Atti del Convegno / Abstract Book
VI Incontro Nazionale sui
Fitoplasmi
e le Malattie da Fitoplasmi
VI Italian Meeting on Phytoplasmas
and Phytoplasma Diseases
Bologna, 17-19 Giugno / June, 2013
A cura di / Edited by Assunta Bertaccini
Struttura Ospitante / Host University
Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
Scuola di Agraria e Medicina veterinaria
Vicepresidenza di Agraria
www.agrariaveterinaria.unibo.it
Partners
IPWG
International Phytoplasmologist Working Group
www.ipwgnet.org
SIPaV
Società Italiana di Patologia Vegetale
www.sipav.org
SIROE
Società Italiana per la Ricerca sugli Oli Essenziali
www.siroe.it
L'ORTOFRUTTICOLA
Albenga
www.ortofrutticola.it
ADAMO CANEL S.A.S.
Col San Martino - TV
www.canel.it
Comitato Scientifico / Scientific Committee
Alberto Alma
Marina Barba
Assunta Bertaccini
Piero Attilio Bianco
Maurizio Conti
Caio Bruno Faraglia
Ruggero Osler
Gianfranco Romanazzi
Comitato Organizzatore / Organizing Committee
Maria Grazia Bellardi
Assunta Bertaccini
Enrico Biondi
Lisa Cavicchi
Nicoletta Contaldo
Carla Lucchese
Paola Minardi
Samanta Paltrinieri
Juan Fernando Mejia
Stefano Ardizzi
Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
Scuola di Agraria e Medicina veterinaria
Vicepresidenza di Agraria
Viale G. Fanin 46, 40127 - Bologna, Italy
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Presentazione
Facendo seguito agli ormai tradizionali appuntamenti iniziati ad
Udine quasi vent’anni fa, il gruppo di studio sulle fitoplasmosi delle
piante ha organizzato presso l’Università di Bologna il "VI Incontro
Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi" con lo scopo di
aggiornare la comunità scientifica e gli operatori del settore sui vari
aspetti delle problematiche legate a queste importanti malattie. Viene
presentata come introduzione al convegno la coltivazione dei fitoplasmi
in substrato axenico che potrà aprire la strada a ricerche nuove e più
focalizzate in questo importante settore fitopatologico. Sono pervenute
36 comunicazioni che coprono i diversi aspetti del settore: nuove
malattie e malattie da quarantena, trasmissione ed insetti vettori,
interazione con gli ospiti, epidemiologia, controllo e diagnostica. Le
tre giornate di lavori si concluderanno con una tavola rotonda che
verterà sul tema “Fitoplasmi e territorio: diffusione, diagnosi e sistemi
innovativi di controllo”.
Presentation
Following the traditional meetings started in Udine almost twenty years
ago the phytoplasmology group is organizing at Bologna University,
the “VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases”
in order to update the scientific community and the stakeholders on the
different aspect of phytoplasma and phytoplasma associated diseases.
The introduction will present the axenic cultivation of phytoplasmas
that could open new research avenues leading to eventually increase
the knowledge in this relevant plant pathology field. The different
aspects of the phytoplasma research such as new diseases and
quarantine diseases, transmission and insect vectors, phytoplasmahost interactions, epidemiology, control and diagnostic are covered
by 36 communications. The three days meeting will end with a round
table about “Phytoplasma and environment: diffusion, diagnostic and
innovative management systems”.
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Indice / Index
RELAZIONE INTRODUTTIVA
INVITED PRESENTATION
Contaldo N., A. Bertaccini, S. Paltrinieri, D. Windsor, H. Windsor
Cultivation of several phytoplasmas from a micropropagated plant collection /
Coltivazione di fitoplasmi in substrato axenico utilizzando ceppi mantenuti in
collezione mediante micropropagazione ............................................................pag. 13
NUOVE MALATTIE E MALATTIE DA QUARANTENA
NEW AND QUARANTINE PHYTOPLASMA DISEASES
Casati P., Y. Abou-Jawdah, A. Cominetti, F. Quaglino, E. Choueiri, M. Molino
Lova, R. Tedeschi, S. Prati, L. Picciau, A. Alma, P.A. Bianco
Identificazione molecolare di ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in piante spontanee
presenti in frutteti del Libano / Molecular identification of ‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ in spontaneous plants in fruit orchards in Lebanon ..........................pag. 21
Paltrinieri S., M. Piergiacomi, N. Contaldo, F.R. De Salvador, A. Bertaccini
Indagine sulla presenza di fitoplasmi in Actinidia spp. in Italia centrosettentrionale / Survey to verify phytoplasmas presence in Actinidia spp. in
North-Central Italy ..........................................................................................pag. 25
Ermacora P., F. Ferrini, M. Martini, F. Pavan, A. Loschi, N. Loi, S. Moruzzi, R. Osler
Caratterizzazione biologica e molecolare di un fitoplasma associato alla fillodia
della cicoria nel nord-est dell’Italia / Biological and molecular characterization of a
phytoplasma associated with chicory phyllody in North-East Italy ......................pag. 29
Gentili A., L. Ferretti, E. Costantini, A. Zoina, L. Cozzolino, P. Spigno, G. Pasquini
Rilevamento di flavescenza dorata ceppo FD-D in areali viticoli dell’isola di Ischia /
Identification of “flavescence dorée” strain FD-D in viticultural areas of Ischia island
(Campania, Italy) .............................................................................................pag. 33
Contaldo N., A. Bertaccini, G. Bozzano, G. Parrella, L. Cavicchi, M.G. Bellardi
Infezione da “stolbur” e virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro (TSWV) in
Lupinus polyphyllus / Mixed infection by “stolbur” phytoplasmas and tomato spotted
wilt virus (TSWV) in Lupinus polyphyllus .........................................................pag. 37
Spallino R.E., S. Rizza, C. Marzachì, M. Tessitori
Scopazzi della ginestra in Sicilia / Spartium witches’ broom in Sicily ...............pag. 41
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Bertaccini A., J.F. Mejia, S. Paltrinieri, N. Contaldo, G. Granata
Grave deperimento in kentia associato alla presenza di fitoplasmi / A severe kentia
decline associated with phytoplasma presence ..................................................pag. 45
Marcone C., E. Seemüller
Diffusa presenza di scopazzi del melo in impianti familiari in Val d’Agri, Basilicata /
Widespread occurrence of apple proliferation in low-intensity orchards in Agri valley,
Basilicata (Italy) ................................................................................................pag. 49
Quaglino F., P. Casati, Y. Abou-Jawdah, E. Choueiri, M. Molino-Lova, R.
Tedeschi, A. Alma, P.A. Bianco
Elevata omogeneità genetica in popolazioni di fitoplasmi associati agli scopazzi
del mandorlo in Libano / High genetic homogeneity among almond witches’ broom
phytoplasma populations in Lebanon .................................................................pag. 53
Salem N.M., F. Quaglino, A. Abdeen, P. Casati, D. Bulgari, A. Alma, P.A. Bianco
Prima segnalazione di ‘Candidatus Phytoplasma solani’ associato a legno nero della
vite in Giordania / First report of ‘Candidatus Phytoplasma solani’ associated with
grapevine “bois noir” disease in Jordan ...........................................................pag. 57
Costantini E., L. Ferretti, A. Gentili, F. Punelli, G. Pasquini
Identificazione di fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrIX-C in piante di
Argyranthemum frutescens / Identification of 16SrIX-C phytoplasmas in
Argyranthemum frutescens L. ............................................................................pag. 61
TRASMISSIONE DI FITOPLASMI ED INSETTI VETTORI
PHYTOPLASMA TRANSMISSION AND INSECT VECTORS
Conti M.
Fitoplasmi e trasmissione per seme / Phytoplasmas and seed transmission .........pag. 67
Mori N., F. Pavan, N. Contaldo, S. Paltrinieri, A. Bertaccini
Indagini epidemiologiche su ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ in colza / ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ epidemiology in oil seed rape ...........................................pag. 71
Monti M., M. Martini, R. Tedeschi
Diagnosi e quantificazione specifiche di ‘Candidatus Phytoplasma mali’ in insetto
mediante EvaGreen “real-time” PCR / Specific detection and quantification of
‘Candidatus Phytoplasma mali’ in insect by EvaGreen real-time PCR .................pag. 75
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Tedeschi R., L. Picciau, F. Quaglino, P. Casati, M. Molino-Lova, Y. Abou-Jawdah,
P.A. Bianco, A. Alma
Indagini preliminari su insetti vettori di ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in
Libano / Preliminary survey on potential insect vectors of ‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ in Lebanon .....................................................................................pag. 79
Forte V. , E. Bortolamai, L. Filippin, E. Angelini, N. Mori
Emitteri Auchenorrincha presenti in Ailanthus altissima infetto dal fitoplasma della
flavescenza dorata della vite / Auchenorrhyncha fauna living on Ailanthus altissima
infected by grapevine “flavescence dorée” phytoplasma ...................................pag. 83
Mori N., V. Forte, P. Collodel, E. Angelini
Sopravvivenza dei diversi stadi di sviluppo di Scaphoideus titanus su Ailanthus
altissima / Scaphoideus titanus survival on Ailanthus altissima .........................pag. 87
Rizza S., V. D’Urso, C. Marzachì, M. Tessitori
Osbornellus horvathi potenziale vettore di fitoplasmi del gruppo 16SrIX / Osbornellus
horvathi potential vector of 16SrIX phytoplasmas .............................................pag. 91
INTERAZIONE FITOPLASMA ED OSPITI
INTERACTION AMONG PHYTOPLASMAS AND HOSTS
Pacifico D., L. Galetto, S. Abbà, S. Bertin, S. Palmano, M. Rashidi, D. Bosco,
G. Firrao, C. Marzachì
Risultati preliminari dell’espressione genica del fitoplasma del giallume della
margherita nella pianta e nell’insetto vettore / Preliminary results on gene expression
of chrysanthemum yellows phytoplasma in plant and insect vector ...................pag. 97
Miotti L., R. Musetti, E. Angelini
Studi di espressione genica in Catharanthus roseus infetto dal fitoplasma della
flavescenza dorata della vite / Gene expression studies on Catharanthus roseus infected
by grapevine “flavescence dorée” phytoplasma ..............................................pag. 101
Rashidi M., L. Galetto, F. Veratti, C. Marzachì, D. Bosco
Studio in vivo del ruolo delle proteine di membrana di “chrysanthemum yellows
phytoplasma” nella trasmissione con insetti vettori / In vivo assays to test the role of
phytoplasma membrane proteins of chrysanthemum yellows phytoplasma on vector
acquisition and transmission capabilities ........................................................pag. 105
Serwaa R.A., M. Kube, R. Reinhardt, S. Paltrinieri, A. Bertaccini
Organizzazione del gene imp in ‘Candidatus Phytoplasma cynodontis’ / Organisation
of the imp-locus in ‘Candidatus Phytoplasma cynodontis’ ...............................pag. 109
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Nissen L., P. Mattarelli, N. Contaldo, L. Cavicchi, A. Bertaccini, M.G. Bellardi
Studio analitico-comparativo sull’attività antibatterica di oli essenziali di Monarda
fistulosa sana e infetta da fitoplasmi / Comparative analysis of the antibacterial
activity of essential oils from healthy and phytoplasma infected Monarda
fistulosa............................................................................................................pag. 113
Margaria P., P. Caciagli, A. Ferrandino, A. Schubert, S. Palmano
Analisi biochimiche e di espressione genica della via metabolica dei flavonoidi
in viti affette da flavescenza dorata e risanate / Transcriptional and metabolic
analyses of the flavonoid pathway in “flavescence dorée” affected and recovered
grapevines .......................................................................................................pag. 117
EPIDEMIOLOGIA DELLE FITOPLASMOSI
EPIDEMIOLOGY OF PHYTOPLASMA DISEASES
Punelli F., A. Gentili, E. Costantini, L. Ferretti, G. Pasquini
Variabilità molecolare multigenica del fitoplasma “stolbur” in relazione alla distribuzione
geografica sul territorio italiano / MLST variability of “stolbur” phytoplasmas in
relationship with their geographic distribution in Italy ......................................pag. 123
Bertaccini A., S. Paltrinieri, N. Contaldo, E. Gargani, P. Braccini, B. Bagnoli
Variabilità genetica di fitoplasmi associati a flavescenza dorata in un vigneto
della provincia di Massa Carrara / Genetic variability in phytoplasmas
associated with “flavescence dorée” in a vineyard of the Massa Carrara
province (Tuscany, Italy) ..............................................................................pag. 127
Vizzaccaro L., G. Pasquini, E. Costantini, A. Gentili, F. Punelli, L. Ferretti
Studio della variabilità molecolare mediante analisi multigenica di ‘Candidatus
Phytoplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ e ‘Candidatus Phytoplasma
pyri’ / Investigation on molecular variability of ‘Candidatus Phytoplasma mali’,
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ and ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ by multilocus
sequence analysis .............................................................................................pag. 131
Mejia J.F., L. Zamora, B. Duduk, M.L. Quiñones, A. Bertaccini, N. Contaldo
Caratterizzazione molecolare di ceppi di ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ da
mais /Molecular characterization of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ strains
from maize .......................................................................................................pag. 135
Duduk B., Y. Arocha, J. Mitrović, R. Michelutti, R. Benabid, J. Scott, A. Bertaccini
Caratterizzazione molecolare di ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ in ortensia in
Canada / Molecular characterization of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ infecting
hydrangea in Canada .......................................................................................pag. 139
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
CONTROLLO DELLE MALATTIE ASSOCIATE A FITOPLASMI
CONTROL OF PHYTOPLASMA-ASSOCIATED DISEASES
Osler R., P. Ermacora, N. Loi, M. Martini, R. Musetti
Malattie da fitoplasmi: il “recovery” e le resistenze acquisite, l’epigenetica e la resilienza
/ Recovery and acquired resistances, epigenetic and resilience ..........................pag. 145
Romanazzi G., S. Murolo, E. Feliziani, L. Landi, V. Mancini
Effetti dell’applicazione in campo di induttori di resistenza sulle caratteristiche
quantitative e qualitative della produzione e sulle infezioni di legno nero della vite /
Application of resistance inducers in grapevines affected by “bois noir”: effects on
qualitative and quantitative production parameters.........................................pag. 149
Gonella E., E. Crotti, M. Mandrioli, D. Daffonchio, A. Alma
Colonizzazione e trasmissione del batterio acetico Asaia in Scaphoideus titanus
Ball, vettore del fitoplasma della flavescenza dorata della vite / Colonization and
transmission pathways of the acetic acid bacterium Asaia in Scaphoideus titanus Ball,
vector of “flavescence dorée” phytoplasma to grapevine ................................pag. 153
Lessio F., A. Alma
Influenza dello sviluppo del ritidoma e della termoterapia sulle uova di Scaphoideus
titanus Ball / Influence of bark’s development and hot water treatment on the eggs of
Scaphoideus titanus Ball ..................................................................................pag. 157
Tessari F., N. Mori, F. Quaglino, G. Posenato, P.A. Bianco
Possibilità di diffusione del legno nero della vite attraverso il materiale vivaistico / Possibility
of grapevine “bois noir” diffusion through propagation material ...........................pag. 161
Poggi Pollini C., A.R. Babini, M. Dallara, C. Lanzoni, C. Ratti
Valutazione di nuove varietà di albicocco nei confronti del giallume europeo delle drupacee
(ESFY) mediante l’utilizzo di tecniche molecolari / Evaluation of tolerance to European
Stone Fruit Yellows (ESFY) of new apricot cultivars with molecular methods ...........pag. 165
DIAGNOSI DI MALATTIE DA FITOPLASMI
PHYTOPLASMA DISEASE DETECTION
Pasquini G., A. Bertaccini, P.A. Bianco, P. Casati, E. Costantini, L. Ferretti, A.
Gentili, M. Martini, C. Marzachì, S. Palmano, S. Paltrinieri, M. Barba
Progetto ARNADIA: definizione di protocolli nazionali di diagnosi per ‘Candidatus
Phytoplasma mali’ e ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ / ARNADIA project:
definition of National diagnostic protocols for ‘Candidatus Phytoplasma mali’ and
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ ..............................................................pag. 171
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
CULTIVATION OF SEVERAL PHYTOPLASMAS FROM A
MICROPROPAGATED PLANT COLLECTION
N. Contaldo1, A. Bertaccini1, S. Paltrinieri1, D. Windsor2, H. Windsor2
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
Mycoplasma Experience - Reigate, UK
1
E-mail: [email protected] and [email protected]
Introduction
The recognition that certain plant diseases were associated with mycoplasmalike structures in the sieve-tubes was first reported by Doi and coworkers in 1967
who extended this observation by confirming possible disease causation, and their
similarity to mycoplasmas, by showing that disease symptoms could be ameliorated
by treatment with tetracycline (Ishiie et al., 1967).
Hitherto, these diseases - referred to as the aster yellows group - had been thought to be
caused by viruses. In animals and humans, mycoplasma infections had similarly often
been regarded as viral in nature due partly to their filterability through membranes
of small pore size but also due to the inability to culture the infectious organism in
common bacteriological media.
Many workers, mainly plant pathologists rather than mycoplasmologists, took up the
challenge to culture these organisms. An early outcome of this effort was the culture
of spiroplasmas – microorganisms derived from insects capable of causing plant
diseases following infection of the sieve tubes. This distinct group of organisms grew
readily in mycoplasma media formulations whereas the mycoplasma-like objects
(phytoplasmas) did not and a possible reason was that a closer alignment of media
to sieve-tube sap composition was required. Morphologically the two groups were
quite distinct, spiroplasmas having a spiral structure as the name suggests whereas
phytoplasmas were generally pleomorphic.
Some reports of successful phytoplasma culture were published (Lombardo and
Pignattelli, 1970; Lin et al., 1970; Giannotti and Vago, 1971; Ghosh et al., 1975)
but none proved repeatable and as the years of failure increased, hope of cultivation
decreased to such an extent that some plant workers came to consider that phytoplasmas
were indeed uncultivable (reviewed in Maramorosch, 2011).
Over forty years had elapsed since Doi’s publication but there were workers who
believed culture to be possible and a collaboration was initiated in 2008 between
Bologna University and Mycoplasma Experience. Early success was definitely not
anticipated and a lengthy process of medium modification/alignment to sieve-tube sap
composition was envisaged.
13
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Materials and methods
The collaboration started with routine mycoplasma liquid and solid media (lacking
thallium acetate) being sent to Bologna for isolation attempts from the micropropagated plant collection infected with phytoplasmas. Several lots of media were
sent to Bologna and before any modifications were made to the formulation, evidence
of phytoplasma cultivation was obtained (Bertaccini et al., 2010).
Sliced midribs, leaf stalks and stems from infected and healthy micropropagated
shoots were inoculated into 2 ml volumes of liquid medium and incubated at 26°C.
The broth culture inoculated with some “stolbur” phytoplasma strain (Contaldo
et al., 2012) was seen to have a strong acid colour change (yellow as phenol
red is the pH indicator) after about 1 to 9 months incubation. The colour change
was passaged in fresh liquid medium and the colonies produced on Mycoplasma
Experience solid medium were in-keeping with the size and overall shape of
mycoplasma colonies.
Several other apparent successful isolations did show that, however surprising, culture
of phytoplasmas was a reasonable interpretation of the evidence, so it was important
to repeat this work in UK laboratories.
Phytoplasma infected micropropagated plants were accordingly transferred and
culture was repeated. So, despite many failures over the years, why has this effort
succeeded with a medium that supported animal mycoplasmas? Here is a list of
necessary requirements for phytoplasma cultivation.
1. Plant tissue selected for isolation must contain viable phytoplasmas.
2. Release from the plant tissue of viable phytoplasmas.
Disruption of whole plants could release factors inhibitory to growth.
Release of phytoplasmas must be achieved from the sieve-tubes in the presence of
sieve-tube sap coagulation mechanisms to prevent loss on trauma.
3. Culture media and temperature must be suitable to support growth of the
phytoplasma species infecting the chosen plant.
Where solid media are chosen for isolation attempts, the atmosphere must also be
considered.
4. The incubation period must be of sufficient time to allow evidence of phytoplasma
growth to manifest itself.
5. The observer must be able to recognize elements of microbial growth if it occurs.
This is not always straight forward and time-consuming inspections of solid media
may be required.
Inadequacy on any of these points would result in failure so there are many reasons,
apart from a suitable medium, that could be responsible for previous failures. It is
quite possible that isolations have been made but not recognized as such, or not
suitably subcultured for isolation to be confirmed.
PCR amplification using phytoplasma specific primers (Gibb et al., 1995; Gundersen
and Lee, 1996; Lee et al., 1994; 1995) under previously described conditions (Schaff
et al., 1992; Lee et al., 1998) confirmed that the colonies were indeed identical to
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
the phytoplasmas that were initially transferred to the agar plates. Identification
using RFLP analysis and direct sequencing of selected amplicons confirmed
phytoplasma identity.
Results and discussion
Phytoplasmas reveal their presence by turning the medium acid (yellow) and this
can often become strongly acid overnight. Endosymbionts, if present, can also
cause strong acid colour changes, but on plating these organisms produce large,
spreading colonies that cover the entire plate on continued incubation. Filtration of
acid broth cultures through 0.8 µm filters can sometimes exclude the endosymbionts
whilst allowing through the phytoplasmas. The incubation time required before a
phytoplasma induced colour change occurs, as demonstrated by plating and colony
development, is extremely variable.
Colonies are conveniently detected by observing plates at an overall magnification of
X25 with colonial growth commonly occurring in three to seven days.
Storage of cultures at -70°C has resulted in stable counts so far – mycoplasma suspensions
are stable for tens of years at -70°C (death occurs within months at -20°C). Inactivation
of phytoplasmas, like mycoplasmas, occurs at temperatures around 50°C to 60°C.
Besides the initial seven phytoplasmas (Contaldo et al., 2012), five additional strains
were grown: potato witches’ broom (PWB, ribosomal group 16SrVI-A), witches’
broom disease of lime (WBDL, ribosomal group 16SrII-B), peach X disease (CX,
ribosomal group 16SrIII-A), clover phyllody England (KVE, ribosomal group
16SrI-C), Pichris echioides yellows (PEY, ribosomal group 16SrIX-C). Because PCR
confirmation of these latter phytoplasmas is still in progress, they should be regarded
as preliminary results. Additional types of phytoplasmas are in the initial isolation
stage, but it appears that all the available phytoplasma strains can be cultured.
Contrary to the prevailing dogma in plant pathology, therefore, phytoplasmas, like
mycoplasmas, can indeed be grown independently from the host(s). The commercial
medium used for phytoplasma isolation and cultivation utilizes media available for
purchase at Phytoplasmas in vitro Ltd. (Reigate, UK), although their composition is
proprietary.
From the preliminary cultivation work a patent was submitted (Bertaccini et al., 2012)
to cover the commercial exploitation of the methodology. However, research carried
out for scientific purposes is not restricted by the patent. Another key point for in vitro
cultivation is that micropropagated periwinkle shoots infected with phytoplasmas
must be used for initial isolation. These can be obtained from the official collection
of phytoplasma strains in micropropagation (http://www.ipwgnet.org/collection.html)
and have been available since 1990 (Bertaccini et al., 1992).
A major advantage of the procedure is that it makes it possible to obtain a source of
phytoplasma cultures from different strains, which may then be compared in order to
improve understanding of these microorganisms and their mechanisms of pathogenesis.
Possible applications of phytoplasma cultivation include improvement of diagnostic
15
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
techniques by allowing the preparation of specific antisera and assessment of compounds/
biochemical agents for inhibition of phytoplasma growth. Selection and screening of
plants resistant to phytoplasma infection, as well as the study of the modes of colonization
by phytoplasmas of plant and insect vectors, are other possible applications.
As a consequence, strategies aiming to treat and/or prevent phytoplasma related plant
diseases could be better defined and more effective. In addition, faster production of
diagnostic reagents can be achieved, as well as a more detailed knowledge about basic
mechanisms that regulate the survival of phytoplasmas, which are among the smallest
known living organisms.
Key words: phytoplasmas, axenic growth, PCR/RFLP analyses, sequencing
Coltivazione di fitoplasmi in substrato axenico utilizzando ceppi mantenuti in
collezione mediante micropropagazione
Viene descritta la coltivazione in substrato axenico di diversi ceppi di fitoplasmi
ottenuta per la prima volta ed utilizzando materiale infetto mantenuto in
micropropagazione. Il successo di questa ricerca, dopo oltre 40 anni di tentativi, è
dovuto principalmente alla collaborazione fra l’Università di Bologna e l’azienda
inglese che produce substrati per la coltura dei micoplasmi patogeni per uomo ed
animali. Dopo tentativi preliminari che avevano fatto capire che i fitoplasmi erano in
grado di svilupparsi in maniera autonoma in substrato liquido, è stata messa a punto
una metodologia specifica per il prelievo e la coltivazione in substrati liquido e solido
che è stata poi brevettata. Fino ad ora è stato possibile ottenere colonie di 12 ceppi di
fitoplasmi e precisamente “stolbur”, ceppo STOL (gruppo ribosomico 16SrXII-A);
legno nero, ceppo CH-1 (gruppo ribosomico 16SrXII-A); “Chrysanthemym yellows”,
ceppo CY-TO (gruppo ribosomico 16SrI-B); “tomato big bud”, ceppo TBB (gruppo
ribosomico 16SII-D); “pear decline”, ceppo PD (gruppo ribosomico 16SrX-C);
“apple proliferation”, ceppo AP-15 (gruppo ribosomico 16SrX-A); “poinsettia
branching factor”, ceppo JR (gruppo ribosomico 16SrIII-J); “potato witches’
broom”, ceppo PWB (gruppo ribosomico 16SrVI-A); “witches’ broom disease of
lime”, ceppo WBDL (gruppo ribosomico 16SrII-B), “peach X disease”, ceppo CX
(gruppo ribosomico 16SrIII-A), “clover phyllody”, ceppo KVE (gruppo ribosomico
16SrI-C) e “Pichris echioides yellows”, ceppo PEY (gruppo ribosomico 16SrIX-C).
Da quanto fatto si ipotizza che tutti i fitoplasmi possano essere coltivati su questo
substrato o su sue varianti. La conferma dell’avvenuto isolamento viene ottenuta
mediante l’osservazione delle colonie al microscopio ottico a 25 ingrandimenti e
l’analisi dell’acido nucleico estratto dalle colonie seguita da saggio PCR. L’impiego
di “primers” ribosomici e non, specifici per i diversi fitoplasmi, seguita dall’analisi
RFLP e dal sequenziamento degli ampliconi ottenuti hanno confermato che non vi
sono rilevanti variazioni nelle sequenze studiate degli acidi nucleici rispetto ai ceppi
originali identificati nelle piante ospiti.
16
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Le ricadute a livello scientifico e pratico di questo lavoro vanno dalla possibilità di
soddisfare i postulati di Koch, chiarendo i ruolo di questi patogeni nelle malattie ad
essi associate, alle prospettive di produzione di specifici reagenti per kit diagnostici
di rapida e facile applicazione, fino allo studio di possibili resistenze ai diversi
patogeni.
Parole chiave: fitoplasmi, cultura axenica, analisi PCR/RFLP, sequenziamento
Lavori citati / References
Bertaccini a., r.e. Davis, i-M. Lee, 1992. In vitro micropropagation for maintenance
of mycoplasmalike organisms in infected plant tissues. Horticultural Science,
27(9), 1041-1043.
Bertaccini a., n. contaLDo, a. caLari, s. PaLtrinieri, H.M. WinDsor, D.
WinDsor, 2010. Preliminary results of axenic growth of phytoplasmas from
micropropagated infected periwinkle shoots. 18th Congress IOM, Chianciano
Terme, Italy abstr. P-147, page 153.
Bertaccini a., n. contaLDo, D.G. WinDsor, 2012. Method for culturing phytoplasma.
Pct/Ib2012/052965, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna Phytoplasmas In Vitro Ltd.
contaLDo n., a. Bertaccini, s. PaLtrinieri, H.M. WinDsor, D.G. WinDsor,
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18
NUOVE MALATTIE E
MALATTIE DA QUARANTENA
neW anD Quarantine
PHYtoPLasMa Diseases
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE DI ‘CANDIDATUS
PHYTOPLASMA PHOENICIUM’ IN PIANTE SPONTANEE
PRESENTI IN FRUTTETI DEL LIBANO
P. Casati1, Y. Abou-Jawdah2, A. Cominetti1, F. Quaglino1, E. Choueiri3,
M. Molino Lova4, R. Tedeschi5, S. Prati1, L. Picciau5, A. Alma5, P.A. Bianco1
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia, Università degli Studi di Milano,
Via Celoria 2, 20133 Milano
2
Faculty of Agricultural and Food Sciences (FAFS), American University of Beirut,
PO Box 11-0236, Beirut, Lebanon
3
Lebanese Agricultural Research Institute, Tal Amara, Rayak,
PO Box 287, Zahlé, Lebanon
4
AVSI Lebanon, Rue St. Fawka, Centre Jean Paul II, 1200 Jounieh Ghadir, Lebanon
5
DISAFA, Università degli Studi di Torino– via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il mandorlo rappresenta una delle principali colture arboree in Libano. Durante gli
ultimi dieci anni, la comparsa di una malattia denominata “almond witches’ broom”
(AlmWB) ha portato al suo rapido declino nelle regioni di maggiore produzione
(Choueri et al., 2001; Abou-Jawdah et al., 2002). Questa malattia, in tempi recenti,
ha interessato anche peschi e nettarine (Abou-Jawdah et al., 2009). Fitoplasmi
della specie ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’, gruppo tassonomico 16SrIX
(sottogruppi 16SrIX-B, -D, -F, -G), sono stati individuati in piante infette (Molino
Lova et al., 2011; Lee et al., 2012). Al fine di chiarire alcuni aspetti dell’epidemiologia
di AlmWB, sono state condotte indagini per individuare altri ospiti del patogeno tra la
flora spontanea presente nei frutteti.
Materiali e metodi
Durante l’autunno 2011 e la primavera 2012, sono state campionate le specie
vegetali spontanee presenti in aree pilota del nord e sud del Libano, dove sono state
segnalate piante di mandorlo, pesco e nettarine con sintomi di AlmWB. Sono stati
raccolti 521 campioni da piante appartenenti a differenti specie. I DNA estratti dai
campioni vegetali sono stati analizzati mediante un nuovo saggio diagnostico di
“real time” PCR (qPCR), basato sull’impiego della coppia di “primers” ALW-F2/
21
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
ALW-R2 (Abou-Jawdah et al., 2003) e dell’intercalante Sybr® Green. La miscela
di reazione era costituita da Master Mix 1X Kapa Sybr® Fast qPCR e dai “primers”
alla concentrazione finale di 0,4 mM. Alla fine di ogni ciclo di amplificazione è stata
determinata la curva di dissociazione per ciascun campione; inoltre la specificità
del frammento amplificato è stata verificata mediante corsa elettroforetica su gel di
agarosio. In ciascun esperimento sono stati inseriti controlli positivi (DNA estratto da
mandorli infetti) e negativi (DNA proveniente da mandorli sani e da vinche infette da
fitoplasmi appartenenti a gruppi tassonomici diversi da 16SrIX, e campioni in cui non
è stato inserito DNA).
Risultati e discussione
Durante i sopralluoghi effettuati sono stati raccolti numerosi campioni appartenenti
a 76 specie. L’indagine ha evidenziato una diversa distribuzione delle piante
spontanee tra il nord e il sud del Paese. Il saggio qPCR è risultato un buon metodo
diagnostico in quanto specifico per i fitoplasmi del gruppo 16SrIX. Tale dato
è stato confermato sia dalla curva di dissociazione eseguita dopo ogni ciclo di
amplificazione sia dalla corsa elettroforetica effettuata con i frammenti ottenuti
dalla reazione di qPCR. Sono stati ritenuti positivi unicamente i campioni che
mostravano una Tm uguale a quella del controllo positivo inserito nel saggio e un
amplificato delle dimensioni attese (390 bp). I dati acquisiti mostrano che le piante
spontanee infette da fitoplasmi del gruppo 16SrIX sono 39 nelle regioni al nord del
Libano e 25 nel sud. Le piante spontanee positive al saggio qPCR appartengono alle
seguenti specie: Quercus sp., Smilax aspera, Clematis sp., Osyris alba, Rahaia sp.,
Asparagus sp., Solanum nigrum, Allium sp., Polypodiales sp., Geranium purpureum
e Malva silvestris al nord, e Amaranthus sp., Bryonia multiflora, Pistacia palaestina,
Quercus sp., Rhamnus punctata, Inula viscosa, Scolymus maculatus, Convolvulus
sp., Euphorbia sp., Lactuca serriola, Sinapsis arvensis, Anthemis sp., Medicago sp.
e Onobrychis sp. al sud.
I dati preliminari non includono l’identificazione del sottogruppo di appartenenza
dei fitoplasmi rilevati nelle piante spontanee, ma confermano la grande diffusione di
questi patogeni (Bertaccini e Duduk, 2011).
I risultati ottenuti, una volta confermati e identificato il sottogruppo di appartenenza dei
fitoplasmi, saranno di notevole aiuto per l’impostazione di piani per il contenimento
della malattia e di gestione dei trattamenti insetticidi ed erbicidi, intervenendo con
criteri di razionalità e sostenibilità ambientale sia sul vettore sia sugli eventuali ospiti
alternativi del fitoplasma.
Parole chiave: “almond witches’ broom”, 16SrIX, diagnostica
22
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Molecular identification of ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in
spontaneous plants in fruit orchards in Lebanon
In the last decades, almond witches’ broom (AlmWB) disease caused severe crop
losses of almond, peach and nectarine in Lebanon. Even the agents associated with
AlmWB have been identified as phytoplasma strains of ‘Ca. P. phoenicium’ (subgroup
16SrIX), no accurate information are available about the AlmWB epidemiology such
as insect vector(s) and additional phytoplasma plant hosts. In the present study, the
spontaneous plant species in Lebanese fruit orchards were monitored and real time
PCR (qPCR) assays were performed for detecting the presence of the pathogen. During
the survey carried out in autumn 2011 and spring 2012, 76 spontaneous plant species,
differently distributed in orchards of North and South Lebanon, were identified, and
521 leaf samples were collected for molecular analyses. Real time PCR assays revealed
the presence of AlmWB phytoplasmas in 64 out of 521 samples (39 in North and 25 in
South Lebanon) collected from the plant species Quercus sp., Smilax aspera, Clematis
sp., Osyris alba, Rahaia sp., Asparagus sp., Solanum nigrum, Allium sp., Polypodiales
sp., Geranium purpureum, and Malva silvestris in North Lebanon orchards, and the
plant species Amaranthus sp., Bryonia multiflora, Pistacia palaestina, Quercus sp.,
Rhamnus punctata, Inula viscosa, Scolymus maculatus, Convolvulus sp., Euphorbia sp.,
Lactuca serriola, Sinapsis arvensis, Anthemis sp., Medicago sp., and Onobrychis sp.
in South Lebanon orchards. These data confirmed the spread of 16SrIX phytoplasmas
in a wide range of host plants. Further analyses will be carried out for determining the
subgroup(s) of phytoplasma strains identified in these spontaneous plants. Information
from present and future studies will be crucial for developing novel environmentallyfriendly strategies to manage the AlmWB phytoplasma rapid spread.
Key words: almond witches’ broom, 16SrIX, diagnostic
Lavori citati / References
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24
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
INDAGINE SULLA PRESENZA DI FITOPLASMI IN
ACTINIDIA SPP. IN ITALIA CENTRO-SETTENTRIONALE
S. Paltrinieri1, M. Piergiacomi1, N. Contaldo1, F.R. De Salvador2, A. Bertaccini1
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum – Università di Bologna
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
CRA - Centro di Ricerca per la Frutticoltura, CRA-FRU – via Fioranello, 52, 00156 Roma
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Negli ultimi anni, a livello mondiale, si è verificata una rapida diffusione del cancro
batterico del kiwi (Psa) in tutti gli areali di coltivazione dell’actinidia. Anche in Italia
si è assistito ad una maggior sensibilizzazione nei confronti del problema da parte
dei produttori e del mondo scientifico e, dal 2011, in alcuni frutteti situati in zone
particolarmente vocate per la coltivazione del kiwi, sono stati organizzati sopralluoghi
per monitorare la presenza di Psa. Nel corso di queste indagini sono stati osservati
alcuni quadri sintomatologici diversi da quelli tipicamente riferibili alla batteriosi
e riconducibili alla possibile presenza di fitoplasmi. Alcune delle analisi effettuate
per verificare la presenza di Psa sono risultate negative, spingendo a verificare la
presenza di eventuali altri patogeni quali i fitoplasmi. La prima segnalazione di questi
patogeni in actinidia risale al 1999 (Marzachì et al., 1999) quando venne segnalato
il gruppo 16SrXII-A (“stolbur”) in campioni di actinidia provenienti dalla Liguria.
Recentemente è stata individuata la presenza di fitoplasmi diversi in piantine di
actinidia che presentavano sintomatologie tipiche quali arrossamenti fogliari
(Bertaccini et al., 2011).
Materiali e metodi
L’indagine è stata condotta su 71 campioni provenienti da tre fra le principali aree
di coltivazione di actinidia in Italia: Emilia-Romagna, Veneto e Lazio. Il materiale
vegetale è stato prelevato nel periodo di aprile-maggio in actinidieti in cui era stata
riscontrata anche la presenza di Psa; i campioni sono stati prelevati sia da piante
asintomatiche che da piante che mostravano sintomi tipicamente associati alla
presenza di fitoplasmi: foglie di consistenza cartacea con evidenti ingiallimenti e
arrossamenti, arrotolamento della lamina verso il basso e, in alcuni casi, presenza di
ricacci dalla base delle piante. Le piante campionate appartenevano alle principali
cultivar di interesse economico/agronomico quali Jintao, Hayward e Belen.
25
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Per verificare la presenza di fitoplasmi si è ricorsi all’estrazione dell’acido nucleico
utilizzando un protocollo che prevede l’impiego di cloroformio/fenolo (Prince et
al., 1993) e successivamente sono stati effettuati saggi di PCR diretta e “nested”
utilizzando i “primer” P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), R16F2/
R2 (Lee et al., 1995) e 16R758f/16R1232r (=M1/M2) (Gibb et al., 1995). Per confermare i
risultati ottenuti sono stati impiegati anche i “primers” gruppo specifici R16(I)F1/R1 e
R16(X)F1/R1 (Lee et al., 1994). L’identificazione dei fitoplasmi individuati è avvenuta
mediante analisi RFLP utilizzando gli enzimi di restrizione Tru1I, RsaI, SspI e HhaI.
Risultati e discussione
Dalle analisi molecolari eseguite è emersa in tutte e tre le zone campionate la
presenza di fitoplasmi. Il DNA ottenuto dall’estrazione è risultato sempre molto
colloso e caratterizzato da elevata presenza di impurità, probabilmente attribuibile
ad una elevata percentuale di polifenoli. Questa caratteristica, tipica del DNA estratto
da fruttiferi, in kiwi è risultata particolarmente accentuata, creando problemi nella
preparazione delle diluizioni necessarie per le analisi molecolari. A conferma delle
difficoltà di individuazione dei fitoplasmi nei tessuti di kiwi, probabilmente correlabili
alle difficoltà tecniche dovute alle caratteristiche del DNA, i campioni sono risultati
positivi sempre in seconda amplificazione. Dalle analisi sono risultate positive più
della metà delle piante saggiate e sono stati individuati, in infezione singola o mista,
i seguenti fitoplasmi: 25% 16SrI-B (giallume dell’astro), 11% 16SrX-A (scopazzi del
melo), 6% 16SrXII-A (“stolbur”), 11% infezione mista di 16SrI+16SrX, 4% infezione
mista di 16SrX+16SrXII-A, 2% infezione mista di 16SrI+16SrXII-A. Le varietà di
kiwi a polpa gialla sono risultate quelle maggiormente suscettibili rispetto quelle a
polpa verde, in quanto positive nel 75% dei casi esaminati.
Non sono stati ancora studiati insetti vettori di fitoplasmi in actinidia però l’elevata
presenza di piante infette in alcuni degli impianti sottoposti ad indagine potrebbe essere
riconducibile al materiale utilizzato nella propagazione vegetativa, essendo noto che
questi procarioti si mantengono nel materiale micropropagato che non sia sottoposto a
drastiche metodiche di risanamento mediante coltura di meristemi (Bertaccini, 2007).
E’ altresì estremamente diffusa infatti la pratica di utilizzare materiale micropropagato
di kiwi per l’impianto di vivai e la diffusione nel mondo di materiali di propagazione.
I risultati di queste indagini rendono necessarie ulteriori approfondimenti per
conoscere meglio la diffusione dei fitoplasmi nelle coltivazioni di kiwi e per verificare
la possibilità di un’eventuale correlazione tra la loro presenza e la diffusione epidemica
del nuovo ceppo di Psa (Scortichini et al., 2012; Biondi et al., 2013). Infatti è noto
che piante debilitate dalla presenza di stress biotici quali fitoplasmi e/o virus risultano
maggiormente suscettibili alle infezioni di altri patogeni.
Parole chiave: kiwi, fitoplasmi, Psa, PCR/RFLP, identificazione patogeni
26
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Survey to verify phytoplasma presence in Actinidia spp. in North-Central Italy
During surveys carried out to monitor the kiwi plants showing severe canker symptoms
caused by Pseudomonas syringae pv actinidiae (Psa) phytoplasmas were also detected.
