Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Ricerca di Parassiti in Campioni diversi dal Sangue
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4.1 | data di emissione: 09.05.14 | Pagina: 1 di 48
© Crown copyright 2014
Ricerca di Parassiti in Campioni diversi dal Sangue
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida dell’Health Protection Agency (HPA) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul
sito web http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e
controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i
laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo
documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
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Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................5
SMI RU: SCOPO E PROPOSTE ................................................................................................7
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
SCOPO .......................................................................................................................................9
INTRODUZIONE ........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/ LIMITAZIONI .............................................................................20
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ......................................................................21
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE ........................................................................................22
3
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ................................................24
4
PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE ..............................................................24
5 PROCEDURA DI REFERTAZIONE .... .......................................................................... 31
6
NOTIFICA AL PHE O EQUIVALENTE .........................................................................31
APPENDICE 1: TIPOLOGIA DEI CAMPIONI E POSSIBILI PARASSITI
IDENTIFICABILI……………………………………………………………………………………
33
APPENDICE 2: DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA DELLE INFEZIONI PARASSITARIE ......34
APPENDICE 3: CALIBRAZIONE DEL MICROSCOPIO PER COMPONENTI FECALI ..........35
APPENDICE 4: COMUNI COSTITUENTI MICROSCOPICI DELLE FECI...............................36
APPENDICE 5: DIMENSIONI COMPARATIVE DELLE UOVA DI ELMINTI ..........................37
APPENDICE 6: OOCISTI DI COCCIDI ...................................................................................38
APPENDICE 7:CONFRONTO FRA TENIE RISCONTRATE NELL'UOMO ...........................39
APPENDICE 8:LARVE DI ELMINTI - CARATTERISTICHE ...................................................40
APPENDICE 9: IDENTIFICAZIONE DI TROFOZOITI DI AMEBA IN STRISCI COLORATI ..41
APPENDICE 10: BALANTIDIUM COLI - TROFOZOITE E CISTE .........................................42
APPENDICE 11: IDENTIFICAZIONE DELLE CISTI DI AMEBE E FLAGELLATI .................42
APPENDICE 12:MICROFILARIE RISCONTRATE NELL'UOMO ..........................................43
BLIOGAFIA ..............................................................................................................................44
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NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
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Tabella delle modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Date.
8/09.05.14
Emissione eliminate no.
4
Emissione inserita no.
4.1
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato
che evidenzia il passaggio della Health Protection
Agency alla Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Intero documento
Rinominata la pagina di “Stato come Scopo” e
Obiettivo ed aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
Revisionati e aggiornati Standard di sicurezza e
referenti delle denunce
Il contenuto scientifico rimane invariato
Modifica No/Date.
7/26.03.13
Emissione eliminate no.
3.1
Emissione inserita no.
4
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Edito per chiarezza.
Riorganizzazione di parte del testo.
Modifiche minori al testo.
Intero documento
Maggior chiarezza per appropriati metodi di
colorazione..
Cambiamenti Tassonomici:
Giardia duodenalis (sinonimo di Giardia intestinalis
e Giardia lamblia).
Cystoisospora belli (in precedenza Isospora belli).
Pneumocystis jirovecii (in precedenza
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Peumocycstis carinii).
Microsporidi reclassificati come fungi.
Aggiunti metodi rapidi /molecolari a Informazione
Technical/Limitazioni.
Aggiunti vantaggi/svantaggi alle variazione della
dimensione dei pori dei filtri per la concentrazione
delle feci.
Aggiunti collegamenti ai laboratori di riferimento.
Rimozione del raschiamento corneale, lenti a
contatto, e fluidi per lenti a contatto.
Appendice.
Tipologia del campione e distribuzione delle
tabelle spostate da Appendice 1 e 2.
Bibliografia.
Aggiornate alcune voci bibliografiche
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UK SMI#: Scopo e Obiettivi
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che
operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici
informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle
infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione
elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche
anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da
adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti
del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche
(prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli
algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la
diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note
orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad
esempio la validazione della prova.
La standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori che è una
condizione essenziale per interventi di sorveglianza della salute pubblica, e per le attività di
ricerca e di sviluppo.
La standardizzazione delle procedure diagnostiche tramite l’applicazione delle SMI aiuta a
garantire uniformità nelle stratefie di ricerca nei diversi laboratori nel RU ed è una condizione
essenziale per la sorveglianza della salute pubblica , ricerca e sviluppo di attività.
Coinvolgimento delle Organizzazioni Professionali
Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of
Pathologists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può
essere trovato su sito http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di
un’organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione
del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del Comitato
Direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono
necessariamente quelle espresse da tutta l'organizzazione che essi rappresentano. I
rappresentanti agiscono da tramite con funzione di collegamento bi-direzionale per
informazione e dialogo. Le attività di rappresentanza sono ricercate tramite un processo di
consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate e aggiornate tramite un ampio processo di
consultazione.
Assicurazione di Qualità
La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le
SMI. L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall’Ottobre 2009. La
procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano
una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria
attività tutti i laboratori di
microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE
#
Microbiology is used as a generic term to include the two GMC-recognised specialties of Medical Microbiology (which includes
Bacteriology, Mycology and Parasitology) and Medical Virology.
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rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di
laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i
requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono
essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei
allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed
eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il
coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di
operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà
strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di
partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al
nostro sito web.
Informazione della Gestione dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e
di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313.
I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione
efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici
coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, la PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano
modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali
modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate
nel corso della revisione successiva. Queste procedure standard (SMI) possono essere
sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da
parte dell’ente accreditato NICE.
Le SMI sono assoggettate a diritti d’autore che dovrebbero essere riconosci
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Errore. L'origine riferimento non è stata trovata..
UK Standards for Microbiology Investigations. B 31Issue 4.
http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf
Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4 | Data emissione: 26.03.13 | Pagina: 8 di 48
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
Scopo del Documento
Tipo di campione
Feci, urine, vetrino con nastro adesivo, tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi,
aspirati duodenali / digiunali, tessuti, csti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare
biopsie
Scopo
Questa SMI descrive le procedure per la ricerca e l’isolamento di un certo numero di parasiti
ottenuti da diversi materiali clinici, esclusi i campioni ematici.
Questa SMI deve essere usata insieme alle altre SMI.
Introduzione
Sebbene i campioni fecali siano quelli più frequentemente inviati al laboratorio per la ricerca dei
parassiti, molti altri diversi tipi di parassiti possono essere isolati da vari altri materiali inviati in
laboratorio. In questa sede sono descritti i quadri clinici, la preparazione dei campioni e
l’identificazione dei parassiti più frequentemente identificati presso i laboratori della Public Health
England (PHE), ma ne possono essere riscontrati anche altri. Per completezza sono descritte
anche le specie di non frequente osservazione.
I Laboratori di Riferimento devono essere utilizzati per identificare i parassiti che non fanno parte
della normale attività diagnostica del laboratorio.
Anche laboratori di ematologia, istologia e sierologia possono contribuire in modo significativo alla
diagnosi delle infezioni da parassiti.
Questa introduzione descrive:
•
Protozoi
- Amebe
- Flagellati/ciliati
- Coccidi
•
Nematodi
•
Trematodi
•
Cestodi
Protozoi2
Amebe intestinali
Le Amebe che possono essere isolate dal tratto gastrointestinale includono Entamoeba histolytica,
Entamoeba dispar, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Endolimax nana e Iodamoeba
butschlii. Tutte, tranne E. histolytica, di solito non sono patogene (consultare Appendici 9-11).
E. histolytica ed E. dispar sono morfologicamente indistinguibili al microscopio ottico. Delle due
specie, solo E. histolyticaè in grado di indurre una malattia a carattere invasivo. Quando la diagnosi
Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4 | Data emissione:09.05.14 | Pagina: 9 di 48
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
è posta con l’osservazione al microscopio ottico, le cisti devono essere segnalate come E.
histollytica/ E.dispar3. In alternativa, i metodi diagnostici comprendono la ricerca dell’antigene con
saggio immunoenzimatico o la ricerca del DNA con la PCR2,4.
E. histolytica può produrre lesioni di tipo ulcerativo ed infiammatorio nel colon. Diffonde in sedi
extraintestinali, più frequentemente epatica, dove si manifestano estese lesioni dei tissuti, che
possono provocare formazione di ascessi, aumento della peristalsi intestinale e feci liquide.
L’infezione può provocare la perforazione colica, megacolon tossico, ameboma, e ulcerazione
perianale3.
Campioni appropriati includono i liquidi aspirati o raschiamenti da un’area di tessuto intestinale o
rettale sede d’infiammazione in corso di dissenteria e le feci di emissione recente per l’esame
microscopico con il metodo della concentrazione per sedimentazione con etere/formolo. Il rilievo
nei campioni fecali, o in quelli tissutali, di trofozoiti con emazie ingerite suggerisce la probabile
diagnosi di malattia invasiva da E. histolytica2.
Amebe a vita libera
L’infezione nell’uomo da amebe a vita libera è infrequente. Questi protozoi includono: specie
Acanthamoeba, Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris e Sappinia diploidea5. Le infezioni
causano l’invasione del sistema nervoso centrale e la cheratite da acanthamoeba.
La meningoencefalite primitiva amebica (MPA) è causata dalla N. fowleri. Si manifesta negli adulti
e nei bambini che hanno da poco nuotato in acque calde infette. I microrganismi raggiungono la
sede del sistema nervoso centrale per invasione diretta attraverso la mucosa nasale. Non si
dispone di trattamento terapeutico efficace ed affidabile e la malattia è rapidamente a decorso
infausto5.
Deve essere presa in considerazione la MPA quando i pazienti sviluppano meningite o
meningoencefalite purulenta ed un’anamnesi di esposizione recente ad acqua dolce. Il conteggio
dei globuli bianchi nel sangue nella fase iniziale della malattia può essere basso, ma aumenta nel
tempo. L’aspetto del liquido cefalorachidiano (LCR) è emorragico, la glicorrachia è ridotta o
normale e la protidorrachia aumentata
La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame di un preparato in sospensione di LCR e di uno
colorato per trofozoiti di ameba (consultare Appendice 9 e 10).
