Screening NAT per HCV-RNA nei Centri Trasfusionali:
organizzazione della Regione Marche e primi risultati
Giovanna Salvoni, Barbara Tonnarelli, Donatella Domenella,
Santa Masciandaro, Mario Piani
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, Azienda Ospedaliera Umberto I, Ancona
Although the risk for transfusion-transmitted HCV
infection is extremely low, there is still a small chance
that blood donated by infected individuals before
seroconversion can escape detection by current
antibody-based assays. The application of nucleic acid
amplification techniques (NAT) to blood screening has
reduced the window period of infected donors.
The aim of this study is to report the Marche Region
organization about NAT testing and the preliminary
results of the screening NAT in blood and blood products.
Parole chiave: biologia molecolare, tecnologia NAT, virus
epatite C, screening delle unità donate
Key words: molecular biology, nucleic acid amplification
technology, hepatitis C virus, screening of blood donations
Introduzione
I dati riportati dalla letteratura scientifica degli ultimi
anni indicano come il rischio di trasmissione di malattie ad
eziologia virale mediante terapia trasfusionale si sia
enormemente ridotto ma non sia del tutto scomparso. Il
rischio residuo di trasmissione durante le fasi precoci
d'infezione (periodo finestra) è stato stimato in Europa, in
uno studio del 1996 su 4.000.000 di donatori, pari a 1:48.000
per HCV, 1:65.000 per HBV e 1:1.000.000 per HIV con le
tecniche di screening allora in uso1. Il rischio di trasmissione
del virus dell'epatite B è legato sia a livelli di antigenemia
così bassi che sfuggono ai kit di rilevazione dell'HBsAg,
sia alla complessazione dell'antigene s con l'anticorpo
specifico, sia alla presenza di mutanti del virus B. Al
contrario, per il virus dell'epatite C il rischio è attribuibile
principalmente al lungo periodo di tempo che intercorre dal
Ricevuto: 5 giugno 2002 - Accettato: 12 luglio 2002
Corrispondenza:
Dr.ssa Giovanna Salvoni
Via Enrico Toti, 20
60123 Ancona
momento di acquisizione dell'infezione alla comparsa degli
anticorpi specifici. Le tecniche immunoenzimatiche oggi in
uso, pur essendo dotate di elevata sensibilità e specificità,
presentano limiti che sono propri della diagnosi di tipo
indiretto, cioè basata sulla rilevazione di anticorpi specifici
e non direttamente sui marcatori virali 2.
Le tecniche di biologia molecolare sviluppate inizialmente
nella ricerca di base, hanno trovato in poco tempo un largo
impiego anche nella diagnostica di laboratorio, nella terapia
e nel monitoraggio delle infezioni virali.
Tra queste, le tecniche di amplificazione degli acidi
nucleici (NAT) sono quelle attualmente più sensibili per
una precoce diagnosi di infezione.
Dopo l'introduzione della Polymerase Chain Reaction
(PCR) sono state sviluppate altre tecniche di rilevazione
degli acidi nucleici: Nucleic Acid Sequence-Based
Amplification (NASBA), Transcription-Mediated
Amplification (TMA), branched DNA signal amplification
(bDNA), Ligase Chain Reaction (LCR) che hanno
consentito, da una parte, la standardizzazione delle
metodiche e la semplificazione delle procedure operative e,
dall'altra, la loro semi-automazione che ne consente l'
applicazione in attività di routine. In campo trasfusionale
l'introduzione della ricerca di HCV-RNA direttamente nello
screening delle unità di sangue e di emocomponenti,
aumenta la sicurezza trasfusionale in quanto riduce
sensibilmente il "periodo finestra" soprattutto per l'HCV3,4.
Recenti studi americani hanno valutato il rischio residuo
di trasmissione di HCV prima e dopo l'introduzione della
NAT, utilizzando modelli matematici sviluppati da Lackritz
e Schreiber che combinano l'incidenza delle
sieroconversioni nei donatori al periodo finestra5. Inoltre,
l'elevata sensibilità della tecnica permette di analizzare oltre
che campioni in singolo, anche pool costituiti da campioni
diversi6. In Italia il Decreto Ministeriale 29 marzo 1999 ha
recepito le indicazioni dei competenti organismi europei
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 47 - num. 4 luglio agosto 2002 (443-446)
443
G Salvoni et al.