Further surveys were then carried out in kiwi plantations located in North and Central
Italy. Analyses were carried out on 71 samples collected in Emilia-Romagna, Veneto
and Lazio regions from plants showing symptoms of leaf reddening and downward
curling and crinkling; the green variety (Hayward) show also leaf reddening while
in Jintao (yellow) there was a general plant decline and yellowing of the leaves.
Scattered plants also showed other symptoms such as irregular shape of non lignified
branches and reddening shoot proliferation from the rootstock. These samples showed
negative results for Psa presence, while phytoplasma presence was confirmed in the
majority of tested samples. Yellow varieties resulted to be more susceptible than green
varieties to phytoplasma presence, resulting positive in the 75% of tested samples. In
particular the 25% of positive samples were infected by 16SrI-B (aster yellows), the
11% by 16SrX-A (apple proliferation), the 6% by 16SrXII-A (“stolbur”). Moreover
the 11% of the positive samples presented mixed infection by 16SrI+16SrX, the 4%
by 16SrX+16SrXII-A, the 2% by 16SrI+16SrXII-A. No studies related to possible
vector of phytoplasmas to kiwi plants were carried out, but there is the possibility of
infection by micropropagation techniques that are massively used to produce nursery
materials for all varieties. These results confirm preliminary reports and further work
is in progress to evaluate possible interaction of the two prokaryotes in infected plants
and the phytoplasma influence in the epidemic of canker disease.
Key words: kiwi, phytoplasmas, Psa, PCR/RFLP, pathogen identification
Lavori citati / References
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA E MOLECOLARE DI
UN FITOPLASMA ASSOCIATO ALLA FILLODIA DELLA
CICORIA NEL NORD-EST DELL’ITALIA
P. Ermacora, F. Ferrini, M. Martini, F. Pavan, A. Loschi, N. Loi, S. Moruzzi,
R. Osler
DISA - Università di Udine, Via delle Scienze, 206, 33100 Udine, Italy
E-mail: [email protected]
Introduzione
Nel corso delle estati 2011 e 2012 sono state rinvenute in comune di Carlino (UD)
piante di cicoria (Cichorium intybus L., 1753) che presentavano alterazioni a
carico degli organi fiorali quali virescenza e fillodia, e proliferazione delle gemme
ascellari. La forte incidenza della malattia in un’areale ristretto faceva ipotizzare la
presenza di vettori attivi e l’analisi molecolare sul gene 16S rDNA di alcuni campioni
metteva in evidenza la presenza di un fitoplasma appartenente al gruppo “pigeon pea
witches’ broom” (16SrIX) (Martini et al., 2012). Lo scopo del lavoro è stato quello
di caratterizzare dal punto di vista molecolare e biologico il fitoplasma associato
alla fillodia della cicoria, classificandolo e sviluppando sistemi di diagnosi specifici
oltre che definire la gamma di piante ospiti del patogeno e studiarne la trasmissione
mediante vettori.
Materiali e metodi
Nel corso del 2011-2012 è stato condotto un monitoraggio capillare nel sito di Carlino
volto a definire la gamma di piante ospiti del fitoplasma associato alla cicoria e ed
effettuare quindi la sua caratterizzazione biologica. A partire da maggio sono state
effettuate, a cadenza bisettimanale, visite in campo per il monitoraggio delle specie
vegetali sintomatiche e per catture di insetti auchenorrinchi. Gli insetti catturati sono
stati identificati e quelli appartenenti a specie tipicamente floemomize sono stati esposti
a piante di cicoria e vinca sane allevate in serra. Adulti di Neoaliturus fenestratus sono
stati raccolti anche in località esenti dalla malattia ed allevati in ambiente controllato
in serra ottenendo così una colonia sana utile per caratterizzare alcuni parametri di
trasmissione della fitoplasmosi. Neanidi sane sono state poste ad acquisire su una
pianta di cicoria sintomatica per 48 ore dopo di che sono state poste su un gruppo di
tre piante di cicoria sane sostituendo le piante ogni 7 giorni per un totale di 15 piante
esposte durante un periodo di 5 settimane.
29
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
La diagnosi del fitoplasma nelle piante erbacee sintomatiche e in insetti è stata
condotta con PCR diretta o “nested” su geni per le proteine ribosomiche (rp) usando
“primer” specifici disegnati nel corso del presente lavoro e “primers” semi-universali
per i fitoplasmi (Martini et al., 2007). La caratterizzazione molecolare mediante PCRRFLP, il sequenziamento e l’analisi filogenetica di alcuni ceppi di fitoplasma della
fillodia della cicoria e di altre piante erbacee sintomatiche è stata condotta sul gene
16S rDNA e sui geni più variabili rp e secY (Lee et al., 2012).
Risultati e discussione
Tra le specie vegetali raccolte ed analizzate sono risultate positive alla presenza di
fitoplasmi: Cichorium spp., Erigeron annuus, Vicia sativa e Convolvolus arvensis. Gli
insetti catturati in campo con maggior frequenza sono risultati essere: N. fenestratus,
Aphrodes makarovi., Psammotettix spp., Anaceratagallia ribauti. Dalle analisi
molecolari sono risultati positivi diversi adulti di Neoaliturus fenestratus raccolti
a maggio-giugno ed a fine settembre-ottobre mentre quelli raccolti in estate sono
risultati negativi. La sopravvivenza di N. fenestratus in cattività su cicoria è stata
buona e durante il periodo estivo si sono susseguite diverse generazioni a cadenza
pressoché mensile mentre la forzatura dell’insetto su vinca ha evidenziato una sua
sopravvivenza media di 15 giorni senza il completamento del ciclo. Tale forzatura su
vinca ha portato alla trasmissione del fitoplasma alla pianta indicatrice, con lo sviluppo,
dopo circa due mesi di sintomi di giallumi, virescenza e fillodia. La caratterizzazione
dei parametri di trasmissione del fitoplasma mediante N. fenestratus ha evidenziato
che le fasi giovanili dell’insetto sono in grado, con un’alimentazione di 48 ore su
ospite infetto, di acquisire il fitoplasma; il periodo di latenza nel vettore è risultato
di circa 28 giorni (alle condizioni di temperatura di massima 26°C e minima 22°C),
evidenziando quindi il ruolo degli adulti nella diffusione della malattia.
Le analisi PCR/RFLP, delle sequenze e filogenetiche hanno dimostrato che tutti i ceppi
analizzati erano quasi identici tra di loro con similarità di sequenza molto elevate
(99,7-100%) in tutti e tre i geni, che sono risultati strettamente correlati ai ceppi PEY
(“Picris echioides yellows”) e NaxY (“Naxos periwinkle virescente”) e come questi
appartenenti ai sottogruppi 16SrIX-C, rp(IX)-C1 e secY(IX)-C1. In conclusione, il
presente lavoro ha evidenziato la diffusione epidemica, seppure ancora geograficamente
limitata, di una fitoplasmosi mai segnalata in precedenza nel nord-est Italia associata
ad un fitoplasma del sottogruppo 16SrIX-C, a cui appartengono fitoplasmi riportati
soprattutto al sud, in Basilicata e Sicilia, regioni a clima mediterraneo. Saranno oggetto
di approfondimenti futuri il monitoraggio sulla diffusione della malattia e lo studio di
eventuali correlazioni con i cambiamenti climatici.
Parole chiave: fillodia della cicoria, Neoaliturus fenestratus, caratterizzazione
molecolare, caratterizzazione biologica
30
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Biological and molecular characterization of a phytoplasma associated with
chicory phyllody in North-East Italy
Phytoplasma disease symptoms were observed on chicory in a restricted area
near Carlino (North East Italy). Preliminary analyses demonstrated the presence
of a phytoplasma belonging to pigeon pea witches’ broom (16SrIX) group.
Aims of this study were to characterize the phytoplasma associated with chicory
phyllody, to develop specific diagnostic tools as well as to define the host range
of the pathogen and its natural vectors. During 2011-2012 an extensive survey
was conducted starting from May by collection of symptomatic herbaceous plants
and Auchenorrincha every two weeks. The captured insects were identified and
exposed to test plants of chicory and periwinkle. Healthy Neoliturus fenestratus
insects were used to characterize some of the parameters of phytoplasma
transmission. The phytoplasmas detection in herbaceous plants and in individual
insects was carried with direct or nested PCR on ribosomal proteins (rp) genes.
Molecular characterization by PCR-RFLP, sequencing and phylogenetic analysis
of phytoplasma strains was conducted on 16S rDNA, rp and secY genes.
Among the collected plants Chicorium spp., Erigeron annuus, Vicia sativa
and Convolvulus arvensis were positive. The insects captured in the field were
mostly: N. fenestratus, Aphrodes makarovi, Psammotettix spp., Anaceratagallia
ribauti. Molecular analysis were positive for several adults of N. fenestratus. N.
fenestratus was reared in greenhouse on chicory. Young stages of the insect were
able to acquire the phytoplasma feeding 48 hours on infected chicory; the latent
period was approximately 28 days. Molecular characterization showed that all the
phytoplasma strains were nearly identical (99.7-100% similarity) on the three genes
and were closely related to 16SrIX-C strains PEY (Picris echioides yellows) and
NaxY (Naxos periwinkle virescence). This epidemic on chicory in Northern Italy
associated with a 16SrIX-C phytoplasmas is the first in this areas since previous
reports in Italy were mostly in Mediterranean regions.
Key words: chicory phyllody, Neoaliturus fenestratus, molecular characterization,
biological characterization
Lavori citati / References
LEE I-M., K.D. Bottner-Parker, Y. ZHao, A. Bertaccini, R.E. Davis, 2012.
Differentiation and classification of phytoplasmas in the pigeon pea witches’
broom group (16SrIX): an update based on multiple gene sequence analysis.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62,
2279-2285.
31
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Martini M., I-M. Lee, K. D. Bottner, Y. ZHao, S. Botti, A. Bertaccini, N.A.
Harrison, L. Carraro, C. Marcone, A.J. KHan, R. OsLer, 2007. Ribosomal
protein gene-based phylogeny for finer differentiation and classification
of phytoplasmas. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 57, 2037-2051.
Martini M., P. ErMacora, S. MoruZZi, N. Loi, R. OsLer, 2012. Molecular
characterization of phytoplasma strains associated with epidemics of chicory
phyllody. Journal of Plant Pathology, 4(supplement), doi:10.4454/JPP.
V95I4SUP.006.
32
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
RILEVAMENTO DI FLAVESCENZA DORATA CEPPO FD-D
IN AREALI VITICOLI DELL’ISOLA DI ISCHIA
A. Gentili1, L. Ferretti1, E. Costantini1, A. Zoina2, L. Cozzolino2, P. Spigno3,
G. Pasquini1
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura - Centro di Ricerca
per la Patologia vegetale, CRA-PAV - via C.G. Bertero, 22, 00156 Roma
2
ArBoPaVe Sezione Patologia Vegetale, Università di Napoli, via Università 100,
80055 Portici, Napoli
3
Laboratorio di Patologia Vegetale, Servizio Fitosanitario Regione Campania,
via Don Bosco, 9E, Napoli
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
In Italia la diffusione di flavescenza dorata (FD) è limitata agli areali viticoli
settentrionali, ad eccezione di occasionali rilevamenti in Toscana (Bertaccini et al.,
2003), Marche (Credi et al., 2002) ed Umbria (Natalini et al., 2005). Negli areali
viticoli del centro-sud Italia i monitoraggi effettuati hanno sempre individuato la sola
presenza del fitoplasma “stolbur” (16SrXII-A), agente di legno nero (LN), in viti con
sintomi riferibili ai giallumi.
Il vettore di FD, Scaphoideus titanus è stato invece identificato in alcune località di
diverse regioni del centro-sud: Lazio, Abruzzo, Campania e Basilicata (Viggiani et al.,
2002, 2004; Romanazzi et al., 2007; Bagnoli et al., 2008), dove probabilmente l’insetto
è arrivato sfarfallando da uova trasportate su materiale propagativo di vite e si è ormai
insediato, pur non essendo mai stato associato a nuovi focolai di infezione da FD.
Nel 2011, nell’ambito dei monitoraggi effettuati dal Servizio Fitosanitario Regionale della
Campania in ottemperanza al Decreto di Lotta Obbligatoria per flavescenza dorata e per il
suo vettore, un focolaio di FD è stato individuato in alcuni vigneti localizzati sull’isola di
Ischia, dove sono stati catturati in seguito anche individui di S. titanus (Griffo et al., 2011).
In questo lavoro viene riportata la caratterizzazione molecolare del ceppo di FD
individuato sull’isola di Ischia, tramite analisi sul gene 16S rDNA e sul gene secY
(FD9). La tipizzazione del fitoplasma è stata effettuata nel 2012 su campioni di vite
sintomatici prelevati negli stessi impianti in cui l’anno precedente era stata rilevata la
presenza di FD ed in impianti adiacenti.
Materiali e metodi
Dieci campioni da piante di vite sintomatiche appartenenti a varietà locali e nazionali
(Grenache, Biancolella e Shiraz) sono stati raccolti nel Settembre 2012 da 4 vigneti
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
commerciali di 9-16 anni di età localizzati in due aree della parte sud-occidentale
dell’isola di Ischia (Comune Forio). In questo areale la presenza di sintomi di giallumi
era stata già osservata a partire dal 2009, ma solo nel 2011 era stata accertata la
presenza di un focolaio di FD.
I campioni sono stati sottoposti ad una prima analisi molecolare mediante PCR diretta
effettuata con i “primers” universali P1/P7, seguita da due PCR “nested” gruppospecifiche, effettuate con le coppie di “primers” R16(V)F1/R1 and R16(I)F1/R1 (Lee
et al., 1994). Gli ampliconi ottenuti dalla PCR “nested” effettuata con i primers R16(V)
F1/R1 sono stati sottoposti a digestione enzimatica con l’endonucleasi BfaI e successiva
analisi dei frammenti di restrizione.
Per determinare il sottogruppo di appartenenza degli isolati risultati positivi alla presenza
di FD, gli ampliconi ottenuti da PCR diretta con i “primers” P1/P7 sono stati ulteriormente
amplificati con i “primers” 16R758f (Gibb et al., 1995) e M23SR1804r (Padovan et al.,
1995) e sottoposti ad analisi di restrizione mediante digestione enzimatica con TaqI.
Infine, tutti gli isolati sono stati analizzati sul frammento di DNA non-ribosomico FD9,
mediante amplificazione diretta e “nested” con le coppie di primers FD9f2 (Angelini
et al., 2001)/FD9r (Daire et al., 1997) e FD9f3/FD9r2 (Angelini et al., 2001), seguita
da analisi di restrizione mediante digestione con le endonucleasi AluI e MseI.
Gli amplificati dei frammenti FD9 sono stati sequenziati e le sequenze nucleotidiche
ottenute sono state confrontate in banca dati mediante software BLAST.
I campioni di riferimento inseriti nei protocolli di PCR sono stati i seguenti: viti infette
da FD-C e FD-D (Regione Veneto, 16SrV-C e 16SrV-D), vinche infette da EY (“Elm
yellows”, 16SrV-A) e vinche infette da SAY (“severe aster yellows”, 16SrI-B) (CRAPAV) e pomodoro infetto da STOL (“stolbur”, 16SrXII-A) (CRA-PAV).
Risultati e discussione
Tutti i campioni di vite sintomatici hanno mostrato una banda delle dimensioni
attese nella amplificazione PCR “nested” effettuata con i “primers” R16(V)F1/
R1, mentre nessuna banda di amplificazione si è evidenziata nella “nested” PCR
effettuata con i “primers” R16(I)F1/R1, escludendo la presenza nei campioni di
fitoplasmi riferibili ai giallumi della vite appartenenti ai gruppi 16SrI e 16SrXII.
L’analisi di restrizione dopo digestione enzimatica degli ampliconi ottenuti in PCR
“nested” R16(V)F1/R1 con l’enzima BfaI ha evidenziato in tutti i campioni profili
identici a quelli generati dai fitoplasmi di riferimento appartenenti ai sottogruppi
ribosomici 16SrV-C e 16SrV-D.
Tutti i campioni di vite analizzati hanno mostrato bande di amplificazione anche in
PCR “nested” effettuata con i “primers” 16R758f/M23SR1804r ed il profilo di restrizione,
ottenuto dopo digestione degli ampliconi con TaqI, ha evidenziato profili riferibili a
quello del controllo 16SrV-D in tutti i campioni saggiati.
La presenza di isolati di flavescenza dorata di tipo D è stata, infine, confermata anche
sul frammento non ribosomico FD9. L’analisi del profilo di restrizione ottenuto dopo
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
digestione enzimatica con AluI e MseI degli ampliconi ottenuti in PCR “nested” ha
evidenziato, infatti, nei campioni di vite un unico profilo per ogni enzima considerato,
identico a quello del controllo 16SrV-D.
Il ceppo di flavescenza dorata FD-D, associato con i primi focolai di infezione
identificati in Veneto negli anni ’90, è considerato un ceppo maggiormente virulento
rispetto a FD-C, almeno nei vigneti italiani, e sembra confinato agli areali italiani
settentrionali (Bertaccini et al., 2008). Considerando l’isolamento geografico
dell’isola di Ischia, l’introduzione del ceppo FD-D e del relativo vettore potrebbero
essere spiegati come risultato di un movimento a lunga distanza. La presenza del
vettore aumenta, comunque, il rischio di diffusione del fitoplasma sull’isola, con
un conseguente grave danno economico alla viticoltura locale. Le piante riscontrate
infette nel 2011 sono state prontamente eradicate, tuttavia nella stagione vegetativa
successiva nuove piante sintomatiche sono state individuate negli stessi areali.
D’altro canto, essendo questo nuovo focolaio localizzato in un area geograficamente
isolata, è certamente più facile il controllo da parte del Servizio Fitosanitario affinché
l’epidemia non comprometta anche la viticoltura regionale.
Parole chiave: FD, caratterizzazione molecolare, Campania, 16S, gene secY
Identification of “flavescence dorée” strain FD-D in viticultural areas of
Ischia island (Campania, Italy)
“Flavescence doreé” (FD) in Italy, where several major outbreaks of FD have occurred
in the past, is still mainly restricted to the Northern regions and is under mandatory
regulation. In 2011 the disease was recorded for the first time in Southern Italy, in
several vineyards located on the isle of Ischia (Campania). In order to determine the
FD strain infecting these grapevines, molecular investigations were carried out on
grapevine samples collected from several FD infected vineyards. The 16S rDNA/
spacer region and the FD9 non-ribosomal fragment (secY gene) were investigated
using a PCR/RFLP based method; a nucleotide sequence analysis of the FD9 amplified
fragments was also carried out. The RFLP profiles obtained from all the analyzed
samples showed the presence of FD-D phytoplasmas, on both 16S and secY regions.
Sequencing of the FD9 fragments showed a 99% nucleotide sequence identity among
the tested isolates and the various FD-D strains retrieved from the NCBI database.
Key words: FD, molecular characterization, South Italy, 16S, secY gene
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il lavoro è stato svolto nell’ambito del P.F. EUPHRESCO GRAFDEPI, finanziato
dal MiPAAF.
35
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
anGeLini e., D. cLair, M. BorGo, a. Bertaccini, e. BouDon-PaDieu, 2001. Flavescence
dorée in France and Italy. Occurrence of closely related phytoplasma isolates
and their near relationships to Palatinate grapevine yellows and an alder
yellows phytoplasma. Vitis, 40, 79-86.
BaGnoLi B., L. ferretti, v. triveLLone, L. nucciteLLi, G. PasQuini, 2008. Occurrence
of Scaphoideus titanus in Latium region. Petria, 18(2), 304-308.
Bertaccini a., e. anGeLini, P.a. Bianco, s. Botti, P. casati, G. Durante, L. fiLiPPin,
c. MarZacHì, D. Pacifico, s.PaLtrinieri, f. QuaGLino, 2008. Molecular
characterization of “Flavescence dorée” strains detected in Italy from 2004 to
2008. Petria, 18(2), 268-271.
Bertaccini a., s. Botti, a. tonoLa, c. MiLano, P. Braccini, a. sfaLaGna, 2003.
Identificazione di fitoplasmi di Flavescenza dorata in vigneti della Toscana.
L’informatore Agrario, 59(21), 65-67.
creDi r., f. terLiZZi, f. stiMiLLi, G. narDi, r. LaGnese, 2002. Flavescenza dorata
della vite nelle Marche. L’informatore Agrario, 58(22), 61-63.
Daire, X., D. cLair, J. Larrue, e. BouDon-PaDieu, 1997. Detection and differentiation
of grapevine yellows phytoplasmas belonging to elm yellows group and to
the stolbur subgroup by PCR amplification of non-ribosomal DNA. European
Journal of Plant Pathology, 103, 507-514.
GiBB k.s., a.c. PaDovan, B.D. MoGen, 1995. Studies on sweet potato little-leaf
phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in
Northern Australia. Phytopathology, 85, 169-174.
Griffo r., D. BencHi, a. BifuLco, G. PesaPane, 2011. Flavescenza dorata anche in
Campania. L’informatore Agrario, 44, 67.
Lee i-M., D.e. GunDersen, r.W. HaMMonD, r.e. Davis, 1994. Use of mycoplasmalike
organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to
detect mixed-MLO infections in a single host plant. Phytopathology, 84, 559-566.
nataLini G., c. santineLLi, c. PorcaccHia, 2005. Bilancio Fitosanitario 2004 Umbria.
Informatore Fitopatologico, 25(15), 49.
PaDovan a. c., k.s. GiBB, a. Bertaccini, M. viBio, r.G. BonfiGLioLi, P.a. MaGareY,
B.B. sears, 1995. Molecular detection of Australian grapevine yellows
phytoplasma and comparison with grapevine yellows phytoplasmas from Italy.
Australian Journal of Grape and Wine Research, 1, 25-31.
roManaZZi G., s. MuroLo, D. D’ascenZo, r. Di Giovanni, 2007. Nuove acquisizioni
sulla diffusione dei giallumi della vite in Abruzzo. Italus Hortus, 14, 253-256.
viGGiani G., 2002. Il vettore della Flavescenza dorata trovato in Basilicata.
L’Informatore agrario, 58(36), 59.
viGGiani G., 2004. Il vettore della Flavescenza dorata anche in Campania.
L’informatore Agrario, 60(18), 98.
36
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
INFEZIONE DA “STOLBUR” E VIRUS
DELL’AVVIZZIMENTO MACULATO DEL POMODORO
(TSWV) IN LUpINUS poLyphyLLUS
N. Contaldo1, A. Bertaccini1, G. Bozzano2, G. Parrella3, L. Cavicchi4,
M.G. Bellardi1
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
Cooperativa L’Ortofrutticola, Reg Masseretti 31, Fraz. Bastia, 17031 Albenga, Savona
3
Istituto per la Protezione delle Piante, CNR, via Università 133, 80055 Portici, Napoli
4
Plesso Didattico G. Scarabelli, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Ascari 17, 40026 Imola, Bologna
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Nel maggio 2012 in una coltivazione in vaso di lupino ornamentale (Lupinus polyphyllus
Lindt.; famiglia Fabaceae) della zona di Albenga (Savona) sono state notate numerose
piante caratterizzate da una grave sintomatologia sulle foglie tipicamente riferibile
all’infezione da Tospovirus: anulature concentriche clorotiche, rosso-arancio e/o
nerastre; i fiori apparivano leggermente screziati. Alcuni degli esemplari con sintomi
fogliari erano inoltre di taglia ridotta, gli steli fiorali erano vistosamente ripiegati “a
gomito” e le foglie più giovani rimanevano piccole e raggomitolate.
Materiali e metodi
Sono state svolte indagini virologiche al fine di verificare la presenza di Tospovirus
nelle piante con anulature concentriche sulle foglie applicando la tecnica sierologica
del “Lateral Flow Test” (LFT). Inoltre, sono state eseguite inoculazioni meccaniche
su piante di saggio appartenenti a diverse famiglie botaniche, fra cui Lamiaceae,
Fabaceae e Solanaceae. E’ stata quindi applicata, sull’RNA totale estratto da foglie
di lupino ornamentale sintomatico con il kit commerciale “E.Z.N.A. Plant RNA kit”
(Omega Bio-tek, USA), la tecnica molecolare rt-PCR utilizzando la coppia di inneschi
5’-GA(A/G)GAACATCTTCCTTTGG-3’ e 5’-CCTCTTCTTCTTCAACTGATC-3’
specifica del gene NSM della proteina di movimento (MP) del virus dell’avvizzimento
maculato del pomodoro (TSWV) (Finetti Sialer et al., 2002). Inoltre, nelle piante
infette da TSWV e caratterizzate anche da nanismo e ripiegamento dello stelo fiorale,
previa estrazione dell’acido nucleico mediante un metodo basato su cloroformio e
37
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
fenolo (Prince et al., 1993), è stata verificata la presenza di fitoplasmi applicando la
tecnica PCR con i “primers” universali P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991; Schneider et
al., 1995), seguita da PCR-“nested” con i “primers” R16(I)F1/R1 (Lee et al., 1994)
e da analisi RFLP effettuata utilizzando gli enzimi di restrizione TruI, TaqI e Tsp509I
(Fermentas, Vilnius, Lituania).
Risultati e discussione
Dalle analisi sierologiche eseguite applicando la tecnica LFT è risultato che in tutte le
piante con anulature concentriche sulle foglie era presente il virus dell’avvizzimento
maculato del pomodoro (TSWV) che è stato trasmesso con inoculazione meccanica
su specie erbacee fra cui basilico, fava e peperone (sintomi locali e sistemici di necrosi
ed avvizzimento) e fagiolino dall’occhio (anulature locali). L’identità del virus è stata
confermata anche mediante RT-PCR, impiegando per lo scopo “primers” specifici
per il gene NSM di TSWV. Tali “primers”, infatti, hanno prodotto, solo nei campioni
provenienti dalle piante con anulature clorotiche, un amplicone della lunghezza
attesa (670 bp). Due degli ampliconi ottenuti, provenienti da due piante sintomatiche
distinte, sono stati clonati e sequenziati alla MWG (Germania). Le sequenze ottenute
sono risultate 100% identiche fra loro, mentre confrontandole con le sequenze di
TSWV presenti in GeneBank sono risultate per il 99,25% identiche a due isolati di
TSWV (35-2 e 43-2). Inoltre, nelle piante infette da TSWV e caratterizzate anche da
nanismo e ripiegamento dello stelo fiorale, è stata verificata la presenza di fitoplasmi
appartenenti al gruppo ribosomico 16SrXII-A noto anche come “stolbur”.
Infezione da TSWV in lupino in Italia, e precisamente ad Albenga, era già stata
descritta nel 2007, ma il virus non era stato caratterizzato dal punto di vista molecolare
(Bellardi et al., 2008). Dai dati ottenuti l’isolato TSWV-L. polyphyllus si inserisce
nella tipologia “A” cui afferiscono anche gli isolati di TSWV detti RB (“Resistant
Breaking”) in quanto capaci di superare la resistenza a TSWV in pomodoro. Per
quanto riguarda l’infezione da fitoplasmi “stolbur”, si tratta del primo caso di
infezione naturale in L. polyphyllus. Dal punto di vista epidemiologico di particolare
rilievo risulta l’associazione di questi due patogeni, conseguenza di contemporanee
infestazioni nella coltivazione di lupino ornamentale oggetto di studio di tripidi e
cicadellidi, vettori di Tospovirus e fitoplasmi rispettivamente.
Parole chiave: lupino ornamentale, anulature concentriche, PCR/RFLP, RT-PCR,
infezioni miste
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Mixed infection by “stolbur” phytoplasmas and Tomato spotted wilt virus
(TSWV) in Lupinus polyphyllus
In May 2012 some pot plants of Lupinus polyphyllus Lindt. (Fabaceae) at blooming
stage cultivated in the area of Albenga (Liguria region) showed Tospovirus-like leaf
symptoms such as chlorotic, black, red and orange concentric rings; flowers also
showed some colour breaking. Some plants were also stunted with floral stems bent
at “S” shape and younger leaves smaller and rolled. Lateral flow analysis detected
Tomato spotted wilt virus (TSWV) presence in all plants with leaf concentric rings.
The virus was mechanically transmitted to herbaceous hosts, such as basil, broad
bean, pepper and blackeye bean, and molecularly characterized by a specific RT-PCR,
amplifying the TSWV NSM gene. Sequences obtained from amplicons produced by
RT-PCR, revealed 99.25% nucleotide identities with isolates TSWV-35-2 and TSWV43-2. In order to verify possible phytoplasma presence, the plants were also tested
by direct PCR with primers P1/P7 followed by nested PCR with primers R16(I)F1/
R1. RFLP analyses allowed to classify the detected phytoplasmas as belonging to
ribosomal group 16SrXII-A (“stolbur”). TSWV was already detected in Albenga
area in 2007; the isolate TSWV-L. polyphyllus belongs to “A” type which includes
“resistant breaking” isolates able to overcome TSWV resistance in tomato. This case
represents the first phytoplasma report in L. polyphyllus. From an epidemiological
point of view, mixed infection of TSWV and “stolbur” could be explained by
simultaneous infestations of crops by thrips and leafhoppers, vectors of Tospovirus
and phytoplasmas respectively.
Key words: ornamental lupine, concentric rings, PCR/RFLP, RT-PCR, mixed
infections
Lavori citati / References
BeLLarDi M.G., G. BoZZano, v. viccHi, 2008. Lupinus polyphyllus infetto da TSWV.
Clamer informa, 2, 49-52.
DenG s., c. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and
nonculturable Mollicutes. Journal of Microbiology Methods, 14, 53-61.
finetti siaLer M.M., c. Lanave, M. PaDuLa, c. vovLas, D. GaLLiteLLi, 2002.
Occurrence of two distinct Tomato spotted wilt virus subgroups in Southern
Italy. Journal of Plant Pathology, 84, 145-152.
Lee i-M., D.e. GunDersen, r.W. HaMMonD, r.e. Davis, 1994. Use of mycoplasmalike
organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-PCR
assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant. Phytopathology,
84, 559-566.
39
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Prince J.P., r.e. Davis, t.k. WoLf, i-M. Lee, B.D. MoGen, e.L. DaLLY, a. Bertaccini,
r. creDi, M. BarBa, 1993. Molecular detection of diverse mycoplasmalike
organisms (MLOs) associated with grapevine yellows and their classification
with aster yellows MLOs. Phytopathology, 83, 1130-1137.
scHneiDer B., e. seeMüLLer, c.D. sMart, B.c. kirkPatrick, 1995. Phylogenetic
classification of plant pathogenic mycoplasmalike organisms or phytoplasmas.
Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, Vol. 2, 369-380.
40
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
SCOPAZZI DELLA GINESTRA IN SICILIA
R.E. Spallino1, S. Rizza1, C. Marzachì2, M. Tessitori1
Dipartimento di Scienze delle Produzioni Agrarie e Alimentari – Sez. Fitopatologia
e Genetica vegetale, Università di Catania – via S. Sofia, 100 - 95123 Catania
2
Istituto di Virologia vegetale, CNR - Strada delle Cacce, 73 – 10135 Torino
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
La ginestra (Spartium junceum) è un’importante specie vegetale pioniera nel
bacino del Mediterraneo. Come pianta spontanea, insieme a Genista aetnensis,
segue i licheni nella colonizzazione delle colate laviche ed è tipica del paesaggio
dell’Italia meridionale ed insulare. Per il suo accrescimento rapido e la sua capacità di
adattamento, viene usata per combattere l’erosione dei suoli.
La sindrome degli scopazzi (“spartium witches’ broom”, SpaWB) della ginestra è stata
registrata, spesso in forma sporadica, in quasi tutte le regioni italiane, dove la specie
è presente (Marcone et al., 1996). La malattia è stata individuata anche in Spagna
(Torres et al., 2002; 2003). L’associazione alla sindrome di fitoplasmi del gruppo
16SrV-C e 16SrX-D, in infezione singola o mista è stata dimostrata e ‘Candidatus
Phytoplasma spartii’ (GeneBank A.N. X92869) è stato descritto come suo ceppo
di riferimento per il gruppo 16SrX-D (Marcone et al., 2004). Dal 2010 continue e
ripetute segnalazioni di scopazzi della ginestra sono state registrate in Sicilia ed in
particolare nel territorio sulle pendici dell’Etna.
Materiali e metodi
In base alle segnalazioni registrate si è deciso di eseguire un monitoraggio per
il rilevamento di sintomi caratteristici ed il prelievo di campioni da sottoporre ad
analisi, in differenti siti/areali della Sicilia: pendici dell’Etna, isole Eolie, provincie di
Palermo e di Enna.
Allo scopo di rilevare la presenza di fitoplasmi nelle piante in studio, il DNA totale è
stato estratto dai tessuti floematici delle piante sintomatiche con il metodo descritto da
Marzachì e collaboratori (1999) e, successivamente, analizzato tramite “nested”-PCR
(Lee et al., 1995) utilizzando due coppie di “primers” universali (P1/16S-SR seguiti
da R16F2n/R2). Allo scopo di accertare possibili infezioni miste dei due fitoplasmi
associati a SpaWB, “primers” specifici per il sottogruppo 16SrX-D (Marcone et
al., 1996) sono stati utilizzati in parallelo. Gli ampliconi ottenuti tramite R16F2n/
R2 sono stati clonati utilizzando il kit pGEM®-T Easy Vector System (Promega)
e il DNA ricombinante è stato sequenziato in entrambe le direzioni. Le sequenze
41
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
nucleotidiche ottenute sono state comparate con quelle depositate in GeneBank e
classificate tramite analisi RFLP virtuali utilizzando il programma iPhyClassifier
(Zaho et al., 2009).
Risultati e discussione
In tutti i siti monitorati i sintomi osservati sono stati: scopazzi, giallumi, fasciazioni,
diminuzione o assenza di fioritura. I sintomi evolvevano in 1-2 anni portando al
disseccamento della pianta colpita.
Tutti i campioni sintomatici prelevati nei diversi siti sono risultati positivi a fitoplasmi
con ampliconi della taglia attesa di circa 1.200 bp dopo amplificazione “nested” con
i “primers” R16F2n/R2. In base allo studio di similarità di sequenza in BLAST
ed alla successiva analisi tramite RFLP virtuali i campioni saggiati sono risultati
positivi a fitoplasmi del gruppo 16SrV-C (GenBank A.N. del ceppo di riferimento
AY197642) o 16SrX-D, quest’ultimo è stato riscontrato con maggiore frequenza.
L’accertamento della presenza di infezioni miste tramite “primers” specifici per il
sottogruppo 16SrX-D ha permesso di individuare sporadiche infezioni miste dei due
fitoplasmi.
La diffusione epidemica di questa sindrome in ginestra e la sua associazione a
fitoplasmi del gruppo 16SrV-C, non ancora segnalati in Sicilia, desta preoccupazione
vista l’associazione di fitoplasmi di questo sottogruppo con la flavescenza dorata
(Martini et al., 1999), e la possibilità di una loro possibile trasmissione a vite
(Arnaud et al., 2007). La viticoltura siciliana è un settore trainante dell’economia
regionale ed è caratterizzata, tra l’altro, da un importante patrimonio varietale, di
cui non è mai stata studiata la resistenza/tolleranza alle fitoplasmosi.
Parole chiave: Spartium junceum, 16SrV-C, 16SrX-D
Spartium witches’ broom in Sicily
Spartium junceum is an important pioneer species in the Mediterranean basin. Spartium
witches’ broom (SpaWB) disease was already described in both Italy and Spain.
Besides the characteristic symptom, the infected plants show fasciations, yellowing
of twigs, flower malformation and death of the whole plant. Both ‘Candidatus
Phytoplasma spartii’ (16SrX-D) and a phytoplasma member of the 16SrV-C group
have been associated to SpaWB. Since 2010 increasing reports of this syndrome were
registered in Sicily region (South Italy) and particularly in the Etna area, a valuable
viticultural territory. Detection and molecular characterization of phytoplasmas in
symptomatic Spartium plants was carried out through analysis of the 16S ribosomal
RNA gene amplified by nested-PCR using universal primer pairs. Phytoplasma-
42
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
specific amplicons were cloned and sequenced and the obtained sequences allowed to
classify the detected pathogens, on the basis of virtual RFLP analysis performed by
iPhyClassifier, in 16SrV-C and 16SrX-D subgroups.
Key words: Spartium junceum, 16SrV-C, 16SrX-D
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro svolto in parte nell’ambito della convenzione con Servizio Fitosanitario
della Regione Siciliana D.D. n. 1450 del 8/04/2013 “Individuazione di focolai del
fitoplasma (16SrRNA V) agente causale della flavescenza dorata della vite” ed in
parte nell’ambito del PON SO.PRO.ME, O.R.9 “Patogeni emergenti e da quarantena
di specie ornamentali”.
Lavori citati / References
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44
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
GRAVE DEPERIMENTO IN KENTIA ASSOCIATO ALLA
PRESENZA DI FITOPLASMI
A. Bertaccini1, J.F. Mejia1, S. Paltrinieri1, N. Contaldo1, G. Granata2
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
DiGeSA, Università di Catania - Via S. Sofia, 100 - 95123 Catania
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
La kentia (Howea forsteriana, Becc.) appartiene all’ordine delle Arecales ed è una
specie ampiamente utilizzata come pianta ornamentale da giardino e da interni. Il genere
deriva dal nome della capitale dell’isola Lord Howe situata nel sud est dell’Australia
dove è endemico e da dove è stato diffuso nel mondo dalla fine del 1700 mediante
l’impiego di semi. La pianta adulta ha foglie pinnate e lunghe oltre 2 metri, in natura può
raggiungere i 15 metri. Quando la pianta viene coltivata in vaso raggiunge comunque
dimensioni ragguardevoli e solitamente viene impiegata per la decorazione di interni
di piccole e grandi dimensioni. Poche sono le problematiche fitopatologiche descritte,
oltre agli attacchi di cocciniglia che provocano macchie circolari clorotiche delle foglie;
inoltre, necrosi e disseccamenti fogliari sono dovuti a Phytophthora palmivora che, da
sola o in associazione ad altre specie, è segnalata come agente causale di marciume
radicale, favorito da condizioni ambientali caldo-umide ed una antracnosi a foglie e
fusti causata da Colletotricum gloeosporioides (Ciccarone, 1997). I fitoplasmi sono
stati associati alla presenza di diverse malattie delle palme in molte aree del mondo. I
sintomi prevalentemente associati alla loro presenza sono giallumi fogliari, riduzioni di
taglia e deperimenti rapidi o lenti. La malattia associata alla presenza di fitoplasmi più
conosciuta e devastante delle palme è il “lethal yellowing” descritto finora in almeno
30 specie di palme fra cui Phoenix dactylifera, Veitchia merrilli, Caryota rumphiana,
Phoenix canariensis e Elaeis guineensis (Nejat et al., 2009; 2013; Mehdi et al., 2012).
La malattia ha ucciso milioni di palme in particolare da cocco (Cocos nucifera) nei
Caraibi, in Florida e Messico ed in altre aree dell’America centrale (Oropeza et al.,
2011; Ntushelo et al., 2012). Viene qui descritta una malattia individuata in kentia in
Sicilia orientale alla quale è stato possibile associare la presenza di fitoplasmi.
Materiali e metodi
Piante di H. forsteriana con sintomatologia di giallume fogliare, malformazioni
e necrosi parziale delle foglie più interne sono state prelevate insieme a piante
asintomatiche in un vivaio sito nei pressi di Catania e mantenute in serra a prova di
45
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
insetto. In particolare sono state analizzati campioni da 4 piante prelevate nel 2007
e da 6 piante prelevate nel 2011 e da campioni asintomatici aventi la stessa età. Si è
proceduto all’estrazione di acido nucleico da 1,0 g di nervature fogliari o di piccioli
mediante una metodologia basata sull’uso di cloroformio e fenolo (Prince et al., 1993).
Le piante sono state analizzate due volte: a settembre 2011 ed a febbraio/marzo 2013.
L’analisi molecolare mediante PCR è stata effettuata utilizzando i “primers” F1/B6
(Davis e Lee, 1993; Padovan et al., 1995), o P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991; Schneider
et al., 1995), seguiti in PCR “nested” dai “primers” R16mF2/mR1 (Gundersen e Lee,
1996) o R16F2/R2 (Lee et al., 1995). Una ulteriore PCR “nested” è stata poi effettuata
sugli amplificati ottenuti, mediante i “primers” 16R758f/16SR1232r (=M1/M2, Gibb et
al., 1995) ed R16(I)F1/R1 (Lee et al., 1994). Sono infine state effettuate analisi RFLP
mediante l’enzima di restrizione Tru1I (Fermentas, Vilnius, Lituania) sugli amplificati
ottenuti con le coppie di “primers” M1/M2 e R16(I)F1/R1 e con Tsp509I (Fermentas,
Vilnius, Lituania) solo sugli amplificati ottenuti con i “primers” M1/M2.
Risultati e discussione
La sintomatologia presente nelle piante sia prelevate nel 2007 che nel 2011 era simile
e consisteva in ingiallimento acropeto delle giovani foglie cui seguivano necrosi
progressive e disseccamenti. La malattia si manifesta anche in giardini e piante
all’esterno di età variabile fra i 5 e i 30 anni con sintomatologie simili che però in
molti casi progrediscono in maniera rapida e portano alla malformazione delle foglie,
mancata schiusura di quelle giovani con marcata epinastia, fino al deperimento della
pianta nel giro di pochi anni. La stessa sintomatologia si riscontra in Australia su piante
di kentia e su piante del genere Archontophoenix (G. Granata, dati non pubblicati).