L’encefalopatia granulosa amebica (EGA) è causata dalle specie Acanthamoeba e Balamuthia
mandrillaris. E’ un’infezione opportunistica cronica, si manifesta più frequentemente in pazienti
immuodepressi/AIDS, diffondendo al sistema nervoso centrale per via ematogena dal polmone o
da lesioni cutanee. E’ spesso ad esito letale. La cheratite da Acanthamoeba è associata all’uso di
lenti morbide a contatto e a traumatismi oculari; se non trattata immediatamente, può indurre
un’ulcerazione corneale ed eventualmente cecità. Le specie Acanthamoeba possono essere inoltre
isolate dal liquido per lenti a contatto di soggetti privi di segni o sintomi di malattia. (B 2Investigation of Bacterial Eye Infections)5.
L’EGA può essere diagnosticata esaminando materiale bioptico cerebrale. Nell’EGA è frequente la
presenza di ’infezione cutanea da Acanthamoeba; si possono eseguire biopsie su noduli cutanei
od ulcerazioni poi esaminati con microscopia su preparato in sospensione e colorato (consultare
Appendice 9). Sono disponibili anche metodi sierologici.
Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4 | Data emissione:09.05.14 | Pagina: 10 di 48
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Flagellati
Giardia lamblia (sinonimo di Giardia intestinalis and Giardia lamblia)6
Questo microrganismo può causare epidemie diarroiche d’origine idrica ed è prevalentemente
diffuso per via oro-fecale da persona a persona o da animali2. L’infezione può manifestarsi con
diarrea autolimitante o con sindrome diarroica cronica, steatorrea, malassorbimento e perdita di
peso. I sintomi includono diarrea, crampi, gonfiore addominale e flatulenza. Possono manifestarsi
vomito, febbre e tenesmo, ma l’infezione può anche essere di tipo asintomatico2.
La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l’esame microscopico di feci, aspirati duodenali
o digiunali, e biopsie (consultare Appendice 11). Mtodi alternativi sulle feci includono la ricerca
dell’antigene con test immunoenzimatico e la ricerca con PCR6.Esaminare più campioni a causa
dell’emissione discontinua dei microrganismi. In modo ottimale, esaminare complessivamente tre
campioni raccolti in 2 – 3 giorni diversi. Sono disponibili prove sierologiche, sebbene non affidabili.
Dientamoeba fragilis2
La patogenicità della Dientamoeba fragilis è incerta, comunque sono stati documentati casi di
diarrea non invasiva associati ad astenia. Diversamente da altri protozoi non possiede uno stadio
cistico, ed è ora considerata come ameba/flagellata. Il ruolo della diantoameba nei pazienti affetti
da HIV e disordini intestinali è incerto e richiede ulteriori ricerche7.
Nei preparati emulsionati in fisiologica è molto difficile rilevare lo stadio di trofozoite, come pure in
preparati di formolo-etere concentrati. Possono essere rilevati in materiale fecale con colorazioni
quali tricromica, Giemsa o di Field (TP 39 - Staining Procedures). Sono stati sviluppati metodi
alternativi che comprendono la ricerca del DNA con la PCR7.
Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas hominis
Nelle infezioni dell’uomo possono essere isolati Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas
hominis. La maggior parte delle Infezioni da T. vaginalis è a trasmissione sessuale, mentre P.
hominis colonizza l’intestino crasso e non è considerata patogena, sebbene possa causare
moderati sintomi gastro-intestinali se presente ad elevate concentrazioni (B28 – Investigation of
8
Genital Tract and Associated Specimens) .
La diagnosi di laboratorio è di solito ottenuta con l’esame microscopico di un preparato
emulsionato in fisiologica. Possono anche essere allestiti preparati con colorazione di arancio di
acridina, sebbene ciò comporti la disponibilità di un microscopio a fluorescenza e la conseguente
perdita d’immediatezza.
Ciliati
Balantidium coli
B. coli è un ciliato che parassita numerosi animali, inclusi l’uomo e i maiali. E’ presente ovunque. Di
solito gli uomini sono resistenti all’infezione da B. coli, ma l’acloridria o la nutrizione insufficiente
può aumentare il rischio di colonizzazione. La colonizzazione spesso è asintomatica. I pazienti
possono sviluppare diarrea liquida intermittente o colite dissenterica acuta con feci contenenti
muco e sangue2.
Dotati di rapidi movimenti, i grandi trofozoiti possono essere rilevati al microscopio nelle feci
appena emesse (consultare Appendice 10). Nei campioni conservati la diagnosi è di tipo
microscopico con preparato in sospensione, infatti i trofozoiti e le forme cistiche si colorano in
modo indistinto con lo iodio o con le colorazioni permanenti1.
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Coccidi
Cryptosporidium
Nell’uomo le specie Cryptosporidium possono causare diarree liquide profuse9. I bambini sono
particolarmente vulnerabili per la mancanza di immunità acquisita e per la scarsa igiene personale.
L’infezione presenta variazione stagionale con picchi d’incidenza in primavera e autunno.
L’infezione crea particolari problemi negli immunocompromessi 2. La sintomatologia è di solito
grave con diarrea cronica e segni di malassorbimento, ma altri tipi di esordio comprendono una
malattia gastrointestinale atipica, come colangite, colecistite, pancreatite ed epatite. Sono state
segnalate pure affezioni del tratto respiratorio. La diagnosi di laboratorio si avvale principalmente
della dimostrazione di oocisti nei campioni appropriati, solitamente feci, evidenziate con
colorazione auramina-fenolo, di Ziehl-Neelsen modificata (TP 39 - Staining Procedures) o tecniche
con anticorpi fluorescenti. La sensibilità della colorazione di Ziehl-Neelsen modificata per la ricerca
dei criptosporidi si è dimostrata inferiore agli altri metodi10,11. Metodi alternativi sono la ricerca
dell’antigene ed i saggi immunoenzimatici o la ricerca del DNA con PCR2. Le prove di tipo
specialistico includono la microscopia con immunofluorescenza, particolarmente sensibile, e i saggi
PCR per identificazione di specie/genotipo.
Cyclospora
L’infezione da Cyclospora è presente in numerosi paesi e può essere associata all’acqua potabile
contaminata o di balneazione. Durante la stagione delle piogge nel Nepal e nella comunità di Haiti
si sono manifestate diffuse epidemie che hanno colpito i viaggiatori e gli stranieri residenti12,13. In
Europa sono state segnalate epidemie alimentari associate a insalate miste e vegetali14,15.
L’’infezione da Cyclospora cayetanesis è stata inoltre segnalata in pazienti infettati da HIV16.
I sintomi dell’infezione da Clyclospora includono diarrea liquida, perdita di peso, nausea, vomito e
dolore addominale.
La diagnosi di laboratorio si avvale dell’aspetto delle oocisti nei preparati in sospensione o colorati.
Possono essere utilizzati metodi di concentrazione e le colorazioni modificate di Ziehl-Neelsen.
Nota: Cyclospora cayetanesis si colora in modo inadeguato con auramina-fenolo, ma presenta una
caratteristica autofluorescenza blu a 340 - 360 nm (consultare TP 39 - Staining Procedures e
Appendice 3 e 6).
Cystoisospora belli (in precedenza Isospora belli)2
L’infezione da Cystoisospora belli è relativamente infrequente nei paesi sviluppati, ma è endemica
in alcune parti del mondo. Nei pazienti immunodepressi può determinare diarree liquide
aspecifiche, autolimitanti associate a malessere, anoressia, crampi addominali e perdita di peso. I
pazienti affetti da AIDS sono particolarmente predisposti all’infezione da Cystoisospora belli (con
particolare frequenza in Africa).
La diagnosi di laboratorio è ottenuta con l’esame microscopico di un campione fecale o di muco
intestinale. E’ raccomandata la concentrazione delle feci con formolo-etere; come le specie
Cyclospora, Cystoisospora è auto fluorescente a 340-360nm (consultare TP 39 - Staining
Procedures e Appendici 3 e 6).
Sarcocystis
Le Infezioni da specie Sarcocystis sono origine zoonotica. Le specie Sarcocystis differiscono dagli
altri coccidi in quanto richiedono due ospiti per completare il loro ciclo vitale. L’uomo diviene ospite
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
intermedio dopo assunzione di carne cotta in modo incompleto dell’ospite primario contenente
sarcocisti. La maggior parte di queste infezioni è asintomatica, ma sintomi, quali dolore
addominale, nausea, gonfiore addominale e diarrea possono essere correlati alla presenza di
sporocisti nelle feci. Nell’uomo la sarcocistosi muscolare è conseguente all’infezione da ingestione
di carne infetta o trasmessa da gatti infetti. In questo caso i sintomi comprendono dolenzia o
tumefazione muscolare.
Le tecniche di diagnosi di laboratorio sono le stesse di quelle per le specie Cystoisospora essendo
presenti sporocisti mature nelle feci a partire dal nono giorno dall’avvenuta infezione.
Microscopicamente non sono facilmente differenziabili da quelle delle specie Cystoisospora, e
pertanto l’identificazione deve essere eseguita da un Laboratorio di Riferimento.
Toxoplasma
Nella maggior parte dei pazienti immunocompetenti l’infezione da Toxoplasma gondii è
asintomatica, possono comunque manifestarsi sintomatologia febbrile, malessere, linfoadenopatia
e mialgia. Si può manifestare malattia a sede oculare. Le infezioni possono essere primitive o da
riattivazione. La riattivazione di un’infezione latente si manifesta in pazienti divenuti gravemente
immunocompromessi. L’infezione fetale può essere determinata da un’infezione acuta contratta
durante la gravidanza. (consultare P 5 - Investigation of Toxoplasma in Pregnancy).
Le procedure della diagnosi di laboratorio comprendono prove sierologiche, coltura, PCR e
tecniche istologiche.
Microsporidi
Sono noti oltre 100 generi ed almeno 1000 specie. In patologia umana sono implicati quattro
generi, Nosema, Encephalitozoon, Pleistophora, e Enterocytozoon17. Questi organismi sono
parassiti intracellulari obbligati e si riscontrano nei liquidi corporei, tessuti e nel tratto
gastrointestinale. All’inizio sono stati classificati come parassiti, ora sono stati considerati funghi18.
