IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Utilizzo degli elastomeri e degli swab buccali nelle pratiche di identificazione e nelle ricerche genetiche in fauna ittica, nel rispetto del welfare A cura di Foglini Claudio III corso di aggiornamento su tematiche relative agli organismi acquatici -Torino, 18/12/15 Problematica affrontata Necessità di: 1.Associazione univoca genotipo – fenotipo (DNA-individuo) su un consistente numero di animali; 2.Possibilità di recupero del genotipo ricercato in un gruppo di animali senza dimorfismo evidente. Perché marcare gli individui? Identificazione individuale per studi inerenti: • Dinamiche di popolazione; • Dinamiche di dispersione e/o migrazione; • Etologia ed ecologia comportamentale; • Genetica di popolazione. Antibracconaggio – anticontrabbando. La marcatura ideale Per il ricercatore • Economica • Pratica • Visibile a distanza • Elevato numero di combinazioni • Di facile lettura • Persistente Per il benessere animale • Non alterare sviluppo, crescita, mortalità, ecologia ed etologia • Poco invasiva • Tag ben tollerato • Rilascio del tag ? Marcatura degli animali acquatici PIT tag Streamer tag Data-logger Sat/GPS/Acustici Animali naturalmente marcati Problematiche nei pesci Anelli mandibolari e branchiali: invasivi, ostacolano la nutrizione; Etichette: alterano nuoto e comportamento; Fascette: alterano nuoto e comportamento, stimolano predazione; PIT: costosi, recupero impossibile (salvo † pesce); E’ necessario ricatturare l’individuo per la lettura dei dati. Data-logger: estremamente costosi, autonomia limitata. Utilizzabili in piccoli numeri. Visible Implants Elastomer (VIE) •Materiale polimerico biocompatibile, bicomponente ed iniettabile sottocute; •Colori ad alta visibilità ed UV-fluorescenti; PRO Applicabile ad anfibi, pesci, crostacei, molluschi e altri piccoli animali; Minimo impatto su sopravvivenza, crescita e comportamento degli individui marcati; Pratico da gestire, applicazione veloce, costi contenuti; Alto tasso di permanenza; Visibile in luce ambiente anche “a distanza”; CONTRO Numero di individui limitato dai colori disponibili, dalle posizioni utilizzabili, dal n° di tag desiderati; Poco individuabile se usato su tessuti scuri o a veloce accrescimento/rigenerazione; L’osservatore casuale può non individuare il tag; Il kit Polimero colorato (VIE); Componente indurente; Siringhe per miscelazione; Accessori per miscelazione; Siringhe per iniezione; Torcia U.V. Colori di riferimento; Protocollo di marcatura Sul solo sul lato sx combinazioni: -1 sola regione corporea; -1 regione corporea + 1 tag aggiuntivo; Swab boccale in etanolo (99%) • Mantenimento dell'equilibrio cellulare fino a 96 ore dal prelievo; • Nessuna controindicazione per quanto riguarda le interferenze dell'EtoH in PCR; • DNA di buona qualità (estrazione fatta a 72 ore dal prelievo); • Utilizzo e conservazione dei campioni a freddo (4°C) (a T ambiente EtoH è tossico per le cellule); Il metodo su campo Cattura degli animali Marcatura degli animali con VIE Swab boccale e stoccaggio dei campioni biologici Recupero e riconoscimento degli individui Risultati - VIE • Colori più visibili: rosso, arancione, giallo. • Blu: poco visibile nei tessuti pigmentati; in tessuti bianchi o trasparenti è comunque meno visibile dei colori precedenti. L’UV aiuta. •0,1 ml di VIE: 40 pesci marcati con tag multipli. •Una dose di VIE miscelati e pronti all’uso è stata utilizzata anche per 5h* (conservandola al fresco tra due piastre eutettiche) •Possibilità di lettura “a distanza” (confinando il pesce o dopo blanda sedazione). Risultati - Swabs • Prelievo indolore di materiale genetico; • Stress minimo, velocità di esecuzione; • Associazione univoca del genotipo all’individuo; • Recupero di un individuo senza separare i singoli animali; • Stoccaggio su campo dei campioni di DNA per un periodo di tempo consono; • Analisi dei campioni genetici differibile (max 96 ore) Criticità riscontrate • Difficoltà di preparazione di una quantità ridotta di VIE per piccoli lotti di animali. • Regolazione della dose di anestetico per immobilizzare il pesce durante la marcatura. • Ago sottile, difficile da sostituire durante le operazioni di marcatura (problema dato dal tipo di siringa). • La marcatura dietro l’occhio è visibile ma richiede cautela nell’attuarla ed è di interpretazione difficoltosa. Costi approssimativi* TIPO di TAG Costo di 1 tag Stream tag PIT tag VI Alpha tag Gill tag CWT tag VIE tag 2,00 $ 2,00 $ 0,75 $ 0,60 $ 0,09 $ 0,04 $ *Costi indicativi ottenuti da una ricerca internet sui principali siti trattanti materiale per zootecnia, acquacoltura, pesca Grazie per l’attenzione [email protected]