposium on Tick-borne Encephalitis.
Baden/Vienna, Austria; 1979 October 19-20;79-80.
Vial HJ, Gorenflot A (2006) Chemotherapy against Babesiosis. Vet Parasitol 138:147-160.
Walder G, Fuchs D, Sarcletti M, Berek K, Falkensammer B, Huber K, Petrovec M, Dierich MP, Würzner
R (2006) Human granulocytic anaplasmosis in Austria: epidemiological, clinical, and laboratory findings in
five consecutive patients from Tyrol, Austria. Int J Med Microbiol. 296 Suppl 40:297-301.
Walder G, Tiwald G, Dierich MP, Würzner R (2003a) Serological evidence for human granulocytic
ehrlichiosis in Western Austria. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 22(9):543-7.
Walker DH, Dumler JS (1996) Emergence of the ehrlichioses as human health problems. Emerg Infect Dis.
1996 Jan-Mar;2(1):18-29.
Walker DH, Feng HM, Popov VL (2001) Rickettsial phospholipase A2 as a pathogenic mechanism in a model
of cell injury by typhus and spotted fever group rickettsiae. Am J Trop Med Hyg. 65(6):936-42.
Walker DH, Valbuena GA, Olano JP (2003) Pathogenic mechanisms of diseases caused by Rickettsia. Ann N
Y Acad Sci. 990:1-11.
Wallich R., Moter S. E., Simon M. M., Ebnet K., Heiberger A., Kramer M. D. (1990) The Borrelia
burgdorferi flagellum-assiciated 41-ki antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of
the gene. Infect. Immun. 58: 1711-1719
Wallner G., C.W. Mandl, C. Kunz and F.X. Heinz (1995) The flavivirus 3′-noncoding region: extensive size
heterogeneity independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus.
Virology 213:169–178
Wallner G., C.W. Mandl, M. Ecker, H. Holzmann, K. Stiasny, C. Kunz and F.X. Heinz (1996)
Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne
encephalitis virus. J. Gen. Virol. 77:1035–1042.
Walls JJ, Aguero-Rosenfeld M, Bakken JS, Goodman JL, Hossain D, Johnson RC, Dumler JS (1999) Interand intralaboratory comparison of Ehrlichia equi and human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agent strains for
serodiagnosis of HGE by the immunofluorescent-antibody test. J Clin Microbiol. 37(9):2968-73.
Walls JJ, Caturegli P, Bakken JS, Asanovich KM, Dumler JS (2000) Improved sensitivity of PCR for
diagnosis of human granulocytic ehrlichiosis using epank1 genes of Ehrlichia phagocytophila-group
ehrlichiae. J Clin Microbiol. 38(1):354-6.
153
Bibliografia
Wang G., van Dam A. P., Dankert J. (1999) Phenotypic and genetic characterization of a novel Borrelia
burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 37: 3025-3028
Webster P, IJdo JW, Chicoine LM, Fikrig E (1998) The agent of Human Granulocytic Ehrlichiosis resides in
an endosomal compartment. J Clin Invest. 101(9):1932-41.
Wilske B., Fingerle V., Herzer P. et al. (1993) Recombinant immunoblot in the serodiagnosis of Lyme
borreliosis-comparison with indirect immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assay. Med.
Microbiol. Immunol. 182:255-270.
Wilske B., Shriefer M. E. (2003) Borrelia. In: Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken
R. H., eds. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press, 937-954
Wimberly MC, Baer AD, Yabsley MJ (2008) Enhanced spatial models for predicting the geographic
distributions of tick-borne pathogens. Int J Health Geogr. 15;7:15.
Wójcik-Fatla A, Cisak E, Chmielewska-Badora J, Zwoliński J, Buczek A, Dutkiewicz J (2006) Prevalence of
Babesia microtiI in Ixodes ricinus ticks from Lublin region (eastern Poland). Ann Agric Environ Med
13:319–322
Zeng L., I. Kurane, Y. Okamoto, F.A. Ennis and M.A. Brinton (1996) Identification of amino acids involved
in recognition by dengue virus NS3-specific, HLA-DR15-restricted cytotoxic CD4+ T-cell clones. J. Virol.
70:3108–3117.
154
Prodotti della ricerca
PRODOTTI DELLA RICERCA
Pubblicazioni on-line:
• sito dfp.units.it/spirochete/indice.html, “Rischio d’infezione per borreliosi di Lyme
ed altre malattie trasmesse da zecca: creazione di mappe di rischio”
Organizzazione Congressi:
•
Convegno 12 Maggio 2006, Auditorium Biagio Marin, GRADO “Mappa del
rischio per Borreliosi di Lyme ed altre malattie trasmesse da zecche nel Friuli
Venezia Giulia e nella zona transfrontaliera con la Slovenia: un anno di ricerche.