Solo Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon (Septata) intestinalis coinvolgono il tratto
gastrointestinale; per differenziare le due specie sono disponibili saggi PCR.
La microsporidiosi rappresenta un problema particolare nei pazienti infettati da HIV2. Questi ed altri
pazienti immunocompromessi sono frequentemente infettati da parassiti opportunisti che nei
soggetti immunocompetenti di solito non producono sintomatologia19. La diarrea cronica
rappresenta l’aspetto clinico più eclatante dell’infezione da HIV ed è la causa predominante di
morbilità e mortalità in questi pazienti20. La cherotocongiuntivite da Microsporidi è stata
recentemente riscontrata in pazienti affetti da AIDS.
Possono essere utilizzate colorazioni istologiche, tecniche immunologiche e la microscopia
elettronica per identificare questi microrganismi nelle urine, nell’espettorato, lavaggio
broncoalveolare, nella bile, nell’aspirato duodenale, nelle feci, nei tessuti e nei raschiamenti
corneali e congiuntivali. I Microsporidi possono essere evidenziati usando la colorazione tricromia o
la colorazione di Ziehl-Neelsen modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures Appendici 3 e
6). E’ stato valutato l’uso dell’idrossido di potassio associato a colcoflour bianco; entrambi si sono
dimostrati equivalenti alla colorazione di Ziehl-Neelsen modificata21.
Protozoi a tassonomia non definita
Blastocystis hominis
Descritti in precedenza come flagellati, lieviti, coccidi ed amebe, questo microrganismo costituisce
un gruppo diverso classificato come stramenopiles22 E’ dubbio il significato di B. hominis come
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patogeno umano23. La presenza nelle feci in carica consistente (più di cinque microrganismi per
campo ad elevato ingrandimento) è correlata a sintomi di anoressica, flatulenza e diarrea2.
Per la diagnosi di laboratorio possono essere utilizzati la microscopia su preparato in sospensione
dopo concentrazione formolo-etere e strisci colorati con Giemsa e colorante di Fields o le
confezioni di colorazioni differenziali24 (consultare TP 39 - Staining Procedures).
Pneumocystis jirovecii (in precedenza Pneumocistis carini)25
Pneumocystis jirovecii è un microrganismo extracellulare che causa polmonite interstiziale con
infiltrato plasmacellulare nell’uomo e generalmente provoca malattia nei pazienti immunodepressi
od immunosoppressi, nei prematuri, nei bambini ammalati e affetti da malnutrizione26.
Pneumocistis è stata classificata come protozoo, poi riclassificata e ora è considerata un fungo
parassita27.
La polmonite da P jirovecii. è una comune infezione opportunistica frequente nei pazienti con AIDS
(consultare B 57 - Investigation of Bronchoalveolar Lavage, Sputum and Associated Specimens).
La diagnosi di laboratorio si avvale della colorazione dei campioni ottenuti da espettorazione
indotta o da lavaggi bronco-alveolari (BAL). Questa può essere eseguita mediante colorazione con
Giemsa o con impregnazione argentica o, più specificamente, con la ricerca dell’antigene con
metodo di immunofluorescenza diretta od indiretta. (consultare TP 39 - Staining Procedures).
Nematodi (Vermi rotondi)
La diagnosi di laboratorio delle infestazioni da nematodi si avvale principalmente
dell’identificazione delle uova o delle larve emesse con le feci. Un preparato fecale emulsionato in
soluzione fisiologica dopo concentrazione con formolo-etere/etil-acetato consente il rilievo
microscopico delle uova (consultare Appendice 5). Ha pure valore diagnostico il rilevo
macroscopico del parassita.
In numerose infezioni parassitarie intestinali, inclusa la dissenteria amebica, possono presentare
nelle feci cristalli di Charcot-Leyden. Questi sono caratteristici del coinvolgimento degli eosinofili
disgregati in alcune reazioni dei tessuti. I cristalli esagonali proteici di Charcot-Leyden possono
essere osservati con microscopia normale o in fluorescenza come aghi fluorescenti risplendenti di
colore giallo verde28,29.
La presenza di eosinofilia tissutale od ematica in viaggiatori di ritorno da un soggiorno prolungato,
o da un viaggio in alcuni paesi in via di sviluppo, o in immigrati provenienti da aree tropicali,
suggerisce la possibilità di un’infezione da elminti30. Alcune infezioni protozoarie possono causare
anche eosinofila. La maggior presenza di eosinofila nei tessuti e nel sangue circolante si manifesta
quando i parassiti raggiungono un contatto stretto con i tessuti, come per esempio quello delle
larve migranti o per una loro estesa disseminazione in questa sede. Esempi sono rappresentati
dalla trichinosi, larve viscerali migranti, dalla polmonite da ascaris, dalla strongiloidiasi, dalla
filariasi e dalla schistosomiasi acuta. Organismi quali le tenie stazionano nell’intestino e non
invadono la mucosa, pertanto causano eosinofila di moderata entità oppure non la provocano
affatto.
Enterobius vermicularis
Noto anche come ossiuro, determina prurito perianale e perineale, specialmente nei bambini31. I
parassiti migranti sono riscontrati nell’appendice, salpingi e nelle lesioni ulcerative dell’intestino
tenue e del crasso, ma è incerta la loro correlazione con la con la patologia clinica (consultare
Appendice 5).
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La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame microscopico di un preparato con nastro adesivo e/o
di un campione perianale prelevato con tampone.
Trichuris trichiura
Noto come verme a frusta determina infezioni spesso asintomatiche31. La perdita di sangue
conseguente alle penetrazioni cefaliche delle forme adulte nella mucosa intestinale è di solito
trascurabile, ma infezioni severe possono causare anemia di grado medio, diarrea ematica,
disidratazione, sviluppo ritardato e prolasso rettale (consultare Appendice 5).
Ascaris lumbricoides30,31
Questa infezione è solitamente asintomatica. Comunque il verme è in grado di causare una grave
malattia polmonare e di ostruire il tratto biliare e quello intestinale. Le larve migrano nei polmoni e
possono causare eosinofilia ematica e sintomatologia associata all’infiltrazione polmonare.
Nell’espettorato si possono riscontrare larve al terzo stadio. Nei bambini con infezioni gravi la
massa dei vermi può ostruire il lume dell’intestino tenue. Ciò causa distensione addominale, vomito
e crampi, Possono invadere anche il dotto biliare e causare dolore epigastrico, nausea e vomito
(consultare Appendice 5).
Anchilostomi
Due sono le specie note che causano infezione nell’uomo: l’Ancylostoma duodenale ed il Necator
americanus31. Le larve penetrano nella cute causando prurito intenso, eritema ed esantema
papulare o vescicolare. Le larve migrano nei polmoni ove possono causare sintomatologia
respiratoria ed eosinofilia nell’espettorato e nel sangue periferico. Diversamente dal N. americanus,
A. duodenale può causare infezione a seguito di penetrazione per via orale. I sintomi includono
anemia, deficienza proteica cronica, dolore addominale, perdita di peso e malassorbimento. Le
uova dell’anchilostoma possono essere riscontrate nei campioni fecali, ma
non è possibile distinguere fra loro le specie se non dopo la loro schiusa (consultare Appendici 5 e
8).
Nei campioni fecali non “recenti” infetti da anchilostoma si possono riscontrare larve al primo
stadio; ciò consente la loro differenziazione dallo strongyloides (consultare Appendice 8).
Trichostrongylus spp.
Questi organismi sono ubiquitari, ma sono di raro riscontro in Europa. Possono causare malattia
nell’uomo e sono presenti negli allevamenti di animali erbivori delle aree rurali.
Strongyloides stercoralis
Strongyloides stercoralis invade la mucosa intestinale e deposita uova a parete sottile che
schiudono larve rabditoidi30. Queste possono essere emesse con le feci o sviluppare nel lume
intestinale larve infettive che possono provocare autoinfezione dell’ospite. Questa può assumere
andamento destruente nei pazienti immunocompromessi31. La sintomatologia polmonare è molto
simile a quella dell’infezione da anchilostomi. Altri sintomi includono bruciore o coliche addominali
dolorose, diarrea, emissione di muco, nausea, vomito, perdita di peso e malassorbimento. I
pazienti possono sviluppare anche un’esantema orticaroide generalizzato o localizzato,
inizialmente perianale, che si estende poi alle natiche, addome e alle cosce
Il primo stadio delle larve (rabditoide) è di solito riscontrato nelle feci, mentre le uova sono presenti
solo in caso di diarrea severa (consultare Appendice 8)32. Per la diagnosi sono disponibili prove
sierologiche.
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Infezioni insolite da nematodi
La diagnosi di laboratorio delle infezioni di seguito descritte può essere superiore alle possibilità
diagnostiche della maggior parte dei laboratori di routine. Poiché molte di queste infestazioni sono
rare e si riscontrano solo nei paesi tropicali, si raccomanda che i campioni dei pazienti che
presentano alcune peculiarità siano gestiti da un laboratorio di riferimento.
Le specie Trichinella sono ingerite con carne poco cotta30,33. La maggior parte delle infezioni è
asintomatica, ma la presenza nell’intestino di un elevato numero di vermi adulti può causare
diarrea, dolenzia addominale e vomito. Le larve si insediano nei muscoli scheletrici e causano
febbre, edema peri-orbitale e miosite con dolore e rigonfiamento.
L’infezione è confermata con la sierologica o con la prova cutanea per la Trichinella. Di solito non è
necessaria la biopsia muscolare.
Larva viscerale migrante (LVM): si tratta di larve che migrano dall’intestino a fegato, polmone e
trachea30,34. L’agente eziologico più frequente è la Toxocara canis. Le specie Toxocara e altre
elminti (Ascaris lumbricoides, Gnathostoma spinigerum) possono essere pure essere associate
alla sindrome. La LVM si manifesta principalmente nei bambini d’età inferiore a 6 anni. La maggior
parte delle infezioni è asintomatica, anche se i pazienti possono presentare tosse, febbre, dispnea
ed epatomegalia. Raramente le larve si localizzano nell’occhio.
