Informazioni sull`analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi

PRODA
Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica Molecolare
Responsabile Dott. Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Informazioni sull’analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi prenatale
(36 mutazioni + 21 mutazioni regionali italiane)
Che cos’e’ la fibrosi cistica
La fibrosi cistica è una malattia ereditaria, cronica, evolutiva, caratterizzata dalla produzione di muco
particolarmente denso, viscoso, che tende ad ostruire i bronchi ed i dotti del pancreas.
Un bambino ogni 2.500 circa nasce con questa malattia.
La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, danneggiando
l’apparato respiratorio (con presenza di tosse persistente, bronchiti ricorrenti, sinusite, poliposi nasale) e
disturbando la digestione (con difficoltà nella crescita). Inoltre, negli uomini si manifesta sterilità di tipo
ostruttivo e nelle donne una riduzione della fertilità. A volte possono essere presenti anche ostruzione
intestinale alla nascita, diabete ed alterazioni del fegato.
La fibrosi cistica può esprimersi con maggiore o minore gravità in individui diversi e viene pertanto
trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, costituite per lo più da fisioterapia, antibiotici,
aerosol-terapia, estratti pancreatici e vitamine.
Il decorso e la prognosi della fibrosi cistica sono notevolmente migliorati negli ultimi decenni,
soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Nonostante ciò, allo stato attuale la guarigione non
è possibile e la durata media della vita è comunque ridotta rispetto a quella della popolazione generale.
Come si trasmette la malattia
La fibrosi cistica è determinata da alterazioni, chiamate “mutazioni”, a livello di una specifica coppia di
geni, definiti CFTR. I geni sono sequenze di una sostanza chimica complessa, chiamata DNA, e
vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Ogni persona eredita
complessivamente oltre 30.000 coppie di geni dai suoi genitori.
In un malato di fibrosi cistica entrambi i geni CFTR sono difettosi. Viceversa, un portatore di fibrosi
cistica è un individuo sano che possiede un gene difettoso ed un gene normale.
I portatori di fibrosi cistica sono circa il 4% della popolazione, cioè una persona ogni 25 circa è
portatrice.
Una coppia costituita da due portatori ha ad ogni gravidanza un rischio del 25% di generare un figlio
malato (se vengono trasmessi entrambi i geni alterati), ed una probabilità del 75% di generare un figlio
sano, che può essere portatore o non portatore.
Come si esegue l’analisi genetica
Per eseguire l’analisi genetica è necessario il prelievo di un campione di sangue.
Dalle cellule del sangue viene estratto il DNA. Sul DNA si esegue l’analisi della coppia di geni della
fibrosi cistica per la ricerca di una eventuale mutazione. L’analisi fornisce informazioni solo riguardo
alla fibrosi cistica.
Le mutazioni possibili sono numerosissime (circa 1200), molte di esse sono rare, molte altre ancora
sconosciute: abitualmente l’analisi genetica ricerca le più frequenti; non è in grado di identificarle tutte.
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Materiali e metodi utilizzati
La tecnica adottata per l’analisi di 57 tra le più frequenti mutazioni del gene CFTR nella popolazione
italiana (36 mutazioni più frequenti + 21 mutazioni regionali italiane) utilizza 33 coppie di primers che
amplificano tratti di DNA ove sono localizzate le mutazioni stesse, combinate in 3 multiplex PCR. La
presenza o l’assenza delle mutazioni viene valutata mediante ibridazione inversa non radioattiva (LiPA Line Probe Assay) su striscia. Di seguito è riportato l’elenco delle 36 mutazioni più frequenti + 21
mutazioni regionali italiane per le quali si effettua la ricerca:
G85E
E60X
394delTT
621+1G>T
R117H
711+5G>A
R347P
R334W
A455E
ΔF508
ΔI507
G542X
1717-1G>A
G551D
R553X
R560T
Q552X
2183AA>G
2184delA
2143delT
2789+5G>A
R1162X
3659delC
3849+10KbC>T
W1282X
S1251N
N1303K
CFTRdele2,3(21Kb)
711+1G>T
1078delT
G1244E
G1349D
L1065P
R334Q
T338I
991del5
1898+3A>G
I1502
S549R(A>C)
D1152H
3905insT
3272-26A>G
1898+1G>A
I148T
3120+1G>A
3199del
Mutazioni regionali Italiane
1259insA
4382delA
4016insT
R347H
4016insT
D579G
852del22
E217G
D1152H
R1066H
621+3A>G
Le mutazioni su indicate costituiscono circa il 75% delle mutazioni presenti nella popolazione italiana
(sensibilità). La capacità di rilevazione di mutazioni del gene CFTR da parte del test, comparata con la
percentuale di rilevazione considerando tutte le mutazioni del gene CFTR fino ad oggi evidenziate nella
popolazione italiana, è superiore al 97% (Rendine et al, 1997; Bombieri e Pignatti, 2001). Il test è
altamente specifico: non sono state evidenziate cross-reazioni con mutazioni rare o polimorfismi in
prossimità delle posizioni delle sonde utilizzate nel kit.