Le piante mantenute in serra hanno mostrato una progressione più lenta della malattia
che ha portato comunque a morte tre degli esemplari prelevati nel 2007.
Le analisi molecolari hanno presentato notevoli problemi dovuti alla verosimile
presenza di batteri endofiti che hanno interferito con la diagnosi per individuare la
presenza di fitoplasmi e che, in alcuni casi, sono anche stati amplificati e sequenziati.
E’ stato necessario mettere a punto un sistema di PCR “nested” specifiche per i
fitoplasmi individuati e che nel contempo riducesse l’interferenza di altro DNA di
origine procariotica. L’uso di una seconda PCR “nested” ha permesso di rendere il
sistema specifico e di individuare la presenza di fitoplasmi appartenenti ai gruppi
ribosomici 16SrI-B (giallume dell’astro) e 16SrXII-A (“stolbur”). I fitoplasmi sono
stati individuati in infezione singola sia nei campioni prelevati nel 2007 che nel 2011,
in entrambe le analisi effettuate e con entrambe le coppie di “primers” impiegate. E’
stato anche possibile individuare, in una pianta prelevata nel 2007, nelle analisi effettuate
sui prelievi di settembre 2011 la presenza di un fitoplasma appartenente al gruppo
ribosomico 16SrI che è risultato differenziabile dal profilo RFLP da quelli finora descritti.
La presenza di fitoplasmi in kentia allarga il numero dei generi di piante suscettibili
all’infezione di questi procarioti, occorre comunque verificare che non vi siano altri
46
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
agenti che concorrono a determinare la grave sindrome riscontrata in campo per poter
correttamente intervenire bloccando la diffusione della malattia.
Parole chiave: deperimento, giallume dell’astro, “stolbur”, kentia, diagnosi
A severe kentia decline associated with phytoplasma presence
Kentia (Howea forsteriana) is worldwide grown as ornamental especially for inside
decorations. Phytoplasmas have been associated with several diseases of palm trees with
symptoms that are quite variable and consist of leaf yellowing, reduction in fruit and stalk
size, stunting, wilting and severe or slow decline. Lethal yellowing, lethal decline, root
wilt, white tip die-back and Al-Wijaam are some of the reported phytoplasmas-associated
diseases associated with different species of palm in the world. Lethal yellowing is
however a disease associated worldwide with phytoplasmas that affects at least 30 species
of palm, among which the most relevant are Phoenix dactylifera, Veitchia merrilli, Caryota
rumphiana, Phoenix canariensis and Elaeis guineensis. This disease has killed millions of
palm trees such as coconut (Cocos nucifera) throughout the Caribbean, Florida, Mexico,
and the Central American region. Kentia plants showing severe symptoms of decline quite
similar to the lethal yellowing were observed in outside garden in some areas of Eastern
Sicily. To study the disease ten potted plants were collected a few months after sprouting
and maintained under insect-proof greenhouse. Total nucleic acids were extracted from
1 g of tissue from leaves and petioles with a chloroform/phenol-based method and direct
and nested PCR assays were carried out in two different period of the year (Autumn
and Spring). All the samples were negative to phytoplasma presence while in some
cases RFLP profiles and sequences related to possible endophitic bacteria were detected.
A second nested PCR assay with more specific primers allow to detect phytoplasmas
that were identified as belonging to aster yellows (16SrI-B) and “stolbur” (16SrXII-A)
ribosomal groups. The detection of these phytoplasmas in kentia with decline symptoms
increases the number of plant species that can be infected by these prokaryotes. It is
however necessary to further evaluate the possible presence of other microorganisms that
may contribute to determine the severe disease detected in open field in order to devise the
appropriate disease management to contain its spread.
Key words: decline, aster yellows, “stolbur”, kentia, diagnosis
Lavori citati / References
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
DIFFUSA PRESENZA DI SCOPAZZI DEL MELO IN
IMPIANTI FAMILIARI IN VAL D’AGRI, BASILICATA
C. Marcone1, E. Seemüller2
1
Dipartimento di Farmacia, Università degli Studi di Salerno, via Ponte Don Melillo,
84084 Fisciano (Salerno)
2
Julius Kuehn Institute, Federal Research Centre for Cultivated Plants, Institute for
Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture, 69221 Dossenheim, Germany
E-mail: [email protected]
Introduzione
Gli scopazzi del melo (“apple proliferation” = AP) costituiscono una delle più
importanti malattie associate alla presenza di fitoplasmi presenti in Europa. Essi sono
associati ad AP ‘Candidatus Phytoplasma mali’, membro del gruppo 16SrX (IRPCM,
2004; Seemüller e Schneider, 2004). AP è diffuso nei paesi dell’Europa centrale ed
in Italia, nelle regioni estreme settentrionali (Seemüller et al., 2011). Studi condotti
con l’ausilio di metodiche molecolari, hanno consentito di individuare cinque
piante di melo affette da AP in un impianto di tipo familiare in Val d’Agri, una tra
le principali aree agricole della Basilicata (Marcone et al., 1996a). Non sono note,
finora, segnalazioni della presenza di AP in altre aree dell’Italia centro-meridionale.
Si è, pertanto, ritenuto opportuno approfondire ed estendere le conoscenze sulla reale
diffusione e dannosità di AP in Val d’Agri, considerando in particolare impianti di tipo
familiare i quali, di solito, non sono soggetti a trattamenti insetticidi o lo sono solo
raramente.
Materiali e metodi
A partire dal 2010, una serie di osservazioni di campo è stata svolta in vari impianti
familiari ubicati in Val d’Agri, con maggiore frequenza in periodi di più intensa attività
vegetativa, al fine di individuare piante di melo mostranti sintomi tipici di AP. Le piante
esaminate erano costituite prevalentemente da cultivar locali ed avevano una età di
oltre 20 anni. Campioni di rametti, foglie e radici sono stati prelevati da piante di melo
apparentemente sane e da piante sintomatiche e sono stati saggiati mediante PCR per
verificare la presenza di fitoplasmi. Come campione di controllo positivo è stato utilizzato
il ceppo AT del fitoplasma AP di origine tedesca, in vinca. L’estrazione del DNA totale
è stata eseguita da piccioli e nervature fogliari e da porzioni floematiche di rametti e
radici, del diametro approssimativo di 1 cm, di piante malate ed apparentemente sane,
seguendo la tecnica di arricchimento di Ahrens e Seemüller (1992). Per l’estrazione del
DNA da vinca, sono state utilizzate le parti apicali delle piante infette. Per l’analisi PCR
49
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
sono stati impiegati gli iniziatori specifici fO1/rO1, che amplificano un frammento di
circa 1080 nucleotici del 16S rDNA di tutti i fitoplasmi del gruppo 16SrX e la coppia
fAT/rAS che amplifica un frammento di circa 460 nucleotidi del 16S rDNA e la regione
spaziatrice situata tra tale gene e il 23S rDNA del fitoplasma AP (Lorenz et al., 1995;
Smart et al., 1996). I prodotti di amplificazione ottenuti con i “primer” fO1/rO1 sono
stati sottoposti ad analisi di restrizione separatamente con le endonucleasi SspI e BsaAI
seguendo metodiche descritte in letteratura (Marcone et al., 1996b).
Risultati e discussione
Piante di melo mostranti sintomi tipici di AP sono state individuate in quasi tutti
gli impianti esaminati con percentuali di incidenza variabili dal 5 ad oltre il 50%. I
sintomi consistevano principalmente in scopazzi, stipole ingrandite e foglie disposte a
rosetta all’apice dei germogli. Oltre che sulla parte aerea, scopazzi sono stati rinvenuti
a livello ipogeo, ove si originavano dalle grosse radici delle piante affette. Inoltre, alla
base delle piante malate è stata spesso evidenziata l’emissione di nuovi getti. Nella
maggioranza dei casi, comunque, la gravità dei sintomi non è risultata particolarmente
elevata. Sintomi particolarmente intensi, invece, sono stati evidenziati su piante che
erano state sottoposte a drastiche potature e/o capitozzatura durante la precedente
stagione di stasi vegetativa.
Prodotti di amplificazione sono stati ottenuti da tutti i campioni prelevati dai meli
sintomatici saggiati impiegando sia i “primer” fO1/rO1, sia quelli fAT/rAT. Nessuna
amplificazione è stata ottenuta da meli asintomatici. Con entrambe le coppie di “primer”
è stato, inoltre, amplificato il DNA del ceppo di controllo AT. La comparazione dei
profili di restrizione ottenuti previa digestione delle sequenze amplificate del 16S
rDNA con le sopra citate endonucleasi nonché la specificità dei “primer” impiegati,
hanno evidenziato che i meli sintomatici lucani albergavano l’agente AP ‘Ca. P. mali’.
La presenza diffusa di AP negli impianti familiari in Val d’Agri è da mettere in
relazione al fatto che detti impianti non sono sottoposti a trattamenti insetticidi o lo
sono solo raramente. Tali trattamenti, invece, vengono eseguiti normalmente in meleti
commerciali, ampiamente presenti in Val d’Agri, nei quali AP non sembra costituire
affatto un problema. Una situazione simile a quella presente in Val d’Agri è stata
evidenziata in Germania ove una elevata percentuale di piante di melo coltivate in
impianti familiari è affetta da AP (Seemüller et al., 2008).
Il presente studio ha contribuito ad aggiornare le conoscenze sulla reale diffusione di
AP in Val d’Agri, ove soltanto un numero molto limitato di piante affette da AP, presenti
in un solo impianto, era stato rinvenuto in passato (Marcone et al., 1996a). I risultati
ottenuti, inoltre, evidenziano che le condizioni climatiche dell’Italia meridionale non
sono sfavorevoli ad AP e che l’areale di distribuzione di questa temibile malattia da
quarantena è molto più spostato verso sud di quanto riportato in precedenza.
Parole chiave: ‘Candidatus Phytoplasma mali’, scopazzi del melo, PCR, 16S rDNA
50
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Widespread occurrence of apple proliferation in low-intensity orchards in
Agri valley, Basilicata (Italy)
Over the last three years, visual symptom assessment and PCR amplification were
used to survey the occurrence of apple proliferation (AP) disease in low-intensity
orchards in the Agri valley, a major cultivation area of Basilicata region. The apple
trees examined, whose scion cultivars were not determined and consisted mostly of
local cultivars, were more than 20 years old and therefore had been exposed to insect
vectors for a long time. The survey revealed that a high percentage of trees were
infected reaching more than 50% in some locations. The symptoms of diseased trees
were generally mild and consisted of enlarged stipules, rosettes, witches’ brooms as
well as basal witches’ broom-like growth arising from large roots. However, incidence
and severity of symptoms in the aerial parts of affected trees were pronounced only
in trees which had been heavily pruned in the previous dormant season. Specificity
of the primers used and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis
of PCR-amplified 16S rDNA sequences employing SspI and BsaAI restriction
endonucleases showed that the trees testing positive by PCR were infected by the AP
agent ‘Candidatus Phytoplasma mali’. The high incidence of AP infections in lowintensity orchards in Agri valley is likely associated with inappropriate vector control.
The trees examined were not or only rarely treated with insecticides. On the other
hand, typical AP symptoms seem to be uncommon in commercial apple orchards in
Agri valley, which are treated with standard insecticide programs. Although a few APaffected apple trees grown in a low-intensity orchard in Agri valley had previously
been observed, our survey shows that the distribution of AP disease in Europe extents
further south than previously thought and that the climatic conditions of Southern
Italy are not unsuitable for this quarantine disease.
Key words: ‘Candidatus Phytoplasma mali’, apple proliferation, PCR, 16S rDNA
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro eseguito con fondi FARB, anno 2011, dell’Università degli Studi di Salerno.
Lavori citati / References
aHrens u., e. seeMüLLer, 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike
organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S
rRNA gene. Phytopathology, 82, 828-832.
LorenZ k.-H., B. scHneiDer, u. aHrens, e. seeMüLLer, 1995. Detection of the apple
proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of ribosomal
and nonribosomal DNA. Phytopathology, 85, 771-776.
51
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Marcone c., a. raGoZZino, P. DeL serrone, B. aLoJ, M. BarBa, e. seeMüLLer, 1996a.
Detection of apple proliferation and pear decline in southern Italy. Petria, 6(2),
143-157.
Marcone c., a. raGoZZino, B. scHneiDer, u. Lauer, c.D. sMart, e. seeMüLLer,
1996b. Genetic characterization and classification of two phytoplasmas
associated with spartium witches’-broom disease. Plant Disease, 80, 365-371.
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prokaryotes that colonize plant phloem and insects. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1243-1255.
seeMüLLer e., B. scHneiDer, 2004. ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus
Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal
agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit
yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 54, 1217-1226.
seeMüLLer e., H. kison, k.-H. LorenZ, 1998. On the geographic distribution and
prevalence of the apple proliferation phytoplasma in low-intensity orchards
in Germany. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 105(4),
404-410.
seeMüLLer e., L. carraro, W. JarauscH, B. scHneiDer, 2011. Apple proliferation
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Hadidi A., Barba M., Candresse T., Jelkmann W., (Eds). The American
Phytopathological Society (APS Press), St. Paul, Minnesota, USA, 67-73.
sMart c.D., B. scHneiDer, c.L. BLoMQuist, L.J. Guerra, n.a. Harrison, u. aHrens,
k.-H. LorenZ, e. seeMüLLer, B.c. kirkPatrick, 1996. Phytoplasma-specific
PCR primers based on sequences of the 16-23S rRNA spacer region. Applied
and Environmental Microbiology, 62(8), 2988-2993.
52
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
ELEVATA OMOGENEITÀ GENETICA IN POPOLAZIONI
DI FITOPLASMI ASSOCIATI AGLI SCOPAZZI DEL
MANDORLO IN LIBANO
F. Quaglino1, P. Casati1, Y. Abou-Jawdah2, E. Choueiri3, M. Molino-Lova4,
R. Tedeschi5, A. Alma5, P.A. Bianco1
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia,Università degli Studi di Milano,
Via Celoria 2, 20133 Milano
2
Faculty of Agricultural and Food Sciences, American University of Beirut, PO Box
11-0236, Beirut, Lebanon
3
Lebanese Agricultural Research Institute, Tal Amara, Rayak, PO Box 287, Zahlé, Lebanon
4
AVSI Lebanon, Rue St. Fawka, Centre Jean Paul II, 1200 Jounieh Ghadir, Lebanon
5
DISAFA, Università degli Studi di Torino – via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
I fitoplasmi ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ appartenenti ai sottogruppi
16SrIX-B, -D, -F, -G (Molino Lova et al., 2011; Lee et al., 2012), sono associati
alla malattia denominata scopazzi del mandorlo (AlmWB) in Libano. Tale malattia
colpisce mandorlo, pesco e nettarina, causando notevoli perdite di produzione e,
soprattutto in mandorlo, arrivando a provocare la morte delle piante malate in pochi
anni dalla comparsa dei primi sintomi (Abou-Jawdah et al., 2003; 2009). Nonostante
la diversità genetica rilevata sul gene 16S rDNA, l’analisi di geni meno conservati
(rplV-rpsC e secY) ha permesso di riscontrare una forte omogeneità in fitoplasmi
associati a AlmWB (Lee et al., 2012). In questo lavoro, la variabilità genetica in
popolazioni di fitoplasmi associati ad AlmWB è stata valutata impiegando geni mai
usati in precedenza per la caratterizzazione di ceppi di ‘Ca. P. pheonicium’.
Materiali e metodi
Nel corso delle attività di monitoraggio di AlmWB svolte nel 2012 in Libano, sono
stati raccolti campioni fogliari da 41 piante sintomatiche in regioni del Nord (19
mandorli) e del Sud (9 mandorli) e nella valle della Bekàa (8 mandorli e 5 peschi).
I fitoplasmi associati ad AlmWB (AlmWBf) sono stati rilevati attraverso analisi
PCR con l’impiego dei “primers” ALW-F2/ALW-R2 (Abou-Jawdah et al., 2003). I
ceppi di AlmWBf identificati sono stati caratterizzati attraverso analisi PCR-RFLP
e sequenziamento dei geni 16S rRNA, tuf, degV e groEL. Per il 16S rDNA, sono
53
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
stati impiegati “primers” e condizioni di reazione precedentemente descritti (Lee et
al., 1998). Due fitoplasmi di riferimento sono stati utilizzati come controlli positivi:
AlmWBf (sottogruppo 16SrIX-D) e PEY (giallume di Picris echioides, sottogruppo
16SrIX-C). Gli ampliconi ottenuti sono stati digeriti con gli enzimi TaqI e BstUI
(Molino Lova et al., 2011). Per i geni tuf, degV e groEL, i “primers” sono stati disegnati
sulla base dei dati ottenuti dal sequenziamento parziale del genoma di un ceppo di
AlmWBf (dati non pubblicati). Le condizioni di reazione sono state: 94°C per 5 min,
35 cicli (94°C per 1 min, 50°C (53°C per la PCR-“nested”) per 2 min, 72°C per 3 min),
72°C per 10 min. Gli amplificati del gene degV sono stati digeriti con gli enzimi DraI,
HinfI, MboII; quelli del gene groEL con gli enzimi AluI, HinfI, HpyCH4V, MboII, TaqI;
quelli del gene tuf con gli enzimi AluI, MboII, HpyCH4V, Tsp509I. Al fine di valutare la
presenza di eventuali differenze esterne ai siti di taglio, 12 prodotti PCR (4 ampliconi
rappresentativi dei ceppi di AlmWBf identificati nelle diverse aree esaminate) sono
stati sequenziati e successivamente allineati mediante il programma BioEdit.
Risultati e discussione
Fitoplasmi riferibili ad AlmWB sono stati identificati mediante analisi PCR con
l’impiego dei “primers” ALW-F2/ALW-R2 in tutte le piante sintomatiche in esame,
confermando l’efficacia e la specificità del saggio diagnostico utilizzato (AbouJawdah et al., 2003). Soltanto per AlmWBf identificati in 33 piante (13 del Nord,
13 del Sud, 7 della Bekàa) è stato possibile ottenere l’amplificazione dei geni 16S
rRNA, tuf, degV e groEL, impiegati per la successiva caratterizzazione molecolare. Le
analisi RFLP, condotte sui quattro geni esaminati, hanno mostrato profili di restrizione
identici nei 33 ceppi di AlmWBf. Tali profili sono risultati indistinguibili da quelli del
ceppo di riferimento del sottogruppo 16SrIX-D, ma distinti da quelli del ceppo PEY
(sottogruppo 16SrIX-C). Le analisi degli allineamenti delle sequenze nucleotidiche di
geni 16S rRNA, tuf, degV e groEL, amplificati da 12 ceppi rappresentativi di AlmWBf,
hanno confermato l’estrema omogeneità genetica all’interno della popolazione
fitoplasmatica. In particolare, le sequenze dei geni 16S rRNA, tuf e groEL dei ceppi
esaminati sono risultate identiche (100% identità di sequenza). Per quanto riguarda il
gene degV, la sequenza di un ceppo di AlmWBf, identificato in una pianta di mandorlo
nel Nord del Libano, è risultata distinta dalle sequenze dei ceppi rimanenti per la
presenza di una mutazione puntiforme situata all’esterno di siti di restrizione. La
presenza di tale mutazione è stata confermata dalla ripetizione dell’amplificazione e del
sequenziamento dallo stesso DNA. I risultati dell’analisi di sequenza di geni multipli,
effettuata attraverso la caratterizzazione molecolare di quattro frammenti genomici di
AlmWBf, ha evidenziato un’omogeneità genetica estremamente elevata all’interno
di popolazioni di ceppi di ‘Ca. P. phoenicium’ associati a AlmWB, suggerendo la
possibile proprietà clonale di tali popolazioni fitoplasmatiche in Libano. Ulteriori
studi saranno condotti su geni meno conservati (per esempio, regioni genomiche di
origine fagica) al fine di approfondire tale aspetto.
54
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Parole chiave: analisi di sequenze geniche multiple, ‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’, RFLP
High genetic homogeneity among almond witches’ broom phytoplasma
populations in Lebanon
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ (CaPphoe), subgroups 16SrIX-B, -D, -F,
-G, is associated with almond witches’ broom (AlmWB) disease in Lebanon. The
severity of AlmWB symptoms and related crop losses produced in almond, peach and
nectarine prompted further studies on diverse aspects of the disease epidemiology.
In the present work, analyses focused on molecular characterization of CaPphoe
populations associated with AlmWB through a multilocus sequence typing (MLST)
approach based on PCR-RFLP and sequence analyses of the genes 16S rRNA, tuf,
degV, and groEL. Forty-one symptomatic plants were sampled in northern and
southern Lebanon, and in the Bekàa valley. PCR-based detection confirmed the
presence of CaPphoe in all the analyzed samples. MLST analyses were performed
on 33 AlmWB phytoplasma strains that were positive to amplifications of the four
analyzed genes. Identical patterns from RFLP analyses of 16S rRNA, tuf, degV, and
groEL genes were shared by the CaPphoe strains examined. Such profiles were
undistinguishable from those of CaPphoe reference strain of subgroup 16SrIX-D,
but distinct from those of PEY (Pichris echioides yellows) strain (16SrIX-C).
Alignments of 16S rRNA, tuf, degV, and groEL gene sequences of 12 representative
CaPphoe strains (from North and South Lebanon, and from Bekàa valley) revealed
the presence of a single nucleotide polymorphism within the degV gene of one
CaPphoe strain identified in almond. Nucleotide sequences of other CaPphoe strains
are completely identical. MLST analyses evidenced an unexpected high genetic
homogeneity among CaPphoe populations from diverse geographic regions of
Lebanon. These data suggested the possible clonal properties of CaPphoe strains
in Lebanon. Further studies on less conserved genes will be carried out to confirm
results from the present work.
Key words: multilocus sequence typing, ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’, RFLP
Lavori citati / References
aBou-JaWDaH Y., H. DakHiL, s. eL-MeHtar, i.-M. Lee, 2003. Almond witches’ broom
phytoplasma, a potential threat to almond, peach and nectarine. Canadian
Journal of Plant Pathology, 25, 28-32.
aBou-JaWDaH Y., H. soBH, M. akkarY, 2009. First report of Almond witches’ broom
phytoplasma (‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’) causing a severe disease
on nectarine and peach trees in Lebanon. Bulletin OEPP/EPPO, 39, 94-98.
55
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lee i-M., k.D. Bottner-Parker, Y. ZHao, a. Bertaccini, r.e. Davis, 2012.
Differentiation and classification of phytoplasmas in the pigeon pea witches’
broom group (16SrIX): an update based on multiple gene sequence analysis.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, 22792285.
Lee i-M., D.e. GunDersen-rinDaL, r.e. Davis, i.M. BartosZYk, 1998. Revised
classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA
and ribosomal protein gene sequences. International Journal of Systematic
Bacteriology, 48, 1153-1169.
MoLino Lova M., f. QuaGLino, Y. aBou-JaWDaH, e. cHoueiri, H. soBH, P. casati, r.
teDescHi, a. aLMa, P.a. Bianco, 2011. Identification of new 16SrIX subgroups,
-F and -G, among ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ strains infecting
almond, peach and nectarine in Lebanon. Phytopathologia Mediterranea,
50(2), 273-282.
56
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
PRIMA SEGNALAZIONE DI ‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA
SOLANI’ ASSOCIATO A LEGNO NERO DELLA VITE IN
GIORDANIA
N.M. Salem1, F. Quaglino2, A. Abdeen3, P. Casati2, D. Bulgari2, A. Alma4,
P.A. Bianco2
Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Jordan,
Amman, 11942, Jordan
2
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia,Università degli Studi di Milano,
Via Celoria 2, 20133 Milano
3
Knowledge Sector, Royal Scientific Society, Amman, 11942, Jordan
4
DISAFA, Università degli Studi di Torino – via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il legno nero (LN) è una malattia del complesso dei giallumi della vite (GY) associata
a ‘Candidatus Phytoplasma solani’, appartenenti al sottogruppo 16SrXII-A, trasmessi
principalmente dal cixiide polifago Hyalesthes obsoletus Signoret (Alma et al., 1987).
LN è diffuso soprattutto in Europa e nei Paesi del Bacino del Mediterraneo ma, negli
ultimi anni, la sua presenza è stata rilevata anche in Sud America, Sud Africa, Cina
ed Iran (Botti e Bertaccini, 2006; Gajardo et al., 2009; Karimi et al., 2009; Duduk et
al., 2010). In questo lavoro si riporta la prima segnalazione di fitoplasmi associati a
LN in Giordania.
Materiali e metodi
Nel corso delle attività di monitoraggio condotte in vigneti della Giordania in agosto
e ottobre 2012, sono stati raccolti campioni fogliari da 25 piante di vite (Vitis vinifera
L.) che mostravamo alterazioni cromatiche accompagnate da accartocciamento della
lamina fogliare, disseccamento dei grappoli e maturazione irregolare dei tralci, sintomi
tipici dei giallumi della vite (GY) (Belli et al., 2012). Negli stessi vigneti, sono stati
raccolti campioni fogliari da sei piante di convolvolo (Convolvulus arvensis L.) che
mostravano riduzione della crescita e alterazioni cromatiche, sintomi solitamente
associati alla presenza di fitoplasmi. Campioni fogliari sono stati raccolti anche da
piante asintomatiche di vite e di convolvolo. Il DNA totale è stato estratto dai campioni
in esame e impiegato come templato in reazioni di amplificazione (“nested” PCR)
del gene 16S rRNA condotte mediante l’impiego delle coppie di “primers” P1/P7 e
57
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
R16F2n/R2, universali per il genere ‘Candidatus Phytoplasma’ (Lee et al., 1998).
Inoltre, i DNA estratti da piante di vinca [Catharanthus roseus G. (Don)] infetta dai
ceppi STOL (‘Ca. P. solani’, 16SrXII-A), SAY (‘Ca. P. asteris’, 16SrI-B) e EY (‘Ca. P.
ulmi’, 16SrV-A) sono stati impiegati come controlli positivi. Il DNA estratto da vinca
sana e la miscela di reazione priva di DNA sono stati usati come controlli negativi.
I prodotti PCR ottenuti sono stati sequenziati da un servizio commerciale (Primm,
Milano) e depositati in GenBank (no. KC835139, vite; no. KC835140, convolvolo).
Per l’identificazione molecolare dei fitoplasmi, le sequenze sono state analizzate con
i software BlastN (identità di sequenza), BioEdit (allineamento) e iPhyClassifier
(attribuzione sottogruppo tassonomico).
Risultati e discussione
Le reazioni di “nested” PCR hanno evidenziato la presenza di un frammento della
lunghezza attesa (circa 1250 nucleotidi) in tre piante di vite sintomatiche, in cinque
piante di convolvolo sintomatiche e nei tre controlli positivi, confermando la presenza
di fitoplasmi in vite e convolvolo in Giordania. Nessuna amplificazione è stata
riscontrata nelle piante asintomatiche e nei controlli negativi. L’analisi BlastN delle
sequenze nucleotidiche ha evidenziato che i fitoplasmi, identificati in vite e convolvolo
in Giordania, condividono un’identità di sequenza del 99,5% con STOL (sequenza no.
AF248959), il ceppo di riferimento della specie ‘Ca. P. solani’. Inoltre, l’allineamento
effettuato con il software BioEdit ha mostrato che i fitoplasmi individuati possiedono
le sequenze distintive di STOL senza alcuna mutazione (Quaglino et al., 2009; 2013).
La successiva analisi di RFLP virtuale, condotta con il software iPhyClassifier,
ha confermato l’appartenenza dei ceppi al sottogruppo 16SrXII-A. Tali evidenze
sperimentali hanno consentito di segnalare, per la prima volta, la presenza di ‘Ca. P.
solani’, associati a LN della vite in Giordania. Ulteriori indagini saranno condotte per
accertare il ruolo di H. obsoletus, già segnalato in Giordania, e di altri possibili insetti
vettori nella diffusione di ‘Ca. P. solani’ e nell’epidemiologia di LN.
Parole chiave: Vitis vinifera L., 16S rDNA, sequenze distintive, Hyalesthes obsoletus
First report of ‘Candidatus Phytoplasma solani’ associated with grapevine “bois
noir” disease in Jordan
During a survey carried out in Jordan vineyards in August and October 2012, grapevine
plants showing typical grapevine yellows disease symptoms were observed. In the same
vineyards, bindweed plants showing stunting and leaf chromatic alteration suggesting
the involvement of phytoplasmas in the disease were found. Total DNA was extracted
from leaf veins of 25 symptomatic and two asymptomatic grapevines, and from five
58
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
symptomatic and two asymptomatic bindweeds. 16S rDNA nested PCRs, carried out
using the primer pairs P1/P7 followed by R16F2n/R16R2, evidenced the presence of
a band of the expected size (1,250 nuclotides) in three grapevine and in five bindweed
samples. Selected PCR products were sequenced and deposited in NCBI GenBank
under accession no. KC835139 (strain from grapevine) and KC835140 (strain from
bindweed). The 16S rDNA nucleotide sequences of phytoplasmas identified in
grapevine and bindweed in Jordan shared >99.5% sequence identify with ‘Candidatus
Phytoplasma solani’ reference strain STOL (AF248959), and carried identical
STOL-unique signature sequence and distinguishing sequence blocks. Moreover,
phylogenetic and in silico RFLP analyses confirmed the affiliation of phytoplasma
strains identified in grapevine and bindweed in Jordan to ‘Ca. P. solani’ (subgroup
16SrXII-A), opening to future studies focusing on investigating more accurately the
diffusion and impact of BN in Jordan, where the insect Hyalesthes obsoletus Signoret,
a polyphagous Cixiidae responsible for BN phytoplasma transmission in vineyards in
Europe, was previously reported.
Key words: Vitis vinifera L., 16S rDNA, signature sequence, Hyalesthes obsoletus
Lavori citati / References
aLMa a., c. arnò, a. arZone, c. viDano, 1987. New bio-logical reports on
Achenorrhyncha in vineyards, pp. 509-516. In: Proceeding of the 6th
Auchenorrhyncha Meeting, Turin, Italy, 7-11 September 1987.
BeLLi G., P.a. Bianco, M. conti, 2010. Grapevine yellows in Italy: past, present and
future. Journal of Plant Pathology, 92, 303-326.
Botti s., a. Bertaccini, 2006. First report of phytoplasmas in grapevine in South
Africa. Plant Disease, 90, 1360.
DuDuk B., J.B. tian, n. contaLDo, X.P. fan, s. PaLtrinieri, Q.f. cHen, Q.f. ZHao,
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‘Candidatus Phytoplasma japonicum’ in woody host plants in China. Journal
of Phytopathology, 158(2), 100-104.
GaJarDo a., n. fiore, s. ProDan, s. PaLtrinieri, s. Botti, a.M. Pino, a. ZaMorano,
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yellows in Chile. Plant Disease, 93, 789-796.
kariMi M., n. contaLDo, B. MaHMouDi, B. DuDuk, a. Bertaccini, 2009. Identification
of stolbur-related phytoplasmas in grapevine showing decline symptoms in
Iran. Le Progrès agricole et viticole, HS, 208-209.
Lee i-M., D.e. GunDersen-rinDaL, r.e. Davis, i.M. BartosZYk, 1998. Revised
classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA
and ribosomal protein gene sequences. International Journal of Systematic
Bacteriology, 48, 1153-1169.
59
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
QuaGLino f., Y. ZHao, P.a. Bianco, W. Wei, P. casati, G. Durante, r.e. Davis, 2009.
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QuaGLino f., Y. ZHao, P. casati, D. BuLGari, P.a. Bianco, W. Wei, r.e. Davis,
2013. ‘Candidatus Phytoplasma solani’, a novel taxon associated with
stolbur and bois noir related diseases of plants. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology (Epub ahead of print,
doi:10.1099/ijs.0.044750-0).
60
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
IDENTIFICAZIONE DI FITOPLASMI APPARTENENTI AL
GRUPPO 16SrIX-C IN PIANTE DI
ArgyrANTheMUM frUTeSCeNS L.
E. Costantini, L. Ferretti, A. Gentili, F. Punelli, G. Pasquini
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura- Centro di Ricerca per
la Patologia vegetale, CRA-PAV – via C.G. Bertero, 22, 00156 Roma
E-mail: [email protected]
Introduzione
Le malattie associate alla presenza di fitoplasmi oltre ad interessare specie
agronomiche quali vite, drupacee, pomacee e piante orticole, possono colpire
anche specie ornamentali di interesse florovivaistico. In questo caso i danni sono a
carico della qualità delle produzioni floricole: l’infezione riduce, infatti, la vigoria
e la vitalità delle piante, la differenziazione e la formazione completa dei fiori,
con conseguente riduzione del valore commerciale di tali produzioni, che vengono
drasticamente compromesse e annullate. Le principali fitoplasmosi che colpiscono le
piante ornamentali sono state riscontrate in crisantemo, in cui si manifestano fenomeni
di virescenza e di fillodia a carico dei fiori e riduzioni della dimensione fogliare
(Ragozzino et al., 1977; Bertaccini et al., 1990; 1992); in ranuncolo, in cui si ha un
anomalo sviluppo delle branche laterali ed infiorescenze malformate (Bertaccini et
al., 1998); in margherita in cui si manifestano giallumi fogliari ed emissione eccessiva
di ricacci laterali a carico delle branche (Conti e Mela, 1987).
In questo lavoro viene riportata la prima segnalazione del “Picris echioides yellows
phytoplasma” (fitoplasma appartenente al gruppo 16SrIX) in piante di margherita
(Argyranthemum frutescens L.).
Materiali e metodi
Durante un programma di monitoraggio condotto presso alcuni vivai della regione
Lazio, sono state individuate delle piante di A. frutescens manifestanti sintomi
riconducibili ad infezioni di origine fitoplasmatica: giallumi diffusi a livello fogliare,
anomalo sviluppo di germogli ascellari laterali, tale da fare assumere alle piante il
tipico aspetto di scopazzi, malformazioni di foglie ed infiorescenze.
Il DNA totale è stato estratto da otto piante sintomatiche seguendo il protocollo
proposto da Doyle e Doyle (1990) opportunamente modificato, partendo da 0,5 g
di tessuto fogliare. Al fine di individuare la presenza del fitoplasma, il DNA è
stato sottoposto ad amplificazione genica mediante PCR con la coppia di “primer”
universale P1/P7 (Deng and Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995) e PCR “nested” con
61
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
i “primers” R16F2n/R16R2 (Gundersen e Lee, 1996); è stata inoltre effettuata una
PCR diretta con la coppia di “primers” universali U5/U3 (Lorenz et al., 1995).
L’amplificazione con i “primers” P1/P7 e R16F2n/R16R2, è stata eseguita secondo
i seguenti parametri: denaturazione iniziale a 94°C per 3 min, 35 cicli comprendenti
denaturazione a 94°C per 45 s, “annealing” a 55°C per 1 min, ed allungamento a 72°C
per 2 min, a cui è seguita una fase di allungamento finale a 72°C per 10 min. I prodotti
della prima amplificazione sono stati utilizzati come templato nella PCR “nested”,
con le seguenti condizioni di temperatura: denaturazione iniziale a 95°C per 3 min,
35 cicli comprensivi di denaturazione a 94°C per 1 min, “annealing” a 55°C per 2
min, allungamento a 72°C per 3 min, ed infine un’ultima fase di allungamento a 72°C
per 7 min. L’amplificazione con i “primers” U5/U3 è stata invece ottenuta con una
denaturazione iniziale di 95°C per 3 min, 35 cicli comprendenti: denaturazione a 94°C
per 1 min, “annealing” a 55°C per 1 min, allungamento a 72°C per 1 min 30 s, e una
fase di allungamento finale a 72°C per 10 min.
I seguenti campioni di riferimento sono stati inseriti come controlli positivi: “Picris
echioides yellows phytoplasma” (PEY, 16SrIX-C) (Bertaccini, 2010), “severe aster
yellows phytoplasma” (SAY, 16SrI-B); “elm yellows phytoplasma” (EY, 16SrV-A) e
“stolbur phytoplasma” (STOL, 16SrXII-A), questi ultimi presenti in collezione presso
il CRA-PAV. In ogni esperimento sono stati altresì inclusi un controllo negativo (sano)
e il bianco.
I frammenti di DNA così ottenuti sono stati sottoposti ad analisi del polimorfismo della
lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP), utilizzando le seguenti endonuclesi:
TaqI, RsaI e MseI (Bio-labs®Inc). Dieci microlitri del prodotto della PCR “nested”
sono stati digeriti secondo le indicazioni fornite dall’azienda produttrice e i profili di
restrizione sono stati separati in un gel di poliacrilammide al 5% in tampone TBE 1X
e visualizzati a luce UV dopo essere stati trattati con bromuro di etidio.
Inoltre il DNA amplificato in PCR “nested” è stato purificato con il kit commerciale
Microcon PCR kit – Amicon, Bedford, MD, USA, e clonato in un sistema vettore
pGEM–T easy secondo le istruzioni del produttore (Promega, Madison, WI, USA). I
cloni sono stati, quindi, sequenziati e la sequenza ottenuta è stata confrontata in banca dati
(NCBI) mediante software BLAST. La stessa sequenza è stata sottoposta ad un saggio di
restrizione in silico con l’endonucleasi AluI, utilizzando il software iPhyClassifier (Zhao
et. al., 2009) al fine di caratterizzare ulteriormente il fitoplasma individuato.
Risultati e discussione
Tra le piante di Argyranthemum frutescens L. saggiate soltanto tre, provenienti dallo
stesso vivaio, sono risultate positive sia alla PCR “nested” con i “primers” R16F2n/
R16R2 che nella PCR diretta effettuata con i “primers” U5/U3, confermando la presenza
di fitoplasmi. La mancata positività delle altre piante potrebbe essere dovuta al fatto che
i tessuti floematici erano già fortemente compromessi per la gravità dei sintomi.
L’analisi dei profili di restrizione eseguita con le endonucleasi TaqI, RsaI e MseI ha
62
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
confermato la presenza di un fitoplasma appartenente al gruppo 16SrIX. Dall’analisi
dei frammenti di restrizione virtuale, effettuata con l’enzima AluI, è stato possibile
confermare l’appartenenza del fitoplasma individuato sulle piante di margherita
sintomatiche al sottogruppo di “Picris echioides yellows” (16SrIX-C) (Heinrich et
al., 2001). Le sequenze dei cloni relative al gene ribosomico 16S, analizzate con
il programma NCBI BLAST, hanno messo in evidenza un’omologia del 99% con
“Picris echioides yellows” (PEY, 16SrIX-C). Questo lavoro rappresenta la prima
segnalazione di un fitoplasma strettamente correlato a “Pichris echioides yellows” in
Argyranthemum frutescens L.
L’indagine effettuata in alcuni vivai del Lazio ha evidenziato la presenza di piante di
margherita con sintomi simili a quelli descritti in diversi vivai al dettaglio. Ciò mette
in luce l’importanza di controlli fitosanitari a livello di produzione, per garantire la
qualità e la sanità del materiale che viene immesso sul mercato.
Parole chiave: “Pichris echioides yellows phytoplasma”, Argyranthemum frutescens,
PCR “nested”
Identification of 16SrIX-C phytoplasmas in Argyranthemum frutescens L.
Phytoplasmas diseases are well known to affect not only vegetable species of very
high economic importance like grape, stone and pome fruits, but even plant species
of horticultural interest, like ornamental species. In these cases the pathogens reduce
dramatically the quality of production, the vigor and vitality of the plants, modify the
flowers differentiation, compromising drastically their commercial value. Ssymptomatic
plants of cultivated Argyranthemum frutescens L., identified in some nurseries located
in Latium region were tested for phytoplasmas presence. The plants showed strong
symptoms including general yellowing and stunting, little-leaf and/or abnormal
proliferation of axillary shoots resulting in witches’ broom appearance, and reduced
size of flowers. The presence of a phytoplasma infection in symptomatic samples was
confirmed by amplification of 16S rDNA in direct PCR using the universal primers P1/
P7, followed by a nested PCR with primers R16F2n/R16R2, and in direct PCR using
universal primers U5/U3. The analysis of restriction fragments length polymorphism
of amplicons obtained in nested PCR, performed with the endonucleases TaqI, RsaI
and MseI, revealed that the phytoplasma belonged to the group 16SrIX. The same
amplicons were purified, cloned into pGEM–T easy vector system and sequenced.
The 16S rRNA gene sequences analyzed through in silico restriction assay using AluI
endonuclease (iPhyClassifier software) identified the phytoplasma as Picris echioides
yellows, belonging to the 16SrIX subgroup C. The sequence analysis (NCBI BLAST
program) showed an homology of 99% with the same phytoplasma. This is the first
report of 16SrIX-C phytoplasma infection in A. frutescens.
Key words: Pichris echioides yellows phytoplasma, Argyranthemum frutescens, PCR nested
63
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il lavoro è stato svolto nell’ambito del P.F. STRATECO, finanziato dal MiPAAF.
Lavori citati / References
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64
TRASMISSIONE DI FITOPLASMI ED
INSETTI VETTORI
PHYTOPLASMA TRANSMISSION
AND INSECT VECTORS
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
FITOPLASMI E TRASMISSIONE PER SEME
Maurizio Conti
Istituto Virologia Vegetale, CNR, (IVV) Strada delle Cacce 73, 10135 Torino, Italy.