L’eosinofilia associata a leucocitosi è indicative di LVM. Sono disponibili prove sierologiche.
La larva migrante oculare è conseguente alla penetrazione delle larve di T. canis (e meno
frequentemente di T. cati) che sono intrappolate nell’occhio formando una massa infiammatoria
eosinofila34. La larva cutanea migrante, o eruzione strisciante, è di solito causata dall’Ancylostoma
braziliense34. Si presenta come lesione cutanea pruriginosa serpiginosa, rilevata e arrossata.
Questa manifestazione può essere causata da altri parassiti, come lo S. stercoralis.
Le larve di specie Anisakis (associate ad ingestione di pesce crudo, es. sushi), specie Phocanema
e altri generi, possono penetrare nello stomaco e nell’intestino tenue e provocare sintomi
addominali simulanti un’appendicopatia34.
La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con endoscopia, studi radiologici o con esame
istologico dei tessuti coinvolti.
Angiostrongylus
Le larve di Angiostrongylus cantonensis possono invadere il cervello e causare meningite
associata a pleiocitosi eosinofila nel LCR e ad eosinofilia periferica34. Le larve sono raramente
rilevate nel LCR. G. spinigerum può causare una malattia simile.
L’angiostrongiliasi addominale è causata dall’A. costaricensis34,35. Le larve penetrano e si
sviluppano nell’intestino tenue e nel colon.
La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l’esame di campioni bioptici.
Capillaria26, 34
La capillariasi, causata dalla Capillaria philippinensis e da C. hepatica, può presentarsi con diarrea,
vomito, perdita di peso e malassorbimento, o epatite acuta/subacuta ed eosinofilia periferica.
Per la diagnosi sono richiesti l’esame del materiale fecale dopo concentrazione formolo-etere o
materiale bioptico.
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Dracunculus
L’infezione da Dracunculus medinensi è caratterizzata dalla presenza di ulcere cutanee croniche
dalla quali protrudono i vermi33. Alcuni pazienti presentano reazione generalizzata con orticaria,
vomito, diarrea e dispnea.
Si sviluppano ulcere dolose che producono liquido contenente le larve. Queste possono essere
riscontrate all’esame microscopico che conferma la diagnosi.
Onchocerca volvulus
Questo parassita è trasmesso dalle “mosche nere33. Causa una dermatite pruriginosa, noduli
sottocutanei, cheratite e corioretinite. Le microfilarie possono essere dimostrate nei raschiamenti
cutanei, nella camera anteriore dell'occhio o nella cornea.
Vermi adulti possono essere riscontrati nei campioni bioptici delle formazioni nodulari (consultare
Appendice 12).
Mansonella streptocera
Questa specie particolare è trasmessa dai moscerini e da alcune specie di “mosche nere33. Altre
specie sono di solito riscontrate nel sangue.
Dirofilaria immitis34
Nell’uomo sviluppano noduli a sede polmonare o ascessi sottocutanei. Le filarie migranti muoiono
e causano vasculite localizzata che provoca infarti polmonari. Le altre specie causano la
formazione di masse sottocutanee.
La diagnosi di laboratorio si avvale degli esami bioptici.
Trematodi (Distomidi)36
Di solito la diagnosi di laboratorio è ottenuta mediante l’identificazione microscopica delle uova
emesse con le feci, le eccezioni sono di seguito elencate. Possono essere richiesti campioni di
sangue soprattutto quando la presenza del parassita è scarsa nelle feci e nelle urine e può
determinare un esito negativo. Una preparazione con sospensione del campione in soluzione
fisiologica e / o iodio seguita da una concentrazione formolo-etere permette la dimostrazione
microscopica delle uova. La colorazione del sedimento può aiutare l'identificazione (appendice 5)
Distomi ematici
Schistosomiasi
Questa può essere causata da cinque specie di Schistosoma: Schistosoma haematobium,
Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, e Schistosoma
mekongi37. Le forme adulte sono presenti nei vasi portali e mesenterici, diversamente S.
haematobium è presente nel plesso venoso vescicale. Le sindromi patologiche principali includono
dermatite, febbre di Katayama e sequele croniche di tipo fibrotico-ostruttivo. Queste sindromi sono
conseguenti e correlate a tre differenti stadi dello sviluppo nell’ospite dei parassiti: cercarie, vermi
maturi ed uova. La penetrazione delle cercarie determina l’insorgenza di papule pruriginose, a cui
segue un quadro dermatologico definito dermatite da schistosoma o prurito del nuotatore. I vermi
adulti giunti a maturazione iniziano a depositare le uova e si sviluppa la febbre di Katayama o la
schistosomiasi acuta. Alcune uova rimangono nell’organismo dell’ospite. Queste possono indurre
la formazione di granulomi e danneggiamento dei tessuti che possono ostruire il flusso ematico
portale verso il fegato ed il flusso circolatorio verso i polmoni, o quello urinario verso gli ureteri e la
vescica. L’infezione da S. haematobium solitamente esordisce con ematuria30. L’infezione cronica
da S. haematobium può evolvere in cancro della vescica35.
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
La diagnosi di laboratorio è ottenuta con il rilievo delle uova nelle feci (urine, o liquido seminale per
S. haematobium). Possono inoltre essere esaminati frustoli rettali o biopsie. Sono disponibili prove
sierologiche.
Distosomi epatici
Opisthorchis (Clonorchis) sinensis
Le infezioni massive possono causare ostruzione localizzata dei dotti biliari e ispessimento delle
pareti, ed anche colangite e colangioepatite37.
Fasciola hepatica
L’infestazione sviluppa due distinte fasi cliniche, corrispondenti alla fase migratoria epatica del ciclo
vitale e quella di insediamento del verme nella sede finale, il dotto biliare37. La fase iniziale è
caratterizzata da epatomegalia, febbre e dolore nel quadrante addominale superiore destro con
ostruzione del dotto e conseguente cirrosi biliare.
Possono essere dimostrate uova nelle feci o nella bile. Sono disponibili prove sierologiche.
Distosomi intestinali
Questi includono Fasciolopsis buski, Heterophyes heterophyes, Nanophyetus salmincola,
Metagonimus yokogawai ed Echinostoma species34,37. La maggior parte delle infezioni da F. buski
sono asintomatiche. Infezioni massive possono causare diarrea, dolore addominale e
malassorbimento. H. heterophyes causa dolore addominale e diarrea. L’infezione da specie
Echinostoma è rara, ma è stata ben documentata. N. salmincola causa diarrea, dolore addominale,
gonfiore ed eosinofila.
Distosomi polmonari
Specie Paragonimus
I distosomi polmonari si incapsulano nel parenchima, di solito in prossimità dei bronchioli37. Le
uova sono depositate e penetrano nei bronchioli dai quali sono espettorate. Possono essere
ricercate nell'espettorato o, se sono ingerite, nelle feci. I pazienti sviluppano eosinofila e possono
manifestare difficoltà respiratoria, espettorare escreato brunastro e presentare emoftoe
intermittente. La parassitosi evolve in bronchite cronica o in bronchiectasie con espettorazione
profusa e dolore pleurico toracico.
La diagnosi di laboratorio si avvale della dimostrazione microscopica di uova nell’escreato o nelle
feci.
Cestodi (Tenie)
Generalmente la diagnosi di laboratorio dell'infestazione da cestodi è ottenuta con l’identificazione
delle uova emesse con le feci. Saranno specificate le eccezioni. La preparazione del campione in
soluzione fisiologica e/o iodica, seguita dalla concentrazione con formolo-etere consente il loro
rilievo microscopico. La colorazione del sedimento può aiutare l’identificazione. Ha pure valore
diagnostico il riscontro macroscopico delle proglottidi nel campione (consultare le Appendici 5 e 7).
Nell’uomo, le infestazioni da cestodi si presentano con una o due modalità: tenie mature nel tratto
gastro–intestinale, o infestazione di una o più cisti larvali (definite idatidosi, cistocercosi, cenuriosi e
sparganosi) insediate nel fegato, polmone, muscolo, cervello, occhio o in altri tessuti.
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Diphyllobothrium latum
Noto anche come tenia del pesce, è riscontrato nelle acque fredde, limpide della Scandinavia, nel
nord Europa, Giappone del nord, Canada, Alaska e Nord America. Le infestazioni sono di solito
asintomatiche, il parassita può comunque raggiungere grandi dimensioni e causare ostruzione
meccanica dell’intestino con conseguente diarrea e dolore addominale. Infezioni prolungate e
massive possono indurre carenza di vitamina B1238.
Hymenolepis nana
E’ la tenia di più piccole dimensioni che infetta l’uomo. Può causare una moderata dolenzia
addominale, ed è l’infezione umana da tenia più diffusa negli USA40. Sebbene l’uomo possa
acquisire accidentalmente l’infezione con l’ingestione di coleotteri infetti (spesso presenti nei
cereali disidratati) l’infezione diretta è la forma più frequente e di solito si riscontra nella comunità
famigliari ed istituzionali con condizioni di scarsa igiene. Hymenolepsis diminuta, è principalmente
un parassita dei topi ed occasionalmente dell’uomo che si infetta con l’ingestione dei coleotteri
presenti nei cereali. Dipylidium caninum è di solito riscontrato nei cani e nei gatti. I bambini si
infettano principalmente dopo contatto diretto con gli animali e le loro pulci.
Taenia saginata
Provoca dolenzia addominale e i pazienti possono emettere proglottidi migrate in sede anale38.
Taenia solium
Le forme adulte provocano scarsa sintomatologia, ma le larve causano infiammazione locale38. La
loro migrazione nel sistema nervoso centrale causa crisi convulsive, idrocefalo e aracnoidite.
La cistocercosi è un’infezione dei tessuti causata da cisticerchi di T. solium38. La cisticercosi può
svilupparsi nell’uomo con auotoinfezione dal verme adulto. Il coinvolgimento del sistema nervoso
centrale è definito neurocisticercosi.
La diagnosi può essere ottenuta con metodi immunodiagnostici o bioptici39.
Coenurosi
E’ un’infezione cistica causata da Taenia multiceps, Taenia serialis (Europa ed USA) e Taenia
brauni (Africa), che di solito si sviluppano in tenie nei cani38. La malattia sintomatica nell’uomo
interessa occhio, sistema nervoso centrale, tessuto sottocutaneo e muscolare.