Che risultati puo’ dare l’analisi genetica per fibrosi cistica e che implicazioni comporta per la
gravidanza
Nel caso di richiesta di analisi molecolare per Fibrosi Cistica in gravidanza il test viene innanzitutto
effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo
successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate,
viene valutata la diagnosi prenatale molecolare (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di
malattia sul feto;vedi oltre).
• Con l’attuale analisi si possono avere due tipi di risultati:
- l’analisi individua nel DNA la presenza di una mutazione del gene CFTR (si dice che il soggetto risulta
“positivo” al test). Questo risultato significa che il soggetto è un portatore.
- l’analisi non individua la presenza di mutazioni del gene della fibrosi cistica (si dice che il soggetto
risulta “negativo”al test). Questo risultato significa che il soggetto ha una probabilità diminuita, rispetto
a prima dell’analisi, di essere un portatore (≃ 1%). Non è possibile che l’analisi escluda in assoluto la
probabilità di essere un portatore, perché non è possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime
mutazioni del gene della fibrosi cistica;
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•
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Ciò implica che:
se entrambi i membri di una coppia sono negativi al test, la probabilità di avere un figlio affetto è
inferiore a quello della popolazione generale (1 probabilità su 40.000 );
- se entrambi risultano positivi al test (entrambi portatori), il rischio di avere un figlio affetto è pari al
25% (cioè ad 1 probabilità su 4) ad ogni gravidanza. In questo caso la coppia può fare ricorso alla
diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto;
- se, infine, un genitore è positivo al test (portatore) e l’altro è negativo, il rischio di avere un figlio affetto
è superiore a quello della popolazione generale (cioè ≃1 su 400).
In questa circostanza la diagnosi prenatale molecolare (test di esclusione fetale) permette di escludere la
malattia nel feto solo nel 50% dei casi; mentre negli altri casi, la mancata esclusione raddoppia il rischio di
malattia nel feto (1 su 200). In tali circostanze è comunque possibile fare ricorso anche ad indagini
prenatali di altra natura per ottenere una migliore definizione del rischio, mentre tecniche più complesse di
analisi molecolare per la ricerca di mutazioni fibrosi cistica (eseguibili preferibilmente in fase
preconcezionale come analisi di II livello- DDGE, DHPLC, sequenziamento- e valutate comunque in un
colloquio specialistico di consulenza genetica), richiedono tempi lunghi di esecuzione e costi elevati e,
comunque, non arrivano mai ad escludere la presenza di mutazioni (sensibilità non assoluta, difficoltà
nell’interpretare varianti di sequenza dalle incerte conseguenze cliniche).
Problematiche e limiti dell’analisi genetica molecolare
In generale le analisi genetiche sono indagini di sviluppo recente, continuamente sottoposte a revisione e
perfezionamento. E’ possibile che per problemi tecnici,in una percentuale molto bassa di casi (inferiore
all’ 1%) il test genetico per fibrosi cistica vada ripetuto o fornisca un risultato sbagliato.
E’ importante ricordare che:
• La probabilità di trovare una mutazione (e quindi di ricevere la diagnosi di portatore di fibrosi
cistica) è maggiore per un soggetto che sia parente di un malato o di un portatore. In questo caso è
necessario prima identificare la mutazione del malato o del portatore presente in famiglia
(mutazione “familiare”) e poi ricercarla nel parente;
• Se un individuo imparentato con un malato chiede l’analisi genetica e non è stato possibile
identificare la mutazione familiare nel soggetto malato, o nel caso di diagnosi prenatale uno dei
due genitori è portatore di una mutazione non identificabile, è necessario ricorrere ad indagini più
complesse che coinvolgono oltre al malato altri familiari (analisi indiretta mediante siti
polimorfici, ovvero sequenze diverse, ma normali, di DNA ereditabili in associazione al gene
CFTR) che comportano un moderato aumento di rischio di errore e che non sempre possono
fornire un risultato.