E-mail: [email protected]
Introduzione
L’eventualità che i fitoplasmi possano trasmettersi attraverso il seme delle piante
ospiti non è stata presa in considerazione se non lungo tempo dopo la scoperta di
questi patogeni (1967), forse perché molto spesso le piante infette presentano
alterazioni di tale gravità da renderle sterili, inducendo ad escludere tale possibilità
a priori. Conforta questa opinione anche il fatto che i virus delle piante localizzati
nel solo floema – come i fitoplasmi - non sono trasmessi per seme. Le prime ricerche
specifiche sulla trasmissione per seme dei fitoplasmi, iniziate tra la fine del ‘900 e
il principio del secolo corrente, hanno evidenziato la complessità di questi studi e
lasciano ancora adito a molte incertezze (Khan et al., 2002a; Cordova et al., 2003;
Jiang et al., 2004; Botti e Bertaccini, 2006; Calari et al., 2011). Con il presente lavoro
si intende portare a conoscenza di risultati di indagini realizzate negli anni settanta del
secolo scorso e mai pubblicate perché incompiute, che potrebbero però fornire spunti
utili a nuovi studi sull’argomento.
Materiali e metodi
Al fine di ottenere semi da piante infette, alcune vinche (Catharanthus roseus)
allevate da seme in serra, sono state innestate con marze prelevate da piante infette
con un isolato di “aster yellows” (CY: 16SrI-B) dopo che avevano sviluppato 2-4 fiori.
I primi sintomi di infezione sono comparsi 2-3 settimane più tardi ma gli ultimi fiori
normali hanno prodotto frutti con semi che sono stati raccolti, conservati a secco per
un mese circa e quindi seminati in terreno sterilizzato, in serra. I semenzali ottenuti
sono stati allevati in condizioni di isolamento per oltre due anni, insieme con piante
coetanee sane, utilizzate come controlli per agevolare il rilevamento di eventuali
sintomi di infezione. Soggetti che presentavano alterazioni di natura dubbia sono stati
controllati per la presenza di infezioni da fitoplasmi mediante microscopia elettronica
(in sezioni ultrasottili di tessuti) e prove di trasmissione per innesto a vinche sane.
E’ appena il caso di ricordare che all’epoca i moderni mezzi diagnostici non erano
purtroppo disponibili.
67
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Risultati e discussione
I sintomi sulle vinche in fioritura infettate per innesto sono stati: virescenza, giallume,
riduzione di sviluppo, accorciamento degli internodi e scopazzi. Dai frutti prodotti sono
stati raccolti complessivamente un centinaio di semi che hanno originato 79 semenzali.
A circa quattro mesi dall’emergenza, questi presentavano due aspetti distinti: (A)
normali, non distinguibili dai controlli sani: in tutto 36 piante; (B) di sviluppo ridotto
e portamento cespuglioso per l’emissione di numerosi ricacci basali e laterali: 39
piante, delle quali solo 7 con uno o più fiori. Altre 4 piante avevano aspetto intermedio
ai precedenti. Con il passare del tempo, ciascun gruppo di piante ha mantenuto il
portamento originario, accentuandone anzi i caratteri: le piante di tipo A sono cresciute
in modo normale, conservando l’aspetto di piante sane, come i controlli; le piante di
tipo B sono rimaste di sviluppo ridotto, aspetto cespuglioso e non hanno prodotto fiori,
se non in pochi casi e parecchi mesi dopo l’emergenza. I fiori erano inoltre di numero
e dimensioni inferiori alla norma, con petali disuguali e deformati.
Da piante del tipo B prove di trasmissione per innesto a vinche sane sono state
eseguite 8, 13 e 20 mesi dopo l’emergenza. Una sola pianta delle 82 innestate
complessivamente ha sviluppato sintomi di infezione da CY (riduzione di sviluppo,
virescenza, miniaturizzazione delle foglie) e la microscopia elettronica ha confermato
in essa la presenza di fitoplasmi (R.G. Milne, dati non pubblicati). Gli altri controlli
effettuati al microscopio elettronico direttamente su piante del tipo B, a vari stadi di
sviluppo, fino a due anni dall’emergenza, sono risultati tutti negativi.
Anche le indagini di molti anni or sono, su riportate, non hanno fornito risultati
conclusivi sulla trasmissibilità per seme dei fitoplasmi come anche, del resto, quasi
tutti gli studi condotti in epoca più recente (Cordova et al., 2003; Jiang et al., 2004;
Chung et al., 2006). Tra questi, i risultati ottenuti con le indagini sulla malattia degli
scopazzi dell’erba medica, diffusa in Oman, sono quelli che maggiormente sembrano
suggerire la possibilità della trasmissione per seme, almeno per questa particolare
malattia (Khan et al., 2002b; Botti e Bertaccini, 2006). Grazie alle metodologie
diagnostiche attualmente disponibili, gli studi sulla trasmissibilità per seme dei
fitoplasmi potrebbero essere affrontati, oggi, con probabilità di successo molto
maggiori: se così fosse, anche qualcuno dei dati riferiti nel presente lavoro potrebbe
forse tornare utile allo scopo.
Parole chiave: epidemiologia, interazioni pianta-patogeno, prevenzione, lotta,
quarantena
Phytoplasmas and seed transmission
The question of whether or not phytoplasmas might be transmitted through the seeds
of their host plants was not considered for long after they had been discovered as plant
pathogens (1967). This may be because phytoplasma diseases often cause sterility of
68
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
the affected plants which would exclude such possibility, and possibly also because
plant pathogenic viruses which, like phytoplasmas, are strictly limited to the phloem,
are not seed borne. This paper reports some data from studies carried out long ago
(1969-1974) on the seed transmissibility of one aster yellows phytoplasma (CY:
16SrI-B). Such studies could not be completed, mostly due to the lack of advanced
diagnostic means like those now available but they might supply some data useful
for future research. Healthy periwinkle plants grown in the glasshouse were graftinfected with CY when they were bearing 2-4 flowers and showed early symptoms
of infection in 2-3 weeks. As plants grew on, symptoms became more severe but the
last ‘normal’ flowers yielded several fruits with seeds. These were collected, stored
for one month and then sown in steam sterilized soil in the glasshouse. About four
months after 79 seedlings had emerged, 36 of them showed a normal appearance
(A), resembling that of healthy controls, but 39 other plants showed growth reduction
and bushy appearance due to the production of many basal and lateral shoots (B).
Besides, only 7 of them had flowers. As plants grew on, those of the A type maintained
their normal appearance, like healthy controls, while those of the B type became
increasingly bushy, produced no or only very few flowers and remained considerably
reduced in growth. Due to the lack of modern diagnostic techniques, attempts to detect
possible phytoplasma presence in plants of the B type were done by graft-transmission
to indicator plants and electron microscopy. Graft transmission trials were done 8, 13
and 20 months after plant emergency. As a result, only one of 82 graft-inoculated
periwinkles developed CY symptoms and typical phytoplasma cells were detected in
its phloem by the electron microscope. The other electron microscopy observations
done directly on B-type plants were negative. Although the work here reported did not
supply conclusive results, it was believed to worth publication in the hope that such
data may be useful to and may stimulate future research in this field.
Key words: epidemiology, plant-pathogen interactions, prevention, control, quarantine
Lavori citati / References
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70
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
INDAGINI EPIDEMIOLOGICHE SU ‘CANDIDATUS
PHYTOPLASMA ASTERIS’ IN COLZA
N. Mori1, F. Pavan2, N. Contaldo3, S. Paltrinieri3, A. Bertaccini3
DAFNAE-Università di Padova, Viale dell’Università 16, 35020 Legnaro (PD)
2
DISA - Università di Udine, Via delle Scienze 206, 33100 Udine
3
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Dall’anno della sua prima segnalazione in Italia su colza nel 2009 (Rampin et al.,
2010), piante con sintomi ascrivibili alla presenza di ‘Candidatus Phytoplasma
asteris’ sono state segnalate in molti appezzamenti della crucifera in Veneto (Mori
et al., 2010). La produzione delle piante sintomatiche è severamente compromessa
sia a livello quantitativo che qualitativo. I semi, pur evidenziando malformazioni
e avvizzimenti che determinano dimensioni e peso inferiori al normale, riescono
comunque a germogliare e a propagare il fitoplasma (Olivier et al., 2006, Olivier
e Galka, 2008; Calari et al., 2011). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di
indagare alcuni aspetti epidemiologici del fitoplasma agente del giallume dell’astro
in colza. In particolare è stata confermata la trasmissione del fitoplasma attraverso
il seme ed indagato il possibile ruolo nella diffusione dell’agente fitopatogeno di
omotteri auchenorrinchi catturati nei od in prossimità degli appezzamenti infetti.
Materiali e metodi
Trasmissione del fitoplasma attraverso il seme. La sperimentazione è stata condotta
durante la stagione vegetativa 2011 presso una serra a prova di insetto dislocata
presso l’azienda sperimentale “L. Toniolo” dell’Università di Padova. Sono state
indagate tre diverse cultivar di colza: PR45D01, Excalibur e Catalina. Per ogni
cultivar è stato impiegato il seme commerciale utilizzato per la semina del 2008
e del 2009, e quello raccolto da piante sintomatiche e non nel 2010. I semi sono
stati posti in alveoli contenente terriccio sterile nel marzo del 2011. A 3, 7, 15, 30
giorni dall’emergenza sono state effettuate osservazioni sulla germinabilità dei semi,
sui sintomi e sullo sviluppo vegetativo (valutando il peso della massa vegetativa)
delle piante, e sulla presenza di fitoplasmi attraverso indagini molecolari effettuate
mediante estrazione dell’acido nucleico da campioni di 2 gr di materiale vegetale
con il kit “Macherey-Nagel DNA from plant and fungi”. L’amplificazione è quindi
stata effettuata utilizzando i “primers” P1A/P7A (Lee et al., 2004), seguiti da R16F2/
71
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
R2 (Lee et al., 1995) e da 16R758f/16R1232r (=M1/M2) (Gibb et al., 1995) cui è seguita
la digestione enzimatica di quest’ultimo amplicone con Tru1I (Fermentas, Vilnius,
Lituania) a 65°C per 10 minuti.
Cattura ed identificazione insetti potenziali vettori. Durante i mesi estivi del 2012 sono
stati catturati con retino entomologico auchenorrinchi potenziali vettori di fitoplasmi
presso appezzamenti con piante di colza infette situati nell’azienda “L. Toniolo”.
Dato il notevole sviluppo vegetativo e l’alta densità delle piante, non è stato possibile
indagare la presenza di questi omotteri al centro degli appezzamenti. Dopo la raccolta,
gli insetti sono stati conservati in alcool 75%, identificati e sottoposti ad indagini
molecolari effettuate con le metodologie descritte sopra dopo estrazione dell’acido
nucleico con un metodo basato sull’uso di CTAB (Angelini et al., 2001).
Risultati e discussione
Trasmissione del fitoplasma attraverso il seme. I semi derivanti da piante sintomatiche
hanno evidenziato una minore capacità di germinare (77,3%) rispetto a quelli da
piante non sintomatiche (89,8%) o commerciali (93,9%). Semi provenienti da piante
di colza infette hanno originato progenie mostranti malformazioni, ingrossamento del
fusto, ingiallimento fogliare, ma per quanto riguarda lo sviluppo della plantula non
sono state osservate differenze significative nel peso della massa vegetativa.
Dalle analisi molecolari condotte, è emerso che il 40% delle plantule germinate da
seme derivato da piante infette è risultato positivo alla presenza di ‘Ca. P. asteris’, lo
stesso fitoplasma riscontrato nelle piante madri. Nelle plantule originatesi da seme
proveniente da piante asintomatiche il fitoplasma è stato ritrovato nel 22% dei casi
esaminati. La presenza del fitoplasma è stata rilevata in tutti i campioni analizzati
da 3 fino a 30 giorni dall’emergenza. Anche le piante da seme commerciale sono
risultate infette in percentuali variabili dal 5 al 40%. Questi dati confermano l’alta
percentuale di piante infette provenienti da seme raccolto da piante sintomatiche
osservato in canola (Brassica napus e B. rapa) (Olivier e Galka, 2008). I risultati
dimostrano che può essere infetto anche il seme prelevato da piante non sintomatiche
e quello commerciale.
Identificazione e ruolo insetti potenziali vettori. In prossimità delle piante infette
in pieno campo, sono stati catturati 132 omotteri auchenorrinchi. Sono stati raccolti
individui appartenenti ai generi: Chiasmus, Euscelidius, Macrosteles, Psammotettix e
Recilia della famiglia dei cicadellidi; Laodelphax e Toya della famiglia delfacidi; Cixius
della famiglia cixiidi. Dalle analisi molecolari condotte è emerso che in 22 insetti (1
Macrosteles quadripunctulatus, 5 Psammottetix alienus, 2 P. confinis, 13 P. striatus,
1 Toya propinqua) sono stati identificati fitoplasmi appartenenti al gruppo ribosomico
16SrI (giallume dell’astro), i fitoplasmi erano sempre individuati in infezione singola.
Le piante infette da fitoplasmi sono capaci di portare a termine la produzione di
seme, seppur con caratteristiche quanti-qualitativo inferiori di quelle sane. Da questa
72
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
semente si sono sviluppate piante sintomatiche ed infette dallo stesso fitoplasma delle
piante madri da cui sono state generate. Il movimento di sementi provenienti da piante
infette spiegherebbe la diffusione geografica a largo raggio della malattia in aree in
cui essa non è presente. Inoltre sono stati catturati molti insetti comunemente presenti
negli areali di coltivazione padani, appartenenti agli omotteri auchenorrinchi, che
sono risultati positivi alle analisi molecolari. Ulteriori indagini e prove di trasmissione
dirette da pianta infetta a pianta sana sono in corso per verificare la reale capacità
infettiva di queste specie.
Parole chiave: giallume dell’astro, trasmissione via seme, auchenorrinchi, crucifere
‘Candidatus Phytoplasma asteris’ epidemiology in oil seed rape
The presence of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ in oilseed rape already reported
in Italy was studied to verify its epidemiological aspects using three cultivars:
PR45D01, Excalibur and Catalina. In particular results of analyses carried out to
verify germination ability for this phytoplasmas/plant species show that seeds from
infected plants have 77.3%, while seeds from asymptomatic plants 89.8% and
commercial seeds 93.9%. Seedlings from infected mother plants show malformation,
stem thickening, leaf yellowing, however no significant differenced were reported
between these plants and seedlings from healthy mother plants in both weight and
amount of vegetation. Molecular analyses carried out during the vegetation period
show that 40% of seedling from infected mother plants was positive to ‘Ca. P. asteris’.
Seedlings from asymptomatic mother plants was positive in 22% of the cases to
phytoplasmas allowing to speculate an field-insect transmission or a latent infection
in mother plants. Among the insect species collected in infected fields Macrosteles
quadripunctulatus, Psammottetix alienus, P. confinis, P. striatus and Toya propinqua,
resulted to carry 16SrI phytoplasmas. Phytoplasma infected plants are able to produce
seed, seedlings produced were highly infected with same phytoplasma. This can
explain the geographic spreading of the disease in non infected areas and the presence
of numerous potential insect vector can be the way to further disseminate the disease
producing eventually serious epidemic. Research are in progress to verify the roles
of both transmission ways in the epidemiology of winter oil seed rape phytoplasmas
disease epidemiology.
Key words: aster yellows, seed trasmission, auchenorrincha, cruciferous plants
Ringraziamenti/Acknowledgements
Si ringrazia il dottor Davide Bollettin per la collaborazione prestata.
73
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
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DIAGNOSI E QUANTIFICAZIONE SPECIFICHE DI
‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA MALI’ IN INSETTO
MEDIANTE EVAGREEN “REAL-TIME” PCR
M. Monti1, M. Martini2, R. Tedeschi1
DISAFA, Università degli Studi di Torino, Via Leonardo da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
2
DISA, Università Degli Studi di Udine, Via delle Scienze 206, 33100 Udine
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Diversi approcci di “real time” PCR sono stati sviluppati per l’identificazione e
quantificazione di ‘Candidatus Phytoplasma mali’(“apple proliferation phytoplasma”,
APP) in piante ospiti e vettori, alcuni basati sull’uso di agenti intercalanti come il
SYBR Green, (Galetto et al., 2005; Jarausch et al., 2004), altri invece sull’impiego di
sonde specifiche come quelle TaqMan (Baric e Dalla-Via, 2004; Aldaghi et al., 2009;
Nikòlic et al., 2010). In questo lavoro si è scelto di utilizzare l’agente intercalante
EvaGreen®, dimostrato più efficiente del SYBR®Green (Eischeid, 2011), in
combinazione con un approccio relativo di quantificazione che correla la quantità del
fitoplasma a quella del DNA dell’insetto.
Materiali e metodi
Per la messa a punto del metodo sono stati impiegati DNA di individui di Cacopsylla
melanoneura (Förster) infetti da ‘Ca. P. mali’ e di insetti infetti da altri fitoplasmi
quali ‘Ca. P. pyri’,‘Ca. P. prunorum’, flavescenza dorata e ‘Ca. P. phoenicium’ (usati
come controlli). Il metodo consiste di due reazioni “real time” PCR consecutive
usando 2x SsoFast™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad, CA). La prima prevede l’uso
della coppia di “primers” rpAP15f-mod/rpAP15r3 (TGCTGAAGCTAATTTGGC/
CCCATGAATATTAACCTCCT) (Martini et al., 2010), e amplifica una porzione di
238 nucleotidi del gene ribosomico rplV di APP, mentre la seconda, necessaria per poter
normalizzare i dati e quantificare il titolo del fitoplasma, utilizza la coppia di “primers”
MqFw/MqRv (AACGGCTACCACATCCAAGG/GCCTCGGATGAGTCCCG), che
amplifica una porzione di 98 nucleotidi del gene 18S rDNA (Marzachì et al., 2005).
Per entrambi i geni, è stata prodotta una curva standard a partire da 8 diluizioni seriali
di un plasmide contenente il frammento del gene rp del fitoplasma AP15 (Martini et
al., 2010), e di uno contenente la porzione del gene 18S rDNA dell’insetto (Marzachì
e Bosco, 2005). Per ottenere una stima della quantità dell’intero gene 18S rDNA di
C. melanoneura il risultato dell’amplificazione è stato moltiplicato per 20, sulla base
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
dell’ipotesi che il frammento amplificato sia circa 1/20 della dimensione dell’intero
gene 18S rDNA dello psillide Trioza eugeniae Froggatt (2.199 nucleotidi). Per
l’amplificazione e l’analisi di “melting temperature” di APP e del 18S rDNA sono
stati seguiti i seguenti protocolli termici: incubazione a 95°C per 2 min, e 40 cicli di
amplificazione a 94°C per 15 s, 56°C per 15 s, 72°C per 20 s, estensione finale a 72°C
per 8 min; incremento da 65°C a 95°C di 0,2°C/s (per APP) e incubazione a 94°C per
3 min, e 37 cicli di amplificazione a 94°C per 45s, 65°C per 1 min e incremento da
65°C a 94°C di 0,5°C/s (per il 18S rDNA). Il titolo del fitoplasma in ciascun insetto è
stato espresso come unità genomiche (GU) di fitoplasma per picogrammi (pg) di 18S
rDNA. La specificità della metodica è stata valutata utilizzando nella stessa reazione
di “real time” PCR campioni di DNA di insetto contenenti ‘Ca. P. mali’, campioni
contenenti ‘Ca. P. pyri’, ‘Ca. P. prunorum’, flavescenza dorata e ‘Ca. P. phoenicium’.
La sensibilità del metodo è stata saggiata usando diluizioni seriali (da 109 a 1) di un
campione di DNA di insetto infetto da ‘Ca. P. mali’, analizzate in “real time” PCR e in
PCR “nested”, quest’ultima effettuata impiegando “primers” e condizioni di reazione
precedentemente descritti (Deng e Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995; Lorenz et al.,
1995). Riproducibilità e ripetibilità di entrambi i saggi (APP e 18S rDNA) sono state
valutate ed espresse come coefficiente di variazione (CV%) di GU di fitoplasma e pg
del frammento 18S rDNA.
Risultati e discussione
Su un totale di 61 campioni inclusi nel saggio, la specificità dei “primer” per APP
è stata confermata dalla amplificazione dei soli campioni di DNA contenenti ‘Ca.
P. mali’, come dimostrato dalla presenza di un unico picco a 75,5°C (±0,260)
osservato durante l’analisi della curva di dissociazione. Per questi campioni il titolo
fitoplasmatico variava da 5,940x102 a 2,510x104 GU/pg di 18S rDNA dell’insetto.
Sono state confermate buone efficienze delle curve standard per entrambi i geni:
una pendenza media di -3,474 (±0,05) e R2 > 0,999, per il 18S rDNA, e di -3,345
(±0,08) e un R2 > 0,998, per il gene rplV, hanno dimostrato un’efficienza del 94 e
99%, rispettivamente. Inoltre non è stata individuata nessuna differenza in termini di
sensibilità tra “real time” PCR e PCR-“nested” in quanto l’ultima quantità rilevata
da entrambe le metodiche era pari a 38 GU/µl. Sono state dimostrate affidabilità
e robustezza del saggio per APP e per 18S rDNA: sono stati ottenuti valori di CV
inferiori a 13,63 e 5,88% per il test di ripetibilità e inferiori a 9,11 e 10,08%, per il test
di riproducibilità, rispettivamente.
Il metodo sviluppato è risultato valido ed efficiente per la quantificazione del titolo
di ‘Ca. P. mali’ negli insetti. Il suo impiego potrebbe quindi essere lo studio del titolo
fitoplasmatico negli insetti nel tempo, nell’ottica di capire meglio la biologia del
patogeno e sviluppare strategie di controllo più efficaci.
Parole chiave: gene rp, gene 18S rDNA, psille, scopazzi del melo, titolo fitoplasmatico
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Specific detection and quantification of ‘Candidatus Phytoplasma mali’ in insect
by EvaGreen real-time PCR
An implemented real time PCR protocol has been developed for the sensitive
and specific quantification of ‘Candidatus Phytoplasma mali’ (apple proliferation
phytoplasma, APP) in Cacopsylla melanoneura. The approach relates the
concentration of the phytoplasma to insect 18S rDNA, running two separated real
time PCR assays using 2x SsoFast™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad, CA), each
with a specific primer pair: rpAP15f-mod/rpAP15r3 primers which amplify a 238
bp fragment of the ribosomal protein rplV (rpl22) gene of APP, and MqFw/MqRv
primer pair which amplifies a 98 bp fragment of 18S rDNA gene. Standard curves
prepared from serial dilutions of plasmid containing a portion of 18S rDNA and
rplV-rpsC genes were used for absolute quantification of 18S rDNA and APP. The
phytoplasma titre in insects was expressed as genome units (GU) of phytoplasma
per picogram (pg) of individual insect 18S rDNA. Values ranging from 5.94*102 to
2.51*104 GU/pg of insect 18S rDNA were obtained for C. melanoneura adults. Both
assays revealed a good efficiency of amplification (94% for 18S rDNA and 99%
for rplV gene). Specificity was demonstrated by running in the same real time PCR
assay APP samples with other phytoplasmas: ‘Ca. P. pyri’, ‘Ca. P. prunorum’, ‘Ca.
P. phoenicium’ and “flavescence dorée” phytoplasma. The sensibility was evaluated
comparing the real time PCR method with a conventional 16S rDNA-based nestedPCR procedure. Repeatability and reproducibility were also evaluated: CV equal
to 13.3% and 5.88% for reproducibility test, and equal to 9.11% and 10.08% for
repeatability test were obtained for phytoplasma and insect qPCR assays, respectively.
The method described has been demonstrated reliable, sensitive and specific for APP
quantification in insects and can be applied for studying the trend of phytoplasma
titre in the vectors, allowing a deepen investigation on the disease epidemiology.
Keywords: apple proliferation, psyllids, phytoplasma titre, rp gene, 18S rDNA gene
Lavori citati / References
aLDaGHi M., s. Massart, o. DutrecQ, a. Bertaccini, M.H. JiJakLi, PH. LePoivre,
2009. A simple and rapid protocol of crude DNA extraction from apple trees
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Virological Methods, 156, 96-101.
Baric s., J. DaLLa-via, 2004. A new approach to apple proliferation detection: a
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nonculturable mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
77
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
INDAGINI PRELIMINARI SU INSETTI VETTORI DI
‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA PHOENICIUM’ IN LIBANO
R. Tedeschi1, L. Picciau1, F. Quaglino2, P. Casati2, M. Molino Lova3,
Y. Abou-Jawdah4, P.A. Bianco2, A. Alma1
DISAFA, Università degli Studi di Torino - via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
2
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia,Università degli Studi di Milano, Via
Celoria 2, 20133 Milano
3
AVSI Lebanon, Rue St. Fawka, Centre Jean Paul II, 1200 Jounieh Ghadir, Lebanon
4
Faculty of Agricultural and Food Sciences (FAFS), American University of Beirut,
PO Box 11-0236, Beirut, Lebanon
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
La malattia denominata “almond witches’ broom” (AlmWB) ed associata alla presenza
di ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ ha seriamente compromesso, nell’ultimo
decennio, la coltivazione di mandorlo e nettarine in Libano (Abou-Jawdah et al., 2002;
2009). Gli insetti vettori di questa malattia sono ancora sconosciuti, anche se recenti
ricerche incentrate sulla famiglia Cicadellidae (Hemiptera, Auchenorrhyncha) (Dakil
et al., 2011) hanno permesso di rilevare la presenza del fitoplasma in diverse specie,
tra cui Asymmetrasca decedens (Paoli), Empoasca decipiens Paoli ed Euscelidius
mundus (Haupt). Al fine di ampliare le conoscenze sui potenziali vettori di AlmWB,
nuove indagini sono state condotte su altri due gruppi di insetti noti come vettori di
fitoplasmi, gli psillidi (Hemiptera, Sternorrhyncha, Psillidae) ed i cixiidi (Hemiptera,
Fulgoromorpha, Cixiidae).
Materiali e metodi
Durante gli anni 2010-2012 sono state effettuate regolari raccolte di insetti mediante
trappole Malaise e cromotropiche gialle, da aprile a novembre, in due località
del Libano, una nel Nord (Feghal) e una nel Sud (nella provincia di Marjayoun),
coltivate rispettivamente a mandorlo e nettarine, dove sono stati osservati gravi
attacchi di AlmWB negli ultimi anni. I barattoli delle trappole Malaise e le trappole
cromotattiche sono stati sostituiti a intervalli quindicinali. Gli insetti raccolti sono stati
successivamente osservati al microscopio stereoscopico per la loro identificazione e
quindi sottoposti ad analisi molecolari. Il DNA è stato estratto seguendo il protocollo
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
descritto da Marzachì et al. (1998) e quindi amplificato mediante l’uso sia dei “primer”
universali P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991; Smart et al., 1996) seguiti dai “primers” R16F2n/
R2 (Gundersen e Lee, 1996) in “nested” PCR, sia dai “primers” gruppo-specifici
ALW-F2/ALW-R2 (Abou-Jawdah et al., 2003). In ciascuna analisi sono stati inseriti
controlli positivi (DNA estratto da mandorli infetti) e negativi (DNA di insetti sani).
Risultati e discussione
Per quanto riguarda gli psillidi, Cacopsylla myrthi (Puton) è stata la specie più
abbondante in entrambe le località indagate, mentre un discreto numero di Trioza galii
Förster è stato trovato nel Sud del Libano. Nessuno degli individui di psille saggiate è
risultato positivo a ‘Ca. P. phoenicium’.
Per quanto riguarda invece i cixiidi, le osservazioni morfologiche hanno permesso
di individuare la presenza di 5 generi: Hyalesthes, Tachycixius, Cixius, Setapius e
Pentastira. A causa delle ancora limitate conoscenze della cixiidofauna dell’area
medio-orientale, l’attribuzione specifica è stata possibile solo per Hyalesthes obsoletus
Signoret, mentre gli esemplari degli altri generi sembrano appartenere a diverse specie
non ancora descritte. Gli individui appartenenti ai generi Cixius e Tachycixius sono
risultati i più abbondanti in entrambe le località. Le analisi molecolari hanno permesso
di rilevare la presenza di ‘Ca. P. phoenicium’ in esemplari di Cixius sp., Tachycixius
spp., H. obsoletus e Pentastira spp. con percentuali variabili da 5% a 77%.
Considerando che la presenza di un patogeno in un insetto non è prova della sua
funzione di vettore, questi risultati dovranno essere avvalorati da prove sperimentali
di trasmissione per accertare che i cixiidi risultati positivi a ‘Ca. P. phoenicium’
siano realmente in grado di trasmettere il fitoplasma a piante sane di mandorlo o
nettarine. Inoltre, ulteriori indagini saranno necessarie per studiare la biologia di
questi insetti in Libano e, in attesa di una accurata revisione tassonomica di questo
gruppo di insetti, sono in corso di studio protocolli molecolari per discriminare le
specie in esame.
Parole chiave: “almond witches’ broom”, analisi molecolari, cixiidi, psillidi
Preliminary survey on potential insect vectors of ‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ in Lebanon
Almond witches’ broom (AlmWB) phytoplasma caused, in the last decade, serious
economic losses in peach, nectarine and almond cultivations in Lebanon. The
insect vectors are still unknown even if recently some leafhoppers tested positive to
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’. New surveys were carried out in the years
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
2010-2012 in the North (Feghal) and South (Marjayoun province) of Lebanon, to
search further possible vectors. The focus was mainly on two groups, psyllids and
planthoppers, that include many species known as phytoplasma vectors. The insects
were sampled biweekly by means of Malaise and yellow sticky traps from April
to November, observed under the microscope for morphological discrimination and
analysed by molecular tools for phytoplasma presence. Cacopsylla myrthi (Puton)
was the most abundant psyllid species in both localities, while in the South a fair
number of Trioza galii Förster was collected. None of the analysed psyllids tested
positive to ‘Ca. P. phoenicium’. Concerning cixiids, 5 genera were collected:
Hyalesthes, Tachycixius, Cixius, Setapius e Pentastira. Due to the limited knowledge
about the Middle-East cixiids, the identification at species level was possible only
for Hyalesthes obsoletus Signoret, while the individuals of the other genera seem
to belong to different yet undescribed species. Cixius sp. and Tachycixius spp. were
the most abundant cixiids, and AlmWB phytoplasma was detected in Cixius sp.,
Tachycixius spp., H. obsoletus and Pentastira spp. specimens, with infection rates
ranging from 5% to 77%. As the detection of phytoplasmas in an insect does not
prove its vector activity, these results need to be validated by transmission trials.
Moreover, further investigations on the biology of these species in Lebanon are
required. Awaiting a careful revision this insect group taxonomy, molecular tools for
their specific discrimination are being implemented.
Key words: almond witches’ broom, molecular analyses, planthoppers, psyllids
Lavori citati / References
aBou-JaWaDH Y., a. karakasHian, H. soBH, M. Martini, i-M. Lee, 2002. An
epidemic of almond witches’ broom in Lebanon: classification and
phylogenetic relationship of the associated phytoplasma. Plant Disease, 86,
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aBou-JaWDaH Y., H. soBH., M. akkarY, 2009. First report of almond witches’ broom
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on nectarine and peach trees in Lebanon. EPPO Bulletin, 39, 94-98.
DakHiL H.a., e. a-f. HaMMaD, c. eL-MoHtar, Y. aBou-JaWDaH, 2011. Survey of
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DenG s., c. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and
nonculturable Mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
GunDersen D.e., i-M. Lee, 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nestedPCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea,
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81
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
MarZacHì, c., f. veratti, D. Bosco, 1998. Direct PCR detection of phytoplasmas in
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LorenZ k.H., seeMüLLer e., kirkPatrick B.c., 1996. Phytoplasma-specific
PCR primers based on sequences of the 16S-23S rRNA spacer region. Applied
and Environmental Microbiology, 62, 2988-2993.
82
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
EMITTERI AUCHENORRINCHA PRESENTI IN AILANThUS
ALTISSIMA INFETTO DAL FITOPLASMA DELLA
FLAVESCENZA DORATA DELLA VITE
V. Forte1, E. Bortolamai2, L. Filippin1, E. Angelini1, N. Mori2
CRA-VIT – Viale XXVIII Aprile 26, 31015 Conegliano (TV)
DAFNAE-Università degli Studi di Padova – Viale dell’Università 16, 35020
Legnaro (PD)
1
2
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il fitoplasma associato alla flavescenza dorata (FD), malattia epidemica che ancora
oggi causa gravi danni alla produzione viticola dell’Italia settentrionale, è stato
ritrovato, oltre che nella vite, anche in Ailanthus altissima (Mill.) (Filippin et al.,
2010). Questa pianta simaroubacea introdotta dalla Cina in Europa nel 1751, grazie
al suo sistema radicale esteso ed alla capacità di provocare effetti allopatici (Mergen,
1959), è divenuta specie invasiva in continua espansione. Oltre al vettore naturale
Scaphoideus titanus Ball, sono stati segnalati altri insetti in grado di trasmettere o
veicolare la FD, come Dictyophara europaea (L.) e Orienthus ishidae (Matsumura)
(Filippin et al., 2009; Mehle et al., 2011).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di indagare l’auchenorrincofauna su siepi
di ailanto con piante infette, presenti in prossimità di vigneti, al fine di evidenziare la
presenza di insetti in grado di veicolare il fitoplasma di FD.
Materiali e metodi
Il monitoraggio dell’auchenorrincofauna è stato effettuato nel 2011 tramite
campionamenti diretti della vegetazione con retino ed aspiratore entomologico e con
l’ausilio di trappole cromotropiche gialle. Con le trappole cromotropiche sono state
indagate una siepe in provincia di Treviso ed una in provincia di Vicenza. Le trappole,
sostituite ogni 15 giorni, da luglio a settembre, sono state poste a due diverse altezze
(0.4 m e 2 m).
Con i campionamenti diretti, eseguiti ogni 15 giorni da maggio a settembre, sono
state investigate 4 siepi situate in provincia di Treviso. Gli insetti raccolti sono stati
conservati in alcol 70% a -20°C per l’identificazione e per le indagini molecolari. La
presenza del fitoplasma negli esemplari raccolti, analizzati singolarmente o a pool di
2-5 individui, è stata effettuata mediante Taqman “real time” PCR (Angelini et al.,
2007).
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Risultati e discussione
Con i campionamenti diretti della vegetazione sono stati catturati 431 esemplari, di
cui 306 appartenenti alle specie Empoasca vitis (Göthe) e Metcalfa pruinosa (Say),
molti dei quali neanidi e ninfe. Tra le specie di maggior interesse sono stati raccolti
esemplari di D. europaea, Hyalesthes obsoletus (Signoret), H. scotti (Ferrari) e
Reptalus quinquecostatus (Dufour). Sono stati analizzati mediante analisi “real time”
PCR 125 individui, per un totale di 39 campioni, che sono risultati tutti non infetti da
fitoplasmi. Ulteriori studi su siepi o piante isolate di ailanto infette, presenti ai bordi
dei vigneti, sono in corso.
Il monitoraggio con le trappole cromotropiche ha permesso di catturare 166 esemplari,
raggruppabili in 25 specie di auchenorrinchi. Circa la metà degli individui catturati
appartiene alle specie: Fieberiella florii (Stål), Japananus hyalinus (Osborn), O.
ishidae, Philaenus spumarius (L.) e Synophropsis lauri (Horváth). Il 64% di tali
insetti è stato catturato con le trappole posizionate a 40 cm dal suolo. In provincia
di Vicenza è stato catturato un numero maggiore di specie e di individui rispetto a
Treviso, probabilmente a causa della ridotta estensione della siepe trevigiana, posta
peraltro ai limiti di una strada asfaltata. Tra le specie catturate, sono stati identificati 2
individui di S. titanus e 12 di D. europaea, oltre a diversi esemplari appartenenti alla
famiglia dei Cixiidi dei generi: Cixius, Hyalesthes e Reptalus.
In sintesi, complessivamente con le trappole e con il retino sono stati raccolti 597
individui, appartenenti a quasi 40 specie e 10 famiglie. Tra le specie catturate sono state
rinvenute specie vettrici di fitoplasmi, come D. europaea, che trasmette i fitoplasmi
FD-C da clematide a vite (Filippin et al., 2009), F. florii, che diffonde il ‘Candidatus
Phytoplasma mali’ (Tedeschi e Alma, 2006), H. obsoletus, vettore dell’agente di legno
nero (Maixner, 1994) ed infine alcune specie del genere Reptalus spp., associate a
fitoplasmi del gruppo 16SrXII (Palermo et al., 2004; Pinzauti et al., 2008; Cvrković
et al., 2013).
E’ stata rilevata una grande variabilità dell’entomofauna raccolta nei diversi
siti, probabilmente a causa della differente ubicazione delle siepi, della diversa
dimensione delle piante o della presenza di altre specie erbacee ed arbustive
all’interno delle stesse. In generale, il numero di insetti presenti su ailanto è stato
basso, a dimostrazione che questa pianta non è un ospite gradito a insetti con apparato
boccale pungente succhiatore. Dato il limitato numero di specie catturate in questo
lavoro e alla mancanza di individui infetti, si può ipotizzare che A. altissima abbia un
ruolo circoscritto nell’epidemiologia di FD.
Parole chiave: ailanto, cicaline, potenziali vettori
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Auchenorrhyncha fauna living on Ailanthus altissima infected by grapevine
“flavescence dorée” phytoplasma
“Flavescence dorée” (FD) is one of the most serious phytoplasma grapevine diseases in
North-Italy. It is an epidemic disease, spread by the Cicadellidae Scaphoideus titanus
Ball. However, recently new insect vectors or potential vectors of the phytoplasma
were identified: the leafhoppers Dictyophara europaea (L.) and Orienthus ishidae
(Matsumura). Moreover, the identification of FD phytoplasma in plants of Ailanthus
altissima and Clematis vitalba provided further insight into the epidemiology of
the disease and has led to the necessity of new focused studies. Investigation were
therefore carried out on the Auchenorrhyncha fauna living on A. altissima (tree of
heaven), in order to identify the potential vectors responsible for the transmission
of FD from A. altissima to other plants, including grapevine. Monitoring with sticky
traps and sweep net was carried out in 6 localities of Treviso and Vicenza provinces
(North-east of Italy). A total of 166 specimens, belonging to 25 species and 5 genera,
were captured by sticky traps. Sweep net allowed capturing 431 specimens, 306 of
them belonging to Empoasca vitis (Göthe) and Metcalfa pruinosa (Say) species. The
most frequent species identified were Fieberiella florii (Stål), Japananus hyalinus
(Osborn), O. ishidae, Philaenus spumarius (L.) and Synophrospis lauri (Horváth).
Moreover, 2 specimens of S. titanus and 12 of D. europea were found. The presence
of phytoplasmas belonging to the group of FD was analyzed in 125 specimens of the
Auchenorryncha order using real time PCR assays. No insects infected with the FD
phytoplasma were detected.
Key words: leafhopper, potential vector, tree of heaven
Ringraziamenti / Acknowledgements
Si ringrazia il personale del CRA-VIT di Susegana per la collaborazione.
Lavori citati / References
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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86
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
SOPRAVVIVENZA DEI DIVERSI STADI DI SVILUPPO DI
SCAphoIDeUS TITANUS SU AILANThUS ALTISSIMA
N. Mori1, V. Forte2, P. Collodel1, E. Angelini2
DAFNAE-Università degli Studi di Padova – Viale dell’Università 16, 35020
Legnaro (PD)
2
CRA-VIT – Viale XXVIII Aprile 26, 31015 Conegliano (TV)
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Scaphoideus titanus Ball, vettore di flavescenza dorata della vite (FD), è un insetto
ampelofilo: sulle piante del genere Vitis (V. riparia, V. vinifera, etc.), infatti, sono stati
ritrovati tutti gli stadi di sviluppo, uovo compreso (Vidano, 1966; Lessio et al., 2007).
Occasionalmente l’insetto è stato rinvenuto su piante erbacee ed arbusti spontanei,
sia nel suo areale di origine (Gibson, 1973; Barnett, 1976) sia in Europa (Caudwell et
al., 1970, Cravedi et al., 1993, Mazzoni et al., 2009). Recentemente il fitoplasma di
FD è stato identificato in piante di Ailanthus altissima (Mill.) (Filippin et al., 2010);
inoltre, indagini condotte sull’entomofauna presente su siepi di questa simaroubacea
hanno evidenziato la presenza di adulti di S. titanus (Forte et al., 2013). Lo scopo
del presente lavoro è stato quello di verificare la sopravvivenza dei diversi stadi di
sviluppo di S. titanus su piante di A. altissima a confronto con quella su vite.
Materiali e metodi
Al fine di verificare se S. titanus sia in grado di nutrirsi su A. altissima, neanidi, ninfe
ed adulti del cicadellide sono stati confinati in gabbie fabbricate su piante allevate
in vaso. Per ogni stadio di sviluppo considerato sono state costruite 4 gabbie con
rete antinsetto sull’ailanto ed altrettante su barbatelle di ‘Chardonnay’ di un anno.