La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame microscopico di appropriati materiali in cui si
possono riscontrare i protoscolici (simili a quelli di T. solium).
Spirometra mansonoides
La Sparganosi è un’infezione dei tessuti causata dalla Spirometra mansonoides. Si tratta di
un’infezione tissutale da cisti pleiocercoidi causata da numerose specie di cestodi e i sintomi
includono infiammazione locale della cute nel sito d’ingresso38. Il danno dei tessuti può essere
grave, particolarmente nell’occhio, ed alcune forme del parassita diffondono in altre sedi corporee.
La diagnosi di laboratorio si avvale esclusivamente di tecniche istologiche.
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Echinococcosi
L’echinococcosi si manifesta con due diverse modalità: idatidea o malattia cistica uniloculare,
causata da Echinococcus granulosus o Echinococcus vogeli, e malattia cistica alveolare causata
da Echinococcus multilocularis38. Le uova si schiudono per sviluppare oncosfere che penetrano
nella mucosa intestinale ed entrano in circolazione. Queste si incistano nei visceri dell’ospite e
sviluppano le forme larvali cistiche mature. La sintomatologia è conseguente ai loro effetti di tipo
meccanico ed all’ingrandimento in spazi ristretti.
La diagnosi di laboratorio si avvale di metodi immunodiagnostici ed occasionalmente della biopsia.
Talvolta le cisti polmonari contenenti E. granulosus si rompono e i protoscolici e gli uncini intatti
sono emessi con l’espettorato, riscontrati poi nei preparati microscopici. Sono disponibili prove
sierologiche.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMI del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e
specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le
risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere
ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i
saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Contenitori per Campioni40,41
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere
quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I
requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari
Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve c
onsentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la
contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il
rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a
questi scopi''.
Test Diagnostici Rapidi
Sono disponibili numerosi metodi di identificazione rapida con diversa sensibilità e specificità.
Queste tecniche possono avere potenziali vantaggi/svantaggi e devono pertanto essere valutate e
validate prima dell'uso. I metodi molecolari (ad esempio PCR multiple) e i saggi immunoenzimatico (EIA) possono funzionare meglio rispetto ai metodi tradizionali, e devono pertanto
essere presi in considerazione per l'uso, se disponibili, previa validazione per garantire
un’adeguata interpretazione clinica10,42.
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1 Considerazini sulla Sicurezza40,41,43-57
1.1 Considerazioni sulla sicurezza40,41,43-46
Usare tecnica asettica
Raccogliere in appropriati contenitori marcati CE a tenuta ermetica i campioni e trasportarli in
sacchetti di plastica sigillati, tranne i vetrini con nastro adesivo/tamponi rettali per uova di E.
vermicularis che devono essere trasportati in sacchetti di plastica sigillati1.
In caso di LCR ogni piastra seminata deve essere trasportata in un robusto contenitore
impermeabile con marchiatura CE.
E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.
1.2 Procedura sul Campione40,41,43-46
Tutti i tipi di campione
Livello di Contenimento 2, se non altrimenti specificato(consultare di seguito).
Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere
eseguite in cabina microbiologica di sicurezza49.
Per tutte le ricerche parassitologiche devono essere calzati guanti monouso
Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione sicura di tutti i microrganismi
documentati in questa SMI.
Feci
E’ richiesto un livello di Contenimento 3 per le ricerche su specie Echinococcus e Taenia solium
(non è indispensabile una cabina microbiologica di sicurezza).
Le proglottidi di tenia non trattate con conservanti inviate al laboratorio per l’identificazione sono
pericolose per la possibilità di infezione accidentale e di cistocercosi58.
I campioni per la microscopia devono essere preparati con formalina 10% (v/v) in acqua (non
idonea per la ricerca di trofozoiti).
Per ragioni di sicurezza deve essere usato etil acetato e non dietil etere per approntare le
concentrazioni della soluzione formolo-etere26. Le procedure devono essere eseguite in un’area
ben ventilata in assenza di sorgenti di fiamma non protetta.
LCR
Contenimento di Livello 3 ed è richiesta una cabina di sicurezza per l'indagine per Naegleria
fowleri.
Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi
Processare i campioni prelevati dal polmone e dalla cavità pleurica, e le cisti idatidee, in cabina di
Classe 1 con scarico protetto in ambiente con Livello di Contenimento 3.
Espettorato/lavaggio broncoalveolare
Tutti i campioni devono essere processati in cabina di Classe 1 con scarico protetto in ambiente
con Livello di Contenimento 3.
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con le valutazioni del rischio.
2
Prelievo del Campione
2.1
Tipi di Campione
Feci, urine, vetrino con nastro adesivo, tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi,
aspirati duodenali/digiunali, tessuti, cisti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare
biopsie
2.2
Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo59
Per considerazioni sulla Sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
Raccogliere il campione prima dell’inizio della terapia antibiotica, se possibile59.
Feci
Prima della terapia antibiotica o antidiarroica, quando possibile
Nastro adesivo per vetrino/tampone perianale per uova di E. vermicularis
1
Fra le 10 del pomeriggio e mezzanotte, o al mattino presto prima della defecazione e del bagno.
Le feci possono essere inserite direttamente in un contenitore impermeabile sterile a bocca larga
con marchiatura CE o possono essere trasferite da una padella asciutta e pulita o contenitore
simile e poi raccolte in un contenitore impermeabile con marchiatura CE.
Trasportare immediatamente i campioni appena ottenuti, senza conservanti. Le cisti non si
formano una volta che il campione è stato emesso. Se il campione è liquido, deve essere
esaminato o fissato con formalina al 10% in acqua, preferibilmente entro 30 minuti dalla raccolta.
I trofozoiti protozoari non sopravvivono se il campione si essica. La formalina al 10% uccide i
trofozoiti e li rende immobili. Se si ricercano i trofozoiti le feci liquide dovranno essere esaminate in
assenza di formalina (di solito con una goccia di fisiologica).
Le feci soffici dovrebbero preferibilmente essere esaminate entro 1 ora dall’emissione60.
Nastro adesivo/tampone perianale per uova di E. vermicularis1
Nastro adesivo
Applicare il nastro adesivo alla regione perianale, premendo saldamente più volte il lato adesivo
del nastro contro le pieghe perianali di sinistra e destra; il nastro può essere avvolto attorno a un
abbassalingua per facilitare il prelievo. Posizionare il nastro adesivo sul vetrino, parte adesiva
verso il basso.
Tampone perianale
Bastoncino di cotone in contenitore asciutto.
Divaricare le natiche e strofinare il tampone di cotone inumidito su tutta l'area circostante l'ano, ma
non inserirlo nell'orifizio. Riporre il tampone di cotone lana nel suo contenitore (non è necessario
un mezzo di trasporto).Talvolta, può essere raccolto dal paziente un verme adulto poi inviato in
acqua o soluzione fisiologica per l'identificazione.
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Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue
Urina (per S. haematobium)
È preferibile ottenere tutte le urine emesse dalle 10 di mattino alle 2 del pomeriggio(periodo
massimo di attività), in alternativa, raccogliere la parte terminale di urina per 24 ore.
E’ preferibile ottenere il campione completo di urine fra le dieci del mattino e le 2 del pomeriggio
perché è stato dimostrato che in questo periodo si verifica la maggior concentrazione di uova
escrete61. Utilizzare contenitori sterili senza acido borico. Nei pazienti con ematuria le uova
possono essere intrappolate nel sangue e muco nella parte terminale del campione di urina.
Se l'urina non può essere esaminata entro un'ora dalla raccolta, si consiglia di aggiungere 1 ml di
formalina non diluita per conservare tutte le uova eventualmente presenti.
LCR
I campioni devono essere prelevati da uno specialista, secondo i protocolli locali.
Tessuti, Biopsie, Cisti idatidea e Pus da ascessi, Bile, Aspirati
duodenali/digiunali
I campioni devono essere prelevati da specialisti secondo i protocolli locali
Espettorato/lavaggio brroncoalveolare
È richiesto espettorato dal tratto respiratorio inferiore ottenuto con colppi di tosse profonda..
Quando la tosse è secca, prima di espettorazione possono essere utili fisioterapia, drenaggio
posturale o l'inalazione di un aerosol
2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni59
Feci
Per una ricerca ottimale, raccogliere tre campioni di feci in non più di dieci giorni. Di solito si
raccomanda che i campioni siano ottenuti a giorni alterni. Tranne i casi di pazienti affetti da diarrea
grave o dissenteria, per i quali non dovrebbe essere analizzato più di un campione ogni 24 ore in
quanto l’emissione delle cisti e delle uova tende ad essere intermittente.
Se si sospettano E. histolytica o G. lamblia ed il primo dei tre campioni è negativo, si consiglia di
raccoglierne altri tre con intervallo settimanale.
Non sono previsti limiti definiti per il volume del campione richiesto, ma alcune procedure di
laboratorio richiedono quantità superiori ad altre.
Vetrino nastro adesivo/tampone perianale per uova di E. vermicularis1
Si raccomanda il prelievo dei campioni per almeno 4 – 6 giorni consecutivi. Se i risultati di tutti
questi campioni sono negativi il paziente può essere considerato non infetto. Nella pratica corrente,
raramente si riceve più di un campione.
Urine (perS. hametobium)
In teoria, un volume minimo di 10mL.
LCR
In teoria, un volume minimo di 1 mL.
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Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi
Pus
In teoria, tutto il pus ottenuto o un minimo di 1 mL.
Tessuti/biopsie
Quantità teorica di campioni sufficiente per preparati microscopici e colture.
Bile, Aspirati duodeno/digiunali
In teoria, un volume minimo di 1 mL.
Espettorato/lavaggio broncoalveolare
In teoria, un volume minimo di 1 mL.
3
Trasporto e Conservazione del Campione40,41
3.1
Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
I campioni devono essere trasportati il più presto possibile59.
Feci
Se non può essere effettuato un accertamento tempestivo delle feci, per evitare il deterioramento
della morfologia dei protozoi, la schiusa delle larve del primo stadio degli anchilostomi e la crescita
eccessiva dei lieviti è richiesto l’uso, come conservante, di formalina al 10% in acqua62.