− Mappa del rischio infezioni da zecche in regione FVG e fascia transfrontaliera
slovena.
Cinco Marina
− Dinamica della distribuzione di Ixodes ricinus nel Friuli Venezia Giulia e
nell’area transfrontaliera Italia/Slovenia.
Boemo B., Mignozzi K., Cinco M., Floris R., Menardi G., Bandi M. e Altobelli A.
− Individuazione e genotipizzazione di Borrelia burgdorferi e virus TBE nel
Friuli Venezia Giulia ed area transfrontaliera Italia/Slovenia, mediante
tecniche PCR.
Floris R., Menardi G., Bandi M., Mignozzi K., Boemo B., Altobelli A. e Cinco M.
− Rischio da infezione da zecca nell’area transfrontaliera.
Mignozzi K., Boemo B., Floris R., Menardi G., Bandi M., Cinco M. e Altobelli A.
− Individuazione degli habitat favorevoli a Ixodes ricinus e produzione di una
mappa di rischio mediante l’impiego di dati biofisici (satellitari), banche
faunistiche e la carta dei sistemi ecologici del Friuli Venezia.
Altobelli A., Mignozzi K., Boemo B., Floris R., Menardi G., Bandi M. e Cinco M.
Prodotti della ricerca
Lavori pubblicati o in corso di stampa
−
First detection of TBE virus sequences in Ixodes ricinus from Friuli Venezia
Giulia (Italy). New Microbiologica, 29,147-150, 2006.
Floris R., Altobelli A., Boemo B., Mignozzi K. and Cinco M..
−
Spatial risk assessment to tick Ixodes ricinus transmitted infections in Northeastern Italy and transborder Italia/Slovenia territory. Int J Med Microbiol. 298
(Suppl 1), 211-217, 2008
Cinco M., Floris R., Menardi G., BoemoB., Mignozzi K. and Altobelli A.
−
Detection and genotyping of Borrelia burgdorferi in the trans-boprder area
between Italy and Slovenia and evaluation of co-infection wit Anaplasma
phagocytophilum in ticks. Int J Med Microbiol. 298 (Suppl 1), 121-124, 2008.
Menardi G., Floris R., Mignozzi K., Boemo B., Altobelli A., Cinco M.
−
Spatial risk assessment for Lyme borreliosis in Friuli Venezia Giulia (Italy).
Int J Med Microbiol. 298 (Suppl 1), 125-128, 2008.
Altobelli A., Boemo B., Mignozzi K., Bandi M., Floris R., Menardi G., Cinco M.
−
Detection and Identification of Rickettsia Species in the Northeast of
Italy. Vector Borne Zoonotic Dis 2008 Jul 18. [Epub ahead of print].
Floris R, Yurtman AN, Margoni EF, Mignozzi K, Boemo B, Altobelli A, Cinco M
−
First detection of Babesia EU1 and Babesia divergens-like in Ixodes ricinus ticks
in north-eastern Italy. Parassitologia (submitted)
Floris R., Cecco P., Mignozzi K., Boemo B., and Cinco M.
Tesi di laurea:
− Tesi sperimentale in microbiologia, laureanda Chiara Urbani, relatore Prof.ssa
Marina Cinco, “Lyme borreliosi del Friuli Venezia Giulia: prevalenza nelle zecche
vettrici e rischio di infezione”, anno accademico 2006-2007.
− Tesi sperimentale in microbiologia, laureanda Paola Cecco, relatore Prof.ssa
Marina Cinco, correlatore Dott. Romina Floris, “Individuazione di Babesia spp. in
zecche Ixodes ricinus del Carso triestino mediante tecniche molecolari”, anno
accademico 2007-2008.
−
Prodotti della ricerca
Partecipazione a Congressi:
• Workshop: “Cross border Activities - Good practices for Better Health”,
EUREGIO, 20-21 January 2006 in Bielefeld, Germany.
−
Spatial risk assessment for Lyme borreliosis and tick-borne encephalitis (TBE) in
the trans-border area between Italy and Slovenia: preliminary results.
Cinco M., Altobelli A., Boemo B., Floris R. and Mignozzi K.
• 34° Congresso Nazionale della Società Italiana di Microbiologia, Palazzo Ducale
Genova, 15-18 Ottobre 2006.
−
Individuazione e genotipizzazione molecolare di B. burgdorferi in pazienti
affetti da borreliosi e in zecche Ixodes ricinus: confronto ospite-vettore in Regione
Friuli Venezia Giulia.
