Brescia – 9 Giugno 2011
Simposio satellite VIRVET
“La Mixomatosi:
Mixomatosi: una malattia sempre attuale”
attuale”
a cura del
Centro di Referenza Nazionale per le Malattie Virali dei Conigli
Laboratorio di Riferimento OIE per le Malattie Emorragiche dei Lagomorfi
Eziologia e diagnosi di
laboratorio virologica e
sierologica
Il Myxoma virus : caratteristche virologiche ed immunobiologiche e breve storia
La diagnosi virologica ”classica” (non molecolare)
La diagnosi sierologica, strumenti e significato
P
O
X
V
I
R
I
D
A
E
Small-pox (Vaiolo)
Eradicato dal 1980
Vaccinia virus, a representative poxvirus: virion structure (A) and genome organization with
an expanded view of the HindIII D restriction enzyme fragment (B).
Harrison S C et al. PNAS 2004;101:11178-11192
©2004 by National Academy of Sciences
Genoma & proteine myxoma virus
• DNA doppia elica chiusa covalentemente alle terminazioni
• 161774 nucleotidi
• 171 geni unici (ORF)
120 Kb
11,5 Kb
“housekeeping genes” conservati nei poxvirus
Geni per la replicazione genoma
Geni per le proteine strutturali ecc.
Regioni TIR “terminal inverted regions” contengono 12 ORF
TIR + regioni terminali contengono i geni “immuno modulatori” (o
“guastatori”?) = proteine che intralciano (rallentano o aboliscono)
il divenire dei processi immunologici sia nativi che adattativi.
IMMUNOSOPRESSIONE
MYXOMATOSI
Gene M-T1 > 2 ORF M001 L/R > glicoproteina di circa 40 Kd secreta al di fuori della cellula
M001 lega le chemochine (simil recettore)> inibisce il richiamo dei
monociti/macrofagi la ove si sviluppa l’infezione.
MV M-T1 deleto rimane virulento in vivo anche se si evidenzia un incremeto di
infiltrati infiammatori
MV MT5KO (deleto) NON sviluppa mixomatosi ma solo infezione localizzata
al sito di inoculo ove si sviluppa una rapida reazione di infiammazione.
Replicazione MV
MV wt
MV MT5KO
Linfocita
“Suicidio”
cellulare
La proteina M -T5 è responsabile del tropismo di MV per i linfociti e di
conseguenza è un fattore di virulenza essenziale per l’instaurarsi della myxomatosi.
Proteina M153 si localizza a livello del reticolo endoplasmatico cellulare
interferendo nella produzione dell MHC-1 e del CD4, indirizzandone i
precusorsi ai lisosomi.
La riduzione delle molecole di MHC-1 rende meno efficiente la distruzione delle
cellule infette da parte dei linfociti CD8 citotossici.
Genomi a DNA e variabilità virale
Genere
Specie
ORF
TIR (Kb
(Kb)
Kb)
Avipox
Fowlpox
261
9,5
Orthopox
Monkeypox
173
6,4
"
Vaccinia
273
12
"
Variola
197
0,7
Capripox
Sheeppox
148
2,2
Leporipox
Fribroma
165
11,5
"
Myxoma
171
12,4
L’evoluzione dei “large DNA virus”: mettere insieme le
informazione genetiche di virus ed ospite
Ricombinazione fra ceppi
Mutazioni a livello di singoli geni
Ospite naturale del myxoma virus è il Sylvilagus – rapporto continuo 10100 migliaia anni.
Il rapporto myxoma Oryctolagus è di soli 60 anni!!!!
The single-cell reproductive cycle of vaccinia virus.
CICLO CELLULARE
Recettori ingresso ubiquitari
(glycosaminoglycans)
Replicazione citoplasmatica
Trascrizione geni
precoci
Intermedi
tardivi
CEV
Due forme:
IMV (intracellulare) infettivo in circolo?
CEV (associato membrana cell)
o infetta direttamente cellule vicine
o EEV (forma extracellulare)
Harrison S C et al. PNAS 2004;101:11178-11192
©2004 by National Academy of Sciences
Patogenesi di MV
(Kerr & Best 1998 RevSciTechOIE 17, 256)
*
24 ore
p.i.
p.i.
palpebre
polmoni
testicoli
* cellule MHC-II simil dendritiche cellule endoteliali vasi sanguini secondari
Tessuti maggiormente interessati: la pelle e i tissuti linfoidi ove si riscontra
la maggior concentrazione di virus.