All’interno di ogni gabbia sono stati rilasciati mediamente 15 individui, ottenuti da
un allevamento su vite allestito presso il CRA-VIT di Conegliano. Gli insetti sono
stati confinati il 6 giugno (1à e 2à età), 22 giugno (ninfe di 3à, 4à e 5à età) e 13 luglio
(adulti) nel 2011 e il 18 giugno, 29 giugno e 25 luglio nel 2012. Quotidianamente
fino al 7° giorno, e successivamente ogni settimana fino a 2 mesi dall’immissione,
è stata osservata e registrata la mortalità dei singoli individui. Complessivamente
sono stati impiegati 24 vasi di A. altissima e 24 vasi di ‘Chardonnay’, sui quali sono
stati immessi ed osservati circa 720 esemplari S. titanus. I dati raccolti sono stati
normalizzati ed analizzati con le curve di sopravvivenza di Kaplam-Maier.
87
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Risultati e discussione
Le neanidi allevate su A. altissima hanno evidenziato una sopravvivenza
significativamente minore rispetto a quella riscontrata su vite. Infatti dopo un giorno di
confinamento è stata registrata una mortalità media nei due anni del 43% e dopo 7 giorni
solo l’8% degli individui immessi era ancora vivo. Sui vasi di Chardonnay, invece, oltre
il 60% degli individui era sopravvissuto dopo una settimana in gabbia. La bassa vitalità
dei primi stadi di sviluppo di S. titanus sull’ailanto può essere imputata alla difficoltà di
adattamento delle neanidi dalla vite, su cui sono nate, alla nuova pianta.
Le ninfe allevate su A. altissima non hanno evidenziato diversità di sviluppo rispetto a
quelle confinate su vite. Dopo qualche giorno, in entrambe le piante, è stato osservato
un regolare cambio della muta ed un progressivo completamento dello sviluppo dallo
stadio preimmaginale a quello adulto. Per quanto riguarda la sopravvivenza, dopo
7, 28 e 56 giorni erano ancora vivi l’86, il 45 ed il 31% degli individui immessi su
ailanto, ed il 93, 48 e 24% su vite, senza differenze significative tra le due tesi.
Gli adulti confinati su ailanto hanno evidenziato una buona adattabilità, anche se più
bassa rispetto alla vite. Infatti, sono stati osservati individui vivi di S. titanus fino a 35
giorni sulla simaroubacea, con una sopravvivenza del 67, 36 e 11% (rispettivamente a
7, 28 e 35 giorni); su ‘Chardonnay’ sono stati ritrovati adulti vivi anche dopo 48 giorni
di confinamento ed una sopravvivenza significativamente maggiore (80, 51 e 38%
rispettivamente a 7, 28 e 35 giorni).
All’interno delle gabbie, su entrambe le piante, gli individui di tutti gli stadi di sviluppo
si posizionavano nella pagina inferiore delle foglie, preferendo i siti più riparati e/o
ombreggiati.
I dati raccolti consentono di affermare che S. titanus è in grado di nutrirsi e sopravvivere
su A. altissima. Solo le neanidi di 1à età e parzialmente gli adulti evidenziano una
minore adattabilità rispetto alla vite.
Alla morte di tutti gli individui, le gabbie sono state aperte per controllare l’eventuale
ovideposizione. Non sono state riscontrate uova su ailanto: probabilmente la folta
peluria che ricopre i germogli delle giovani piante impiegate nei vasi ha impedito alla
femmine di deporre. Considerando che le femmine ovidepongono preferibilmente sul
legno di almeno due anni (Bagnoli et al., 2011), per definire se A. altissima può essere
considerata pianta ospite per S. titanus, è necessario condurre indagini su piante adulte
in pieno campo.
Parole chiave: ailanto, cicadellidi, flavescenza dorata, ospiti vegetali
Scaphoideus titanus survival on Ailanthus altissima
Scaphoideus titanus Ball, the vector of grapevine “flavescence dorèe” (FD), lives
strictly associated to grapevine, where it lays its eggs. Nevertheless, it has been
occasionally collected also on some wild plants. Recently, both the phytoplasma
88
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
associated to FD and its vector have been found on Ailanthus altissima plants (tree of
heaven). The aim of the present work was to verify if S. titanus young and old nymphs
and adults are able to survive on tree of heaven. S. titanus individuals were collected in
June and July 2011 and 2012 from a rearing cage and confined in 48 cages containing
potted grapevine cuttings or young A. altissima plants. Every cage hosted at least
15 insects. The survival was recorded every day for the first period and every week
afterwards, until September. The young nymphs showed a clearly lower survival rate
in A. altissima compared to V. vinifera. Indeed, after 7 days only 8% of the individuals
survived on tree of heaven, compared to 60% on grapevine. The survival of the old
nymphs was similar in both plants: after 7, 28 and 56 days respectively, 86, 45 and
3% of the individuals confined in tree of heaven were still alive, while values on
grapevine were 93, 48 and 24%, respectively. The adults showed a good survival rate
on A. altissima, where the last individuals died after 35 days: indeed, after 7, 28 and
35 days respectively, 67, 36 and 11% of the insects were still alive. On grapevine,
adults survived 48 days, with the survival rate being significantly higher (80, 51 and
38% ). No egg deposition was observed on tree of heaven plants used in these trials.
In conclusion, S. titanus is able to live on A. altissima. Young nymphs showed a strong
difficulty to adapt to this host plants, however it is important to note that they were
born on grapevine. Old nymphs did behave similarly on grapevine and A. altissima.
S. titanus adults showed a slight lower adaptability to tree of heaven compared to the
preferred host plant, however some individuals could survive up to 35 days.
Key words: Cicadellidae, “flavescence dorée”, host plants, tree of heaven
Lavori citati / References
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89
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
forte v., e. BortoLaMai, L. fiLiPPin, e. anGeLini, n. Mori, 2013. emitteri
auchenorrinchi presenti in Ailanthus altissima infetta dal fitoplasma della
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90
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
oSBorNeLLUS horVAThI POTENZIALE VETTORE DI
FITOPLASMI DEL GRUPPO 16SrIX
S. Rizza1, V. D’Urso2, C. Marzachì3, M. Tessitori1
Dipartimento di Scienze delle Produzioni Agrarie e Alimentari – Sez. Fitopatologia
e Genetica vegetale, Università di Catania – Via S. Sofia, 100 - 95123 Catania
2
Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali – Sez. Biologia
Animale “M. La Greca” – Via Androne, 81 – 95125 Catania
3
Istituto di Virologia vegetale, CNR - Strada delle Cacce 73 – 10135 Torino
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il gruppo 16SrIX include diversi fitoplasmi raggruppati, ad oggi, in 7 sottogruppi:
16SrIX-A, avente come ceppo di riferimento “pigeon pea witches’ broom” (PPWB);
16SrIX-B e -D, ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ (“almond witches’ broom”,
AlmWB); 16SrIX-C, Pichris echiodes yellows (PEY); 16SrIX-E, “juniper witches’
broom” (JunWB); 16SrIX-F e 16SrIX-G, associati a drupacee in Libano (Molino
Lova et al., 2011). I fitoplasmi appartenenti a questo gruppo ribosomico sono associati
a malattie di piante erbacee e arboree in diverse parti del mondo. Nel 2008 sono
stati anche associati a “huanglongbing” degli agrumi in Brasile (Texeira et al., 2008).
Fitoplasmi del gruppo IX sono stati identificati in Campania in Dimorphotheca
sinuata (Marcone et al., 2001), in echinacea ed altre specie in Emilia-Romagna
(Bertaccini et al., 2009) ed in vinca e Picris echioides in Sicilia (Heinrich et al., 2001;
Spallino et al., 2012). Studi preliminari su potenziali vettori di fitoplasmi del gruppo
16SrIX hanno evidenziato numerosi generi e specie di cicaline quali potenziali vettori
solo di “almond witches’ broom” in Libano. In questo studio sono riportate indagine
molecolari per verificare la presenza di fitoplasmi di questo gruppo in una cicalina
potenziale vettrice in Sicilia.
Materiali e metodi
Il parco urbano di Monte Serra è situato nell’area protetta del Parco dell’Etna (Provincia
di Catania). Nell’ambito di un monitoraggio per fitoplasmosi di piante spontanee e
potenziali vettori nel sito sono state collocate trappole adesive cromotropiche gialle e
contemporaneamente è stata eseguita una raccolta tramite retino entomologico sulla
vegetazione spontanea.
Una volta identificato genere e specie delle cicaline e psillidi catturati sono stati estratti
gli acidi nucleici totali utilizzando il metodo di Doyle e Doyle (1990) modificato
da Marzachì et al. (1998). Il DNA estratto da ciascun esemplare è stato analizzato
91
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
tramite nested-PCR (Lee et al., 1995) utilizzando due coppie di “primers” universali
(P1/16S-SR seguiti da R16F2n/R2). Gli ampliconi della taglia attesa sono stati clonati
utilizzando il kit pGEM®-T Easy Vector System (Promega) e il DNA ricombinante è
stato sequenziato in entrambe le direzioni. Le sequenze nucleotidiche ottenute sono
state comparate con quelle depositate in GeneBank e classificate tramite RFLP virtuali
utilizzando il programma iPhyClassifier (Zaho et al., 2009).
Risultati e discussione
Delle 17 specie di cicadellidi (15), cixidi (1) e psillidi (2) individuate solo 2 sono
risultate positive a fitoplasmi con ampliconi di taglia attesa di circa 1200 bp. Dopo
identificazione e caratterizzazione degli ampliconi ottenuti, una delle specie di
Deltocephalinae, Osbornellus horvathi (Matsumura 1908), è risultata positiva a
fitoplasmi del gruppo 16SrIX. La specie è presente in Sicilia (D’Urso, 1995) e in
Nord Africa; è verosimilmente polifaga su vegetazione erbacea. Durante il periodo di
campionamento, durato da metà maggio a fine ottobre, sono stati raccolti e identificati
32 esemplari di O. horvathi.
Le analisi “nested”-PCR eseguite sugli individui di O. horvathi, a gruppi di 4, hanno
permesso di ottenere ampliconi della taglia attesa in 6 degli 8 campioni analizzati e
quattro di questi sono stati clonati e sequenziati. Le sequenze ottenute hanno mostrato
una identità di 98,7% (Osb3), 98,6% (Osb4) e 99% (Osb1 e Osb2) con il gene 16SrDNA
di ‘Ca. P. phoenicium’ (AF515636). Tutti e quattro i fitoplasmi sono risultati diversi dai
gruppi/sottogruppi presenti in iPhyClassifier: Osb2 con un coefficiente di similarità (F)
0,95 rispetto al profilo del ceppo tipo del gruppo 16SrIX-C (Y16389: “Picris echioides
yellows”) ed Osb1, Osb3 e Osb4 con F 0,89-0,95 rispetto al ceppo tipo del gruppo
16SrIX-E (GQ925918: “JunWB”). L’eventuale appartenenza a sottogruppi descritti o
l’appartenenza a un nuovo sottogruppo è in fase di accertamento tramite analisi RFLP.
O. borealis De Long & Bohr, 1936, specie congenere di O. horvathi è stata segnalata
in Canada e USA quale vettore di fitoplasmi del sottogruppo 16SrIII-A, associati a
X-disease (Jensen, 1957; Lee et al., 1998).
Questa risulta essere la prima segnalazione di O. horvathi quale potenziale vettore di
fitoplasmi e la prima segnalazione di un potenziale vettore di fitoplasmi del gruppo
16SrIX in Italia.
Parole chiave: ‘Ca. P. phoenicium’, trasmissione, Sicilia
osbornellus horvathi potential vector of 16SrIX phytoplasma
At the present time seven subgroups have been described among phytoplasmas of group
16SrIX -A, pigeon pea witches’ broom (PPWB); -B and -D, ‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ (almond witches’ broom, AlmWB); -C, Pichris echiodes yellows (PEY);
92
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
-E, juniper witches’ broom (JunWB); -F and -G, identified in stone fruits in Lebanon.
These phytoplasmas are associated with diseases affecting herbaceous and woody
plants in different areas worldwide. In Italy they have been reported in Dimorphoteca
sinuate, Echinacea purpurea, Catharanthus roseus and Pichris echioides. Preliminary
studies have shown the presence, just in Lebanon, of different leafhoppers genera
as potential vectors of almond witches’ broom phytoplasma. During a survey for
phytoplasma diseases in Sicily insects have been collected on yellow sticky traps or
by sweep net and tested by nested-PCR with universal primer pairs for phytoplasmas
detection. Among the trapped insects, the leafhopper Osbornellus horvathi resulted
positive to phytoplasmas presence. The four obtained sequences showed identity
between 98.6% and 99.0% with 16SrDNA gene of the reference strain of ‘Ca. P.
phoenicium’ (AF515636). In virtual RFLP analysis with iPhyClassifier three of
them (Osb1, Osb3, Osb4) shared a similarity coefficient (F) of 0.95 – 0.89 with the
reference strain of subgroup16SrIX-E, while Osb2 shared a similarity coefficient (F)
of 0.95 with the reference strain of subgroup16SrIX-C. To our knowledge this is the
first report of O. horvathi as potential vector of phytoplasmas as well as the first report
of potential vector of phytoplasmas of group 16SrIX in Italy.
Key words: ‘Ca. P. phoenicium’, transmission, Sicily
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito della convenzione con Servizio Fitosanitario della Regione
Siciliana (D. D. n. 1450).
Lavori citati / References
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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INTERAZIONE FITOPLASMA
ED OSPITI
INTERACTION AMONG
PHYTOPLASMAS AND HOSTS
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
RISULTATI PRELIMINARI DELL’ESPRESSIONE GENICA
DEL FITOPLASMA DEL GIALLUME DELLA MARGHERITA
NELLA PIANTA E NELL’INSETTO VETTORE
D. Pacifico1, L. Galetto1, S. Abbà1, S. Bertin2, S. Palmano1, M. Rashidi1,
D. Bosco2, G. Firrao3, C. Marzachì1
Istituto di Virologia Vegetale – CNR, Strada delle Cacce, 73, 10135 Torino
2
DISAFA, Università degli Studi di Torino – via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
3
DISA, Università di Udine, Via delle Scienze, 208, 33100 Udine
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
I fitoplasmi sono batteri fitopatogeni parassiti endocellulari di piante ed insetti.
Alcuni recenti studi basati sull’analisi mediante “microarrays” hanno suggerito
che l’espressione del genoma dei fitoplasmi sia modulata in funzione dell’ospite
(pianta o vettore) e dello stadio di infezione (Oshima et al., 2011). E stato altresì
dimostrato che alcune porzioni trasponibili (PMU) (Toruno et al., 2010) del genoma
del ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ e alcune proteine effettrici (Hoshi et al., 2009;
Sugio et al., 2011) sono in grado di modulare la risposta dell’ospite all’infezione.
Recentemente il sequenziamento Illumina dell’isolato “chrysanthemum yellows”
(CYP) del ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ ha permesso di identificare alcuni geni
specifici di CYP. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare il livello di
espressione di geni di CYP, coinvolti in diverse vie metaboliche, durante l’infezione
in pianta (Arabidopsis thaliana) e in due specie di cicadellidi vettori (Macrosteles
quadripunctulatus Kirschbaum, Euscelidius variegatus Kirschbaum), al fine di
identificare i meccanismi molecolari che il fitoplasma utilizza per l’adattamento agli
ospiti pianta e insetto.
Materiali e metodi
L’espressione di 14 geni di CYP codificanti tre proteine secrete, quattro trasportatori
generici (un canale meccano-sensibile, la componente di traslocazione della traslocasi
SecY, un trasportatore multidrug e uno di oligopeptidi), due trasportatori specifici
(uno per arginina e uno per ione Zn++), una proteina coinvolta nel metabolismo dei
fosfolipidi e la subunità ribosomica 30S rRNA ottenute dal sequenziamento Illumina,
una proteina effettrice “Tengu” (Hoshi et al., 2009), la principale proteina antigenica
di membrana amp (Galetto et al., 2008) e la proteina immunodominante di membrana
imp (Kakizawa et al., 2009) è stata analizzata in pianta (A. thaliana) e in insetto (M.
97
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
quadripunctulatus, E. variegatus). Per ognuno dei geni selezionati, sono stati disegnati
“primers” specifici ed è stato ottimizzato un protocollo di qPCR con SYBR Green.
Le efficienze di amplificazione e le temperature dei differenti picchi di “melting”
sono state ottenute analizzando in qPCR diluizioni seriali di plasmidi contenenti gli
ampliconi specifici di ciascun gene. Per lo studio di espressione in pianta, CYP è stato
trasmesso da M. quadripunctulatus alle piante di A. thaliana e campioni di foglie sono
stati raccolti a tempi diversi dall’inoculazione (dpi). Per lo studio di espressione di
CYP in insetto, diversi esemplari delle due specie analizzate sono stati raccolti a tempi
differenti in seguito all’acquisizione (dpa) del fitoplasma da crisantemi infetti. Dallo
stesso campione di pianta e insetto, suddiviso in parti uguali, sono stati estratti il DNA
e l’RNA totali. Il DNA è stato poi sottoposto ad analisi molecolari per determinare la
presenza (Lee et al., 2004) e il titolo (Marzachì e Bosco, 2005) del fitoplasma. L’RNA
totale estratto è stato trattato con DNAsi, retrotrascritto e analizzato in qPCR per
quantificare i trascritti dei geni prescelti.
Risultati e discussione
I sintomi tipici della fitoplasmosi (ingiallimento, deformazione fogliare e nanismo)
sono comparsi due settimane dopo l’inoculazione. Il 15% delle piante risultava
infetto già a 5 giorni dopo l’inoculo, mentre a 25 dpi, ultima data di campionamento,
l’83% delle piante risultava sintomatico. Alle prime due date di campionamento (7
e 14 dpa) complessivamente risultavano positivi alla presenza dei fitoplasmi il 91
e il 79% degli esemplari di M. quadripunctulatus e E. variegatus, rispettivamente
analizzati. Alle date successive (fino a 35 dpa) risultavano infetti tutti gli adulti di M.
quadripunctulatus e all’incirca il 90% di E. variegatus, in accordo con le efficienze
di acquisizione di CYP precedentemente osservate per queste specie (Bosco et al.,
2007). Il titolo di CYP nella pianta aumentava da 5 a 28 dpi per raggiungere un valore
simile a quello osservato in altre specie erbacee (Saracco et al., 2006). Il titolo di CYP
seguiva un andamento analogo nelle due specie vettrici, raggiungendo il massimo a
28 e a 35 dpa rispettivamente in M. quadripunctulatus ed E. variegatus. I “primers”
selezionati per l’analisi dell’espressione genica producevano ampliconi specifici e le
curve standard ottenute presentavano un R2 superiore a 0,99 e un’efficienza compresa
tra 74% e 100%. Il livello di espressione di ogni singolo gene target è stato poi correlato
all’effettivo titolo di fitoplasma misurato in ogni pianta e in ogni insetto alle differenti
date di campionamento. Una volta ultimata, l’elaborazione dei risultati permetterà di
determinare i profili di espressione dei geni selezionati nel corso dell’infezione tra
ospiti diversi (pianta e insetto) e tra due specie di vettori, e quindi di identificare i
meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’adattamento all’ospite.
Parole chiave: Arabidopsis thaliana, Macrosteles quadripunctulatus, Euscelidius
variegatus, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’
98
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Preliminary results on gene expression of chrysanthemum yellows phytoplasma
in plant and insect vector
Microarrays analysis suggests that phytoplasma genome expression in the plant can
be modulated according to the infection stage. A real time PCR protocol was set
up to study the expression profile of different ‘Candidatus Phytoplasma asteris’
chrysanthemum yellows isolate (CYP) genes during infection of Arabidopsis
thaliana and of the two vector species Macrosteles quadripunctulatus and
Euscelidius variegatus. Target genes were selected among secreted proteins, known
effectors, general metabolism and specific CY genes, obtained following Illumina
sequencing. Genes coding three putative secreted peptides, antigenic membrane
protein (Amp), immunodominant membrane protein (Imp), four general transporters
(multidrug, mechano-sensitive channel, SecY translocation component and an
oligopeptide transporter), two specific transporters (arginine, Zn++), one protein
involved in phospholipid metabolism and the 30S rRNA gene were selected from
the CYP genome. Specific primers were designed for each selected gene, and the
appropriate real time PCR protocols were optimized. Amplification efficiencies for
each target were determined by amplification of five dilutions of different plasmids
containing the specific amplicon. The expression level of each target gene was
correlated to the actual titer of phytoplasma in each infected plant or insect sample
to provide a detailed study on gene expression of this obligate parasite in the plant
and insect hosts.
Key words: Arabidopsis thaliana, Macrosteles quadripunctulatus, Euscelidius
variegatus, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’
Ringraziamenti / Acknowledgements
D. Pacifico and S. Bertin were supported by the Regione Piemonte grant FLADO and
M. Rashidi was supported by the Regione Piemonte grant ELIFITO.
Lavori citati / References
Bosco D., L. GaLetto, P. Leoncini, P. saracco, B. raccaH, c. MarZacHì, 2007.
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GaLetto L., J. fLetcHer, D. Bosco, M. turina, a. WaYaDanDe, c. MarZacHì, 2008.
Characterization of putative membrane protein genes of the ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’, chrysanthemum yellows isolate. Canadian Journal of
Microbiology, 54, 341-351.
99
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
HosHi a., k. osHiMa, s. kakiZaWa, Y. isHii, J. oZeki, M. HasHiMoto, k. koMatsu,
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insect vector. Physiological and Molecular Plant Pathology, 67, 212-219.
toruno t.Y., M. seruGa-Music, s. siMi, M. nicoLaisen, s. HoGenHout,
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extrachromosomal elements and has enhanced expression in insect vectors
compared with plant hosts. Molecular Microbiology, 77, 1406–1415.
100
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
STUDI DI ESPRESSIONE GENICA IN CAThArANThUS
roSeUS INFETTO DAL FITOPLASMA DELLA
FLAVESCENZA DORATA DELLA VITE
L. Miotti1,2, R. Musetti2, E. Angelini1
CRA-VIT – viale XXVIII Aprile 26, 31015 Conegliano (TV)
DISA, Università degli Studi di Udine – via delle Scienze 206, Udine
1
2
E-mail: [email protected]
Introduzione
La flavescenza dorata (FD) della vite è una grave malattia da quarantena associata a
fitoplasmi, epidemica in Europa. Le interazioni vite-fitoplasma sono state finora poco
studiate, specialmente a livello molecolare, per le difficoltà sia di coltivare l’agente
eziologico sia di usare la vite come pianta sperimentale.
In questo lavoro sono stati studiati i livelli di espressione genica di 11 geni
potenzialmente legati a risposte di difesa ai fitoplasmi tramite “real time” PCR
quantitativa, utilizzando Catharanthus roseus G. Don come pianta modello.
Materiali e metodi
Sono state usate piante clonali di C. roseus, ottenute mediante micropropagazione e
poi ambientate. Il piano sperimentale ha previsto due tesi: innesto con marza di C.
roseus infettato con FD-C e controllo innestato con marze sane, per un totale di 10
piante. I prelievi per gli studi di espressione sono stati effettuati a due tempi: a 3 mesi
dall’innesto, al momento della comparsa dei primi sintomi fogliari, e a 5 mesi, quando
la sintomatologia era conclamata.
I geni indagati codificano 5 diverse famiglie di proteine putative legate alle risposte
di difesa: proteine di patogenesi di tipo I (PR1), proteine taumatina - simili (TLP o
PR5), callosio sintasi (CalS), fenilalanina ammonio liasi (PAL), invertasi di parete
(cwINV). Sono stati inoltre inclusi anche i fattori di trascrizione WRKY, implicati
nella regolazione dei trascritti associati alle risposte di difesa delle piante.
Sulle sequenze di questi geni, ricavate da banche dati o ottenute sperimentalmente al
CRA-VIT, sono stati disegnati “primers” per l’analisi di espressione mediante “real
time” PCR (qPCR). Per la normalizzazione dei dati di espressione genica, sono stati
selezionati come potenziali geni di riferimento quelli codificanti: la proteina ribosomica
40S-S9 (RPS9), l’ubiquitina 11 (UBQ11), la ciclofilina (CYC), l’actina 7 (ACT7) e il
fattore di allungamento 1α (EF1α) (Wei, 2010). La valutazione dei geni più stabili è
stata eseguita mediante l’analisi dei dati qPCR con i programmi geNorm e NormFinder.
101
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lo studio di espressione genica è stato svolto con i “primers” risultati idonei e
con i due geni di riferimento che si sono rivelati più stabili, secondo le più recenti
indicazioni in materia (Bustin et al., 2009). Le analisi statistiche sono state condotte
con il programma dedicato REST2009 (Pfaffl et al., 2002).
Risultati e discussione
Tutte le coppie di “primers” saggiate si sono rivelate idonee all’uso in qPCR nelle
condizioni sperimentali saggiate (ottima specificità, sensibilità molto buona, efficienza
fra 93 e 105%). Tra i candidati geni di riferimento, quelli la cui espressione è risultata
più stabile sono stati EF1a e ACT7.
Le analisi di espressione a 3 mesi dall’innesto hanno evidenziato che 3 geni sugli 11
studiati erano sovraespressi in maniera significativa nelle piante infette dal fitoplasma:
STS14, un gene codificante una proteina PR1-simile (33,8 volte) e le callosio sintasi
CalS3 (1,7 volte) e CalS11 (4 volte). Si nota come categorie di geni che sono state
spesso descritte in letteratura come sovraespresse durante l’infezione da fitoplasmi,
quali quelle codificanti le proteine di patogenesi (Albertazzi et al., 2009; Hren et al.,
2009), in questo caso non risultino modulate. Ciò può essere spiegato con il fatto che
i lavori di letteratura sono stati effettuati in fasi più avanzate dell’infezione.
Il profilo di espressione genica si modifica a 5 mesi dall’inoculo, quando il gene
TLP risulta sovraespresso in maniera significativa di circa 4 volte rispetto al non
infetto. Quest’ultimo dato conferma il coinvolgimento di questa categoria genica
nelle fasi avanzate della malattia, come già evidenziato in numerosi e differenti
binomi pianta – fitoplasma (Hren et al., 2009; Margaria e Palmano, 2011; Zhong e
Shen, 2004).
In conclusione, questo è il primo lavoro sull’interazione pianta – fitoplasma che
mostra un diverso profilo di espressione fra il momento della comparsa dei sintomi
e l’infezione sistemica, mettendo in evidenza quali potrebbero essere le “pathways”
coinvolte nella risposta diretta all’infezione da fitoplasmi e quali invece quelle
derivanti da risposte secondarie dovute agli squilibri fisiologici indotti dal patogeno.
Parole chiave: geni di difesa, interazione pianta-fitoplasma, qPCR
Gene expression studies on Catharanthus roseus infected by grapevine
“flavescence dorée” phytoplasma
Grapevine “flavescence dorée” (FD) is a serious quarantine disease, associated with
phytoplasmas. Grapevine – phytoplasma interactions are still little studied, due to the
difficulty to cultivate the pathogen and to use grapevine as experimental plant. For
these reasons for investigation on these phytoplasmas Catharanthus roseus G. Don
as model plant was employed. To investigate the plant responses to FD infection at
102
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
molecular level by means of quantitative real time PCR (qPCR) micropropagated
periwinkle plantlets infected by grafting with FD-C phytoplasma were therefore used.
It has been possible to design qPCR primers for 11 different genes putatively involved
in plant defence mechanism, belonging to 6 different gene families: pathogenesisrelated protein type-1 (PR1), thaumatin-like protein (TLP), callose synthase (CalS),
phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cell wall invertase (cwINV) and WRKY
transcription factor. Gene expression studies were carried out at first appearance
of leaf symptoms (3 months after inoculation) and 2 months later. Although highthroughput studies performed on other plant species infected with phytoplasmas
revealed involvement of defence genes in plant response to these pathogens, only a
few, among the tested genes, seems to be activated in early stages of FD infection,
i.e. at symptom appearance: STS14, coding a PR1-like protein (expressed 33.8 times
more in infected compared to healthy plants), and 2 callose synthases, CalS3 (1.7
times higher) and CalS11 (4 times higher). The gene expression pattern changes 5
months after inoculation, when TLP resulted over-expressed 4 times in the infected
periwinkle compared to the healthy control plants, confirming literature data for other
plant-phytoplasma interactions.
Key words: defence gene, plant-phytoplasma interaction, qPCR
Ringraziamenti / Acknowledgements
Si ringrazia il personale del DISA, Università di Udine e del CRA-VIT di Susegana
(TV) per l’assistenza tecnica.
Lavori citati / References
aLBertaZZi G., J.a. MiLc, a. caffaGni, e. francia, e. roncaGLia, f. ferrari, e.
taGLiafico, e. stefani, n. PeccHioni, 2009. Gene expression in grapevine
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Bustin s.a., v. Benes, J.a. Garson, J. HeLLeMans, J. HuGGett, M. kuBista, r. MueLLer,
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Hren M., P. nikoLic, a. rotter, a. BLeJec, n. terrier, M. ravnikar, M.
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103
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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104
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
STUDIO IN VIVo DEL RUOLO DELLE PROTEINE
DI MEMBRANA DI “CHRYSANTHEMUM YELLOWS
PHYTOPLASMA” NELLA TRASMISSIONE CON INSETTI
VETTORI
M. Rashidi1, L. Galetto1, F. Veratti1, C. Marzachi1, D. Bosco2
1
Istituto di Virologia vegetale CNR – Strada delle Cacce 73, 10135 Torino
2
DISAFA, Università degli Studi di Torino– via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
E-mail: [email protected]
Introduzione
I fitoplasmi sono batteri fitopatogeni trasmessi con modalità persistente e propagativa
da insetti floemomizi dell’ordine Hemiptera. Studi recenti hanno indicato che la
principale proteina antigenica di membrana (amp) di diversi isolati di ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ interagisce in maniera specifica con proteine citosoliche
(actina, miosina) e di membrana (ATP sintasi) di specie vettrici (Suzuki et al., 2006;
Galetto et al., 2011). Questa interazione non è stata osservata nel caso di altri insetti
filogeneticamente vicini, ma non vettori. I fitoplasmi, dopo essere stati acquisiti dal
vettore durante una nutrizione su pianta infetta, attraversano l’epitelio intestinale e la
lamina basale, si moltiplicano nell’emolinfa e colonizzano le ghiandole salivari per
essere nuovamente trasmessi durante una successiva nutrizione (Bosco e D’Amelio,
2010). E’ quindi probabile che una o più proteine di membrana dei fitoplasmi
interagiscano con le cellule dell’epitelio intestinale e delle ghiandole salivari e siano
coinvolte nel determinare la specificità di trasmissione. Lo scopo di questo lavoro
è sviluppare un sistema per studiare in vivo il ruolo delle principali proteine di
membrana dei fitoplasmi nel determinare l’efficienza di acquisizione e trasmissione
degli insetti vettori.
Materiali e metodi
Per lo studio in vivo del ruolo della principale proteina antigenica di membrana (amp)
dell’isolato “chrysanthemum yellows” (CYP) di ‘Candidatus Phytoplasma asteris’
a livello dell’epitelio intestinale, i cicadellidi vettori Macrosteles quadripunctulatus
Kirschbaum ed Euscelidius variegatus Kirschbaum, prima dell’acquisizione di
CYP su crisantemi infetti, sono stati sottoposti a nutrizione artificiale su una dieta
contenente: un costrutto di fusione della proteina amp di CYP (Galetto et al., 2008),
un costrutto di fusione della proteina artI di CYP (Galetto et al., 2008), trasportatore di
105
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
membrana non associato alla specificità di trasmissione (Galetto et al., 2011), anticorpi
specifici contro amp and artI da soli o in presenza dell’antigene. Completata la fase
di latenza, gli insetti sono stati posti singolarmente ad inoculare piante di crisantemo.
Esperimenti preliminari hanno permesso di definire le concentrazioni ottimali di
proteine utilizzabili per la nutrizione artificiale e la microiniezione, la minima durata
di acquisizione su pianta infetta (AAP) e di latenza (LP) per garantire un’efficace
acquisizione e trasmissione del patogeno.
Per lo studio del ruolo di CYP Amp a livello delle ghiandole salivari, adulti sani di E.
variegatus sono stati sottoposti a microiniezione con una sospensione di fitoplasmi
(Bressan et al., 2006) addizionata dei costrutti di fusione delle proteine di membrana
(Galetto et al., 2008) e dei corrispondenti anticorpi specifici. A seguito della
microiniezione è stata definita la durata della fase di latenza mediante inoculazioni
seriali a piante di crisantemo. Al termine dell’ultimo turno di trasmissione (almeno
35 giorni dopo la microiniezione), gli insetti sono stati analizzati per confermare la
presenza del fitoplasma (Lee et al., 1993; 1994) e per quantificarne il titolo (Marzachì
e Bosco, 2005).
Risultati e discussione
Il substrato di nutrizione che garantiva la miglior sopravvivenza dei vettori era
costituito da saccarosio 5% in TE (100% di sopravvivenza per M. quadripunctulatus
e 80% per E. variegatus dopo 24 h). La concentrazione di proteina di fusione ottimale
è risultata 1 mg/ml di substrato nutritivo. Tale quantità garantiva, per entrambe le
specie, una sopravvivenza di circa il 50% dopo 24 h di nutrizione artificiale e dell’80%
dopo microiniezione addominale, in accordo con quanto osservato per una proteina di
Spiroplasma citri microiniettata nel vettore Circulifer haematoceps (Labroussaa et al.,
2011). Gli esperimenti di nutrizione artificiale hanno permesso di determinare che l’AAP
minima per ottenere un’elevata trasmissione era di 4 e 6 ore, per M. quadripunctulatus
ed E. variegatus, rispettivamente. Inoltre la latenza minima nel vettore era di 20 (M.
quadripunctulatus) e 33 giorni (E. variegatus). Il tempo di latenza dopo microiniezione
è stato di 24 giorni per E. variegatus, inferiore a quello necessario dopo nutrizione
su pianta. I risultati preliminari ottenuti indicano che la sola presenza di proteine di
membrana di fitoplasmi nel mezzo di nutrizione non è sufficiente ad alterare le efficienze
di acquisizione e trasmissione nonché il titolo di fitoplasma nelle due specie. Questo
risultato può suggerire che l’interazione non avvenga a livello dell’epitelio intestinale
oppure che altre proteine agiscano in complessi che coinvolgano amp. Gli esperimenti
di microiniezione per determinare il ruolo delle principali proteine di membrana di
CYP a livello delle ghiandole salivari dei vettori sono in corso.
Parole chiave: Macrosteles quadripunctulatus, Euscelidius variegatus, ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’, amp
106
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
In vivo assays to test the role of phytoplasma membrane proteins on vector
acquisition and transmission capabilities
Phytoplasmas are plant pathogenic bacteria transmitted by hemipteran phloem
sucking insects in a persistent, propagative manner. Recent studies on ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ showed that the major antigenic membrane protein (amp)
specifically interacts with vector proteins, localized either in the cytosol (actin and
myosin) or on plasma membrane surface (ATP synthase) localization. Following
acquisition, phytoplasmas must cross the gut epithelium and colonize salivary glands
for successful transmission. The gut epithelium and salivary glands are physical
barriers that must be overcome by the phytoplasma during vector colonization.
Specific interactions of amp with vector membrane proteins occur in vitro at both
sites. Aim of this work was to develop a system to study the effects of phytoplasma
membrane proteins on vector acquisition and transmission capabilities. To investigate
the biological effects of the interactions of CYP Amp at the gut epithelium, vectors
of two species (Macrosteles quadripunctulatus, and Euscelidius variegatus), before
CYP acquisition from infected plants, were fed on a medium containing i) a fusion
construct of the protein, ii) a fusion protein of artI, a membrane protein not involved
in specific interaction with vectors, iii and iv) antibodies raised against amp and
artI, v) no proteins. After latency, insects were singly caged on healthy plants for
an inoculation period after which they were collected and assayed in nested PCR
to detect the presence of CYP. Phytoplasma titre in insects was also quantified by
RT-PCR. To determine the role of CYP membrane proteins at the salivary gland
level, abdominal microinjection experiments with a suspension of CY phytoplasmas
added with Amp fusion protein or its specific antibody are in progress. The results of
preliminary experiments are presented and discussed.
Key words: Macrosteles quadripunctulatus, Euscelidius variegatus, ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’, amp
Ringraziamenti / Acknowledgements
MR è stata finanziata dalla Regione Piemonte (Progetto FLADO)./ MR was supported
by the Piemonte Region grant FLADO.
Lavori citati / References
Bosco D., r. D’aMeLio, 2010. Transmission specificity and competition of multiple
phytoplasmas in the insect vector. In: Weintraub P, Jones P, eds. Phytoplasmas:
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
ORGANIZZAZIONE DEL GENE IMP IN ‘CANDIDATUS
PHYTOPLASMA CYNODONTIS’
R.A. Serwaa1, M. Kube2, R. Reinhardt3, S. Paltrinieri1, A. Bertaccini1
DipSA, Plant Pathology, Alma Mater Studiorum - University of Bologna,
viale Fanin 42, 40127 Bologna
2
Humboldt-Universität zu Berlin, Faculty of Agriculture and Horticulture,
Lentzeallee 55/57, 14195 Berlin, Germany
3
Max-Planck Genome Centre Cologne, Max-Planck Institute for Plant Breeding
Research, 50829 Cologne, Germany
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
“Bermuda grass white leaf” (BGWL) è una malattia che colpisce varie graminacee
ed è associata alla presenza di ‘Candidatus Phytoplasma cynodontis’ (Marcone et
al., 2004) appartenente al gruppo ribosomico 16SrXIV (Lee et al., 1998). Ceppi di
fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrXIV sono stati identificati in Italia in Cynodon
dactylon e Poa annua comunemente note con il nome comune di gramigna (Marcone
et al., 1997; Lee et al., 1997). La malattia è stata descritta in diverse aree tropicali
e subtropicali del mondo o in aree limitrofe. I ceppi di BGWL possono essere
distinti utilizzando specifici marcatori genetici dai ceppi di fitoplasmi simili sul gene
ribosomico 16S associati ad importanti malattie quali “sugarcane white leaf” (SCWL),
“sugarcane grassy shoot” (SCGS), “rice yellow dwarf” (RYD) e “sorghum grassy
shoot” (SGS). BGWL è stato inoltre descritto come il fitoplasma che ha il genoma più
piccolo fra tutti i fitoplasmi fino ad ora studiati ed è poco conosciuto anche al livello
di effettori codificanti o di proteine di membrana che possano interagire con la pianta
ospite e/o l’insetto vettore. Una prima sequenza parziale del genoma di BGWL ha
permesso di evidenziare la presenza del gene imp sul quale sono state effettuati studi
preliminari per valutarne le possibilità di impiego in dignostica.
Materiali e metodi
Sedici campioni di gramigna o Poa annua con sintomi di sbiancamento fogliare
sono raccolti in diverse località italiane in diversi anni e sono stati sottoposti ad
estrazione di acido nucleico seguendo una metodica basata sull’uso di cloroformio
e fenolo (Prince et al., 1993). I campioni sono stati successivamente analizzati in
PCR/RFLP per verificare la presenza ed identificare i fitoplasmi individuati. Le
analisi PCR “nested” sono state effettuate impiegando i “primers” P1A/P7A (Lee et
al., 2004), che amplificano un frammento di circa 1800 nucleotidi sul gene 16S fino
109
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
all’estremità 3’ del gene codificante l’RNA ribosomico 23S, includendo la regione
spaziatrice. A questa amplificazione sono seguite amplificazioni con i “primer”
universali 16R758f/16R1232r (=M1/M2) (Gibb et al., 1995) e R16F2/R2 (Lee et al.,
1995) che amplificano frammenti interni al precedente di 500 e 1200 nucleotidi
rispettivamente. Come controlli positivi sono stati utilizzati i fitoplasmi AVUT
(16SrI-B), ASHY, “ash yellows” (16SrVII-A) e CLP, “cleome phyllody” (16SrII-A)
estratti da vinca dalla collezione di riferimento per i fitoplasmi mantenuta al DipSA,
Università di Bologna, come controllo negativo è stata utilizzata acqua distillata e
deionizzata. Gli amplificati ottenuti con M1/M2 e quelli ottenuti con R16F2R2 con
Tru1I e Tsp509I (Fermentas FastDigest, Vilnius, Lituania) seguendo le indicazioni
della ditta. Sulla base di sequenziamenti preliminari (M. Kube, dati non pubblicati) è
stato possibile verificare che i fitoplasmi in oggetto avevano nel genoma la frazione
codificante il gene imp. Sono quindi stati disegnati 4 “primers” sulle sequenze a
disposizione e sei dei ceppi di fitoplasmi risultati positivi alla analisi molecolare sono
quindi stati utilizzati per studiare il gene imp. Il DNA di Acholeplasma brassicae
è stato impiegato come controllo positivo. I “primers” disegnati utilizzando il
programma Primer 3 Input (versione 0.4.0) disponibile in http://frodo.wi.mit.edu/,
sono: RSBWL1: TGTTATAATTATGGTATTGAATCTTTG; RSBWL2: TCATATA
ACAATGCTGAAAACAA; RSBWL4: TTTTTATTATGTCGTCTTACCATGTTT:
RSBWL5, GGTTGGATATTTTTAGCCTGCT. L’analisi PCR è stata effettuata
utilizzando optiTaq (Roboklon, Germania), 1 μl di ogni “primer” ed 1 μl di DNA
preamplificato con RepliG (Qiagen). Gli ampliconi purificati dal gel sono stati clonati
e sequenziati, le sequenze ottenute, dopo allineamento manuale sono state comparate
con le banche dati di acidi nucleici e proteine mediante gli appropriati algoritmi Blast.