Floris R., Menardi G., Bandi M., Mignozzi K., Boemo B., Altobelli A., Marina C.
−
Determinazione del rischio potenziale di infezione per borreliosi di Lyme ed
encefalite TBE in regione Friuli Venezia Giulia
Menardi G, Floris R, Bandi M, Mignozzi K, Boemo B, Altobelli A, Cinco M.
• IX International Jena Symposium on Tick-borne diseases. Jena, 15-18 March
2007, in Jena (Germany).
−
Spatial risk assessment and prediction to tick (Ixodes ricinus) transmitted
infections in North-eastern Italy and transborder Italia/Slovenia territory.
Cinco M., Floris R., Menardi G., Boemo B., Mignozzi K. and Altobelli A.
−
Detection of TBE virus in Friuli Venezia Giulia region (Italy) and evaluation of
co-infection with Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum in ticks.
Floris R., Menardi G., Bandi M., Mignozzi K., Boemo B., Altobelli A. e Cinco M.
−
Detection and genotyping of Borrelia burgdorferi in the trans-border area
between Italy and Slovenia and evaluation of co-infection with Anaplasma
phagocytophilum in tick.
Menardi G., Floris R., Bandi M., Mignozzi K, Boemo B. Altobelli A. and Cinco M.
−
Spatial risk assessment for Lyme borreliosis in Friuli Venezia Giulia (Italy).
Altobelli A., Boemo B., Mignozzi K., Bandi M., Floris R., Menardi G., Cinco M.
XXI ciclo dei Dottorati di Ricerca - Università degli Studi di Trieste
MESSA A PUNTO DI METODICHE MOLECOLARI PER LA RICERCA E
L’IDENTIFICAZIONE DI AGENTI PATOGENI TRASMESSI DA ZECCHE
IN IXODES RICINUS E NELL’UOMO
Riassunto
La zecca Ixodes ricinus, molto diffusa in Friuli Venezia Giulia, rappresenta il vettore
principale responsabile della trasmissione del morbo di Lyme (Borrelia burgdorferi),
anaplasmosi (Anaplasma phagocytophilum), rickettiosi (Rickettsia spp.), babesiosi (Babesia
spp.) e del virus dell’encefalite TBE (tick-borne encephalitis). La regione Friuli Venezia
Giulia è stata già dichiarata zona endemica per la borreliosi di Lyme; di recente cinque casi
clinici di anaplasmosi sono stati descritti nell’alto Friuli, mentre negli ultimi anni si è rilevato
un incremento costante dei casi di encefalite TBE. Vari casi di rickettiosi e babesiosi sono
stati registrati di recente in Europa, compresi in territori confinanti con la nostra regione.
Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato quello di creare una mappa del territorio
regionale che identifichi le zone a rischio per tutti e cinque gli agenti patogeni al fine di
ridurre i casi d’infezione e facilitare la diagnosi considerando anche la possibilità di contrarre
co-infezioni.
La ricerca di sequenze genomiche dei patogeni di interesse è stata effettuata impiegando varie
tecniche di biologia molecolare. Sono state analizzate le zecche raccolte in 38 stazioni della
regione FVG durante il biennio 2005-2006. La prevalenza di B. burgdorferi è stata valutata
amplificando lo spazio intergenico 5S-23S e i campioni positivi sono stati genotipizzati
tramite un nuovo sistema PCR-RFLP diretto verso il gene plasmidico ospA ideato nel nostro
laboratorio. La presenza del virus TBE è stata dimostrata applicando la tecnica nested-RTPCR specifica per la regione non codificante all’estremità 5’ dell’RNA virale, seguita da
sequenziamento per l’identificazione del sottotipo. Per la ricerca di A.phagocytophilum sono
stati scelti dei primer specifici per il gene epank1, mentre la presenza di Rickettsia spp. è stata
constatata amplificando il gene per la subunità 16S ribosomiale; i campioni positivi sono stati
sequenziati per identificare le specie. La presenza di Babesia spp. è stato condotto su
campioni di zecche provenienti dalla zona del Carso raccolti negli anni 2006-2007. Lo
screening è stato effettuato applicando una nested-PCR specifica per il gene per la β-tubulina
associato ad una PCR specifica per il gene 18S rRNA. I positivi sono stati identificati tramite
sequenziamento seguito da analisi dell’omologia ed elaborazione di due alberi filogenetici.
