lucia bondioli

Nanoparticelle polimeriche per il
direzionamento cerebrale:
Rilascio di Zinco e studi preliminari
in vitro su cellule neuronali
Lucia Bondioli
Dipartimento di Scienze farmaceutiche
Università di Modena e Reggio Emilia
Sindrome di PhelanPhelan-McDermid (Delezione 22q13)
Sindrome da microdelezione cromosomica
Zinco
Shank
chiave per modulare
Cromosoma 22
Proteine strutturali
post-sinaptiche
sinapsi eccitatorie
Amyloid beta protein-induced
zinc sequestration leads to
synaptic loss via dysregulation
of the ProSAP2/Shank3 scaffold
Grabrucker A. et al, Accepted for
pubblication 2011
velocemente la plasticità
sinaptica in una situazione di
alterazione morfologica dei
Disfunzione della proteina
contatti sinaptici
causa ritardi dello sviluppo
mentale e fisico
Presenza di Shank a livello post-sinaptico può essere modulata dalla presenza di
Zinco
Standford and ULM_Project
• Sindrome di Phelan-McDermid
– Carenza di Zn2+ a livello delle sinapsi
• Veicolazione di Zn2+ in neuroni mediante NPs
– Incapsulazione di Zn2+
– Test in vitro su 3 tipologie cellulari
•HEK293
•Neuroni Ippocampali di Ratto
•Cellule Gliali
SISTEMI NANOPARTICELLARI
P-NPs
Nps vuote e
non modificate,
usate come
controllo
Size: 190±3 nm
Zp: -13,8±0,3 mV
Nanoparticelle
targetizzate
con il peptide g7
e non targetizzate
BBB-NPs
Nps vuote
modificate
con il g7
Size: 217±3 nm
Zp: -14,9±0,5 mV
PLGA____acido polilattico-co-glicolico
Zn-P-NPs
Nps caricate con
ZnSO3 e
non modificate
Size: 231 ±4 nm
Zp: -4,4±0,1 mV
Contenuto Zn2+:
2,6 mg/100 mg Nps
Nanoparticelle
targetizzate con il peptide
g7
e non targetizzate,
caricate con Zn2+
Zn-BBB-NPs
Nps caricate con
ZnSO3 e modificate
con il g7
Size: 215 ±
±5 nm
Zp: -5,6±0,6
±
mV
Contenuto Zn2+:
2,8 mg/100 mg Nps
5% PLGA-Rodamina
CD44-NPs
Nps vuote
modificate
con l’anticorpo
CD44
Size: 217±3 nm
Zp: -14,9±0,5 mV
Nanoparticelle
targetizzate
con gli anticorpi NCAM1
e CD44
NCAM1-NPs
Nps vuote
modificate
Size: 217±3 nm
con l’anticorpo
Zp: -14,9±0,5 mV
NCAM1
Neuroni
Glia
Vitalità cellulare
P-NPs
[Nps]= 625 µg/ml ; [ZN2+]= 250 µM
BBB-NPs
ZnP-NPs
ZnBBB-NPs
Cellule
trattate
MAP2: marker neuronale
Numero Cellule
Cellule
Non trattate
DAPI
DAPI
DAPI
DAPI
MAP2
CTRL
MAP2
P-NPs
MAP2
BBB-NPs
DAPI
MAP2
Zn-P-NPs
MAP2
Zn-BBB-NPs
Vitalità cellulare
P-NPs
BBB-NPs
Numero Cellule
P-NPs
BBB-NPs
Neuroni
Glia
[Nps]= 625 µg/ml
ZnP-NPs
ZnBBB-NPs
Neuroni
[NPs]= 625 µg/ml pari a [ZN2+]= 250 µM
CONC. INTRACELLULARE DI ZN2+
CONC. INTRACELLULARE DI ZN2+
HEK293
Valutazione della [Zn2+]
CTRL
Zn-P-NPs Zn-BBB-NPs Zn-P-NPs Zn-BBB-NPs
3d 3d
1d 1d
Zn-PNPs 1d
Zn-BBBNPs 1d
Zn-PNPs 8d
Zn-BBBNPs 8d
Colocalizzazione di NPs e
HEK293
2+
Zn
[Nps ZN]= 625 µg/ml ; [ZN2+]= 250 µM
BBB-NPs
ZnBBB-NPs
Strutture vescicolari
Neuroni
Meccanismo di Internalizzazione
• Neuroni trattati con P-NPs fluorescenti (Rodamina)
• Incubazione con FM1-43 (Marker di endocitosi)
• NPs e FM1-43 colocalizzano.
• NPs entrano nella cellula attraverso un meccanismo endocitotico
P-NPs
P-NPs
Tosi et al, Nanomedicine (2011) 6(3), 423-436
Meccanismo di Internalizzazione
BBB-NPs
Glia
BBB-NPs
BBB-NPs
BBB-NPs
BBB-NPs
Neuroni ippocampali
BBB-NPs
BBB-NPs
Presenza del g7 sulla
superficie NPs
aumenta l’interazione con
le cellule neuronali
P-NPs
P-NPs
Neuroni ippocampali
BBB-NPs
P-NPs
Anticorpi come DIREZIONANTI
CD44 per direzionare verso le cellule gliali
NCAM1 per direzionare verso i neuroni
CD44NPs
NCAM1NPs
Selective Targeting
Neuroni
Glia
Perfetta colocalizzazione di
NCAM1 e MAP2
MAP2 come marcatore per i neuroni
GFAP come marcatore per le cellule gliali (astrociti)
Anticorpi come MARCATORI
CD44NPs
P-NPs
NPs modificate con Anticorpi specifici
NCAM1NPs
NCAM: Ab specifico per Neuroni
CD44: Ab specifico per cellule gliali
P-NPs
P-NPs
MAP2: marker neuronale; GFAP: marker gliale (astrociti)
Conclusione
No significativa tossicità alla concentrazione utilizzata
sono in grado di veicolare Zn2+ in differenti tipi cellulari
NPs
Endocitosi: possibile meccanismo di internalizzazione
Glicopeptide g7: aumenta interazione con le cellule
Presenza Ab specifici: targeting selettivo
Prof. Forni
Prof. Vandelli
Dr. Tosi
Dr. Ruozi
Dr. Badiali
Dr. Belletti
Prof. Rivasi
Dr. De Vita
University of Standford and Ulm
Dr. Grabrucker
Dr. Garner
Dr. Boeckers
Grazie per l’attenzione