Nastro adesivo per vetrino /tampone perianale per uova di E. vermicularis1
Refrigerazione o conservazione a temperatura ambiente (20 -25°C) fino a 48 ore.
Urine (per S. haematobium), Bile, Aspirati duodenali/digiunali ed espettorato/
lavaggio bronchiale
Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura
ambiente (20 – 25°C)..
Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi
Se il campione di tessuto/biopsia è piccolo, inserirlo in acqua sterile per prevenirne l'essiccamento.
Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura
ambiente (20 – 25°).
4
4.1
Procedura sul campione40,41
Selezione della prova
Feci
Selezionare una quota rappresentativa del campione per le appropriate procedure quali la coltura
per batteri patogeni, prova per le tossine per Clostridium difficile (B 10 – nvestigation of Faecal
Specimens for Clostridium difficile) ed esami virologici, in funzione delle caratteristiche cliniche del
paziente
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La concentrazione delle feci mediante centrifugazione con formolo/etere è approntata su tutti i
campioni quando è richiesta specificamente la ricerca dei parassiti, ove esistono specifiche
indicazioni cliniche e quando ritenuto opportuno dal referente senior del laboratorio.
Tutti i campioni da soggetti sintomatici devono essere colorati per la ricerca di oocisti di
Cryptosporidium63.
Colorare per microsporidi i campioni di pazienti sintomatici, HIV positivi ed immunodepressi dopo
consultazione con un microbiologo/ricercatore.
Per tutti gli altri campioni
N/D
4.2
Aspetto
N/D
4.3
Preparazione del Campione
4.3.1 Pretrattamento
N/D
4.3.2 Procedura sul campione
Feci
Prelevare campioni da aree fecali contenenti sangue, pus o muco per l’esame diretto con
preparato in sospensione o per colorazione.
Quando si campionano feci formate, prelevare il materiale da sedi diverse per concentrarli, per
sospenderli in liquidi e per la colorazione.
Feci per la ricerca di protozoi
Standard
Se il campione è stato emesso di recente ricercare nel modo seguente i trofozoiti mobili:
1.
Porre 1 goccia di soluzione fisiologica 0.85% sulla parte sinistra di un vetrino da
microscopio pulito e sulla parte destra 1 goccia di colorante Lugol iodato a doppia
concentrazione (la distanza fra le gocce deve essere tale da consentire di
posizionare i coprioggetti su ciascuna di loro).
2.
Per prelevare le feci usare un bastoncino con tampone diverso per ogni preparato
ed emulsionarle vigorosamente nella soluzione fisiologica e nel colorante di Lugol
iodato.
3.
Ricoprire con coprioggetto ciascun preparato del vetrino. Esaminare entrambe le
aree con obiettivo a basso ingrandimento. Utilizzare l’ingrandimento medio per
identificare qualsiasi immagine sospetta.
4.
Se opportuno, preparare strisci su vetrini da microscopio puliti per le colorazioni con
auramina-fenolo e/o Giemsa (consultareTP 39 - Staining Procedures).
5.
Inoltre concentrare il campione usando formolo-etere* come di seguito descritto.
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Feci per esame di cryptosporidium60,64
1.
Preparare uno striscio con materiale fecale di spessore sottile o medio su un vetrino
da microscopio pulito.
Nota: Se il campione è secco o solido può essere aggiunta formalina al 10%.
2.
Lasciare asciugare all’aria, fissare con metanolo per due-tre minuti.
3.
Gli strisci possono essere colorati con auramina fenolo o con la colorazione di ZiehlNeelsen modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures).
Concentrazione formolo-etere* modificata65,66
*Usare etil acetato (non dietil etere) in un’area ben ventilata in assenza di sorgenti con
fiamma non protetta
Il metodo seguente è raccomandato per concentrare le feci. Sono disponibili numerose confezioni
commerciali per la concentrazione delle feci che si avvalgono del metodo di Ridley Allen di seguito
descritto. Le confezioni commerciali per la concentrazione devono essere usate quando è richiesto
un sistema completamente chiuso.
1.
Prelevare un campione fecale delle dimensioni di un grosso pisello (circa 1g) con
bastoncino con tampone ed emulsionare in 7 mL di formalina 10% (1 volume di
formaldeide al 40% diluita in 9 volumi di acqua distillata) in un normale contenitore
pulito.
2.
Setacciare l’intero contenuto con colino normale (colino di nailon da te o garza
quadrata) e raccogliere in un recipiente idoneo. I setacci sono sciacquati
abbondantemente in acqua pulita e riutilizzati.
3.
Trasferire il filtrato in una provetta di vetro o di polipropilene dotata di chiusura
(resistente all’etere) idonea alla centrifugazione.
4.
Aggiungere 3 mL di etil acetato e passare su vortex per 15 secondi, o agitare
vigorosamente per 60 secondi.
5.
Centrifugare il campione a 1500 x g per 60 secondi o a 1100 x g per 2 minuti.
6.
Allontanare lo strato lipidico con un bastoncino con tampone passandolo attorno
all’intera circonferenza della provetta, rimuovendo i residui lipidici dalla stessa.
7.
Scartare il contenuto della provetta, lasciando che poche gocce si raccolgano sul
fondo per ricoprire il sedimento rimasto.
8.
Sospendere di nuovo il sedimento nel liquido rimasto. Trasferire una goccia di
questo su un vetrino da microscopio pulito e applicare su di essa un coprioggetto.
9.
Ad un preparato separato si può aggiungere colorante contenete iodio a doppia
concentrazione per migliorare e facilitare il confronto delle caratteristiche
morfologiche.
10.
Ricercare con obiettivo a basso ingrandimento sull’intera area del preparato; usare
medio ingrandimento per rilevare le caratteristiche morfologiche.
Le confezioni commerciali disponibili per la concentrazione contengono setacci con pori di varie
dimensioni che influenzano la resa delle componenti parassitarie e la quantità di detriti presenti6770. Una dimensione più grande dei pori può consentire in una resa maggiore delle componenti
parassitarie, tuttavia l'incremento di detriti porta ad un deposito denso che rende più difficile
l’osservazione sul vetrino e gli ovuli e le cisti possono essere quindi mascherate. Se la
dimensione dei pori è troppo piccola, pur avendo un vetrino più pulito più facile da esaminare, la
resa delle componenti parassitarie sarà ridotta. Le confezioni per la concentrazione fecale
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disponibili in commercio devono essere validate prima dell'uso e devono essere seguite le
istruzioni del produttore
Per ottimizzare il recupero dei parassiti è importante setacciare la miscela fecale formolata,
utilizzare un solvente acetato di etile con triton X e centrifugare per il tempo appropriato con forza
di centrifugazione idonea68. Il recupero dei diversi stadi del parassita può essere notevolmente
ridotto se non è usato un solvente come un estrattore di grassi e detriti (ad esempio acetato di
etile)70. Uno studio recente suggerisce che 1.100 x g per 3 minuti può essere una soluzione
ottimale per il rilievo del parassita70.
Vetrino con nastro adesivo
1.
Prima di esaminare il vetrino, può essere opportuno sollevare il nastro ed inserire
una goccia di olio per immersione o di glicerolo/alcool al suo centro, per poi
riposizionarlo. Questo accorgimento migliora la trasparenza del nastro stesso.
2.
Esaminare il vetrino con obiettivo a basso ingrandimento.
Tampone perianale
1.
Aggiungere al contenitore sufficiente soluzione fisiologica per ricoprire il tampone.
2.
Agitare vigorosamente.
3.
Estrarre il tampone dalla soluzione fisiologica, spremerlo contro la parete del
contenitore per allontanare la parte liquida. Scartare il tampone.
4.
Concentrare il liquido restante con centrifugazione a 800 x g per 2 minuti.
5.
Rimuovere il sopranatante con una pipetta monouso, senza agitare il sedimento.
6.
Agitare la provetta per sospendere di nuovo il sedimento.
7.
Usando una pipetta monouso, trasferire una goccia del sedimento su un vetrino da
microscopio, applicare un coprioggetto ed esaminare l’intero preparato con obiettivo
a basso ingrandimento.
Urine (per S. haematobium)
Campioni della parte terminale delle minzioni di 24 ore64
Per volumi consistenti di urine (>25 mL)
1.
Lasciare sedimentare il campione per 1 ora.
2.
Decantare e scartare il sopranatante trasferendo poi il sedimento con le urine
residue (circa 1 mL) in un contenitore a fondo conico per la centrifugazione.
3.
Centrifugare a 500 x g per 2 minuti
4.
Decantare e scartare il sopranatante miscelando poi il sedimento con una pipetta.
5.
Usando l’interro sedimento, trasferire 1 o 2 gocce su alcuni vetrini da microscopio e
posizionare i coprioggetti. Esaminare l’intero preparato di ciascun vetrino con
obiettivo a basso ingrandimento.
Altri campioni di urine
Se il campione è gia stato raccolto in un contenitore a fondo conico, procedere come specificato
precedentemente dal numero 3, altrimenti, trasferire l’intero materiale in un contenitore a fondo
conico e procedere come specificato in precedenza.
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Metodo di filtrazione (raccomandato per campioni di urine privi di cellule e di
cristalli)
1.
Inserire ≥10 mL urine in una siringa, connettere poi ad un filtro Swinnex (porosità 12
µm).
2.
Filtrare delicatamente le urine.
3.
Inserire 20 mL di aria facilitando il transito attraverso il filtro.
4.
Rimuovere la parte superiore del filtro e trasferire la membrane su un vetrino da
microscopio.
5.
Aggiungere una goccia di soluzione fisiologica, applicare il coprioggetto e leggere al
microscopio usando un obiettivo a basso ingrandimento.
LCT71
1. Dopo il ricevimento, eseguire l’esame microscopico diretto il più presto
possibile (con obiettivo a basso o medio ingrandimento).
2. Centrifugare il LCR 100 x g per 10minuti.
3. Trasferire il sopranatante con un a pipetta sterile, lasciandone circa 0,5mL; è
richiesto un altro contenitore sterile per le prove addizionali (concentrazione
proteica, prove virologiche ecc.).