Risultati e discussione
Solamente tre degli undici campioni sintomatici esaminati sono risultati positivi in
PCR diretta con i “primers” P1A/P7A ma 14 campioni sono risultati positivi in PCR
“nested” con i “primers” M1/M2. Poiché l’analisi RFLP con gli enzimi utilizzati sugli
ampliconi M1/M2 non consentiva di differenziare il fitoplasma BGWL da alcuni
dei controlli utilizzati (gruppo 16SrI) si è proceduto con l’amplificazione mediante
i “primers” R16F2/R2 che ha permesso di amplificare 6 dei campioni saggiati e di
identificarli come appartenenti al gruppo 16SrXIV.
La sequenza preliminare di alcuni ceppi italiani di BGWL (M. Kube, dati non pubblicati)
ha permesso di assemblare una regione di oltre 5 kb codificante una dsRNA-specifica
la ribonucleasi RNasiIII (Rnc), una proteina che codifica l’inizio della replicazione
cromosomica (DnaD), una proteina “imp-like” (imp), una CTP sintasi (PyrG), una
probabile fosfatidilserina decarbossilasi (psd) ed una fosfatidilserina sintasi (PssA).
L’ordine dei geni in questa regione risulta identico a quello dei medesimi geni in un
ceppo giapponese individuate in Farfugium japonicum var. Kitamura di ‘Candidatus
Phytoplasma oryzae’ (acc. no. AB469012).
110
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Lo studio mediante analisi PCR con i “primers” disegnati su questa regione ha
permesso di ottenere amplificati della lunghezza attesa per ogni coppia di “primers”
impiegata e di ottenere il sequenziamento parziale per i sei campioni di BGWL. Le
sequenze ottenute, variabili da 480 a 500 nucleotidi, sono risultate identiche nei 6
ceppi esaminati e sono risultate avere una omologia di DNA del 68% con il gene
imp di ‘Ca. P. oryzae’. Questo risultato indica che il gene, normalmente soggetto
ad una elevata pressione ambientale (Kakizawa et al., 2006a; 2006b; 2009; Fabre
et al., 2011), in questo caso non risulta in grado di differenziare ceppi di BGWL
anche se prelevati in località diverse o in tempi diversi. La bassa omologia con i ceppi
sequenziati conferma anche la mancanza di interazioni fra le popolazioni italiane di
BGWL e quelle che descritte in riso in oriente, appartenenti, fra l’altro, ad un gruppo
ribosomico differente (16SrXI).
Parole chiave: sbiancamento fogliare, gene imp, PCR/RFLP, sequenziamento
Organisation of the imp-locus in ‘Candidatus Phytoplasma cynodontis’
Bermuda grass white leaf (BGWL) is a destructive disease of bermuda grass (Cynodon
dactylon L.) associated with the presence of ‘Candidatus Phytoplasma cynodontis’.
Strains belonging to 16SrXIV bermuda grass white leaf group were detected in several
tropical and subtropical areas worldwide and regions bordering to these climates.
BGWL strains can be separated by genetic markers from economical important
phylogenetic-related strains such as sugarcane white leaf (SCWL), sugarcane
grassy shoot (SCGS), rice yellow dwarf (RYD) and sorghum grassy shoot (SGS)
phytoplasmas. Beside this interesting relationship, BGWL was described carry the
smallest chromosome in phytoplasmas. Little is known about the genomes of BGWL
strains and the coding of effectors or membrane proteins probable interacting with
host and/or vector. In a genomic survey, a first draft sequence of a BGWL from Italy
was determined. Preliminary analysis of the gene content highlighted the coding of
an imp-gene fragment. The imp-region of three samples from Italy was reconstructed
by a PCR-approach using four primers derived from the genomic draft. The impregion of these samples, above 5 kb in size, encodes a dsRNA-specific ribonuclease
RNaseIII (Rnc), a chromosome replication initiation protein (DnaD), imp-like protein
(Imp), a CTP synthase (PyrG), probable a phosphatidylserine decarboxylase (psd)
and a phosphatidylserine synthase (PssA). Gene order of this region is identical to
‘Candidatus Phytoplasma oryzae’ (acc. no. AB469012) derived from a Japanese
strain detected in Farfugium japonicum var. Kitamura. Partial sequences of the 5’end of imp were determined for six samples showing no variation in their nucleotide
sequence to each other indicating an unexpected conservation of this gene encoding a
putative membrane protein in BGWL strains.
Key words: white leaf, imp gene, PCR/RFLP, sequencing
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Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Ringraziamenti / Acknowledgements
Si ringrazia la Presidenza della ex-Facoltà di Agraria dell’Alma Mater StudiorumUniversità di Bologna per il supporto allo “stage” di R.A. Serwaa presso “Humboldt
University” Berlino, Germania.
Lavori citati / References
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phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in
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kakiZaWa s., k. osHiMa, H-Y. JunG, s. suZuki, H. nisHiGaWa, r. arasHiDa, s.
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bacteriology, 188(9), 3424-3428.
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the phytoplasma associated with Bermuda grass white leaf disease. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1077-1082.
112
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
STUDIO ANALITICO-COMPARATIVO SULL’ATTIVITÀ
ANTIBATTERICA DI OLI ESSENZIALI DI MoNArDA
fISTULoSA SANA E INFETTA DA FITOPLASMI
L. Nissen1, P. Mattarelli1, N. Contaldo2, L. Cavicchi2, A. Bertaccini2,
M.G. Bellardi2
DipSA, Microbiologia, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 44, 40127 Bologna
2
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
La continua evoluzione della resistenza agli antibiotici dei batteri patogeni umani, ha
reso necessaria la ricerca di nuovi prodotti antimicrobici come gli oli essenziali ottenuti
da piante note nella medicina popolare. In questo studio è stata saggiata e confrontata
la capacità antitossigenica degli oli essenziali di Monarda fistulosa ottenuti da piante
sane e infette dai fitoplasmi, nei confronti di Escherichia coli e Campylobacter jejuni.
In particolare, in E. coli normalizzando con gene endogeno FTsZ sono stati saggiati:
il gene CdtIVB codificante l’unità attiva B della olotossina CDT-IV, il gene LuxS
codificante l’auto-induttore 2 del sistema Quorum Sensing promotore della CDT ed il
gene DksA codificante una DNA kinasi, proteina soppressore-repressore della CDT.
Invece, in C. jejuni normalizzando con gene endogeno LpxA coinvolto nella biosintesi
del lipide A sono stati saggiati: il gene CdtB codificante l’unità attiva B dell’olotossina
CDT, il gene LuxS ed il gene Hns codificante per il regolatore trascrizionale H-NS.
Materiali e metodi
E’ stata saggiata e confrontata la capacità antitossigenica degli oli essenziali di
Monarda fistulosa ottenuti da piante sane (S) e infette dai fitoplasmi “aster yellows” e
“stolbur” (I) (Contaldo et al., 2011) nei confronti di E. coli e C. jejuni, che sono stati
coltivati a 37°C in aerobiosi, e a 42°C in microaerofilia, rispettivamente. Il metodo
MIC utilizzato è stato quello di micro-titolazione in brodo con antibiotici specifici di
controllo, secondo NCLSI. Le concentrazioni massime degli oli non inibenti sono state
scelte per condurre l’analisi dell’espressione genica delle esotossine CDT e dei loro
regolatori. In breve, dopo estrazione l’RNA batterico (Promega, USA) è stato retro
trascritto a cDNA, utilizzando M-MLV RT (Promega) e apparato PCR (Biometra,
Germany) ed il prodotto trascritto è stato analizzato con StepOne real-time RT-PCR
e chimica SYBR Green I (Life Science), secondo il protocollo 2-ΔΔCt (Pflaff, 2001).
113
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
In E. coli sono stati utilizzati i seguenti “primers”: per FTsZ, Ftsz-fw GGTATCCTGACCGTTGCTGT/ FtsZ-rev ATACCTCGGCCCAGAACTTT; per CdtIVB, CdtIVB-fwCGGAACGTGAATTTCGTACA / CdtIVB-rev TGCCACTGTTGGAGGTGATA; per LuxS, EcLuxS-F / EcLuxS-R (Schauder et al., 2001); per DksA, DksA-F
GCAAGATTCGCAAATTCCAT / DksA-R AATAGCGTCCCAAGCGATAG. In C.
jejuni sono stati utilizzati i seguenti “primers”, per LpxA, CjLpxA-F/ UniCamp-R
(Klena et al., 2004); per CdtB, CjCdtB-F CATGTGCAACAAGGTGGAAC / CjCdtBR CATTTCCATTGCGAATTCCT; per LuxS, Lux-1 / Lux-2 (Elvers e Park, 2002);
per Hns, EcHNS-F CGAGGGATTTACCTTGCTCA / EcHNS-R GAACGAGCTGCTGAATAGCC.
Risultati e discussione
E’ stata valutata la capacità degli oli essenziali (S) ed (I) di M. fistulosa di modulare
l’espressione genica in E. coli ed in C. jejuni dei geni codificanti CDT, le proteine
auto-induttori codificate da LuxS del sistema quorum sensing (promotore della CDT)
ed i fattori trascrizionali Hns e DNA kinasi DksA (repressori della CDT). I risultati
ottenuti sono promettenti e la “bioattività” dell’olio essenziale di M. fistulosa si è
dimostrata in vitro anche più potente degli antibiotici specifici, nei confronti sia di E.
coli sia di C. jejuni. In particolare, utilizzando le dosi sub-inibenti la crescita batterica,
si è osservato che l’espressione della CDT batterica era sotto regolata rispetto al
controllo negativo fino ad un massimo di circa 40 volte in E. coli e di circa 20 volte
in C. jejuni, in modo dipendente sia dalla concentrazione dell’olio essenziale sia dal
tempo di esposizione. Lo stato sanitario della pianta invece sembra non influenzare
l’attività antimicrobica non essendosi osservate variazioni significative degli oli (S)
ed (I). L’espressione genica dei geni LuxS codificanti gli induttori del sistema quorum
sensing, che sta alla base della regolazione della virulenza batterica, risultava sottoregolata in E. coli fino ad un massimo di circa 30 volte, ed in C. jejuni di 15 volte
dopo 6 h. La sovraespressione genica dei geni H-NS, fino ad un massimo di 12 volte
e DksA, di 9 volte, codificanti per i regolatori trascrizionali negativi leganti il DNA
che sopprimono i fattori di virulenza, supporta l’osservazione che gli oli essenziali
di M. fistulosa sono in grado di regolare la virulenza dei batteri patogeni esaminati. I
risultati ottenuti sono promettenti per una futura applicazione degli oli di M. fistulosa
come agenti inibenti la virulenza di E. coli e C. jejuni nella catena alimentare.
Parole chiave: fitoplasmi, oli essenziali, esotossina, espressione genica, real-time
RT-PCR
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Comparative analysis of the antibacterial activity of essential oils from healthy
and phytoplasma infected Monarda fistulosa
The use of natural products able to inhibit bacterial pathogens growth and control
toxin production could be an alternative solution to the problem concerning the
need to reduce antibiotic load, at least in the food-chain. Indeed, plant essential oils
represent a promising source of new antimicrobials because they are particularly
abundant in diterpenes, which are able to inhibit bacterial growth and to contrast the
induction of multi-drug resistance of pathogens. Escherichia coli and Campylobacter
jejuni are food-borne pathogenic bacteria, known agents of intestinal diseases; both
species exploit their pathogenesis through the production of toxins. In particular, the
cytolethal distending toxin (CDT) of both C. jejuni and E. coli are potent inhibitor
of cell division G2/M phase. In this study, the antimicrobial activity of essential
oils distilled from Monarda fistulosa obtained from healthy and phytoplasmainfected plants was tested against E. coli and C. jejuni, in order to determine and
compare the their antitoxigenic activity. We used the broth dilution method, to define
sub-inhibitory concentrations of the essential oils, followed by the study of gene
expression profiles of toxins production, through the 2-ΔΔCt assay and real-time RTPCR. The analysis was extended to the gene expression of exo-toxins in correlation
with LuxS, encoding for the quorum sensing auto-inducer, that promote virulence and
with 2 transcriptional regulator DNA binding proteins as Hns for E. coli and DksA for
C. jejuni, acting as repressor of virulence factors. The results obtained are promising,
indeed the antitoxigenic activity of the essential oil of M. fistulosa (from both healthy
and phytoplasma-infected plants) is more potent even when compared to specific
antibiotics. The essential oils tested down-regulated the expression of CDT and the
auto-inducer LuxS of the quorum sensing System, oppositely the expression of both
transcriptional regulators Hns and DksA was over-expressed on concentration and
time courses, both in E. coli and C. jejuni.
Key words: phytoplasms, essential oils, microbial ecology, exo-toxins, gene
expression, real-time RT-PCR
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro eseguito con un contributo della Fondazione Cassa di Risparmio di Imola
nell’ambito del progetto “Monarda spp.”.
115
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
contaLDo n., M.G. BeLLarDi, a. Bertaccini, L. caviccHi, f. ePifano, s. Genovese, M.
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a luxS encoded signalling molecule. Microbiology, 148, 1475-1481.
kLena J.D., c.t. Parker, k. kniBB, J.c. iBBitt, P.M. Devane, s.t. Horn, W.G. MiLLer,
M.e. konkeL, 2004. Differentiation of Campylobacter coli, Campylobacter
jejuni, Campylobacter lari, and Campylobacter upsaliensis by a multiplex
PCR developed from the nucleotide sequence of the lipid A gene lpxA. Journal
of Clinical Microbiology, 42, 5549-5557.
PfaffL M.W., 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time
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116
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
ANALISI BIOCHIMICHE E DI ESPRESSIONE GENICA
DELLA VIA METABOLICA DEI FLAVONOIDI IN VITI
AFFETTE DA FLAVESCENZA DORATA E RISANATE
P. Margaria1, P. Caciagli1, A. Ferrandino2, A. Schubert2, S. Palmano1
1
Istituto Virologia Vegetale, CNR, (IVV) Strada delle Cacce 73, 10135 Torino, Italy.
2
Dipartimento Colture arboree, Università di Torino,Via L. da Vinci 44,10095
Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
Introduzione
La flavescenza dorata (FD) è una malattia da quarantena associata a fitoplasmi tra
quelle più importanti della vite. Un continuo impegno della ricerca è indirizzato allo
studio dell’interazione ospite/patogeno, allo scopo di chiarire i meccanismi di infezione
del fitoplasma, i meccanismi di risposta e difesa dell’ospite e le basi molecolari del
“recovery”, un interessante fenomeno di remissione dei sintomi che può verificarsi
spontaneamente nelle piante sintomatiche. Recenti studi di proteomica condotti su
viti affette da FD (Margaria e Palmano, 2011; Margaria et al., 2013), hanno permesso
di evidenziare alterazioni di precisi profili proteici in seguito all’infezione del
fitoplasma, e successive analisi bioinformatiche hanno individuato le vie metaboliche
maggiormente alterate. Tra queste, un “pathway” particolarmente modificato è
risultato essere quello dei flavonoidi. Si è voluto di conseguenza approfondire lo
studio di queste modificazioni, in piante infette e risanate, nelle due cultivar Nebbiolo
e Barbera, note per la loro diversa suscettibilità alla malattia. L’analisi è stata condotta
integrando le analisi biochimiche con quelle di espressione genica, durante le varie
fasi della stagione vegetativa della vite.
Materiali e metodi
In due vigneti situati in provincia di Asti, Piemonte, monitorati da diversi anni per
la presenza di fitoplasmosi, sono stati raccolti campioni sani, infetti e risanati (da
almeno due anni) da FD. I campioni sono stati singolarmente saggiati per la presenza
di fitoplasmi e dei virus più comunemente presenti nei vigneti piemontesi (Margaria
et al., 2009; Gambino e Gribaudo, 2006). Per le successive analisi biochimiche e
trascrittomiche sono stati creati 3 sottogruppi di almeno 4 piante ciascuno, per ogni
tesi (sano, infetto, risanato) e per ciascuna data di raccolta (giugno, luglio, agosto e
settembre).
117
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Flavonoidi, antociani e proantocianidine totali sono stati estratti da tessuto fogliare e
quantificati tramite letture spettrofotometriche. I flavonoli sono stati invece separati
ed identificati tramite HPLC.
Per lo studio di espressione genica in “RealTime” RT-PCR, sono stati selezionati 13
geni di vite, di cui dieci geni appartenenti al ciclo metabolico in studio e tre geni
endogeni di riferimento (ACT, UBI, 18S). La media geometrica dei rapporti di
espressione dei due geni più stabili (ACT e UBI), individuati utilizzando i software
geNorm, Norm Finder e Best Keeper, è stata utilizzata come fattore di normalizzazione
per il calcolo delle quantità relative degli altri geni.
Per quanta riguarda i geni bersaglio specifici, sono stati considerati due isogeni a
monte del “pathway” coinvolti nel fornire i precursori per la sintesi delle diverse
categorie di flavonoidi (CHSII e CHSIII); i principali geni coinvolti nella sintesi dei
metaboliti in studio: F3H2, LDOX, UFGT, FLS, ANR, LAR ed infine due fattori
trascrizionali (Myb1A e Myb1F).
Risultati e discussione
E’ stata condotta un’analisi approfondita delle alterazioni indotte da FD durante la
stagione vegetativa della vite a livello dei tre principali rami che compongono la
via metabolica dei flavonoidi, integrando approcci biochimici e trascrittomici. E’
stata ottenuta un’ottima correlazione tra dati metabolici e di espressione genica.
L’integrazione di questi dati conferma che in seguito all’infezione da FD è presente
un’alterazione della via metabolica dei flavonoidi totali in entrambe le cultivars,
mentre le piante risanate tendenzialmente hanno profili simili a quelle sane. E’
emersa tuttavia, una sostanziale differenza nella reazione del Barbera rispetto a
quella del Nebbiolo. In generale la risposta in Barbera, sia da un punto di vista
biochimico che trascrittomico, è molto intensa e marcata, raggiungendo il suo
picco ad agosto. Il Nebbiolo invece ha una risposta più limitata, raggiungendo il
picco a luglio. In Barbera si assiste ad un drastico aumento degli antociani, la cui
sintesi è fortemente attivata rispetto ad altri componenti del “pathway” metabolico.
Questo non avviene invece in Nebbiolo, dove l’arrossamento generalmente limitato
e settoriale osservato nelle foglie infette, è confermato dal limitato accumulo di
queste molecole.
Sono in corso approfondimenti per verificare l’eventuale coinvolgimento di alcune
specifiche molecole appartenenti alla classe dei flavonoli e delle proantocianidine
nella diversa risposta all’infezione che caratterizza i due vitigni in studio.
Parole chiave: fenil-propanoidi, fitoplasma, recovery, Vitis vinifera
118
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Transcriptional and metabolic analyses of the flavonoid pathway in “flavescence
dorée” affected and recovered grapevines
“Flavescence dorée” (FD) is a quarantine disease of Vitis vinifera, associated with
phytoplasmas, phloem-limited pathogens in the class Mollicutes. The study of the
host/pathogen interaction is a main topic to which recent research has been directed,
in order to clarify the mechanisms of phytoplasma infection, the defense response
of the plant, and the biological bases of recovery, an interesting phenomenon of
symptom remission that can occur spontaneously in infected plants. Recent proteomic
studies conducted on infected grapevines revealed specific protein profile alterations
induced by the phytoplasma presence, and bioinformatic analyses identified the most
affected metabolic pathways. Among these, the flavonoid pathway has been shown to
be specifically modified. The aim of this work was to deeper investigate the changes
induced by infection and recovery from FD in this specific pathway, integrating
biochemical analysis with gene expression data. Two Italian cultivars, Nebbiolo and
Barbera, were selected due to their different sensitivity to phytoplasma infection and
recovery occurrence. Samples from leaves of healthy, infected and recovered plants of
the two cultivars, were collected at four time-points during the vegetative season. Total
flavonoids, anthocyanins and proanthocyanidins were analyzed by spectrophotometry,
while flavonol profiles were determined by HPLC. The expression levels of several
genes involved in the flavonoid biosynthetic pathway were monitored by quantitative
RT-PCR, including upstream genes (CHS), structural genes (F3H, LDOX, UFGT,
FLS, LAR, ANR) and transcription factor genes (Myb1A e Myb1F). Variation in
mRNA level of the target genes was evaluated and correlated to the plant phenological
stage and to the phytosanitary status.
Key words: phenyl-propanoid pathway, phytoplasma, recovery, Vitis vinifera
Ringraziamenti / Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Servizio fitosanitario della Regione Piemonte.
This work was founded by ‘‘Servizio fitosanitario regionale’’, Regione Piemonte,
Italy.
Lavori citati / References
MarGaria P., s. aBBa’, s. PaLMano, 2013. Novel aspects of grapevine response to
phytoplasma infection investigated by a proteomic and phospho-proteomic
approach with data integration into functional networks. BMC Genomics, 14, 38.
MarGaria P., s. PaLMano, 2011. Response of the Vitis vinifera L. cv. Nebbiolo proteome
to flavescence dorée phytoplasma infection. Proteomics, 11, 212-224.
119
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
MarGaria P., M. turina, s. PaLMano, 2009. Detection of flavescence dorée and bois
noir phytoplasmas, grapevine leafroll associated virus-1 and -3 and grapevine
virus A from the same crude extract by reverse transcription-RealTime Taqman
assays. Plant Pathology, 58, 838-845.
GaMBino G., i. GriBauDo, 2006. Simultaneous detection of nine grapevine viruses by
multiplex reverse transcription polymerase chain reaction with coamplification
of a plant RNA as internal control. Phytopathology, 96, 1223–1229.
120
EPIDEMIOLOGIA
DELLE FITOPLASMOSI
EPIDEMIOLOGY OF
PHYTOPLASMA DISEASES
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
VARIABILITÀ MOLECOLARE MULTIGENICA DEL
FITOPLASMA “STOLBUR” IN RELAZIONE ALLA
DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA SUL TERRITORIO
ITALIANO
F. Punelli, A. Gentili, E. Costantini, L. Ferretti, G. Pasquini
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura- Centro di Ricerca per
la Patologia vegetale, CRA-PAV – via C.G. Bertero, 22, 00156 Roma
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il fitoplasma “stolbur” (16SrXII-A) è responsabile di gravi malattie in diverse
specie di interesse agrario, in modo particolare solanacee e vite, in quest’ultima è
associato alla malattia nota come legno nero (LN), appartenente al complesso dei
giallumi.
Il ciclo epidemiologico e le modalità di trasmissione e diffusione di questo
fitoplasma non sono ancora completamente chiarite. Attualmente l’unico vettore
per cui è stata dimostrata la capacità di trasmettere “stolbur” a vite è il cixiide
Hyalesthes obsoletus Signoret, che, però, spesso è presente in quantità esigue
sia all’interno dei vigneti che nei campi di pomodoro, pur in situazioni di forti
epidemie.
L’analisi molecolare di un gene meno conservato del 16S ha consentito di individuare
due tipi di isolati a ciclo epidemiologico differenziato per ospite intermedio: il tuftipo a, legato all’ortica ed il tuf-tipo b, legato al convolvolo (Langer e Maixner,
2004).
In questo lavoro viene riportata l’analisi di un elevato numero di isolati di “stolbur”,
reperiti in diversi areali italiani in ospiti diversi (specie coltivate e spontanee e
individui di H. obsoletus) attraverso un approccio multigenico (MLST) sui geni
secY, stamp e vmp1 (Lee et al., 2006; Fabre et al., 2011; Pacifico et al., 2009),
coinvolti in importanti meccanismi quali la diffusione del fitoplasma nell’ospite e
il rapporto vettore/fitoplasma - ospite/fitoplasma. L’analisi della variabilità genetica
valutata contemporaneamente su più geni ha consentito di ottenere interessanti
informazioni soprattutto in relazione alla distribuzione geografica degli isolati.
123
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Materiali e metodi
Campioni di Vitis vinifera L., Solanum lycopersicum L., Urtica dioica L., Convolvulus
arvensis L., H. obsoletus, Calystegia sepium L. e Cirsium arvense L. sono stati
raccolti in nove regioni italiane (Trentino, Emilia-Romagna, Toscana, Lazio, Umbria,
Molise, Campania, Calabria e Sicilia). I campioni provenienti dall’Emilia-Romagna
erano nella quasi totalità pomodori, mentre gli individui di H. obsoletus provenivano
tutti dal Lazio.
Sono stati amplificati 113 campioni partendo da estratti di DNA totale ottenuti
secondo i metodi descritti in Marzachì et al. (1999), e inizialmente caratterizzati sul
gene tuf mediante PCR/RFLP (Langer e Maixner, 2004). Gli altri geni invece sono
stati sottoposti ad amplificazione secondo quanto riportato in bibliografia (Fabre et
al., 2011, Fialová et al., 2009; Pacifico et al., 2009) e solamente per il gene secY è
stata effettuata PCR “nested” utilizzando dei “primers” appositamente disegnati.
Le sequenze purificate sono state analizzate con il software Chromas Pro ed elaborate
negli allineamenti con il software MEGA 5 per l’analisi della variabilità molecolare. In
tal modo sono stati ottenuti mediante il test del Neighbour-Joining alberi filogenetici
basati sulle distanze.
Risultati e discussione
Il gene vmp1 è risultato essere molto variabile per numero di genotipi individuati.
Di conseguenza l’applicazione dell’MLST ad un numero elevato di campioni
provenienti da diversi areali geografici italiani e da diversi ospiti del fitoplasma ha
evidenziato interessanti correlazioni da un punto di vista epidemiologico soprattutto
sui geni secY e stamp. Nel caso dei campioni di vite analizzati le sequenze si sono
distribuite trasversalmente nella quasi totalità dei genotipi ottenuti, mentre gli isolati
provenienti da piante di pomodoro (Emilia-Romagna e Umbria) e gli individui di H.
obsoletus (Lazio) analizzati hanno mostrato una elevata omologia di sequenza sui
entrambi i geni.
Fra gli isolati tuf-tipo b è stata riscontrata una interessante correlazione tra i genotipi
individuati e la loro distribuzione geografica. In alcuni areali dell’Italia meridionale
è stato, infatti, individuato un solo genotipo sia sul gene secY che sul gene stamp,
facendo ipotizzare una possibile origine comune delle infezioni.
L’analisi multigenica eseguita in questo lavoro ha consentito di rilevare, come già
riportato (Filippin et al., 2009), una corrispondenza tra la suddivisione degli isolati
nei tipi ‘a’ e ‘b’ sul gene tuf ed i principali “clusters” rilevati nei geni analizzati. Solo
alcune divergenze sono state osservate sul gene stamp e vmp1.
Parole chiave: MLST, “stolbur”, tipo tuf, variabilità genetica
124
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
MLST variability of “stolbur” phytoplasmas in relationship with their
geographic distribution in Italy
“Stolbur” phytoplasmas affects several plant species in European countries, in
particular tomato, potato, grapevine and wild plant species and is transmitted by
the planthopper Hyalesthes obsoletus Signoret. In the present work the molecular
variability of “stolbur” from different host plants and H. obsoletus specimens,
previously differentiated into tuf-type a and tuf-type b by PCR/RFLP based method,
has been investigated through a multiple gene approach performed on secY, stamp and
vmp1 genes. Nucleotide sequences of all genes were analyzed and the phylogenetic
relationships were determined by building phylogenetic trees. The obtained strain
clusters were correlated with the geographical origin and ecological features of the
isolates.
Key words: MLST, stolbur, tuf-type, genetic variability
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il progetto è stato svolto nell’ambito del P.F. ESPLORA (ESPLORAzione della
biodiversità vegetale ed animale alla ricerca di alleli superiori da inserire nei
programmi avanzati di miglioramento genetico a sostegno dell’agricoltura nazionale)
del MiPAAF.
Lavori citati / References
faBre a., J-L. Danet, X. foissac, 2011. The stolbur phytoplasma antigenic membrane
protein gene STAMP is submitted to diversifying positive selection. Gene,
472, 37-41.
fiaLová r., P. váLová, G. BaLakisHiYeva, J-L. Danet., D. šafárová, X. foissac, M.
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and wild plant species in South Moravia. Journal of Plant Pathology, 91(2),
411-416.
fiiLiPPin L., e. tonon, v. forte, G. Zottini, G. santovito, M. BorGo, e. anGeLini,
2009. Genetic polymorphism of stolbur phytoplasma in grapevine, wild plant
and insects. Le Progrès agricole et viticole, HS, 139-140.
LanGer M., M. MaiXner, 2004. Molecular characterisation of grapevine yellows
associated phytoplasmas of the stolbur group based on RFLP-analysis of nonribosomal DNA. Vitis, 43, 191-199.
125
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lee i-M., Y. ZHao, k.D. Bottner, 2006. SecY gene sequence analysis for finer
differentiation of diverse strains in the aster yellows phytoplasma group.
Molecular and Cellular Probes, 20, 87-91.
MarZacHì c., a. aLMa, M. D’aQuiLio, G. Minuto, G. BoccarDo, 1999. Detection and
identification of phytoplasmas infecting cultivated and wild plants in Liguria
(Italian Riviera). Journal of Plant Pathology, 81(2), 127-136.
Pacifico D., aLMa a., BaGnoLi B., foissac X., PasQuini G., tessitori M., MarZacHì
c., 2009. Characterization of bois noir isolates by restriction fragment
length polymorphism of a stolbur-specific putative membrane protein gene.
Phytopathology, 99(6), 711-715.
126
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
VARIABILITÀ GENETICA DI FITOPLASMI ASSOCIATI
A FLAVESCENZA DORATA IN UN VIGNETO DELLA
PROVINCIA DI MASSA CARRARA
A. Bertaccini1, S. Paltrinieri1, N. Contaldo1, E. Gargani2, P. Braccini3,
B. Bagnoli4
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
CRA-ABP Centro di ricerca per l’Agrobiologia e la Pedologia, via Lanciola, 12/a,
50125 Firenze
3
Fitopatologo, via F. Baracca, 146, 50127 Firenze
4
Entomologo, via G. Fabbroni, 46, 50134 Firenze
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il primo accertamento della presenza di flavescenza dorata (FD) in Toscana risale
al 2003 e riguarda un vigneto sito nel comune di Montignoso, provincia di Massa
Carrara (Bertaccini et al., 2003). In quest’ultimo decennio il monitoraggio via via
più attento della fitoplasmosi in ambito regionale, ha permesso di evidenziare una
presenza abbastanza diffusa della malattia, esclusivamente nelle aree viticole delle
province di Massa Carrara e Lucca. Alla luce di questa situazione, nell’ambito del
programma EUPHRESCO GRAFDEPI, nel 2012 sono state effettuate indagini
principalmente in vigneti della provincia di Massa Carrara. Nel presente lavoro si
fa specifico riferimento a un impianto già indagato nel 2009 e che, viste le peculiari
caratteristiche ambientali, è stato ritenuto un interessante modello di agro-ecosistema
per l’approfondimento delle conoscenze sulle fitoplasmosi della vite.
Materiali e metodi
Il vigneto oggetto di studio è un impianto del 2004, dell’estensione di circa un ettaro,
ubicato a San Terenzo Monti (Fivizzano, MS). I vitigni presenti sono sei di cui
quattro autoctoni (Albarola, Ciliegiolo, Pollera Pontremolese e Vermentino) e due
internazionali (Chardonnay e Merlot), tutti su portinnesto SO4. La vegetazione di
bordo è caratterizzata, oltre che dalla presenza di piante di castagno, da quella di
arbusti vari tra cui, rovo, biancospino, pruno, sambuco e soprattutto vitalba. A metà
agosto del 2009 fu raccolto un primo lotto di nove campioni da altrettante piante
con sintomi di giallume, mentre a cavallo tra settembre e ottobre del 2012, durante
due sopralluoghi sono stati complessivamente prelevati 21 campioni, sempre da
piante di vite sintomatiche e sei campioni di Clematis vitalba. In laboratorio da
127
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
ciascun campione di campo è stato poi preparato un campione di materiale vegetale
selezionando porzioni di nervature e di floema e si è proceduto con l’estrazione del
DNA totale utilizzando il protocollo a base di cloroformio/fenolo (Prince et al., 1993).
Per l’individuazione dei fitoplasmi, su tutti i campioni è stata eseguita l’analisi del
gene ribosomico 16S e di parte della regione spaziatrice, utilizzando i “primers” P1/
P7 in PCR diretta (Deng e Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), a cui sono seguite
analisi in “nested”-PCR con i “primers” B5/P7 (Padovan et al., 1995) e M1/B6 (Gibb
et al., 1995; Padovan et al., 1995). Mediante l’enzima di restrizione TaqI, utilizzato
sui campioni positivi amplificati con i “primers” M1/B6, è stato possibile procedere
alla distinzione dei fitoplasmi appartenenti ai due gruppi ribosomici 16SrV-C (FDC) e 16SrXII-A. Per confermare la variabilità di FD-C, già riscontrata sia in aree
viticole italiane che estere (Bertaccini et al., 2009; Paltrinieri et al., 2012), è stato
amplificato il gene della traslocasi SecY impiegando in PCR diretta i primers FD9f2/r
ed in “nested”-PCR i primers FD9f3/r2 (Angelini et al., 2001). Quest’ultimi ampliconi
sono stati digeriti con gli enzimi TaqI, Tru1I e Tsp509EI e sottoposti ad analisi RFLP
per verificare la presenza di ceppi di FD-C.
Risultati e discussione
Le analisi effettuate su vite hanno permesso di evidenziare solo la presenza dei
fitoplasmi del sottogruppo ribosomico 16SrV-C (FD-C), sia nei campioni del 2009
(7/9) che in quelli del 2012 (14/21). Dei sei campioni di C. vitalba, uno è risultato
positivo alla presenza di fitoplasmi e il sottogruppo ribosomico identificato è il
16SrXII-A (“stolbur”). Questo sembra essere il primo ritrovamento di “stolbur” in
questa specie, che come è noto è stata riportata per l’Italia e per la Serbia come ospite
alternativo di FD (Angelini et al., 2004; Filippin et al., 2009).
Su tutti i campioni positivi a FD è stato studiato il polimorfismo del gene SecY
mediante il taglio con gli enzimi di restrizione TaqI, Tru1I e Tsp509EI. A differenza
di quanto osservato sul gene 16S tutti i campioni, tranne uno del 2012, hanno
evidenziato un profilo riconducibile a quelli individuati in fitoplasmi FD-D. Solo
un campione ha evidenziato, con l’enzima Tru1I, un profilo misto di FD-C e FD-D,
mentre il taglio enzimatico con TaqI ha mostrato chiaramente solo il profilo tipico
di FD-C. Questi risultati indicano come il polimorfismo del gene SecY, tipicamente
individuato in ceppi FD-D, sia presente anche in ceppi identificati come FD-C.
Ciò conferma che anche sul territorio toscano la differenziazione di ceppi per il
fitoplasma della flavescenza dorata è in atto come già visto in Emilia-Romagna ed in
Francia (Bertaccini et al., 2009; Paltrinieri et al., 2012). È noto che in ambienti in cui
la malattia è presente in maniera endemica, il patogeno è soggetto a minor pressione
selettiva e può quindi sviluppare una forte variabilità molecolare specialmente in
alcuni geni quali SecY (Lee et al., 2006). L’individuazione tempestiva di ceppi
geneticamente diversi è di primaria importanza per tenere sotto controllo i focolai
128
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
dell’epidemia e prevenire possibili nuovi estesi scoppi epidemici, estremamente
difficili da contenere una volta diffusi sul territorio.
Parole chiave: vite, flavescenza dorata, PCR/RFLP, variabilità molecolare, Toscana
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro eseguito nell’ambito del progetto “EUPHRESCO-GRAFDEPI”.
Genetic variability in phytoplasmas associated with “flavescence dorée” in a
vineyard of the Massa Carrara province (Tuscany)
“Flavescence dorée” (FD) is a disease still of relevant importance considering the
ability of phytoplasmas associated with it to differentiate new strains in short periods
of time. The first finding of FD in Tuscany dates back to 2003 and concerns a vineyard
sited at Montignoso, in Massa Carrara province. In the last decade the monitoring of
phytoplasma has highlighted a fairly widespread presence of the disease, only in the
wine-growing areas of the provinces of Massa Carrara and Lucca. In the context of
the program EUPHRESCO GRAFDEPI, in 2012 surveys were carried out mainly in
vineyards in the province of Massa Carrara. The vineyard reported was monitored in
2009 as well, it is made of six varieties, four native (‘Albarola’, ‘Ciliegiolo’, ‘Pollera
Pontremolese’ and ‘Vermentino’) plus ‘Chardonnay’ and ‘Merlot’, all grafted on SO4
rootstock. The flora of the border is made up by chestnut plants and also several shrubs
including, blackberries, hawthorn, plum, elderberry and especially greybeard. A total
of 30 samples of leaves and branches were collected from symptomatic vines (nine
in 2009 and 21 in 2012) and a total of six samples of Clematis vitalba were collected
from border flora in 2012. All grapevine samples positive to phytoplasmas (7/9 in
2009 and 14/21 in 2012) resulted infected by FD-C. Regarding to the greybeard a
sample resulted positive and infected by 16SrXII-A (“stolbur”) phytoplasmas.
Molecular characterization was carried out on FD strains identify that all the samples
were infected by FD-D phytoplasmas, however the fine characterization on the SecY
gene by RFLP analyses showed that all strains but one have a profile indistinguishable
from the one typically described in FD-C strains. One sample showed profile mixed
between typical FD-C and FD-D strains. This result indicates that also in Tuscany
FD-D phytoplasma is producing strains as already reported in other Italian FD-D
epidemic as well as in one strain from France. This finding is quite important since
the possibility to early identify new FD strains allows to better manage the disease
before these strains become epidemically relevant.
Key words: grapevine, “flavescence dorée”, PCR/RFLP, molecular variability, Tuscany
129
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
anGeLini e., D. cLair, M. BorGo, a. Bertaccini, e. BouDon-PaDieu, 2001. Flavescence
dorée in France and Italy- Occurrence of closely related phytoplasma isolates
and their near relationships to palatinate grapevine yellows and an alder
yellows phytoplasma. Vitis, 40(2), 79-86.
anGeLini e., f. sQuiZZato, G. LuccHetta, M. BorGo, 2004. Detection of a phytoplasma
associated with grapevine Flavescence dorée in Clematis vitalba. European
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Bertaccini a., s. Botti, a. tonoLa, c. MiLano, P. Braccini, a. sfaLanGa, 2003.
Identificazione di fitoplasmi di flavescenza dorata in un vigneto della Toscana.
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Bertaccini a., s. PaLtrinieri, f. DaL MoLin, J. Mitrovic, B. DuDuk, 2009. Molecular
identification and geographic distribution of Flavescence dorée phytoplasma
strains. Le Progrès agricole et viticole, HS, 135-136.
DenG s., c. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and
nonculturable Mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
Lee i-M., Y. ZHao, k.D. Bottner, 2006. SecY gene sequence analysis for finer
differentiation of diverse strains in the aster yellows phytoplasma group.
Molecular and Cellular Probes, 20, 87-91.
fiLiPPin L., J. Jovic, t. cvrkovic, v. fortea, D. cLair, i. tosevski, e. BouDon-PaDieu, M.
BorGo, e. anGeLini, 2009. Molecular characteristics of phytoplasmas associated
with Flavescence dorée in clematis and grapevine and preliminary results on the
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PaDovan a.c., k.s. GiBB, a. Bertaccini, M. viBio, r.G. BonfiGLioLi, P.a. MaGareY,
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phytoplasmas. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology,
Vol. 2: 369-380.
130
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
STUDIO DELLA VARIABILITÀ MOLECOLARE MEDIANTE
ANALISI MULTIGENICA DI ‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA
MALI’, ‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA PRUNORUM’ E
‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA PYRI’
L. Vizzaccaro, G. Pasquini, E. Costantini, A. Gentili, F. Punelli, L. Ferretti
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura - Centro di Ricerca per
la Patologia vegetale, CRA-PAV – via C.G. Bertero, 22, 00156 Roma
E-mail: [email protected]
Introduzione
I principali fitoplasmi associati a malattie di rilevante importanza economica a
carico di specie da frutto (drupacee e pomacee) sono rappresentati da ‘Candidatus
Phytoplasma mali’ (16SrX-A), agente degli scopazzi del melo (“apple proliferation”
- AP), ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ (16SrX-C) associato alla malattia nota
come moria del pero (“pear decline” - PD) e ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
(16SrX-B) responsabile su specie del genere Prunus del giallume europeo delle
drupacee (“European stone fruit yellows” - ESFY). La caratterizzazione multigenica
(“multilocus sequence typing” - MLST) viene considerata un valido approccio per
approfondire le conoscenze sulla variabilità genetica dei fitoplasmi. Recentemente,
mediante questo strumento di analisi è stata studiata la diversità genetica dei
fitoplasmi associati alle piante da frutto utilizzando quattro geni non ribosomici (aceF,
pnp, imp, secY) che hanno evidenziato, per ciascun fitoplasma, l’esistenza di genotipi
differenti ed accertato la possibilità di ricombinazione genetica inter-specifica tra ‘Ca.
P. prunorum’ e ‘Ca. P. pyri’ (Danet et al., 2011).
Al fine di estendere ed implementare le conoscenze molecolari e filogenetiche
acquisite con questo approccio multigenico per i tre fitoplasmi considerati, gli stessi
geni sono stati utilizzati per la caratterizzazione e l’analisi filogenetica di isolati di
‘Ca. P. mali’, ‘Ca. P. prunorum’ e ‘Ca. P. pyri’ provenienti da diverse regioni italiane
e da alcuni areali europei di coltivazione di drupacee e pomacee. I risultati dell’analisi
multigenica eseguita su tali isolati sono riportati nel presente lavoro.