La prevalenza d’infezione annuale di B. burgdorferi è stata del 23,3 % nell’anno 2005 e 22,9
% nell’anno 2006; la zona fitoclimatica a più alto rischio d’infezione è risultata l’area del
Carso. La genotipizzazione ha dimostrato la prevalenza di B. afzelii (54.9%) rispetto a B.
garinii (31.7%) e B. burgdorferi s. s. (6%) e il 3.6% di una specie denominata pattern P1. Il
virus TBE è stato rilevato in gran parte delle stazioni campionate nel 2005 con punte di
presenza anche del 70%, soprattutto nelle stazioni situate ad altitudini più elevate (area
alpina). Questa è la prima dimostrazione della presenza del virus in FVG. L’analisi di
sequenza lo ha identificato come appartenente al sottotipo Western European TBE. L’analisi
per la presenza di A. phagocytophilum ha evidenziato una prevalenza annuale del 1,6%
nell’anno 2005 e 0,7 % nel 2006, con una distribuzione disomogenea sul
territorio. Il sequenziamento dei positivi ha confermato la specie. La media
annuale di infezione per Rickettsia spp. è stata del 4% nell’anno 2005; nel 2006 è stata
riscontrata una distribuzione sul territorio paragonabile a quella dell’anno precedente, con una
incremento della prevalenza annuale al 6,1%. I picchi di prevalenza sono stati riscontrati nella
parte centrale della regione FVG, a cavallo delle aree alpina e prealpina. L’analisi di sequenza
ha evidenziato, per la prima volta in regione FVG, la presenza delle specie R. helvetica e R.
monacensis, entrambe patogene per l’uomo; in un campione proveniente dall’area alpina è
stata rilevata una specie omologa a R. limoniae.
La prevalenza media di infezione di Babesia spp. è risultata del 0.8% nel 2006 e 1.1% nel
2007. Tramite l’analisi di omologia e la creazione di alberi filogenetici sono state identificate
la specie patogena Babesia EU1 e una specie altamente omologa al gruppo B. divergens/B.
capreoli, potenzialmente patogena. Questi dati dimostrano per la prima volta la diffusione di
Babesia spp. anche sul versante italiano dell’area transfrontaliera. Inoltre, sono state
individuate zecche coinfette da due o tre agenti patogeni, soprattutto dal virus TBE e B.
burgdorferi, il che suggerisce una possibile trasmissione simultanea all’uomo di patologie
diverse con una probabile complicazione del quadro clinico.
Gli screening basati su grandi numeri necessitano di tecniche rapide come l’uso di una
multiplex PCR che favorisce la tempestività dei risultati, sia nell’analisi del vettore, sia in
campo diagnostico, così come riportato in letteratura per la diagnosi di infezioni miste.
L’ ultima parte di questo studio ha riguardato, perciò, la progettazione di un sistema di
multiplex PCR in grado di rilevare la co-presenza del DNA di Borrelia, Rickettsia, Anaplasma
e Babesia con un’unica amplificazione. Questo sistema ha dimostrato di essere uno strumento
rapido e specifico nell’individuare le coinfezione di agenti patogeni trasmessi da zecche in I.
ricinus e in campioni biologici di pazienti con presunta pluriinfezione.
In conclusione possiamo affermare che questa indagine ha permesso di valutare il rischio di
malattie trasmesse da I. ricinus, in regione FVG e area transfrontaliera slovena fornendo un
quadro più chiaro della situazione epidemiologica, soprattutto in base all’identificazione delle
specie circolanti, alcune rilevate per la prima volta in queste aree.
I risultati di questo studio sono pubblicati sul sito del laboratorio “Rischio d’infezione per
borreliosi di Lyme ed altre malattie trasmesse da zecca: creazione di mappe di rischio”
(dfp.units.it/spirochete/indice.html) allo scopo di renderli usufruibili dai cittadini e, quindi,
contribuire almeno in parte alla prevenzione dell’infezione di malattie trasmesse da zecche
tramite la conoscenza del territorio.
Dottoranda:
Relatore/Tutor:
Dr.ssa Romina Floris
Prof.ssa Marina Cinco
RINGRAZIAMENTI
Voglio ringraziare la Prof.ssa Marina Cinco che mi ha sempre seguita e consigliata in questi
tre anni di dottorato rendendo possibile la realizzazione di questa tesi.
Un grazie a tutte le colleghe con le quali ho collaborato, in particolare la Dr.ssa Marialisa
Bandi, la Dr.ssa Ayse Nur Yurtman e la Dr.ssa Giulia Menardi.
Ringrazio la Dr.ssa Katja Mignozzi, la Dr.ssa Barbara Boemo e il Dr. Alfredo Altobelli per
tutto il lavoro svolto nella raccolta e classificazione delle zecche, nonché per le elaborazioni
statistiche dei risultati molecolari.
Un grazie anche alla regione Friuli Venezia Giulia che ha finanziato questo studio tramite il
programma P.I.C. INTERREG IIIA ITALIA/SLOVENIA 2000-2006.