• Quando siano coinvolti più familiari, se i legami di parentela di coloro che si sottopongono al test
sono diversi da quanto dichiarato, il test può rivelare tale situazione (ad esempio quando il padre
anagrafico non sia quello biologico), oppure può fornire un risultato sbagliato. Una diagnosi
sbagliata in un membro di una famiglia può portare ad altri errori diagnostici per altri soggetti di
quella famiglia.
• Il risultato dell’analisi genetica può condurre a fare diagnosi non solo di portatore, ma anche di
malato di fibrosi cistica, qualora nel soggetto analizzato vengano individuate non una, ma due
mutazioni del gene della fibrosi cistica.
• Il risultato dell’analisi genetica può condurre a considerare l’eventualità di una diagnosi prenatale.
• E’ importante ricordare che casi eccezionali di fibrosi cistica potrebbero essere dovuti a mutazioni
de novo, alleli complessi (combinazioni di più polimorfismi diversi in grado di influenzare la
funzionalità del gene), disomia uniparentale. Nell’1% dei pazienti con fibrosi cistica tipica
eterogeneità genetica (coinvolgimento di geni diversi dal CFTR) non può essere esclusa.
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E’ importante sottolineare che:
• in rari casi un risultato non interpretabile può evidenziarsi a causa della presenza di polimorfismi
di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3’
dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari.
• E’ possibile che siano presenti altre mutazioni ma, che non essendo incluse nel kit, non siano
rilevabili
• Il test LiPA non è in grado di rilevare se le 2 mutazioni di un paziente eterozigote composto
siano presenti su uno o 2 cromosomi (in cis o in trans). Solo lo studio del DNA parentale potrà
dare indicazioni sulla fase cromosomica.
In considerazione delle problematiche sopra esposte, in concomitanza del test genetico viene sempre
offerta una consulenza genetica. I risultati ottenuti con l’analisi del DNA sono strettamente confidenziali;
potranno essere comunicati ad altre persone solo dopo autorizzazione dell’interessato.
Referenti per l’analisi genetica per fibrosi cistica
Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l’analisi molecolare
sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l’eventuale test molecolare di FC sul feto, sono precedute
da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica medica, che ha la finalità di
trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a comprenderne il significato e le
implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso informato degli interessati.
Il prelievo di sangue e l’analisi molecolare sono effettuati presso i laboratori dell’Istituto di Diagnostica
Clinica PRODA nella sede di via Russolillo.
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Consenso informato all’indagine genetica per fibrosi cistica
(36 mutazioni + 21 mutazioni regionali italiane)
Ho preso visione delle informazioni allegate, che ho integrato con ulteriori precisazioni fornite dal Dottor
………………………………………………………………………….... ………………………………
Avendo compreso il significato e le implicazioni di questa procedura, chiedo di sottopormi all’indagine
genetica per la ricerca delle più frequenti mutazioni associate alla fibrosi cistica (36 mutazioni + 21
mutazioni regionali italiane).
La mia richiesta di sottopormi al test è completamente volontaria.
Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al Laboratorio.
Sono consapevole che raramente l’analisi può fornire un risultato errato ma che, comunque, la probabilità
di un errore diagnostico è inferiore all’1%. In rarissimi casi può evidenziarsi un risultato non interpretabile
a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte
dalle sonde o alle estremità 3’ dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello
sono necessari.
Sono consapevole che nel caso di richiesta di analisi molecolare per FC in gravidanza il test viene
innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo
successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate,
viene veffettuata la diagnosi prenatale molecolare per FC (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di
esclusione di malattia sul feto).
Sono, inoltre, consapevole che, per una corretta e completa interpretazione conclusiva, sarà
opportuno esibire al Medico che ha prescritto l’esame, il risultato del test consegnatomi dal Laboratorio.
Dati anagrafici del paziente
Cognome:
Nome:
Data e luogo di nascita:
Indirizzo:
Recapito telefonico:
e-mail:
Roma,
Firma del paziente
Firma del Medico che ha raccolto il consenso
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