Virus non rintracciabile libero nel sangue ma nella popolazione bianca circolante
NON riportate significative dimostrazioni di “persistenza” (no stato
carrier).
La protezione dalla mixomatosi
Durante l’infezione si sviluppano alti titoli anticorpali (IgM e IgG)
neutralizzanti in vitro ma molto poco protettivi in vivo.
Conferme ridotta capacità protettiva immunità umorale vengono anche a
esperimenti di protezione passiva e da animali con anticorpi materni
MAGGIOR PESO IMMUNITA’ CELLULARE
Perchè quella umorale è ridotta
Perchè I vaccini inattivati non funzionano
Perchè il virus è quasi sempre intracellulare
Perchè i geni “guastatori” hanno come bersaglio il sistema cellulare
1896 Pastour Institute Montevideo
Laboratory European rabbits caso di “myxomatosi”
100% mortalità
1943 Aragao scopre ospite naturale nel Sylvilagus
brasiliensis - South America
Sylvilagus bachmani – California
1950 Rilascio definitivo e “positivo” del myxoma virus
in Australia per ridurre la presenza dei conigli
1952 A. Delille inocula 2 conigli a Maillebois (Parigi) con
ceppo Losanna di myxoma virus. Nel 1955 il 90% dei
conigli della Gran Bretagna muoiono per myxomatosi
Frank Fenner,
Fenner, “enemy of rabbits”, dies
Monday, 22/11/2010
One of Australia's greatest scientists, Frank Fenner,
Fenner, has died.
control
ntrol of Australia's
He's best known for his work in eradicating smallpox, and the co
rabbit plague.
Professor Fenner won numerous awards including the Albert Einstein World Award ffor
or
Science in 2000 and the Prime Minister's Science Prize in 2002.
He was 95.
Introdotto volontariamente nel 1860, il coniglio europeo
(Oryctolagus cuniculus), causa la sua enorme diffusione, è
divenuta la specie più dannosa per l’ambiente e l’agricoltura
del continente australiano
European rabbit
VARIAZIONE DEL GRADO DI PATOGENICITA’ DEL MYXOMA
VIRUS IN 30 ANNI DI ENDEMIA IN AUSTRALIA
VIRULENZA O PATOGENICITA’: % MORTALITA’ E TEMPO SOPPRAVVIVENZA
IN CONIGLI DA LABORATORIO DI RIFERIMENTO.
100
I Massimo
II Alto
III Intermedio
IV ridotto
V Minimo
80
60
40
20
0
1950
1952
1955
1959
1964
Riduzione popolazione cunicola <5%
1967
1970
197581
TRASMISSIONE VIRUS VIA INSETTI
VETTORI PASSIVI
ZANZARE
PULCI
PROBABILITA’ DI TRASMISSIONE IN RELAZIONE AL
GRADO PATOGENICITA’
60
50
40
30
20
10
0
I
II
III
IV
V
IN 50 ANNI DI COEVOLUZIONE MV – Oryctolagus…
SELEZIONE GENTICA NEI CONIGLI
DOPO ANNI DI SELEZIONE LA MORTALITA’ DA CEPPI DI GRADO I
SI ASSESTA SUL 60%.
COMPAIONO ANCHE I SEGNI CLINICI DI MINOR GRAVITA’.
CEPPI ISOLATI FRA 1991 E 1994 MOSTRANO UN GRADI DI
PATOGENICITA’ MASSIMO (I) IN CONIGLI MAI SOTTOPOSTI A
SELEZIONE.
DIAGNOSI VIROLOGICA DI LABORATORIO
(non genomica)
genomica)
Microscopia elettronica
Immunofluorescenza diretta sul campione
Colture cellulari
Colture cellulari + immunoperossidasi
ELISA sandwich con sieri e MAb specifici
MAb anti MV western blotting positivi
Mab
Livello reattività
Peso molecolare
6B1
medio-debole
principale a 25 Kd
5G9
medio-debole
18-19 Kd
5D12
“
“
5B4
Medio-alto
14-15 Kd
5C12
“
“
3H11
debole
80-90 Kd
MV Moses
6B1 o 5D12, 5G6 e 5B4 in pool, usati per diagnosi (IF e IP).