Materiali e metodi
L’analisi ha interessato isolati di ‘Ca. P. mali’, ‘Ca. P. prunorum’ e ‘Ca. P. pyri’ di
diversa origine geografica in collezione, come estratti di DNA, presso il CRA-PAV di
Roma. Complessivamente sono stati analizzati 19 isolati di ‘Ca. P. mali’, 45 isolati di
‘Ca. P. prunorum’ e 40 isolati di ‘Ca. P. pyri’. Tutti gli isolati sono stati sottoposti a
131
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
saggi di PCR per l’amplificazione specifica di frammenti dei geni aceF, pnp, secY e
imp secondo il protocollo descritto in Danet et al. (2011).
I prodotti di amplificazione ottenuti da ciascun isolato analizzato sono stati, quindi,
purificati e sottoposti a sequenziamento. Le sequenze nucleotidiche da sottoporre
ad analisi filogenetica sono state, quindi, ricostruite allineando e confrontando le
sequenze dei filamenti complementari. L’analisi filogenetica è stata eseguita su
ciascun gene utilizzando il metodo Neighbor-Joining mediante il software MEGA5
(Tamura et al., 2007) previo allineamento multiplo delle sequenze mediante
ClustalW2 (Larkin et al., 2007).
Risultati e discussione
L’analisi multigenica eseguita su differenti isolati di ‘Ca. P. mali’, ‘Ca. P. pyri’ e ‘Ca.
P. prunorum’ ha evidenziato, su tutti e quattro i geni analizzati, il raggruppamento
delle sequenze nucleotidiche in tre “clusters” principali, separati da elevati valori di
“bootstrap” (99-100), ciascuno corrispondente ad ognuno dei fitoplasmi considerati.
Per tutti i geni esaminati, all’interno di ciascun “cluster” è sempre stato possibile
individuare un numero variabile di genotipi, ciascuno rappresentato da gruppi di
sequenze identiche a livello nucleotidico. In generale, il gene imp è risultato il più
variabile in termini di numero di genotipi complessivamente riscontrati e, nel caso di
‘Ca. P. mali’ e ‘Ca. P. pyri’ anche nel numero di differenze nucleotidiche tra sequenze
appartenenti a genotipi differenti. Gli isolati di ‘Ca. P. prunorum’ sono risultati i
meno variabili; indipendentemente dal gene considerato, infatti, i genotipi individuati
mostravano sempre una elevata omologia nucleotidica.
Per tutti i fitoplasmi, la variabilità molecolare osservata sui singoli geni è risultata
generalmente indipendente dalla provenienza geografica degli isolati. Interessanti
correlazioni sono emerse, invece, tra isolati provenienti dagli stessi frutteti.
L’analisi multigenica ha evidenziato, infine, la presenza di ricombinazione interspecifica ‘Ca. P. pyri’ - ‘Ca. P. prunorum’ in un isolato di ‘Ca. P. pyri’ del Lazio,
fenomeno già osservato da altri autori in un isolato spagnolo e in un isolato proveniente
dall’Azerbaijan (Danet et al., 2011).
Parole chiave: AP, ESFY, PD, MLST, variabilità molecolare
132
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Investigation on molecular variability of ‘Candidatus Phytoplasma mali’,
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ and ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ by
multilocus sequence analysis
The main phytoplasmas associated to economically relevant diseases of temperate
fruit crops (stone and pome fruits) are represented by ‘Candidatus Phytoplasma
mali’ (16SrX-A), agent of apple proliferation, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’
(16SrX-C) agent of pear decline and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (16SrX-B)
associated with European stone fruit yellows in different Prunus species. Multilocus
sequence typing (MLST) is considered a suitable tool to deeply investigate the
genetic variability and the phylogenetic relationships of phytoplasmas and also for
their finer classification. Recently this molecular approach has been used to study
the genetic variability of fruit trees phytoplasmas using a panel of four genes
(aceF, pnp, imp, secY). In this paper are reported the results of a MLST analysis
performed with the same panel of genes on ‘Ca. P. mali’, ‘Ca. P. prunorum’ and ‘Ca.
P. pyri’ isolates from different Italian regions and other European countries. For all
phytoplasmas, the analysis allowed to distinguish molecularly different genotypes
on all considered genes. The imp gene showed the highest variability in terms of
number of genotypes. In ‘Ca. P. mali’ and ‘Ca. P. pyri’ this gene also showed the
highest number of substitutions among sequences belonging to different genotypes.
Independently from the considered genes, ‘Ca. P. prunorum’ isolates exhibited the
lowest molecular variability with high sequence identity among different genotypes.
For all phytoplasmas, the observed molecular variability on the four genes was
not generally related with the geographical origin of the isolates while interesting
correlations were found among isolates from the same orchards. Finally, the presence
of ‘Ca. P. prunorum’-‘Ca. P. pyri’ recombination events were confirmed in a ‘Ca. P.
pyri’ isolate, as previously reported by other authors showing the occurrence of this
phenomenon also in Italy.
Key words: AP, ESFY, PD, MLST, molecular variability
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il lavoro è stato svolto nell’ambito del Progetto EUPHRESCO - APOPHYT, finanziato
dal MiPAAF. Si ringrazia il Dott. Marco Cardoni del CAV, Centro Attività Vivaistiche,
Faenza (RA) per aver fornito alcuni isolati di fitoplasmi delle pomacee.
133
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
Danet J.L., G. BaLakisHiYeva, a. ciMerMan, n. sauvion, v. Marie-Jeanne, G. LaBonne,
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134
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CEPPI DI
‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA ASTERIS’ DA MAIS
J.F. Mejia1, L. Zamora1-3, B. Duduk2, M.L. Quiñones 3, A. Bertaccini1,
N. Contaldo1
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum , Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
Laboratory of Applied Phytopathology, Institute of Pesticides and Environmental
Protection, Banatska 31b, P.O. Box 163, 11080 Belgrade-Zemun, Serbia
3
National Centre for Animal and Plant Health (CENSA), San José de Las Lajas PC
32700, Havana, Cuba
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il fitoplasma associato a “maize bushy stunt” (MBS) è stato descritto in diversi stati
americani dagli Stati Uniti all’Argentina (Bedendo et al., 2000; Gomes et al., 2004;
González et al., 2002); è tramesso dal cicadellide Dalbulus maidis (De Long &
Wolcott, 1923) che è anche in grado di trasmettere il Maize rayado fino virus (MRFV)
e Spiroplasma kunkelii (Whitcomb et al., 1986) agente del “corn stunt” (CS). I sintomi
osservati in piante infette da MBS sono diversi a seconda del genotipo di mais colpito,
comunque clorosi marginale sulle foglie giovani ed arrossamento graduale degli apici
vegetativi che progredisce con l’avanzare della maturazione della pianta rappresentano
i sintomi più comuni. Un sintomo molto evidente è rappresentato dall’aspetto
affastellato della vegetazione dovuto a eccessiva proliferazione delle strutture fogliari
che diventano clorotiche e rossastre. L’osservazione visiva dei sintomi in campo non
permette di distinguere i sintomi associati a MBS da quelli dovuti a CS (CIMMYT,
2004). MBS è stato descritto sia a Cuba che in Colombia; in particolare in Colombia,
dal 1996, la malattia ha iniziato a diffondersi in maniera fortemente epidemica con
picchi elevati di incidenza, probabilmente correlati alla modificazioni climatiche
(temperatura e piovosità) che hanno influenzato l’entità delle popolazioni del vettore
(Varón et al., 2001; González et al., 2002). Analisi molecolari sono state effettuate
su acidi nucleici ottenuti da campioni di mais sintomatici provenienti da Cuba e
dalla Colombia per verificare la presenza e successivamente identificare i fitoplasmi
associati a MBS in questi Stati.
Materiali e metodi
Campioni di mais sintomatico sono stati prelevati in due località di Cuba (Las
Tunas e La Havana) ed in una della Colombia (Valle del Cauca) nel 2012 e nel 2007
135
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
rispettivamente. L’acido nucleico è stato estratto da 0,4 – 1,0 g di tessuti fogliari, piccioli
e giovani pannocchie mediante una metodologia basata sull’uso di cloroformio e fenolo
(Prince et al., 1993). Sono quindi state effettuate analisi di PCR diretta con i “primers”
universali P1A/P7A (Lee et al., 2004) seguiti in amplificazioni “nested” dai “primers”
F1/B6 (Davis e Lee, 1993; Padovan et al., 1995), R16F2n/R2, e/o R16(I)F1/R1 (Lee
et al., 1994; 1995). Gli ampliconi sono poi stati digeriti con gli enzimi di restrizione
Tru1I e HhaI. E’ inoltre stato effettuato il sequeziamento diretto in entrambe le direzioni
utilizzando i “primers” F1, B6, F2n and R2 sugli ampliconi P1A/P7A. Al fine di ottenere
un’ulteriore e più fine caratterizzazione molecolare dei fitoplasmi identificati sul gene
ribosomico16S, si è proceduto all’amplificazione dei geni groEL, tuf, amp e rp.
L’amplificazione di groEL è stata ottenuta in PCR “nested” con i “primers”
AYgroesF/AYampR seguiti dai “primers” AYgroelF/AYgroelR (Mitrović et al.,
2011). L’amplificazione di tuf, amp e dei geni l22 e s3 (rp) è stata invece ottenuta in
PCR diretta utilizzando i “primers” fTufu/rTufu (Schneider et al., 1997), Amp-N1/
C1 (Kakizawa et al., 2004) e rpF1c/rp(I)R1A (Martini et al, 2007), rispettivamente.
Le analisi RFLP su questi ampliconi sono state effettuate con gli enzimi di restrizione
Tru1I, Hpy8I, TaaI, AluI e Tsp509I.
Risultati e discussione
I risultati delle indagini molecolari effettuate hanno permesso di confermare
l’associazione di ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ (Lee et al., 2004) con MBS sia
a Cuba che in Colombia; tutti i campioni sintomatici esaminati sono risultati positivi
per la presenza di questo fitoplasma che è risultato appartenere al gruppo ribosomico
16SrI-B. Le analisi RFLP con Tru1I ed AluI sugli ampliconi di circa 1.4 kb ottenuti
sul gene groEL hanno permesso di differenziare il ceppo che infetta il mais dagli altri
ceppi di giallume dell’astro descritti in letteratura su questo gene (Mitrović et al.,
2011a; 2011b) e di attribuirlo al gruppo groELI RFLP V. Le analisi RFLP effettuate
con Tru1I e Tsp509I sugli amplificati di amp, e con Tru1I, Hpy8I, TaaI, AluI sugli
amplificati del gene rpL22/rpS3 hanno mostrato profili diversificati per i ceppi che
infettano il mais in Colombia ed a Cuba rispetto ai ceppi di controllo utilizzati. In
particolare, mediante l’analisi dei profili di restrizione ottenuti utilizzando l’enzima
Hpy8I sugli ampliconi rpL22/rpS3, è stato possibile individuare una singola differenza
nucleotidica che permette di distinguere il ceppi di MBS prelevati in Colombia da
quelli prelevati a Cuba. Questi risultati sono stati confermati dal sequenziamento degli
ampliconi ottenuti; la caratterizzazione multigenica ha permesso di distinguere i ceppi
di giallume dell’astro che infettano il mais da quelli che infettano altre piante ospiti ed
anche di differenziare i ceppi colombiani da quelli cubani. Questo risultato permetterà
di effettuare studi epidemiologici mirati su questa importante malattia.
Parole chiave: mais, gene amp, gene groEL, gene tuf, gene che codifica per la
proteina ribosomica
136
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Molecular characterization of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ strains from maize
The mollicutes ‘Ca. P. asteris’ and Spiroplasma kunkelii sp. nov. are reported as
agents of maize bushy stunt (MBS) and corn stunt (CS) diseases, among the most
economically important maize (Zea mays L.) diseases, whose incidence has increased
in the Caribbean, Central and Southern American countries. Plants showing disease
symptoms such as marginal chlorosis on young leaves, stunting, reddening of leaves,
early and abnormal ripening, precocious death, poor and shriveled grains in kernels,
that are in some cases also malformed, were collected in distinct Colombia and Cuba
regions. From both countries phytoplasmas belonging to 16SrI-B ribosomal subgroup
were identified only in samples from symptomatic materials. Further molecular
characterized by RFLP analysis and/or sequencing of ribosomal protein rpL22/rpS3,
tuf, amp and groEL genes were carried out and allow distinguishing the aster yellows
strains detected in Cuba and in Colombia in maize from all other aster yellows
phytoplasmas used as reference. Additionally, using a specific restriction enzyme, in
real and in silico RFLP analysis on rpL22/S3 was possible to differentiate the MBS
Colombian strain, from the Cuban strain. This multilocus gene strain characterization
will enable to devise the best management strategies, to contain and prevent the
spreading of this epidemic disease.
Key words: corn, immunodominant protein, groEL, elongation factor, ribosomal protein
Lavori citati / References
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137
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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138
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI ‘CANDIDATUS
PHYTOPLASMA ASTERIS’ IN ORTENSIA IN CANADA
B. Duduk1, Y. Arocha2, J. Mitrović1, R. Benabid2, J. Scott2,3, R. Michelutti4,
A. Bertaccini5
Laboratory of Applied Phytopathology, Institute of Pesticides and Environmental
Protection, Banatska 31b, P.O. Box 163, 11080 Belgrade-Zemun, Serbia
2
Sporometrics, Toronto, Ontario M6K 1Y9, Canada
3
Division of Occupational & Environmental Health, Dalla Lana School of Public
Health, University of Toronto, Windsor, Canada
4
Canadian Clonal Genebank, Harrow, Ontario N0R 1G0, Canada
5
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna,
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
L’ortensia affetta da virescenza e fillodia risulta essere infetta da fitoplasmi classificati
nei sottogruppi 16SrI-A e 16SrI-B (“aster yellows”) sia in Europa che in altre parti del
mondo. In Giappone in piante con questa sintomatologia sono invece stati identificati
fitoplasmi classificati come ‘Candidatus Phytoplasma japonicum’ (Sawayanagi et al.,
1999) ed in Bulgaria e, più recentemente, in Italia sono stati identificati fitoplasmi del
gruppo dello “stolbur” (16SrXII-A) (Bertaccini et al., 1995a; 2012) ed in Giappone
è stato anche identificato ‘Ca. P. asteris’ (Takinami et al, 2013). La sintomatologia è
stata descritta anche in Canada ed associata a fitoplasmi 16SrI-B (Hiruki et al., 1994;
Bertaccini et al., 1995b) dove però non sono state effettuate analisi per caratterizzare a
livello più fine i fitoplasmi individuati.
Materiali e metodi
Sintomi riferibili alla presenza di fitoplasmi sono stato osservati in un giardino
privato in Ontario (Canada) nel mese di ottobre: i sintomi consistevano in evidenti
arrossamenti del margine fogliare ed in ridotte dimensioni della parte vegetativa. Sono
stati prelevati alcuni campioni che sono stati divisi in due sottocampioni e sottoposti
a diverse procedure per la identificazione dei fitoplasmi presenti.
Metodo a) estrazione degli acidi nucleici mediante impiego di 1 g di nervature
estratte mediante un metodo basato sull’utilizzo di CTAB seguito da precipitazione in
isopropanolo (Angelini et al., 2001), analisi di PCR diretta con i “primers” universali
P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995) seguiti in amplificazioni “nested”
dai “primers” R16F2/R2 (Lee et al., 1995). Gli ampliconi sono poi stati digeriti con
139
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
gli enzimi di restrizione Tru1I e HhaI. E’ inoltre stato effettuato il sequenziamento
diretto in entrambe le direzioni utilizzando i “primers” F1 (Davis e Lee, 1993) e B6
(Padovan et al., 1995) su uno degli ampliconi P1/P7.
Metodo b) impiego di 100 mg di nervature estratte mediante FastDNA Spin kit (MP
Biomedicals, USA) ed analisi di PCR diretta con i “primers” universali R16mF2/R1
seguiti dai “primers“ R16F2n/R2 (Gundersen e Lee, 1996) in PCR “nested”. Uno
degli amplificati ottenuti con i “primers” R16F2n/R2 PCR è stato purificato (EZNA
Cycle Pure kit, Omega Bio-Tek, USA), clonato (pGEM-T Easy Vector, Promega),
sequenziato (Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Canada)
e sottoposto and analisi RFLP virtuale (pDRAW32, http://www.acaclone.com).
Due campioni estratti con il metodo a) sono inoltre stati ulteriormente caratterizzati
a livello molecolare mediante amplificazione e sequenziamento del gene groEL.
L’amplificazione è stata ottenuta mediante PCR “nested” con i “primers” AYgroesF/
AYampR seguiti dai “primers” AYgroelF/AYgroelR (Mitrović et al., 2011a). Le
analisi RFLP sono state effettuate virtualmente mediante gli enzimi AluI e Tru1I ed i
profili sono stati comparati con quelli descritti (Mitrović et al., 2011a).
Risultati e discussione
Tutti i campioni prelevati dalle ortensie sintomatiche sono risultati positivi alle analisi
PCR; in particolare, un campione è risultato positivo solo in PCR “nested” e tutti
gli altri sono risultati amplificabili in PCR diretta con il metodo a), mentre tutti i
campioni sono risultati positivi in entrambi i casi con il metodo b). L’analisi RFLP
sugli ampliconi ottenuti con i “primers” R16F2/R2 (metodo a) ha identificato la
presenza di fitoplasmi riferibili al gruppo ribosomico 16SrI-B come già descritto in
campioni di ortensia del Canada (Bertaccini et al., 1995b). Il sequenziamento diretto
del gene ribosomico 16S ha permesso di ottenere una sequenza di 1650 nucleotidi che
ha una omologia del 100% con uno dei ceppi di ‘Ca. P. asteris’ presenti in GenBank
e del 99% con molti altri, confermando quindi la classificazione basata sull’analisi
RFLP. La sequenza di 1246 nucleotidi ottenuta dopo il clonaggio degli amplificati
ottenuti con i “primers” R16F2n/R16R2 seguendo la metodologia b) ha mostrato il
99% di omologia con i ceppi di ‘Ca. P. asteris’ presenti in GenBank.
L’amplificazione ed il sequenziamento diretto del gene groEL ha permesso di ottenere
una sequenza di 1094 nucleotidi con due soli “gaps” di differenza da quelle di giallume
dell’astro disponibili in GenBank, con le quali ha il 99% di omologia. L’analisi RFLP
virtuale ha inoltre permesso di assegnare il ceppo di giallume dell’astro individuato
nell’ortensia canadese al gruppo groELI-III, lo stesso recentemente descritto in un
ceppo italiano da ortensia (Bertaccini et al., 2012); i fitoplasmi assegnati al gruppo
groELI-III erano fino ad ora stati individuati in piante infette da giallume dell’astro
esclusivamente in Europa (Mitrović et al., 2011b).
Parole chiave: ortensia, Canada, sequenziamento, fitoplasmi, 16SrI-B
140
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Molecular characterization of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ infecting
hydrangea in Canada
Hydrangea species are infected by phytoplasmas belonging to subgroups 16SrI-A and
16SrI-B (aster yellows) inducing phyllody and virescence worldwide. In Japan some of
the phytoplasma associated such disease were classified as ‘Candidatus Phytoplasma
japonicum’, moreover 16SrXII-A phytoplasmas were identified in Bulgaria and
more recently in Italy. The hydrangea phyllody disease was associated with 16SrI-B
phytoplasmas in Canada, however no fine molecular characterization was carried
out on the phytoplasmas in that country. Hydrangeas showing symptoms similar to
those associated with phytoplasma diseases were found and collected from landscape
areas in South-western Ontario, Canada. Phytoplasmas belonging aster yellows group
were detected in all symptomatic samples tested by two different methodologies.
Direct sequencing and sequence obtained after cloning of the 16Sr DNA gene show
confirmation of reported classification and the amplification and sequencing of groEL
gene confirm previous classification in subgroup 16SrI-B and allow to enclose aster
yellows phytoplasmas in hydrangeas from Canada in the groELI-III group that up to
now was only detected in Europe.
Key words: hydrangea, Canada, sequencing, phytoplasmas, 16SrI-B
Ringraziamenti / Acknowledgements
Parte del lavoro del dr. B. Duduk è stato effettuato durante la STSM 11520 nell’ambito
della azione COST FA0807 “Integrated Management of Phytoplasma Epidemics in
Different Crop Systems”.
Lavori citati / References
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141
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
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Pathology. March 2013, DOI: 10.1007/s10327-013-0445-7.
142
CONTROLLO DELLE MALATTIE
ASSOCIATE A FITOPLASMI
CONTROL OF
PHYTOPLASMA-ASSOCIATED DISEASES
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
MALATTIE DA FITOPLASMI: IL “RECOVERY” E
LE RESISTENZE ACQUISITE, L’EPIGENETICA E LA
RESILIENZA
R. Osler, P. Ermacora, N. Loi, M. Martini, R. Musetti
DISA - Università di Udine, Via delle Scienze, 206, 33100 Udine, Italy
E-mail:[email protected]
Introduzione
Le conoscenze su questi argomenti di straordinario interesse sono state fortemente
incrementate durante gli ultimi anni (Osler et al., 2000; Musetti et al., 2005; Bianco
et al., 2012; Conti e Faoro, 2012). Si conoscono ora importanti basi fisiologiche e
genetiche che governano il “recovery” e le resistenze acquisite/indotte (Patui et al.,
2012; Musetti et al., 2013) nelle malattie da fitoplasmi.
Le conoscenze sulla epigenetica sono state sviluppate durante questo ultimo decennio,
anche nel comparto vegetale (Bird, 2007).
Per quanto concerne la resilienza - pur trattandosi di un concetto che è stato inizialmente
sviluppato nell’ambito della fisica e della meccanica – recentemente è stato esteso
anche ad altre discipline, alla biologia e alla ecologia in particolare (Walker et al.,
2002). Per quanto concerne la patologia vegetale e la difesa fitosanitaria – proprio
perchè gli studi su questi argomenti sono relativamente recenti – non sempre sono note
le connessioni e le interrelazioni fra “recovery”, resistenze acquisite/indotte, resistenze
epigenetiche e resilienza. Soprattutto, restano da approfondire le ripercussioni pratiche
sulla difesa delle coltivazioni di queste conoscenze scientifiche innovative. Guidati
da queste nuove conoscenze, dobbiamo chiederci quale sia la sostenibilità e l’effetto
sulla resilienza di alcune pratiche assai diffuse in agricoltura, come la riproduzione
delle piante per meristema, la termoterapia massale, l’isolamento delle piante madri
selezionate, l’uso di fungicidi sistemici ad ampio spettro di attività.
Materiali e metodi
Sulla base delle conoscenze recenti, incluse quelle acquisite in Friuli sul binomio
albicocco/giallume europeo delle drupacee (“European stone fruit yellows” = ESFY)
(Osler et al., 2012), si analizzano le connessioni fra “recovery”/resistenze inducibili/
resistenze epigenetiche/resilienza e la loro ricaduta nella difesa pratica delle piante
coltivate.
145
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Risultati e discussione
Le conoscenze - spesso confermate da differenti Autori - su fisiologia, genetica e
manifestazione del “recovery” e sulle resistenze inducibili, indicano che i due
fenomeni sono intimamente connessi (Musetti et al., 2013). Il “recovery” stabile
può essere considerato l’espressione visiva di resistenza acquisita/indotta. Tanto
più se lo stato di “recovery” continua ininterrotto in piante poste in ambienti a forte
pressione di infezione. Ne sono esempio le viti di Prosecco in Valdobbiadene e di
Chardonnay nella Venezia Giulia che, rispettivamente, continuano ad essere esenti da
sintomi di flavescenza dorata (FD) o legno nero (LN) rispettivamente dopo 12 o 6 anni
dall’osservazione del fenomeno del “recovery”, pur essendo in area infetta (Ermacora
et al., 2012).
Nel caso del sistema biologico albicocco-ESFY si è notato in Friuli che nelle piante
con “recovery” stabile si verificano processi biochimici e molecolari riconducibili alla
presenza di Resistenza Sistemica Acquisita (“systemic acquired resistance” = SAR)
(Musetti et al., 2005). In questo caso si tratta di resistenze fenotipiche, che sono stabili
e trasmissibili alla “progenie” per innesto (Osler et al., 2012). Non tutte le piante dello
stesso clone di albicocco ammalate da ESFY ed allevate nelle stesse condizioni vanno
incontro a “recovery” e manifestano stato di resistenza acquisita. Questo fatto indica
che non si tratta di resistenze genetiche innate, ma conseguenti a processi di epigenesi
sensu lato. Del resto, è ben noto che mutazioni di ordine epigenetico occorse anche in
animali (uomo incluso), possono essere stabili e trasmesse a generazioni successive.
E’ fuori dubbio che l’epigenetica sta assumendo un interesse straordinario anche in
ambito vegetale (Bird, 2007).
I fenomeni naturali di “recovery”/resistenze acquisite/indotte/epigenetiche, possono
essere considerati come fattori importanti di resilienza. Infatti, nelle aree con diffusi
fenomeni di resistenze inducibili, il sistema biologico diventa meno fragile e più
stabile, rispetto allo stato precedente. Alla luce di queste conoscenze, sembra evidente
che alcune pratiche agronomiche andrebbero riviste, analizzando innanzitutto il loro
impatto sulla stabilità del sistema biologico coltivato. L’isolamento prolungato di piante
e la moltiplicazione in vitro rappresentano due esempi di pratiche che non sembrano
andare nella stessa direzione della resilienza. Lo stesso si deve dire per quelle pratiche
che riducono la complessità dei sistemi naturali, come la termoterapia di massa e
l’uso di prodotti endoterapici a largo spettro di azione. Viceversa, la valorizzazione di
piante con resistenze di qualsiasi tipo (in modo particolare quelle acquisite in pieno
campo in seguito ad esposizione a stress di vario tipo) contro malattie importanti,
costituisce una scelta positiva. Piante singole che sono state selezionate da epidemie
gravi, sono in effetti piante resilienti. Invece, sono considerate “fuori legge” dal punto
di vista normativo.
Significato biologico di alcuni termini utilizzati.
“Recovery”: vedi Conti e Faoro, 2012
Resistenze acquisite/indotte: vedi Musetti et al., 2005; Bianco et al., 2012.
146
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Resistenze epigenetiche: resistenze che si determinano (in piante) dovute a
cambiamenti della regolazione genica che non dipendono da modificazioni nella
sequenza primaria del DNA. Le resistenze e le tolleranze acquisite/indotte si possono
quindi considerare forme particolari di resistenze sensu lato di tipo epigenetico (le
tolleranze indotte corrispondono alle “phenotypic induced/acquired resistances”).
Resilienza: il termine riferito ad un ecosistema indica la sua capacità di tornare ad uno
stato simile a quello iniziale dopo avere subito uno stress. La capacità di resilienza
rappresenta la capacità di recupero quando il sistema o il singolo individuo è modificato
da perturbazione (ad esempio malattia-epidemia) (www.stockholmresilience.org;
www.ecologyandsociety.org).
Parole chiave: resistenze inducibili, resistenze fenotipiche, interventi sostenibili,
fragilità
Recovery and acquired resistances, epigenetic and resilience
The knowledge concerning these very interesting and intriguing topics have been
recently greatly increased. Important physiological and genetic bases of both recovery
and acquired-induced resistances are now known especially for some phytoplasmasassociated diseases. The epigenetic and the resilience are phenomenon that are
more investigated and taken in a proper consideration at present, also within the
biological and ecological sciences. These studies are even more recent if we consider
plant science, plant pathology in particular. Concerning plant defence it is not yet
clear how and whether apply in practice the knowledge gained in studies applied to
recovery, acquired-induced-epigenetic resistances and resilience. Very recently it was
demonstrated that grapevines can recover from “flavescence dorée” or “bois noir”
diseases (and from the respective phytoplasmas) in a stable manner and than behave
as resistant to new successive infections. In the case of European stone fruit yellows
phytoplasma in apricot it was demonstrated that the acquired phenotypic resistance
(of epigenetic origin) was stable and transmissible by grafting. Nevertheless, new
evidences and suggestions already experimented are hard to be accepted and applied
in practice. Probably because it is clearly difficult to identify the agronomical practices
that really and stably act in favour of the resilience management inside the cultivated
system. Several common practices have been focused that should be reinvestigated to
better understand if they gradually increase the fragility of the cultivated system, that
are: the in-vitro plant propagation; the mass thermotherapy; the long-term isolation of
mother plants; the prolonged use of endotherapic products. The resilience of plants
derived from mothers that where protected (isolated) or freely allowed to encounter
different type of stress is compared. The role and the use of plants that where deepselected after heavy epidemics, is here discussed.
Key words: Inducible resistances, phenotypic resistances, sustainable approaches, fragility
147
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
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OsLer R., S. BorseLLi, P. ErMacora, S. Di LenarDa, F. Ferrini, S. Grisan, N.
Loi, A. LoscHi, M. Martini, S. MoruZZi, R. Musetti, R. PoLiZZotto, 2012.
Considerazioni sul recovery da fitoplasmi: fenomeni di tolleranza acquisita in
albicocco. Petria, 22, 34-43.
Patui S., A. BertoLini, L. CLincon, P. ErMacora, E. BraiDot, A. VianeLLo, M. Zancani,
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148
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
EFFETTI DELL’APPLICAZIONE IN CAMPO DI
INDUTTORI DI RESISTENZA SULLE CARATTERISTICHE
QUANTITATIVE E QUALITATIVE DELLA PRODUZIONE E
SULLE INFEZIONI DI LEGNO NERO DELLA VITE
G. Romanazzi, S. Murolo, E. Feliziani, L. Landi, V. Mancini
Università Politecnica delle Marche, Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed
Ambientali – Via Brecce Bianche, 60131 Ancona
E-mail: [email protected]
Introduzione
Il legno nero (LN) è una delle principali malattie da fitoplasmi della vite, sia in Italia,
sia in diversi altri paesi europei e del bacino del Mediterraneo (Borgo e Angelini,
2002; Belli et al., 2010; Maixner et al., 2011; Foissac et al., 2013). Le infezioni di LN,
associate alla presenza di ‘Candidatus Phytoplasma solani’ (Quaglino et al., 2013)
determinano profonde alterazioni fisiologiche nella pianta e conseguenti perdite di
produzione (Musetti et al., 2007; Landi e Romanazzi, 2011; Endeshaw et al., 2012).
Il controllo di LN si basa principalmente sull’uso di materiale di propagazione sano,
sul contenimento del vettore e sulla gestione delle malerbe. Una volta che il vigneto
è infetto, le uniche possibilità per incrementare il fenomeno naturale del “recovery”
consistono nel potenziare le difese della pianta (Romanazzi et al., 2009). La ricerca
ha avuto come obiettivi l’applicazione di induttori di resistenza e la valutazione degli
effetti sulla crescita dei germogli, sulle caratteristiche quantitative e qualitative della
produzione, nonché sulla capacità di induzione del “recovery”.
Materiali e metodi
Cinque induttori commerciali a base di chitosano (Chito Plant, Brema, D), phosetylAl (Bayer Crop Science, D), benzotiadiazolo (Bion, Syngenta Crop Protection, S)
e glutatione + oligosaccaride (due formulati: Kendal, Valagro, Chieti, di seguito
indicato come GO1, e Olivis, Agrisystem, Lamezia Terme, di seguito indicato come
GO2), sono stati irrorati sulla chioma di viti della cv Chardonnay con sintomi di
LN, settimanalmente da inizio maggio a fine luglio. Nel corso della stagione sono
stati svolti rilievi dei sintomi di malattia sulle piante trattate e alla raccolta sono
stati raccolti dati relativi ai parametri quantitativi (produzione totale, percentuale di
grappoli disseccati, dimensione e peso delle bacche) e qualitativi (contenuto in solidi
solubili, acidità titolabile, pH) della produzione. Inoltre, in un altro vigneto è stata
registrata la lunghezza dei germogli, sia su piante sintomatiche sia asintomatiche, a
seguito del trattamento con il formulato GO1.
149
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Risultati e discussione
Il fenomeno del “recovery” in viti infette da fitoplasmi è stato osservato già poco
dopo la loro scoperta (Caudwell, 1961). La possibilità di indurre “recovery” in vite
mediante stress abiotici è stata descritta già da un paio di decenni (Osler et al., 1993).
L’uso di composti ad attività biostimolante ha fornito preziose indicazioni per il
contenimento delle infezioni in piante con sintomi di fitoplasmosi (D’Amelio et al.,
2007; Romanazzi et al., 2013). Nelle nostre indagini, dei cinque formulati applicati,
quelli a base di benzotiadiazolo e della miscela di glutatione ed oligosaccarine hanno
fornito un significativo incremento del “recovery”, facendo passare mediamente dal
26% ad oltre il 50% il numero di piante nelle quali avveniva la remissione dei sintomi,
nell’arco di un quadriennio. Nelle piante “recovered” a seguito del trattamento con
induttori di resistenza si è ripristinata una produzione statisticamente non dissimile
da quella delle piante sane, come anche osservato in Sardegna (Garau et al., 2007). In
letteratura è riportato il rischio di una potenziale deviazione dei fotosintetati verso la
difesa, a scapito della produzione (Vallad e Goodman, 2004). Le nostre prove hanno
evidenziato una mancanza di differenza nelle caratteristiche fisiologiche e produttive
delle piante trattate con gli elicitori ed i rispettivi testimoni, sia sintomatici che
asintomatici. In una seconda prova, il trattamento con il formulato a base di glutatione
e oligosaccaride GO1 non ha evidenziato alcuna riduzione dell’accrescimento dei
germogli nei rilievi effettuati a maggio e giugno, segno di un mancanza di effetti
negativi sulla vegetazione. Le indagini hanno quindi evidenziato la possibilità di
applicare in campo induttori di resistenza con effetti positivi nella induzione del
“recovery” e senza effetto negativo sulle caratteristiche quanti-qualitative della
produzione. E’ tuttavia necessaria la definizione di strategie di intervento trasferibili
alla pratica agricola che tengano in considerazione la possibilità di usare tali composti,
non sempre registrati come agrofarmaci ma a volte come promotori delle difese della
pianta, con calendari di applicazione che portino ad ottenere la massima efficacia con
il minor numero possibile di interventi.
Parole chiave: fitoplasmi, giallumi della vite, induzione di resistenza, “recovery”
Application of resistance inducers in grapevines affected by “bois noir”: effects
on qualitative and quantitative production parameters
“Bois noir” (BN) can be considered the main phytoplasma disease of grapevine in
Europe and Mediterranean area. It can induce deep changes in the plant physiology
and cause severe losses of production. Because there are no effective means to
control the disease when it is established, a way to increase the recovery rate can
reside in the application of resistance inducers. Five commercial compounds based
on chitosan, phosetyl-Al, benzothiadiazole, and glutathione + oligosaccharines (two
formulations) were applied weekly to the canopy of grapevines cv Chardonnay
150
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
from beginning of May to the end of July. Plants sprayed with a formulation of
glutathione + oligosaccharines did not show any reduction of shoot length in May
and June. Production in plants treated with resistance inducers where BN symptoms
persisted was about the half of that observed in recovered plants and in the control.
The amount of dried clusters in plants that showed BN symptoms after application
of the resistance inducers was not different each other and from the control (around
30%). Overall, recovered plants following application of resistance inducers showed
qualitative and quantitative production parameters not different as compared to
healthy plants. Among tested inducers, the best results in increase of recovery rate
were obtained with the compounds based on benzothiadiazole (Bion), and on the
two formulations containing glutathione + oligosaccharines (Olivis and Kendal).
However, further investigations are needed to set up a protocol to manage BN
infections in the vineyard.
Key words: grapevine yellows, induced resistance, phytoplasma, recovery
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il lavoro è stato condotto nell’ambito dei progetti di ricerca “Varenne” promosso dalla
Fondazione Cariverona (Bando 2007), e MIUR PRIN 2005074429_002. Gli autori
ringraziano il Dott. Pierluigi Biondini (Azienda Santa Casa di Loreto, Ancona), Nello
Petrelli (Montalto Marche, Ascoli Piceno), Federico Patrizio e Mauro Piergiacomi per
la collaborazione alle indagini.
Lavori citati / References
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151
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
foissac X., P. carLe, a. faBre, P. saLar, J.L. Danet, i. eMBer, M. DeLLa BartoLa,
J. PLavec, Z. avraMov, c. MortaDa, s. eroGLu, G. BaLakisHiYeva, Z. acs,
s. Baric, a. BattLe, H. BouYaHia, c. cHireceanu, e. cHoueiri, t. curkovic,
f. ertunc, k. GuionneauD, i. HuseYnova, f. JreiJiri, J. Jovic, n. katis,
i. kriZanac, s. krJanJic, a. Lavina, v. MaLioGka, a.c. MaMMaDov, a.
MateraZZi, s. MuroLo, e. kostaDinovska, f. oancea, a.f. oMar, D. Pacifico,
G. roManaZZi, J. saBate, D. safarova, f. saHin, M. seruGa Music, P. vaLova,
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152
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
COLONIZZAZIONE E TRASMISSIONE DEL BATTERIO
ACETICO ASAIA IN SCAphoIDeUS TITANUS BALL,
VETTORE DEL FITOPLASMA DELLA FLAVESCENZA
DORATA DELLA VITE
E. Gonella1, E. Crotti2, M. Mandrioli3, D. Daffonchio2, A. Alma1
DISAFA, Università degli Studi di Torino – via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco, Torino
2
DeFENS, Università degli Studi di Milano – via Celoria 2, 20133 Milano
3
Dipartimento di Scienze della vita, Università degli Studi di Modena
e Reggio Emilia - via Campi 213/D, 41125 Modena
1
[email protected]
Introduzione
I batteri simbionti degli artropodi vettori di microrganismi patogeni sono stati proposti
come agenti di controllo della trasmissione delle malattie causate da questi (Beard et
al., 1998; Crotti et al., 2012). Tra i simbionti di Scaphoideus titanus Ball, il vettore del
fitoplasma responsabile della flavescenza dorata (FD) della vite, un microrganismo
dominante è il batterio acetico Asaia sp. (Marzorati et al., 2006). Questo simbionte è
un buon candidato per l’applicazione di protocolli di biocontrollo in quanto coltivabile,
facilmente manipolabile e associato a diversi vettori di agenti di malattia, tra cui le
zanzare dei generi Anopheles e Aedes, vettori di virus e protozoi patogeni per l’uomo
(Favia et al., 2007). Lo studio delle interazioni tra Asaia e S. titanus rappresenta un
passo fondamentale verso lo sviluppo di approcci di lotta alla FD della vite basati
sull’uso di simbionti.
Materiali e metodi
Individui adulti di S. titanus, raccolti in vigneti con presenza di sintomi di FD in
diverse aree del Piemonte, sono stati impiegati per lo studio della colonizzazione
e della trasmissione di Asaia nella cicalina. Un primo gruppo di esemplari è stato
utilizzato per identificare i distretti corporei dell’insetto colonizzati da Asaia, tramite
ibridazione in situ in fluorescenza come descritto da Crotti et al. (2009).
I rimanenti individui di S. titanus sono stati sottoposti a prove di trasmissione
orizzontale di Asaia condotte impiegando il ceppo SF2.1(cGfp), trasformato per
la produzione della proteina fluorescente Gfp e strettamente correlato con i ceppi
precedentemente dimostrati colonizzare con successo il corpo della cicalina (Crotti
et al., 2009). Cellule batteriche sono state somministrate insieme a una soluzione
153
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
zuccherina per 48 ore a una prima parte di esemplari, impiegati come donatori.
Successivamente gli stessi esemplari sono stati sottoposti a prove di trasmissione
mediante l’alimentazione o tramite l’accoppiamento unitamente a un egual numero
di insetti, non precedentemente colonizzati dal ceppo fluorescente di Asaia, utilizzati
come riceventi, come descritto in Gonella et al. (2012). Al termine delle prove di
trasmissione, tutti gli individui donatori e riceventi e le rispettive diete zuccherine
sono stati sottoposti a estrazione degli acidi nucleici (Raddadi et al., 2011), seguita da
PCR Real Time quantitativa con primer Gfp-specifici (Gonella et al., 2012).
Risultati e discussione
Le analisi di microscopia confocale condotte sugli organi di S. titanus sottoposti a
ibridazione in situ in fluorescenza con sonde specifiche per Asaia hanno evidenziato la
presenza del batterio acetico in diversi organi della cicalina, incluse le gonadi maschili
e femminili e le ghiandole salivari.
Sulla base di questi risultati, individui di S. titanus sono stati sottoposti a prove di
trasmissione tramite condivisione del substrato alimentare o mediante l’accoppiamento.
I risultati di tali prove hanno confermato in primo luogo la capacità del simbionte
di colonizzare il corpo degli esemplari donatori, in seguito all’assunzione con
l’alimentazione, come emerso dalle analisi di PCR quantitativa svolte su questo
gruppo di esemplari. Le prove di condivisione della dieta hanno evidenziato che
Asaia è regolarmente trasferita da donatore a ricevente, con un picco di frequenza
di trasmissione dopo 72 ore di condivisione della dieta. Inoltre, la concentrazione di
cellule del simbionte negli individui riceventi è crescente nel tempo.