(CPMP/BWP/390/97 e Farmacopea Europea), che
stabilivano che a partire dal 1° luglio 1999, i farmaci
plasmaderivati potessero essere prodotti solo da pool di
plasma risultati non reattivi per HCV-RNA mediante
tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (NAT)
utilizzando metodi validati dal Ministero della Sanità per
specificità e sensibilità. L'applicazione del Decreto
Ministeriale ha posto problemi di natura etica e medicolegale in considerazione del diverso livello di sicurezza
trasfusionale tra i farmaci plasmaderivati e gli
emocomponenti labili (piastrine, globuli rossi e plasma
fresco congelato) non testati. Il Ministero della Sanità
italiano ha emanato la Circolare n° 17 del 30 ottobre 2000,
indirizzata agli Assessori alla Sanità delle Regioni (a statuto
ordinario e speciale) e agli Assessori alla Sanità delle
province autonome, su "Adeguamento dei livelli di
sicurezza trasfusionale in presenza di metodiche atte alle
indagini sui costituenti virali per HCV", nella quale veniva
indicato il termine di un anno (dalla data della pubblicazione)
per l'introduzione della ricerca di costituenti virali dell'HCV,
mediante tecnica NAT sul sangue e sugli emocomponenti
destinati ad uso trasfusionale. L'Istituto Superiore della
Sanità ha affidato ad un gruppo di lavoro interno al Comitato
Tecnico Scientifico l'incarico di condurre uno "Studio di
Fattibilità" individuando il Centro Nazionale Trasfusione
Sangue-Croce Rossa Italiana di Roma ed il Dipartimento
Trasfusionale AVIS dell'Azienda Ospedaliera "S.Anna" di
Torino7. Ad integrazione della precedente è seguita la
Circolare n°14 del 19 dicembre 2001, dove il Ministero della
Sanità ha provveduto alla definizione di importanti parametri.
Metodi
Al fine di garantire una reale economia di scala, il
Servizio Sanità della Regione Marche, con delibera della
Giunta Regionale n° 610 del 20/03/2001, ha individuato il
laboratorio di riferimento regionale per l'esecuzione di test di
biologia molecolare (NAT) per lo screening del virus
dell'epatite C sulle unità di sangue donate, nel Servizio di
Immunoematologia e Medicina Trasfusionale dell'Azienda
Ospedaliera "Umberto I" di Ancona. Sulla base delle
indicazioni fornite dalla Linea Guida disponibile sulle
metodiche NAT destinate alla rilevazione di HCV-RNA in
pool di plasma (PA/PH/OMCL 98/22), elaborata
dall'European Network of Medicines Control Laboratories,
sono stati valutati diversi aspetti organizzativi tra i quali:
- strutturazione del laboratorio, anche ai fini della sua
autorizzazione da parte degli esperti competenti;
- validazione del laboratorio e degli operatori;
- trattamento del campione dal momento del prelievo,
444
durante la conservazione, l'invio, il trasporto e fino
all'esecuzione del test;
- valutazione della opportunità di eseguire il test su pool
(e sue dimensioni ottimali) o su singole unità;
- gestione del risultato reattivo di un pool, con riferimento
particolare ai componenti a scadenza più rapida
(concentrati piastrinici);
- valutazione dei costi in relazione alle diverse soluzioni
organizzative adottate.
Dopo avere individuato i locali, sono stati predisposti i
laboratori rispettando la fondamentale suddivisione di due
aree adeguatamente separate tra loro: zona preamplificazione e zona post-amplificazione per
entrambe le tecnologie Polymerase Chain Reaction e
Transcription Mediated Amplification (PCR e TMA).
La temperatura all'interno dei laboratori viene mantenuta
tra i 21 °C ed i 27 °C, e viene rispettato il corretto flusso
unidirezionale di campioni ed operatori dalla zona di prealla zona di post-amplificazione e mai viceversa. I campioni
vengono raccolti in provette PPT (Plasma Preparation
Tube), identificate con lo stesso ID barcode della relativa
unità del donatore (con la codifica UNI) e trasportati in
opportuni contenitori refrigerati. Esiste un sistema regionale
giornaliero di raccolta delle provette prelevate presso i
Centri di Raccolta, che utilizza tre automobili.
Abbiamo eseguito la validazione del laboratorio e degli
operatori seguendo le linee guida del Consiglio d'Europa
(PA/PH/OMCL (98) 22, DEF)8, definendo il limite di
rilevamento (detection limit o cut-off) calcolato mediante
opportuna analisi statistica (analisi dei probit), la robustezza
della metodica ed al suo interno la cross-contaminazione.
Il limite di rilevamento del nostro laboratorio è di 12,31
UI/mL con 95% confidence limit di 7,53 e 31,65.
Per effettuare questa valutazione è stato utilizzato lo
Standard Internazionale ISS 0498 che è una preparazione
liquida di HCV-RNA di genotipo 1 preparata dal
Laboratorio di Immunologia dell'Istituto Superiore
di Sanità (gentilmente fornito dai Dott. Gentili, Dott. Pisani
e coll.), al quale, a seguito di uno studio collaborativo
internazionale9, è stato attribuito un titolo di 1.700 UI/mL.