4. Sospendere di nuovo il centrifugato nel restante liquido e trasferire 2 gocce
al centro di una piastra di agar purificato ricoperta di batteri
5. Quando il liquido si è assorbito incubare la piastra come descritto per il
raschiamento corneale (descritto in precedenza).
Nota: L’incubazione a 35°C – 37°C fornisce risultati migliori per le specie Naegleria.
1
Trasferire anche una goccia del sedimento del centrifugato su un vetrino da
microscopio pulito ed applicare su questa il coprioggetto. Osservare l’intera
area con obiettivo a basso ingrandimento ed a medio ingrandimento per
rilevare le caratteristiche morfologiche
Cisti idatidea e Pus da ascessi
Pus e contenuti di cisti idatidea (inclusa la sabbia idatidea).
Approntare preparati in sospensione ed asciugare all’aria gli strisci per la colorazione (se richiesta)
(consultare B 39 - Staining Procedures).
Tessuti e biopsie71
1.
Oltre alle preparazioni istologiche standard eseguire strisci per apposizione,
preparazioni con lieve strofinamento e per schiacciamento.
2.
Inserire il campione in una piastra di Petri sterile per l’esame macroscopico e
selezionarne una parte per l’esame microscopico.
3.
Selezionare un’area di aspetto diverso dal normale. Ad esempio, una parte grigia
indurita o granulomatosa del polmone o un’area ulcerata del tessuto intestinale.
Strisci per apposizione
1.
Se il campione e di dimensione sufficiente, tagliarlo ed appoggiare sul vetrino la
superficie di taglio.
2.
Premere di nuovo il tessuto sul vetrino da microscopio pulito, alzare e premere di
nuovo.
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3.
Riportare il campione sul vetrino e premere di nuovo la superficie di taglio per
ottenere due altre apposizioni. Ciò consente 3 deposizioni allineate in successione
su 1 vetrino da microscopio.
4.
Se sono disponibili alcuni campioni di tessuto, effettuare una striscia per
apposizione di ciascuno di loro.
5.
Lasciare asciugare all’aria e fissare per 1 minuto in metanolo prima di colorare con
Giemsa (consultare TP 39 - Staining Procedures).
Preparazioni con schiacciamento
Preparazione per schiacciamento – per parassiti tissutali come la trichinella
1.
Suddividere le quote di tessuti in minuti frammenti in una scatola di Petri,
trasferendone uno su un vetrino da microscopio pulito.
2.
Aggiungere 1 goccia di soluzione fisiologica sterile o di acqua distillata sterile.
3.
Ricoprire con un secondo vetrino da microscopio pulito e pressare entrambi con
forza.
4.
Esaminare al microscopio con obiettivo a basso ingrandimento.
Bile, aspirati duodenali/digiunali
Standard
1.
Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti.
2.
Decantare il sopranatante in disinfettante.
3.
Sospendere di nuovo il sedimento del centrifugato nelle gocce restanti di
sopranatante.
4.
Usare il sedimento sospeso di nuovo per preparare strisci da colorare.
5.
Colorare con Ziehl-Neelsen e auramina-fenolo per Cryptosporidium, Giemsa per
Cyclospora cayetanesis ed I. belli (consultare TP 39 - Staining Procedures), e iodio
o semplici preparati in sospensione per S. stercoralis and G. lamblia.
Prove supplementari
Per la ricerca di microsporidi:
1
Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti
2.
Decantare il sopranatante in disinfettante
3. Sospendere di nuovo il deposito del centrifugato nelle restanti gocce di sopranatante
4.
Usare il materiale risospeso per preparare uno striscio da colorare
5. Colorare con tricromica modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures).
Espettorato71
1.
Per il campionamento selezionare aree viscose con colorazione ematica.
2.
Trasferire 1 mL di espettorato in una provetta da centrifuga.
3.
Aggiungere 1 mL di ditiotreitolo. Scuotere delicatamente per circa 10 secondi.
Lasciare riposare a temperature ambiente per 15 minuti.
4.
Centrifugare a 1500 x g per 2 minuti.
5.
Decantare il sopranatante in un raccoglitore di materiali di scarto.
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6.
Sospendere di nuovo il sedimento nelle poche gocce di sopranatante rimaste.
7.
Trasferire 1 goccia su un vetrino da microscopio pulito ed applicare un coprioggetto.
Esaminare tutto il preparato con obiettivo a basso ingrandimento.
Espettorato indotto / BAL (per P. jirovecii)
Sono disponibili diversi metodi di colorazione e di identificazione per P. jirovecii. Possono essere
usate colorazioni di tipo istologico, anche se i metodi d’immunofluorescenza con anticorpi
monoclonali sono utilizzati in numerosi laboratori microbiologici. Se si utilizzano confezioni
commerciali seguire le indicazioni del produttore. Ù
4.4 Microscopia
Consultare la Sezione 4.3.2 per tutti i campioni
4.5 Coltura
Consultare la Sezione 4.3.2 per tutti i campioni
4.6 Identificazione
Livello minimo
Quando possibile, identificare i parassiti a livello di specie
4.7 Prova di Sensibilità agli Antimicrobici
Fare riferimento alle line guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o
EUCAST
4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico
N/D
4.9 Invio ai laboratori di riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre
richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di
laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati
laboratori di riferimento.
Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili,
tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del campione:
Inghilterra e Galles
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=11
58313434370
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
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5 Procedura di Refertazione
5.1 Microscopia
Refertare qualsiasi parassita osservato
Feci
Includere il commento per tutti i parassiti osservati, anche di quelli che di solito non sono
considerati patogeni.
Tempo di refertazione microscopia
Referto scritto 16 – 72 ore, specificando, se opportuno, che sarà emesso un successivo referto.
Risultati microscopici urgenti: comunicare per telefono quando disponibili.
5.2 Coltura
LCR
Refertare presenza o assenza di specie Acanthamoeba e/o di Naegleria fowleri.
Tempo refertazione coltura
LCR
Referto scritto dopo 4 giorni, specificando, se appropriato, che sarà emesso un referto successivo
Risultato clinicamente urgente; telefonare quando disponibile.
5.3 Coltura
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudente gli antibiotici secondo
i protocolli locali e nazionali raccomandati
6 Notifica alla PHE72,73 o Equivalente74-77
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se
il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
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Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.
http://www.hpa.org.uk/Topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/HealthProtectionRegulations/
In Scozia74,75 e Galles76 e Irlanda del Nord76 sono vigenti altre disposizioni.
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Appendice 1:Tipologia dei campioni e possibili parassiti
identificabili
Tipo di campione
Possibile parassita presente
Bille
Fasciola hepatica, Opisthorchis sinensis, specie Cryptosporidium
LCR
Specie Acanthamoeba, Angiostrongylus cantonensis, Balamuthia
mandrillaris, Microsporidia - Encephalitozoon cuniculi, Naegleria fowleri
Aspirati duodenali e del
digiuno
Specie Cryptosporidium, Cyclospora cayetanesis, Giardia lamblia,
Microsporidia - Enterocytozoon bieneusi, specie Strongyloides
Feci
Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, forme adulte ed uova di
specie Acaris, Balantidium coli, Blastocystis hominis, Capillaria
philippinensis, Chilomastix mesnili, specie Cryptosporidium, Cyclospora
cayetanesis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium latum, specie
Echinostoma, Endolimax nana, Entamoeba histolytica, Altre specie
Entamoeba, Enteromonas hominis, Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski,
Giardia lamblia, Heterophyes heterophyes, Hymenolepis nana, Iodamoeba
butschlii, Isospora belli, Microsporidia [Enterocytozoon bieneusi ed
Encephalitozoon (Septata) intestinalis], Metagonimus yokogawai,
Nanophyetes salmincola, Necator americanus, Opisthorchis sinensis,
specie Paragonimus, Retortomonas intestinalis, specie Sarcocystis, specie
Schistosoma Strongyloides stercoralis, Taenia saginata vermi ed uova,
Taenia solium, Trichuris trichiura, specie Enterobius vermi adulti ed uova
Aspirati epatici e spenici
Entamoeba histolytica, specie Leishmania, Echinococcus granulosus
Vetrino con nastro adesivo
Enterobius vermicularis
Sierologia
Entamoeba histolytica, specie Acanthamoeba, Cysticercosis, Echinococcus
granulosus, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Filaria, Giardia
lamblia, specie Leishmania, specie Schistosoma, Strongyloides stercoralis,
specie Toxocara, Toxoplasma gondii, specie Trichinella, ogni nematode che
produce LMV (Larva Migrante Viscerale)
Escreato
Ascaris lumbricoides, specie Cryptosporidium, specie
Paragonimus westermani, Strongyloides stercoralis
Tessuti e biopsie
Tessuti e biopsie specie Acanthamoeba – biopsia cerebrale, noduli cutanei
ed ulcere;
Microsporidia,
Angiostrongylus costaricensis, specie Anisakis, specie Cryptosporidium –
intestine tenue e biopsia epatica;
Vermi filariali , Giardia lamblia - biopsia duodenale;
Specie Leishmania – biopsie linfonodi, ulcere cutanee;
Microsporidia [Pleistophora, Nosema, e specie Phocanema], specie
Schistosoma, Taenia solium, Trichinella ed altri nematode tissutali – biopsia
muscolare
Urine
Schistosoma haematobium
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Appendice 2: Distribuzione geografica delle Infezioni
parassitarie
Infezione / Microrganismo infettante
Distibuzione geografica
Entamoeba histolytica
Amebe a vita libera - Acanthamoeba, Naegleria
Giardiasi, trichomoniasi
Cryptosporidiosi
Cyclospora, Microsporidia, Cystoisospora
Sarcocystis, toxoplasmosi, Pneumocystis jovecii
Infezioni da nematodi (Tratto-GE) - Enterobius, Trichuris
Ascaris
Ovunque
Ovunque
Ovunque
Ovunque
Ovunque
Ovunque
Ovunque
Strongyloides,
Anchilostomia:
Ancylostoma duodenale
Ovunque
Tropici & subtropici
Europa, S America, India, China, SE Asiatico,
Indonesia, Australia, alcune isole del Pacifico
Necator americanus
Nord e Sud America, Africa sub Sahariana,
India, Cina, SE Asiatico, Indonesia, Australia
alcune isole del Pacifico
Trichinellosi, toxocariasi
Gnathostomiasi (febbre & infiltarti polmonari)
Gnathostomiasi, Angiostrongylus sp. mieloencefalite)
Capillariasi
Dracunculiasi
Onchocerciasi
Schistosomiasi
Opisthorchiasi
Fascioliasi
Paragonimiasi
Ovunque
Asia
Africa, America, Asia, Australasia
Africa, America, Asia, Europa
Africa, Asia
Africa, America (centrale e del sud ), Asia
Africa, America (centrale e del sud), Asia
America (sud), Asia, Europa
Ovunque
Lontano oriente, subcontinente Indiano,
Africa, alcune isole del Pacifico
Diphyllobothrium latum
America (nord), Canada, Europa, Giappone,
Russia, Scandinavia
Ovunque
Africa, America, Asia, Europa, Australasia
America, Asia (particularmente Cina &
Giappone)
Africa, America, Europa
Hymenolepsis nana, taeniasi, cystercercosi
Echinococcosi
Sparganosi
Coenurosis
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Appendice 3: Calibrazione del microscopio per
misurazione
Calibrazione del microscopio per misurazione2
La dimensione dell’uovo e della cisti è un’importante peculiarità per l’identificazione di molti
parassiti.