MV SG33 vaccino
Da palpebra 1° p. 316
Focolaio infezione
ELISA SANDWICH & MAb
Tutti MAbs positivi in immunoperossidasi
Adsorbito siero di coniglio immune anti Myxoma virus
Antigene tc MV Borghi
HRP: IgG coniglio anti IgG topo
2,5
2
1,5
1
0,5
C
-3
C2
C1
4D
1
4C
7
6A
12
5B
7
3F
5
6H
8
1D
7
6H
9
6C
3
2A
4
1B
6
3F
9
3A
7
2G
10
4H
7
4B
12
1E
5
1C
1
0
MAb con il più alto livello di competizione da parte di sieri anti MV
IMMUNOPEROSSIDASI MAb 1E5
CELLULE RK13
VACCINO BORGHI
1° PASSAGGIO CEPPO CAMPO
DIAGNOSI SIEROLOGICA - ELISA COMPETITIVA
1E5 – 1E5 HRP
Siero immune anti MV – 1E5 HRP
Antigene: tc concentrato con ammonio solfato a – 20°C in 50% glicerolo
2
1,5
1
0,5
0
0
42
1/
10
60
25
1/
0
64
1/
0
16
1/
40
1/
1/
10
NEGATIVO
ANIMALI VACCINATI 1/10 - 1/640
ANIMALI CONVALESCENTI 1/640 - 1/10240
OLTRE 100 PROTEINE MIXO:
QUALE PORTA L’EPITOPO DELL’1E5 ?
PROTEINA MIXO “X” + MAb 1E5 = ?
IMMUNOPRECIPITAZIONE 1E5 CON PROT. A
DIGESTIONE CON TRIPSINA
Catena H – 55 kd
FRAMMENTI
1E5 protein antigen
Catena L – 25 kd
ANALISI LC/MS
RISULTATO LC-MS ED ELABORAZIONE BIOINFORMATICA
Proteina
Database
NCBInr
m71L
Peso
molecolare
(kDa)
kDa)
37
Punto
Score statistico
isoelettrico (significativo se >
54)
7.7
200
Recovery (% di
aminoacidi
trovata)
32
[Myxom
a virus]
IMMUNODOMINANT ENVELOPE PROTEIN (IMV)
WESTERN BLOTTING SIERI CONVALESCENTI MIXOMATOSI
60kD
30kD
20kD
15kD
H3L vaccina = M71L di MV
Together, these data show that H3L is a major target of the human
anti-poxvirus antibody response and is likely to be a key contributor to
protection against poxvirus infection and disease.
IgG ELISA PER LA MIXOMATOSI
ADSORBITO 1E5 O SIERO CONIGLIO IMMUNE
ANTIGINE ELISA
SIERI IN DILUIZIONE
MAb ANTI IgG CONIGLIO HRP
ELISA IgG
2
cELISA
2
1,5
1,5
1
1
0,5
0,5
0
0
1/20
1/40
1/80
1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560
1/4
1/16
1/64
1/256
SPERIMENTAZIONE VACCINO
28 gg psot
vaccino
Pre sieri
cELISA
IgG
ELISA
A1
D
A2
12 gg post challenge
cELISA
IgG
ELISA
cELISA
IgG
ELISA
N
1/40
1/640
1/10240
>1/10240
D
N
D
N
D
1/160
A3
N
N
1/10
1/160
1/640
1/10240
A4
N
N
1/10
1/160
1/20
1/320
A5
N
N
1/80
1/640
1/20480
>1/10240
B1
D
N
N
N
1/160
1/640
B2
N
N
1/40
1/640
1/40
1/1280
B3
N
D
<1/10
D
1/20
1/160
B4
N
N
N
N
1/1280
>1/10240
B5
N
N
N
N
1/1280
>1/10240
C1
< 1/10
N
N
D
D
N
C2
N
N
N
N
1/2560
>1/10240
C3
N
N
N
N
1/20
1/160
C4
N
N
N
D
1/1280
>1/10240
C5
N
N
N
D
1/640
>1/10240
VIROLOGIA DIAGNOSTICA - ELISA
SIERI IPERIMMUNI
10 CEPPI DAL CAMPO (OMOGENATI ORGANO) POSITIVI SU CELLULE
MAb 1E5HRP
2
1,5
1
0,5
0
573
557
502
531
N
ELEVATA COINCIDENZA RISULTATI (CIRCA 95%)
Chi ha lavorato…..
Reparto Proteomica
Giuliana Botti
Giulia Nobile – Biologa borsista
Barbara Massardi
Per gli anticorpi monoclonali:
Emiliana Brocchi
Daniela Gamba