Materiali
I due test utilizzati nel nostro laboratorio si basano uno
sulla tecnologia TMA della Ditta Chiron Blood Testing
(Emeryville, CA, USA) che si applica su campione singolo
ed è in grado di rilevare simultaneamente la presenza di
HCV-RNA ed HIV-1/RNA (kit Chiron Procleix TMA HIV-1/
HCV Assay), e l'altro sulla tecnologia rt-PCR della Ditta
Roche Diagnostics SpA (Monza-Italia) con i kit Cobas
Organizzazione per lo screening HCV-RNA nelle Marche
Ampliscreen HCV v. 2.0 e Cobas Ampliscreen Multiprep,
che sono stati registrati per l'applicazione su mini–pool e
rilevano la presenza di HCV-RNA. La metodica rt-PCR si
esegue di routine dal 5 novembre 2001 mentre la metodica
TMA si esegue di routine dal mese di gennaio 2002.
Nell'area di lavoro dedicata alla preparazione dei
campioni vengono allestiti i pool (da 24 campioni) per
l'esecuzione del test Roche, utilizzando il preparatore
automatico Tecan Genesis, il cui software gestisce le liste
di lavoro e l'abbinamento dei barcode dei campioni al
barcode del pool. Il programma Amplipool della Ditta
Themix Italia gestisce il risultato del pool e lo distribuisce
ai campioni che ne fanno parte. In una seconda area di
lavoro, dedicata alla preparazione dei campioni per
l'esecuzione del test TMA della Ditta Chiron, un altro Tecan
Genesis dispensa automaticamente i campioni all'interno
delle Ten Tube Units (TTU). Le fasi analitiche sono state
rispettate alla lettera per entrambe le metodiche.
Risultati
Il numero dei campioni pervenuti al nostro laboratorio
nel periodo 1/11/2001-31/1/2002 sono stati 17.960, di cui 16.860
sono stati analizzati con metodica rt-PCR (PCR di
retrotrascrizione) ed i restanti 1.100 con metodica TMA.
I risultati relativi alle sedute analitiche sono riportati in
tabella I e tabella III per la Ditta Roche, in tabella II e tabella
III per la Ditta Chiron. La validazione della seduta analitica
per entrambi i test è basata sulla corrispondenza dei risultati
dei calibratori, dei controlli negativi e positivi, del run control
e sulla valutazione del numero dei campioni invalidi (inferiore
al 10%). La validazione del singolo risultato è basata sulla
reattività del controllo interno. I risultati vengono inseriti
per via informatica al sistema gestionale centrale per la
validazione biologica delle unità, mentre i risultati relativi alle
donazioni eseguite presso gli altri Servizi/Centri Trasfusionali
della Regione Marche vengono inviati automaticamente al
nostro server del Centro Regionale di Coordinamento e
Compensazione il quale, grazie ad un programma applicativo,
smista i risultati ai centri corrispondenti (codifica UNI dei
codebar) ed invia i risultati per posta elettronica.
Discussione
I test di amplificazione degli acidi nucleici aprono oggi
una nuova era tecnologica nel campo della sicurezza dei
prodotti destinati alla terapia trasfusionale. Entrambe le
tecnologie TMA Chiron e rt-PCR Roche oggi disponibili
per lo screening delle unità donate sono adatte ad essere
Tabella I: risultati riguardanti lo screening rt-PCR della
Ditta Roche
rt-PCR
n° sedute analitiche eseguite
n° sedute analitiche invalide
n° pool analizzati (da 24 campioni)
n° pool invalidi (da 24 campioni)
83
2 (2.4%)*
742
14 (1.8%)**
* 1) problema tecnico dello strumento Cobas Amplicor
2) problema tecnico della centrifuga refrigerata
** Controllo interno non reattivo
Tabella II: risultati riguardanti lo screening TMA della Ditta Chiron
TMA
n° sedute analitiche eseguite
n° sedute analitiche invalide
n° campioni analizzati
n° campioni invalidi
6
1 (16%)*
1.100
83(7.5%)
* problema tecnico del luminometro
Tabella III: risultati Ditta Roche e Chiron
n° pool (rt-PCR)- campioni
(TMA) inizialmente reattivi
n° pool/ campioni falsi positivi
n° campioni confermati reattivi
rt-PCR
TMA
1
4
0
1
4
0
applicate nei laboratori trasfusionali. Ogni Servizio
Trasfusionale può scegliere la tecnologia più adatta alla
propria realtà in funzione del carico di lavoro, del personale
dedicato, delle dimensioni del laboratorio, della
organizzazione interna, dei tempi di raccolta e di validazione.