La dimensione può essere determinata usando un oculare micrometrico. Eseguire la calibrazione
del microscopio nel modo seguente:
La strumentazione richiesta comprende un oculare micrometrico e di un vetrino micrometrico.
1
La scala dell’oculare è suddivisa in 100 piccole parti.
2
La scala del vetrino micrometrico misura 1 mm ed è divisa in parti di 0.1 mm, ciascuna
delle quali è ulteriormente suddivisa in parti di 0,01 mm.
3
Inserire l’oculare micrometrico sostituendolo a quello del microscopio.
4
Porre il vetrino micrometrico sul piano portaoggetti del microscopio.
5
Mettere a fuoco con obiettivo a basso ingrandimento la scala micrometrica del vetrino.
6
Aggiustare le scale micrometrica dell’oculare e quella micrometrica del vetrino in modo che
appaiano parallele e sovrapposte.
7
Registrare il numero di divisioni della scala micrometrica dell’oculare e quelle
corrispondenti alla scala micrometrica del vetrino, ad esempio 10 segmenti della
micrometrica oculare = 0,20 mm della micrometrica del vetrino.
8
Calcolare il valore di un segmento della scala micrometrica oculare nel modo seguente:
10 divisioni della micrometrica oculare = 0.20
1 divisione micrometrica oculare = 0.20/10 = 0.020 mm = 20 μm
9
Ripetere da #5 con ogni obiettivo, registrare i risultati per ciascuno di loro.
10
Eseguire una sola calibrazione per ogni microscopio, suoi obiettivi ed oculare micrometrico
in dotazione.
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Appendice 4: Comuni costituenti microscopici delle feci72
Componenti microscopici delle feci
1-4. cellule vegetali. 5. Parete spiraliforme del sistema vascolare vegetale. 6. ciuffo vegetale.
7. parete di cellulosa di cellula vegetale. 8 grano di polline. 9. bolla d’aria. 10 gocce di
grasso. .11. fibra muscolare. 12 lieviti. 13 larva rabditiforme di Strongyloides stercoralis e
14. uovo di anchilostoma per confronto,
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Appendice 5: Dimensioni Comparative delle Uova di
Elminti1*
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Appendice 6: Oocisti di Coccidi
Cystoisospora belli 1
Oocisti immatura
(32 x 16 µm)
Oocisti matura
Le oocisti sono trasparenti. Si raccomanda illuminazione moderata. Per strisci diretti si può usare
la colorazione Ziehl-Neelsen modificata
Specie Cryptosporidium
Oociste
5µm
Sono raccomandate le colorazioni auramina – fenolo e Ziehl-Neelsen modificata
Specie Cyclospora (CLB)
8-10 µm
assenza di spore
presenza di spore
Nella preparazione in sospensione liquida non colorata, una morula centrale contiene alcune
sfere rifrangenti. In acqua dolce la morula si divide in 2 piccole strutture. Cyclospora cayetanesis
può essere osservata nelle concentrazioni formolo-etere in forma di sfere rifrangenti che non si
colorano con iodio ma presentano caratteristiche variabili all’acido resistenza, assumendo o non
colore rosa alla colorazione Ziehl-Neelsen modificata. Non si colorano con auramina – fenolo.
Sono blu autofluorescenti a 340 – 360 nm
1-2 µm
Anche se i microsporidi possono apparire acido-resistenti alla colorazione Ziehl-Neelsen
modificata, si raccomanda la colorazione tricromica. Le spore dei Microsporidi sono ovoidali e
rifrangenti e la parete delle spore assume colore rosa rosso brillante. Talvolta le spore si
colorano con un cintura 'rossa che attraversa il centro della spora, mostrano granuli polari;
entrambe le formazioni sono di valore diagnostico
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Appendice 7: Confronto fra Elminti riscontrate
nell’uomo79
Taenia saginata
(Tenia del bue)
Taenia solium
(tenia del maiale)
SEGMENTO MATURO (SIMILE IN CIASCUNA SPECIE)
Segmento gravido
Segmento gravido
Più lungo che largo
7 – 12 branche uterine laterali
12 x 6 mm
Più lungo che largo
15 – 30 branche uterine laterali
16 – 20 x 5 - 7 mm
Aspetto di segmenti gravidi di tenia riscontrati nell’uomo.
T. saginata
T. solium
D. latum
H. nana
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Appendice 8: Larve di Elminti – charatteristiche80
Anchilostoma
Strongyloides
Larve filariformi
Dimensione 500 x 14-20 μm
Guaina presente
Affusolate
Esofago lungo un terzo del corpo
Larve filariformi
Dimensione 500 x 14-20 (m
Guaina assente
Aspetto smussato o ramificato
Esofago lungo metà del corpo
Larva rabditiforme
Dimensione 100 - 150 x 15 - 17 μm
Profondità cavità buccale – 15 μm
Esofago lungo un terzo del corpo con due
rigonfiamenti
Abbozzo genitale piccolo – 7 μm
Poro anale a 80 μm dall’estremità caudale
Larva rabditiformi
Dimensione 200 - 300 x 15 -18 μm
Breve cavità buccale – 4 mμ
Esofago lungo un terzo del corpo con due
rigonfiamenti
Abbozzo genitale grande – 22 μm
Poro anale a 50 μm dall’estremità caudale
Nei campioni di feci emissi di recente, le larve di più frequente osservazione sono le rabditoidi di
Strongyloides stercolaris. Se le feci sono state emesse da 12 ore, le larve possono trasformarsi in
larve filariformi che devono essere differenziate da quelle di anchilostoma (queste possono
comparire nelle feci entro 12 - 24 ore).
Larve di elminti
ANCHILOSTOMA
filariforme
STRONGYLOIDES
rabditoide
rabditoide
filariforme
Cavità buccale
Abbozzo genitale
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Appendice 9: Identificazione di Trofozoiti di Amebe in
Strisci colorati1
Trofozoite con o senza
cromatina nucleare periferica
con cromatina
nucleare periferica
citoplasma grossolanamente
granulato
batteri & lieviti
globuli rossi assenti
senza cromatina
nucleare periferica
citoplasma finemente
granulato, globuli rossi
assenti o presenti
batteri assenti
un nucleo
in tutti I trofozoiti
nucleo con
granuli periferici
Entamoeba coli
dimensione >15 μm
endosoma piccolo. granuli
periferici nel nucleo a
disposizione regolare
nucleo senza
granuli periferici
grande endosoma
grandi zolle di
cromatina in
spazio chiaro
endosoma
grande
irregolare
Dientamoeba
Fragilis
dimensione 5 -15 μm
dimensione 8-15 μm
due nuclei in più del
50% dei trofozoiti
dimensione 15 – 60 μm
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Appendice 10: Balantidiun coli – Trofozoite e Ciste1
Balantidium coli trofozoite
Balantidium coli ciste
Appendice 11: Identificazione di Cisti di Amebe e
Flagellati
Ciste
con filamenti dentro
ciste flagellata
forma a pera
1 nucleo
dimensione
4 -7 µm
forma di limone
1 nucleo
dimensione
5-9 µm
senza filamenti,
cisti amebica
cisti ovale
parete spessa
presente cromatina
nucleare periferica
cromatina nucleare
periferica a ssente
4 nuclei grandi
masse di cromatina
nuclei grandi
eccentrici
vacuoli colorati
con iodio
dimensione
< 10µm
1, 2, o 4 nuclei
zolle di glicogeno
dimensione
10-15 µm
dimensione
15-30 µm
2 o 4 nuclei
5 o più nuclei
zolle di glicogeno
dimensione
dimensione
4 – 10 µm
10 - 14 µm
da 1 a 4 nuclei corpi parabasali
di solito 2 nuclei) 2 -4 nuclei
posti ad una
estremità
1. 2 o 4 nuclei
zolle di glicogeno
4 nuclei con presenza
di cromatina periferica
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Appendice 12: Microfilarie riscontrate nell’Uomo1
Spazio cefalico
Con guaina
Poro anale
cellula R1
Senza guaina
Guaina
cell R4
Anello nervoso
Polo escretorio
cell R3
cell R2
Cellule escretorie
nel sangue
Senza guaina
Con guaina
Nuclei estesi fino
all’estremità caudale
Coda gonfia con 2
nuclei distinti, spazio
cefalico di doppia
lunghezza rispetto al
corpo
nella cute
nuclei non estesi all’estremità
caudale, spazio cefalico lungo
quanto largo
nuclei estesi fino
all’estremità caudale
coda smussata
nuclei non estesi
all’estremità caudale
filaria piccola, sottile
Senza guaina
nuclei estesi all’estremità
caudale, filaria piccola,
sottile, estremità ad uncino
Coda uniforme,
spazio cefalico lungo
quanto largo
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nuclei non estesi
all’estremità caudale
filaria sottile
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