Sembra evidente, comunque, che per garantire economia
di scala, riproducibilità analitica e affidabilità del dato, sia
utile centralizzare la procedura NAT presso strutture
adeguatamente automatizzate, attrezzate (è indispensabile
una dotazione di back up della strumentazione), in cui gli
operatori siano adeguatamente formati e "validati"10. Nelle
stesse strutture il laboratorio deve essere organizzato in
modo tale che le aree di lavoro siano attentamente suddivise
al fine di evitare i rischi di contaminazione degli ambienti e
della strumentazione. La centralizzazione, tuttavia, pone
problemi organizzativi notevoli, quali la realizzazione di una
rete di trasporto e di un adeguato supporto informatico per
la gestione delle informazioni e per il trasferimento dei
risultati. Ovviamente, l'introduzione del test NAT
rappresenta una attività aggiuntiva alle preesistenti e
necessita di risorse umane, tecnologiche e strutturali e,
pertanto, di investimenti economici. A tutt'oggi, la
legislazione italiana prevede solo l'applicazione delle
metodiche NAT per la rilevazione dell'HCV-RNA, ma è
445
G Salvoni et al.
ipotizzabile che in un immediato futuro la tecnologia di
amplificazione degli acidi nucleici possa essere allargata
alla rilevazione simultanea dell'HIV1-RNA e dell'HBV-DNA
come già avviene in altri Paesi Europei11-13. Per quanto
riguarda la nostra Regione, la mancanza di un Server Web
regionale impedisce il rapido trasferimento dei dati,
strutturati in modo tale da poter essere importati dai sistemi
gestionali periferici. La strutturazione di questo Server Web
è attualmente in corso, allo scopo di supportare, come
portale, l'insieme delle funzioni specifiche dei Servizi e
Centri Trasfusionali, quali il registro regionale dei donatori
e le schede di raccolta dati per la stima della prevalenza
delle infezioni trasmissibili con la trasfusione di sangue
(sorveglianza epidemiologica).
-
validazione del laboratorio e degli operatori;
trattamento del campione dal momento del prelievo,
durante la conservazione, l'invio, il trasporto e fino
all'esecuzione del test;
- esecuzione del test su pool (e sue dimensioni ottimali)
o su singole unità;
- sequenze organizzative del risultato reattivo di un
pool legato ai tempi di validazione delle unità con
riferimento particolare ai componenti a scadenza più
rapida (concentrati piastrinici);
- valutazione dei costi in relazione alle diverse soluzioni
organizzative adottate.
Nella nostra presentazione vengono riportati i
risultati della nostra attività di screening sulle unità
donate nella Regione Marche nei primi tre mesi.
Ringraziamenti
Bibliografia
Si ringrazia il personale di tutte le Strutture Trasfusionali
della Regione Marche per la fattiva collaborazione prestata
alla risoluzione dei problemi organizzativi. Si ringraziano,
inoltre, il Dr. G. Gentili ed il Dr. G. Pisani del Laboratorio di
Immunologia dell'Istituto Superiore di Sanità di Roma, per
avere cortesemente fornito gli standard ISS 0498 ed ISS HC
indispensabili per la validazione del laboratorio, degli
operatori e per la preparazione del run control.
Riassunto
A seguito del Decreto Ministeriale 29 marzo 1999, il
Ministero della Sanità Italiano ha emanato la Circolare
n°17 del 30 ottobre 2000 indirizzata agli Assessori alla
Sanità delle Regioni (a statuto ordinario e speciale) e
agli Assessori alla Sanità delle province autonome su
"Adeguamento dei livelli di sicurezza trasfusionale in
presenza di metodiche atte alle indagini sui costituenti
virali per HCV" nella quale veniva indicato il termine di
un anno (dalla data della pubblicazione) per
l'introduzione della ricerca di costituenti virali dell'HCV,
mediante tecnica NAT sul sangue e gli emocomponenti
destinati ad uso trasfusionale. Al fine di garantire una
reale economia di scala, il Servizio Sanità della Regione
Marche, con delibera della Giunta Regionale n° 610 del
20/3/2001, ha individuato il laboratorio di riferimento
regionale per l'esecuzione di test di biologia molecolare
(NAT) per lo screening del virus dell'epatite C nelle unità
di sangue donate, nel Servizio di Immunoematologia e
Medicina Trasfusionale dell'Azienda Ospedaliera
"Umberto I" di Ancona. L'introduzione della NAT ha
comportato l'impiego di risorse aggiuntive e la necessità
di valutare diversi aspetti organizzativi tra i quali:
- strutturazione e organizzazione del laboratorio anche
ai fini della sua autorizzazione;
446
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