Le prove di trasmissione venerea sono state condotte in primo luogo accoppiando
maschi infettati da Asaia Gfp con femmine non infette. Le femmine riceventi hanno
efficacemente acquisito Asaia, con i più elevati tassi di infezione riscontrati 72-96 ore
dopo l’accoppiamento con i maschi donatori, e con densità del simbionte crescente
nel tempo. Ulteriori esperimenti sono stati effettuati accoppiando femmine infettate
da Asaia Gfp con maschi non infetti. In questo caso, solo occasionalmente è stata
osservata una trasmissione, probabilmente legata a trasferimenti casuali.
Nel complesso, i risultati ottenuti hanno fornito una delle poche dimostrazioni dirette
di trasmissione orizzontale negli emitteri, riscontrata sia tramite l’alimentazione sia
mediante l’accoppiamento. Questo studio fornisce un sostanziale contributo alla
comprensione dell’ecologia microbica in S. titanus, e sottolinea le potenzialità legate
allo sviluppo di protocolli di controllo simbiotico della FD basati sull’uso di Asaia.
Parole chiave: simbionti microbici, giallumi della vite, cicaline, trasmissione
orizzontale, controllo simbiotico
154
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Colonization and transmission pathways of the acetic acid bacterium Asaia
in Scaphoideus titanus Ball, vector of “flavescence dorée” phytoplasma to
grapevine
The use of bacterial symbionts of vectors of pathogenic agents has been proposed
to contain the transmission of vector-borne diseases. An important symbiont of
Scaphoideus titanus Ball, vector of “flavescence dorée” (FD) phytoplasma to grapevine,
is the acetic acid bacterium Asaia sp., which is considered as a good candidate control
agent against the spread of FD. To study the interaction between Asaia and S. titanus,
fluorescent in situ hybridization essays were carried out on dissected organs of adult
individuals with Asaia-specific probes, to assess the colonization patterns of the acetic
acid bacterium in the body of the leafhopper. The symbiont was observed in different
organs of S. titanus, including male and female gonads and salivary glands. Based on
such evidences, S. titanus specimens were subjected to horizontal transmission trials
through co-feeding or mating, by using the fluorescent Asaia strain SF2.1(cGfp). The
results of co-feeding experiments underlined that Asaia is transferred from donor S.
titanus (previously fed with the fluorescent Asaia strain) to recipient specimens, with
a peak after 72 hours of diet sharing.
Venereal transmission trials were firstly carried out by mating Gfp Asaia-infected
males with uninfected females. Recipient females were successfully colonized by
the symbiont, with the highest infection rates 72-96 hours after mating. Further
experiments were performed by mating Gfp Asaia–infected females with uninfected
males, but only few samples showed an real transfer. Overall results provide one of
the few direct demonstrations of horizontal transmission occurring in Hemiptera.
Such aspects of the association between Asaia and S. titanus represent an important
requirement to develop Asaia-based symbiotic control programs for FD.
Key words: microbial symbionts, grapevine yellows, leafhoppers, horizontal
transmission, symbiotic control
Ringraziamenti / Acknowledgements
Questo lavoro è stato condotto nell’ambito del progetto PRIN 2009 “Interazioni
tra insetti vettori e microrganismi simbionti: nuove prospettive per il biocontrollo
dei patogeni trasmessi alle piante, agli animali e all’uomo” finanziato dal MIUR. /
Financial contribution from the Italian Ministry for Research (MIUR), within the
project PRIN 2009 “Interazioni tra insetti vettori e microrganismi simbionti: nuove
prospettive per il biocontrollo dei patogeni trasmessi alle piante, agli animali e
all’uomo”.
155
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
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the psyllid Cacopsylla pyri apparently behaves as an endophyte rather than a
pathogen. Environmental Microbiology, 13(2), 414-426.
156
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
INFLUENZA DELLO SVILUPPO DEL RITIDOMA E
DELLA TERMOTERAPIA SULLE UOVA DI
SCAphoIDeUS TITANUS BALL
F. Lessio, A. Alma
DISAFA, Università degli Studi di Torino– via L. da Vinci 44, 10095
Grugliasco (Torino)
E-mail: [email protected]
Introduzione
Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae) è il vettore principale della
flavescenza dorata (FD), ampelopatia associata alla presenza di fitoplasmi del gruppo
16SrV, sottogruppi C e D (Malembic-Maher et al., 2011) soggetta in Italia a lotta
obbligatoria con misure estremamente restrittive in vivaio. In quest’ambito, un
problema è rappresentato dalle uova del vettore, che deposte sotto il ritidoma (Vidano,
1964) possono diffondere S. titanus oltre il suo areale di distribuzione in seguito alla
commercializzazione del materiale vivaistico (Papura et al., 2012). La termoterapia
(TT) in acqua calda, utilizzata per il risanamento del materiale di base dalle infezioni
da fitoplasmi sia prima che dopo l’innesto (Caudwell et al., 1997; Mannini, 2007),
sembrerebbe efficace nell’eliminare anche le uova dell’insetto (Linder et al., 2010).
Tuttavia non è chiaro se la TT è un effettivo vantaggio in tal senso, poiché la
deposizione può dipendere anche dallo sviluppo del ritidoma. La presente ricerca ha
avuto lo scopo di quantificare l’influenza dell’età del legno e della termoterapia sulle
uova di S. titanus.
Materiali e metodi
Per verificare l’ovideposizione di S. titanus in funzione dell’età del legno, tralci di
potatura di uno e due anni prelevati dal 2007 al 2009 in vigneti del Piemonte in cui erano
presenti gravi infestazioni dell’insetto vettore sono stati posti in gabbiette escludiinsetto in cella climatica (T=25°C), assieme a una barbatella in vaso, per permettere
la schiusura delle uova e il successivo conteggio delle neanidi. Un sottocampione
di circa 20 spezzoni per tesi (lunghezza 30 cm cadauno) è stato ispezionato allo
stereomicroscopio, dopo aver rimosso il ritidoma con una lametta, per conteggiare le
uova del cicadellide.
Per verificare l’efficacia della termoterapia (TT), spezzoni di legno di due anni raccolti
nelle stesse località precedentemente descritte (2007-2009) sono stati sottoposti al
ciclo di TT utilizzato per il trattamento delle marze (pre-trattamento in acqua calda
157
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
a 30°C per 20 min, e trattamento a 50°C per 45 min). Il materiale è stato quindi
posto in allevamento nelle stesse condizioni descritte in precedenza, parallelamente al
testimone non termotrattato.
La capacità di deporre sul materiale di moltiplicazione è stata studiata nel 2008
mettendo 20 barbatelle in vaso in tre isolatori (gabbioni) di rete, posti all’aperto: su
10 piante il legno di due anni è stato coperto con carta stagnola, in modo da rendere
disponibile solo quello di un anno, mentre le altre 10 sono state lasciate tal quali. In
ogni isolatore sono state immesse circa 50 femmine di S. titanus, raccolte in vigneto
dopo la metà di settembre. L’anno successivo (2009), i vasi con le viti delle due tesi
sono stati posti in gabbioni separati prima del germogliamento; quindi, le neanidi di
S. titanus sono state periodicamente rimosse e conteggiate.
Risultati e discussione
Dai tralci di due anni si sono schiuse 104,5 uova/kg legno, contro 0,94 per quelli di
un anno. Sugli spezzoni di un anno non sono state notate uova; sul legno di due anni,
la media è risultata compresa tra 0,4 e 4,4 uova per spezzone. Nei gabbioni, sono nate
158 neanidi (5,3 per pianta) dalle barbatelle con legno di 2 anni disponibile, e solo 7
(0,2 per pianta) da quelle con legno di 2 anni coperto. La progenie ottenuta è risultata
pari circa al 100% delle femmine immesse (150), tuttavia occorre considerare le
eventuali sovrastime degli adulti (es. mortalità dopo l’immissione, rilascio di femmine
già sgravate dalle uova) e le sottostime delle nascite (uova eventualmente non schiuse,
errori di conteggio degli stadi giovanili). S. titanus depone quindi preferenzialmente
sul legno di due anni, in un rapporto variabile tra 20:1 e 100:1, in accordo con quanto
ottenuto nell’ambito di altre ricerche (Vidano, 1964; Bagnoli et al., 2010).
La termoterapia (TT) ha notevolmente ridotto il numero di uova vitali pur non
portando a un azzeramento delle schiuse, con 0-0,4 neanidi/kg legno contro 45-120
nel testimone, confermando ulteriormente i risultati di Linder et al. (2010). Peraltro, la
TT è stata fatta su tralci di due anni fortemente infestati, mentre marze e portainnesti di
un anno dovrebbero di per sé essere già esenti da uova; nel caso in cui la sanificazione
fosse invece effettuata sulle barbatelle innestate, è possibile che le uova eventualmente
deposte vengano devitalizzate. In conclusione, la presenza delle uova di S. titanus sul
materiale vivaistico appare più probabile dopo l’innesto, durante la permanenza in
barbatellaio: pertanto, a prescindere dalla TT, la sorveglianza fitosanitaria non deve
abbassare la guardia, sia per evitare la trasmissione dei fitoplasmi, sia per impedire la
diffusione di S. titanus con la commercializzazione del materiale vivaistico (Forte et
al., 2010; Papura et al., 2012).
Parole chiave: cicalina, deposizione, sanificazione, vite, vivaismo
158
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Influence of bark’s development and hot water treatment on the eggs of
Scaphoideus titanus Ball
The influence of wood’s age and hot water treatment (HWT) on the eggs of
Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae) the main vector of grapevine
“flavescence dorée”, was studied during 2007-2009 in Piedmont, Italy. Egglaying behaviour was studied by harvesting pruned canes (1 and 2 yrs old), and
observing hatching under laboratory conditions; direct observations of eggs under
a stereomicroscope were also made. Moreover, pruned 2 yrs old canes were subject
to HWT (30°C for 20 min, and 50°C for 45 min), and subsequent egg hatching (on
treated and control canes) was observed under laboratory conditions. Finally, some
150 mated S. titanus females were released into insect-proof cages under natural
conditions, with potted grapevine plants which had or had not 2 yrs old wood
covered by aluminium foil, and egg hatching was observed after a year. Eggs laid
on 2 years wood overrated from 20:1 to 100:1 those observed on 1 year wood in all
of the experiments conducted (direct observations, and egg hatching from pruned
canes or potted grapevine plants). Up to 165 nymphs were obtained from eggs laid
onto potted grapevines, the rate per female being 1:1, but this value did not consider
mortality, females that may have already laid eggs in open field, non-hatched eggs, or
errors in counting nymphs. HWT killed the majority of eggs, although a few nymphs
were obtained from treated wood. The contamination of grapevine nursery stocks by
S. titanus eggs is therefore more probable after grafting, when plants are in open field
nurseries, rather than on scions before grafting where eggs are rare due to the age
of wood. Pest management in nurseries is the key for avoiding contamination with
eggs and therefore the diffusion of the vector worldwide. Hot water treatment may
be effective in decreasing viable leafhopper’s eggs if done after grafting, whereas
before grafting it may not represent a real plus.
Key words: grapevine, egg-laying, leafhopper, plant nursery, sanitation
Ringraziamenti / Acknowledgements
Ricerca condotta nell’ambito del progetto “VIPASMI” (2007-2009), finanziato da
“Regione Piemonte-Servizi di Sviluppo Agricolo”. Si ringraziano le aziende Vivalb e
Roero Viti Vivai per la disponibilità nella prova di termoterapia.
159
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lavori citati / References
BaGnoLi B.,e. GarGani , L. ferretti, a. GentiLi, G. PasQuini, r. frosinini, L.
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160
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
POSSIBILITA’ DI DIFFUSIONE DEL LEGNO NERO DELLA
VITE ATTRAVERSO IL MATERIALE VIVAISTICO
F. Tessari1, N. Mori2, F. Quaglino3, G. Posenato1, P.A. Bianco3
Agrea Centro Studi – via Garibaldi 5, 37057 San Giovanni Lupatoto (VR)
DAFNAE-Università degli Studi di Padova – Viale dell’Università 16, 35020
Legnaro (PD)
3
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia,Università degli Studi di Milano,
Via Celoria 2, 20133 Milano
1
2
E-mail: [email protected]
Introduzione
Data la difficoltà nel contenimento delle principali fitoplasmosi della vite, flavescenza
dorata (FD) e legno nero (LN), risulta molto importante l’attività di prevenzione
attraverso il controllo del materiale vivaistico. Poiché i fitoplasmi sono localizzati
nei vasi floematici appare evidente come la pratica dell’innesto, ampiamente diffusa
in viticoltura, rappresenti una possibile via di trasmissione della malattia. Alcuni studi
hanno dimostrato questa eventualità, ma il rischio di propagazione della malattia con
questa modalità è estremamente basso (Borgo et al., 2007, Credi et al., 2012). Tuttavia
anche poche barbatelle infette possono determinare in un vigneto o in un’area viticola una
pericolosa sorgente di inoculo, che può rapidamente propagare la malattia in presenza
degli insetti vettori (Belli et al., 2002). La sanità del materiale di partenza può influire
sulla possibilità di diffusione dei due giallumi attraverso la commercializzazione del
materiale vivaistico (dall’1‰ al 4%) (Osler et al., 2002). Lo scopo del presente lavoro
è stato quello di verificare la capacità vegetativa di talee provenienti da piante infette di
fitoplasmi associati a LN al fine di valutare l’effettiva potenzialità che materiale infetto
possa essere propagato con successo all’interno della filiera vivaistica.
Materiali e metodi
Il materiale vegetale idoneo per la propagazione vivaistica è stato raccolto a fine
gennaio 2011, in un vigneto di Chardonnay situato nel comune di Ronco all’Adige
(VR). I tralci sono stati prelevati da 10 viti che nel 2010 avevano manifestato sintomi
da giallume e che erano risultate infette da LN, e da 10 viti asintomatiche nel 2010.
I tralci prelevati sono stati sottoposti ad analisi molecolari (“real time” PCR) per
verificare la presenza del fitoplasma. Ciascun tralcio è stato tagliato in porzioni di
due gemme che sono state successivamente poste a radicare in acqua in condizioni
ambientali controllate. A marzo 2011 sono stati eseguiti i rilievi sul germogliamento
e sullo sviluppo dei germogli.
161
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Successivamente, le talee radicate sono state invasate con terriccio sterile ed allevate
in tunnel freddo e isolato da rete anti-insetto. Ad aprile, maggio, agosto 2011 e maggio
2012 sono stati eseguiti i rilievi sulla sopravvivenza e sullo sviluppo vegetativo delle
giovani piante. I dati raccolti sono stati normalizzati ed analizzati con il test del χ2.
Parallelamente sono stati condotti campionamenti visivi sui sintomi ed indagini
molecolari per valutare la presenza del fitoplasma agente del LN.
Risultati e discussione
Dal materiale raccolto è stato possibile ottenere 196 talee dai tralci prelevati da viti
asintomatiche e 163 da quelli prelevati da viti infette. Sin dalla fase di radicazione, il
materiale proveniente dalle viti infette ha dimostrato una vitalità significativamente
più bassa rispetto a quello proveniente da viti sane. Infatti nei primi 3 mesi, la
mortalità è risultata del 42,9% per le talee provenienti da viti infette e del 8,2%
per quelle da viti asintomatiche. Dopo 6 mesi, la mortalità è stata del 75,5% per
le piante provenienti da viti infette e del 28,6% per quelle provenienti da viti sane.
Dopo un anno dal trapianto dal materiale raccolto da viti infette, solo una talea su
10 era rimasta viva a confronto con quello da viti sane dove la mortalità è rimasta
inferiore al 50%.
Riguardo lo sviluppo vegetativo, le talee ottenute da viti infette hanno manifestato
un ritardo nella emissione delle radici ed una vigoria, espressa come lunghezza
dei germogli, inferiore fino a 5 volte rispetto a quella delle piante ottenute da viti
sane.
I primi sintomi sulle piante autoradicate sono stati osservati durante i campionamenti
effettuati a settembre. Sintomi ascrivibili al giallume sono stati registrati sul 9%
delle piante ottenute da materiale raccolto da viti infette. Le analisi molecolari hanno
evidenziato la presenza dei fitoplasmi associati ad LN solo sul 3% delle talee ottenute
da viti sintomatiche. La bassa percentuale di talee sopravvissute, provenienti da viti
malate, sintomatiche e/o infette è stata fortemente influenzata dall’alta mortalità e dallo
scarso sviluppo vegetativo. I risultati della sperimentazione condotta suggeriscono
che le talee sopravvissute, pur prelevate da materiale infetto, possano provenire da
porzioni di legno privo di fitoplasmi, anche se da piante malate, è stata infatti descritta
la distribuzione non omogenea dei fitoplasmi nei tessuti di viti infette (Constable et
al., 2003; Terlizzi e Credi, 2007).
Le indagini condotte hanno messo in evidenza come il materiale proveniente da viti
sintomatiche, ma comunque idoneo alla propagazione vegetativa, abbia una scarso
sviluppo vegetativo ed una bassa vitalità, rendendone difficile l’impiego nella filiera
vivaistica. Tuttavia, anche se in percentuali molto basse, può essere una via di
introduzione di materiale infetto nella filiera vivaistica.
Parole chiave: vivaismo viticolo, fitoplasmi vite, talee autoradicate
162
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Possibility of grapevine “bois noir” diffusion through propagation material
Prevention activities performed through the control of planting material sanitary
status are crucial for the containment of grapevine “bois noir” (BN) and “flavescence
dorée” (FD). The role of propagation material in the diffusion of BN phytoplasmas
was studied. In January 2011, wood cuttings were collected from 10 BN-infected
and 10 asymptomatic grapevine plants (Chardonnay). Health condition of examined
plants was determined by symptom observation and molecular analyses performed in
2010. Cuttings carrying two buds were prepared from sampled canes, placed in sterile
water for rooting, potted in sterile soil, and maintained in cold insect-proof tunnels.
Sprouting, shoot development, and survival were observed from March 2011 to March
2012. Collected data were analyzed by χ2 test. Real time PCR assays were carried out
on leaf tissues from survived plants for BN phytoplasmas detection. Mortality of selfrooted cuttings from infected plants (PIP) was significantly higher in comparison with
the one of self-rooted cuttings from healthy plants (PHD) at three (42.8% vs 8.2%), six
(75.5% vs 28.6%) and twelve (90% vs <50%) months after rooting. Moreover, shoot
and root length in survived PIP were 5-fold lower then those in PHP. No symptoms
were observed in PHP, while a few PIP (9%) showed BN symptoms since September
2011. Molecular analyses revealed BN phytoplasmas presence in only 3% of PIP;
none of the PHP was positive to PCR assays. Low percentage of symptomatic and/or
BN-infected PIP cuttings, indicates that they probably derived from healthy portions
of the cane from infected grapevines due to the well described uneven phytoplasmas
distribution in the plants. The results highlight that planting material from BN-infected
plants has scarce survival and poor development but, even in low percentage, it could
increase the BN phytoplasmas dissemination within the grapevine nurseries.
Key words: grapevine nursery, grapevine phytoplasmas, rooted cuttings
Ringraziamenti / Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Prevenzione e contenimento del Legno nero
della vite nella filiera vivaistica” finanziato dalla Regione Veneto.
Lavori citati / References
BeLLi G., P.a. Bianco, P. casati G. scattini, 2002. La flavescenza dorata della vite in
Lombardia. Quaderni della Ricerca. Epitesto, 50 pp.
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163
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
constaBLe f.e., k.s. GiBB, r.H. sYMons, 2003. Seasonal distribution of phytoplasmas
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Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
VALUTAZIONE DI NUOVE VARIETA’ DI ALBICOCCO
NEI CONFRONTI DEL GIALLUME EUROPEO DELLE
DRUPACEE (ESFY) MEDIANTE L’UTILIZZO DI
TECNICHE MOLECOLARI
C. Poggi Pollini1, A.R. Babini2, M. Dallara1, C. Lanzoni1, C. Ratti1
1
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
2
Servizio Fitosanitario Regionale, Via di Corticella 133, 40129, Bologna
E-mail: [email protected]
Introduzione
La valutazione della sensibilità di numerose varietà di albicocco nei confronti del
giallume europeo delle drupacee (ESFY= “European Stone Fruits Yellows”), associato
alla presenza di ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, realizzata nell’ambito di un
progetto triennale (2006-2009) finanziato dal CRPV e dalle principali associazioni di
produttori ha dimostrato come la quasi totalità delle cultivars diffuse negli ultimi anni
nella regione Emilia-Romagna, presenti un preoccupante livello di suscettibilità a tale
malattia (Poggi Pollini et al., 2010; 2010b).
Nel corso del biennio 2011-2012, nell’ambito di un progetto regionale, è stata così
effettuata una prima valutazione del comportamento, nei confronti di ESFY, di nuove
varietà di albicocco (Faralia, Farbaly e Petra), innestate su mirabolano.
Materiali e metodi
Al fine di valutare la suscettività delle cultivars Faralia, Farbaly e Petra è stata allestita
una prova sperimentale presso il Servizio Fitosanitario Regionale di Bologna, in cui
20 piante di ogni varietà, provenienti da materiale VE o CAC, sono state messe a
dimora in pieno campo. L’inoculo del patogeno è stato realizzato mediante innesti a
gemma sulla varietà (3 per pianta), effettuati nell’ottobre 2011, utilizzando materiale
proveniente da piante di Prunus armeniaca cv. Pinkcot, risultate infette da ESFY;
dieci piante di ogni varietà sono state utilizzate come testimoni.
Nel corso della prova sono stati effettuati rilievi sulla presenza di sintomi tipici o
correlati al patogeno quali: emissione fogliare anticipata rispetto ai fiori (inverno
2012 e 2013), deperimento ed apoplessia, defogliazione ed accartocciamento fogliare
anticipato (estate ed autunno 2012). Ogni pianta è stata analizzata singolarmente tra
luglio 2012 e marzo 2013 con il metodo “spot real time” RT-PCR (Minguzzi et al.,
2010), prelevando il materiale ad almeno 70 cm dal punto di inoculo per verificare
165
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
l’eventuale moltiplicazione e traslocazione del fitoplasma nelle piante inoculate.
Sono stati anche effettuati rilievi di campo (in marzo, luglio e ottobre, dal 2011)
in 3 aziende della Romagna, su 300 piante per cultivar, di diversa età innestate su
mirabolano; anche in questo caso è stata effettuata la raccolta e l’analisi molecolare
del materiale con sintomi sospetti.
Risultati e discussione
Nell’autunno 2012 sono state riscontrate 3 piante di Faralia (15%) e 5 di Farbaly (25%)
con sintomi di deperimento, accartocciamento ed arrossamento fogliare anticipato
rispetto al normale andamento stagionale; le stesse piante hanno mostrato in febbraio
2013 sintomi tipici di ESFY. Tutte le piante sintomatiche sono risultate positive al test
molecolare, il patogeno, invece, non è stato per il momento riscontrato, nella cv. Petra,
né nei testimoni di controllo.
I rilievi in pieno campo hanno permesso di riscontrare una piccola percentuale di
piante infette (1%) solo nella cv. Farbaly al terzo anno di impianto.
La pressoché totale assenza di presidi di lotta diretta contro i fitoplasmi e le gravi
difficoltà incontrate per il contenimento di ESFY in albicocco in altri comprensori
frutticoli mediante l’utilizzo di una lotta insetticida al vettore – lo psillide Cacopsylla
pruni Scopoli – hanno dimostrato come un passo fondamentale nel controllo di questa
malattia ed un forte incentivo per riqualificare la coltura dell’albicocco come coltura
da reddito, possa proprio essere l’individuazione di combinazioni varietà/portinnesti
con buona tolleranza alla malattia (Poggi Pollini et al., 2007).
I dati ottenuti suggeriscono che Faralia e Farbaly non presentino caratteristiche di
tolleranza a ESFY, anche se il numero delle piante infette in pieno campo è finora
molto basso; particolarmente interessante è invece il comportamento di Petra sia
per i risultati finora ottenuti nelle prove sperimentali, sia per la valutazione degli
impianti.
E’ bene ricordare l’origine genetica di Petra come incrocio tra Goldrich e Pelese di
Giovannello (Missere, 2008); varie osservazioni effettuate in provincia di Trento e
in Emilia-Romagna hanno mostrato come la cv. Goldrich presenti un certo grado di
tolleranza alla malattia – intesa soprattutto come ritardo nella comparsa dei sintomi
e riduzione dei danni dovuti al patogeno – che le consente di avere una vita media
superiore a quella delle altre cultivar presenti nei nostri comparti frutticoli (Poggi
Pollini et al., 2010b). Le ricerche proseguiranno per valutare l’eventuale comparsa di
sintomi e la moltiplicazione del patogeno, anche in pieno campo nella cultivar Petra,
almeno per il prossimo biennio.
Parole chiave: ESFY, Prunus armeniaca, “spot real time RT-PCR”, sensibilità varietale
166
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Evaluation of tolerance to European stone fruit yellows (ESFY) of new apricot
cultivars with molecular methods
Surveys conducted in different apricot orchards in the Emilia-Romagna region
since 2006, have been demonstrated that most cultivars are susceptible to European
Stone Fruit Yellows (ESFY), associated with ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
presence. To evaluate tolerance to ESFY of new apricot cultivars Faralia, Farbaly and
Petra grafted on myrabolan molecular methods were applied. Twenty plants of each
cultivar were graft-inoculated with ‘Ca. P. prunorum’ in October 2011 at the regional
phytosanitary service in Bologna. Symptoms observations and molecular analysis
with spot real time RT-PCR method were performed for each plant; the plant material
was collected at least 70 cm above the inoculation point to assess the movement,
distribution and multiplication of the pathogen linked to tolerance evaluation. Field
observations on 300 plants of each cultivar have also been performed three times a
year since the Winter 2011. Premature leaf-roll and typical early bud break during
dormancy were observed in some plants of both cultivars Faralia and Farbaly;
amplification was always obtained only from symptomatic plants. Typical ESFY
symptoms were also scattered observed in Farbaly orchards. On the contrary, ‘Ca. P.
prunorum’ colonization did not occur in cultivar Petra, possibly due to tolerance to
the pathogen. It is worth mentioning that Petra was obtained crossing Goldrich with
Pelese di Giovannello. The potential epidemic threat posed by ESFY to apricot trees
in Italy and the lack of efficacy of insecticide applications in controlling the disease,
suggest that some tolerant cultivars are necessary. Work is underway to verify these
preliminary observations and to analyze additional apricot selections.
Key words: ESFY, Prunus armeniaca, spot real time RT-PCR, ESFY susceptibility
Ringraziamenti / Acknowledgements
Attività svolta nell’ambito del progetto biennale: “Azione 16 del progetto regionale:
messa a punto di linee tecniche di difesa su colture ortofrutticole e vite - Valutazione
della sensibilità varietale ai fitoplasmi dell’albicocco”.
Lavori citati / References
MinGuZZi s., c. ratti, c. LanZoni, c. ruBies autoneLL, n. reGGiani , c. PoGGi PoLLini,
2010. Detection and relative quantification of ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ by Spot Real Time RT-PCR Taqman assay. Petria, 20(2), 219-220.
Missere D., 2008. Maia, Petra e Pieve tardiva: tre nuove varietà proposte da Università
di Bologna e CRPV. Frutticoltura, 6, 27-28.
167
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
PoGGi PoLLini c., L. BiancHi, f. forno, s. francHini, L. GiuncHeDi, M. GoBBer, L.
MatteDi, P. MioreLLi, D. PiGnatta, D. ProfaiZer, c. ratti, n. reGGiani, 2007.
Investigation on European stone fruit yellows in experimental apricot orchards
in the province of Trento (Italy). Bullettin of Insectology, 60(2), 323-324.
PoGGi PoLLini c., a.r. BaBini, D. DraDi D, c. LanZoni, c. MeDoro, s. PaoLini, c.
ratti, 2010a. Il giallume europeo delle drupacee su albicocco in EmiliaRomagna: il punto sulla situazione attuale. Petria, 20(3), 667-669.
PoGGi PoLLini c., c. LanZoni, c. MeDoro, c. ratti, a.r. BaBini, D. DraDi, s.
PaoLini, 2010b. Il giallume dell’albicocco preoccupa sempre più. Agricoltura,
38(12), 74-76.
168
DIAGNOSI DI MALATTIE
DA FITOPLASMI
PHYTOPLASMA DISEASE
DETECTION
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
PROGETTO ARNADIA: DEFINIZIONE DI PROTOCOLLI
NAZIONALI DI DIAGNOSI PER ‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA
MALI’ E ‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA PRUNORUM’
G. Pasquini1, A. Bertaccini2, P.A. Bianco3, P. Casati3, E. Costantini1, L. Ferretti1,
A. Gentili1, M. Martini4, C. Marzachì5, S. Palmano5, S. Paltrinieri2, M. Barba1
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura - Centro di Ricerca
per la Patologia vegetale, CRA-PAV – via C.G. Bertero, 22, 00156 Roma
2
DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
viale G. Fanin 42, 40127 Bologna
3
DISAA, Produzione, Territorio, Agroenergia, Università degli Studi di Milano,
Via Celoria 2, 20133 Milano
4
DISA, Università di Udine, Via delle Scienze, 208, 33100 Udine
5
Istituto di Virologia Vegetale – CNR, Strada delle Cacce, 73, 10135 Torino
1
E-mail: [email protected]
Introduzione
In Italia la diagnosi fitosanitaria viene effettuata da numerosi laboratori di analisi
riconosciuti dal Ministero per le Politiche Agricole Alimentari e Forestali idonei per
l’effettuazione delle analisi fitosanitarie relative a patogeni da quarantena (laboratori
dei Servizi Fitosanitari Regionali – SFR e/o Istituzioni scientifiche) e ai patogeni di
qualità (laboratori pubblici e privati accreditati dal MiPAAF). In questo ambito il D.L.
19 agosto 2005, n. 214, attuativo della direttiva comunitaria 2002/89/CE, prevede la
formazione di una apposita rete laboratoristica nazionale costituita dai laboratori per
le analisi e le consulenze specialistiche per la determinazione degli organismi nocivi
contemplati dalle normative di competenza dei Servizi fitosanitari regionali. Tale rete,
coordinata da uno o più Laboratori di Riferimento (LRN), deve utilizzare protocolli
armonizzati di diagnosi, riconosciuti a livello nazionale, perché i risultati possano
essere tra loro confrontabili. E’ in fase di attuazione, inoltre, nell’ambito della UE, una
rete laboratoristica fitosanitaria nella quale confluiranno i Laboratori di riferimento
nazionali che vengano giudicati idonei a livello comunitario.
Il MiPAAF, tramite il finanziamento di uno specifico Progetto finalizzato (ARNADIA),
ha dato compito al Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale di Roma di produrre
protocolli di diagnosi per i principali patogeni di interesse fitosanitario, riconosciuti
a livello nazionale, tramite la costituzione di opportuni Gruppi di lavoro scientifici
e la effettuazione di “ring test” nazionali per la validazione. Si riportano in questo
contributo i risultati ottenuti nell’ambito della presentazione di protocolli di diagnosi
validati di riferimento nazionale per i principali fitoplasmi dei fruttiferi: ‘Candidatus
Phytoplasma mali’ (16SrX-A) e ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (16SrX-B).
171
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Materiali e metodi
Il Gruppo di lavoro scientifico, con il compito di selezionare e validare i protocolli
di diagnosi, era rappresentato dal CRA-PAV di Roma, il DipSA dell’Università di
Bologna, il DiProVe dell’Università di Milano, l’Istituto di Virologia Vegetale del
CNR di Torino e il DISA dell’Università di Udine.
Il gruppo di lavoro ha selezionato, sulla base di una indagine effettuata tra i laboratori
dei SFR e dell’esperienza acquisita presso le proprie istituzioni, una serie di metodi
molecolari da sottoporre a confronto, utilizzando un numero definito di campioni di
riferimento target e non target di diversa provenienza geografica e ripetendo le analisi
in due diverse fasi vegetative delle piante: fine del riposo vegetativo, a partire da
tessuto sottocorticale prelevato da piante infette e fine della stagione vegetativa, a
partire da nervature fogliari prelevate da piante infette.
Per il ‘Ca. P. prunorum’ sono stati utilizzati 21 campioni “target”, rappresentati da
specie diverse infette dal fitoplasma, 4 campioni “non target” rappresentati da DNA di
batteri fitopatogeni comunemente associati a drupacee e campioni infetti da fitoplasmi
appartenenti a sottogruppi ribosomici diversi dal 16SrX-B e 3 campioni di specie
ospiti di ‘Ca. P. prunorum’, esenti da infezione di ESFY.
Per il ‘Ca. P. mali’ sono stati utilizzati 20 campioni “target” infetti dal fitoplasma
(comprendenti i ceppi AP e AT), 5 campioni “non target” rappresentati da DNA di
batteri fitopatogeni comunemente associati a pomacee e campioni infetti da fitoplasmi
appartenenti a sottogruppi ribosomici diversi dal 16SrX-A e 5 campioni di piante di
melo esenti da infezione di ‘Ca. P. mali’.
Per entrambi i fitoplasmi sono stati messi a confronto metodi di PCR convenzionale e
di real time (rt)PCR. Per ciascun metodo sono stati utilizzati due tipi di estrazione del
DNA totale e cioè un kit commerciale ed il metodo Doyle e Doyle (1999) modificato.
I metodi molecolari valutati sono descritti nella tabella 1.
Per definire un protocollo di diagnosi nazionale, la valutazione di ciascun metodo,
ripetuto in almeno due dei laboratori del Gruppo di Lavoro, è stata effettuata misurando
i seguenti parametri di validazione (UNI CEI EN ISO/IEC 17025): sensibilità e
specificità diagnostica, accuratezza, sensibilità analitica, accordanza.
I metodi selezionati sono stati, infine, sottoposti, ad un ringtest nazionale con 7
laboratori dei SFR per valutare il parametro di validazione della concordanza, al fine
di confermare la riproducibilità di un metodo in diversi laboratori.
Risultati e discussione
Il confronto effettuato nei laboratori del Gruppo di lavoro tra i vari metodi molecolari
selezionati utilizzando il calcolo dei parametri di validazione stabiliti dalla UNI ISO
EN 17025 ha consentito di determinare la capacità e robustezza di ciascun metodo.
Alla fine delle prove sono stati, quindi, definiti per ciascun fitoplasma le diverse
fasi del protocollo di diagnosi: periodo di campionamento, metodo di estrazione del
172
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
DNA totale, metodo di PCR convenzionale e metodo di rtPCR, scelta dell’opportuno
metodo molecolare in funzione del tipo di campione da analizzare. I protocolli sono
sintetizzati in tabella 2.
Per quanto riguarda il ‘Ca. P. mali’ i valori di sensibilità, specificità, accuratezza e
accordanza sono risultati inferiori per PCR diretta, mentre PCR “nested” ed rtPCR
sono risultate pressoché simili. La concordanza e la sensibilità analitica molto più
elevati nel caso della rtPCR hanno suggerito di proporla come metodo da utilizzare
per campioni di particolare interesse, riservando l’uso di PCR “nested” solo al caso
in cui non si disponga della apparecchiatura specifica. Nella diagnosi massale PCR
diretta resta, comunque, un utile mezzo diagnostico, che può essere confermato, in
caso di dubbio, dai metodi più sensibili descritti (tabella 3).
La situazione è risultata analoga per la diagnosi di ‘Ca. P. prunorum’, ma in questo
caso il valore di concordanza ottenuto dal ringtest per PCR “nested” è stato talmente
basso da determinarne l’esclusione dal protocollo finale. Per questo fitoplasma,
quindi, viene suggerito l’uso di rtPCR in caso di campioni di particolare interesse e di
PCR diretta per saggi massali (tabella 3).
Il protocollo di diagnosi definitivo per ciascun fitoplasma è stato sottoposto
all’approvazione del Comitato fitosanitario Nazionale del MiPAAF, organo
riconosciuto per il riconoscimento di Protocolli nazionali di riferimento ai sensi del
sopracitato D.L. 19 agosto 2005, n. 214 ed è disponibile sul sito www.strateco.it.
Parole chiave: protocolli riferimento, ESFY, AP, rt PCR, PCR
173
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Tabella 1 – Metodi molecolari inseriti nelle prove di valutazione effettuate dai cinque laboratori del gruppo
di lavoro.
METODI MOLECOLARI PER DIAGNOSI ‘Ca. P. mali’
Tipo
Universale/specifica
Primers
PCR diretta
16SrX-A/C specifica
fAT/rAS (Smart et al., 1996)
PCR diretta/”nested”
16SrX specifica
- PCR diretta: P1 (Deng e Hiruki, 1991)/16S-SR
(Lee et al., 2004)
- PCR nested: fO1/rO1 (Lorenz et al., 1995)
TaqMan rtPCR
16SrX-A specifica
Primers: qAP-16S-F/qAP-16S-R;
Sonda TaqMan: qAP-16S;
Primers controllo interno: qMd-cpLeu-F/qMd-cpLeu-R;
Sonda Taqman controllo interno: qMd-cpLeu
(Baric e Dalla-Via., 2004)
SybrGreen rt PCR
16SrX-A specifica
fAP2/rAP2 (Galetto et al., 2005)
METODI MOLECOLARI PER DIAGNOSI ‘Ca. P. prunorum’
Tipo
Universale/specifica
Primers
PCR diretta
16SrX-B specifica
16SrX specifica
ESFYf/r (Yvon et al., 2009)
fO1/rO1 (Lorenz et al., 1995)
PCR diretta/nested
16SrX specifica
- PCR diretta: P1 (Deng e Hiruki, 1991)/16S-SR
(Lee et al., 2004)
- PCR nested fO1/rO1 (Lorenz et al., 1995)
TaqMan rt PCR
16SrX-B specifica
Primers AP: qAP-16S-F/qAP-16S-R
(Baric e Dalla-Via, 2004);
Sonda TaqMan AP: qESFY-16S (Pignatta et al., 2008);
Primers controllo interno: 18S DISTA–F/ 18S DISTA–R
Sonda controllo interno: Sonda 18S
(Minguzzi et al., 2010; Osman et al., 2007).
SybrGreen rt PCR
16SrX-B specifica
rpLNS2f/rpLNS2r2 (Martini et al., 2007)
174
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Tabella 2 – Schema dei protocolli di diagnosi definiti nell’ambito della attività espletata dal gruppo di
lavoro.
PROTOCOLLO DI DIAGNOSI PER ‘Ca. P. mali’
Periodo di
campionamento
Campionamento a fine stagione vegetativa (fine estate- inizio autunno)
Matrice vegetale
Nervature fogliari
Metodo estrazione DNA
totale
utilizzazione di kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit Qiagen con o senza
azoto liquido
PCR convenzionale
- PCR diretta: fAT/rAS (Smart et al., 1996)
- PCR diretta: P1 (Deng e Hiruki, 1991)/16S-SR (Lee et al., 2004)
- PCR nested: f O1/rO1 (Lorenz et al., 1995)
rt PCR
SybrGreen rt PCR
fAP2/rAP2 (Galetto et al., 2005)
PROTOCOLLO DI DIAGNOSI PER ‘Ca. P. prunorum’
Periodo di
campionamento
Campionamento a fine riposo vegetativo (fine gennaio-febbraio)
Campionamento a fine stagione vegetativa (fine estate- inizio autunno)
Matrice vegetale
Tessuto floematico sottocorticale a fine riposo vegetativo
Nervature fogliari a fine stagione vegetativa
Metodo estrazione DNA
totale
Utilizzazione di kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit Qiagen con o
senza azoto liquido
PCR convenzionale
PCR diretta: fO1/rO1 (Lorenz et al., 1995)
rt PCR
TaqMan rt PCR
Primers AP: qAP-16S-F/qAP-16S-R (Baric e Dalla-Via, 2004);
Sonda TaqMan AP: qESFY-16S (Pignatta et al., 2008);
Primers controllo interno: 18S DISTA –F/ 18S DISTA –R
Sonda controllo interno: Sonda 18S (Minguzzi et al., 2010; Osman et al., 2007).
175
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Tabella 3 – Valori dei parametri di validazione, calcolati dal Gruppo di lavoro, ad eccezione della
concordanza, risultata dall’effettuazione del ring test.
VALORI DI VALIDAZIONE DEL PROTOCOLLO DI DIAGNOSI PER ‘Ca. P. mali’
Parametri
PCR diretta
PCR nested
rt PCR
Sensibilità
81,0%
83,0%
83,0%
Specificità
100,0%
100,0%
100,0%
Accuratezza
90,5%
91,5%
91,5%
10
10-3
10-5
Sensibilità analitica
-2
Accordanza
100,0%
100,0%
100,0%
Concordanza
89,1%
83,6%
90,9%
VALORI DI VALIDAZIONE DEL PROTOCOLLO DI DIAGNOSI PER ‘Ca. P. prunorum’
Parametri
PCR diretta
rt PCR
Sensibilità
86,0%
86,0%
Specificità
100,0%
100,0%
Accuratezza
93,0%
93,0%
10-2
10-3
Accordanza
100,0%
100,0%
Concordanza
68,7%
80,0%
Sensibilità analitica
176
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
ARNADIA project: definition of national diagnostic protocols for ‘Candidatus
Phytoplasma mali’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
The importance of diagnostic procedures harmonization, the contribution to improved
transparency during the detection of regulated pests and the need of the resolution
of disputes among trading partners suggested, in the frame of the Italian Project
ARNADIA financed by the Ministry of Agriculture, to set up validated diagnostic
protocols, officially approved and published at national level. To select a reference
protocol for ‘Candidatus Phytoplasma mali’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
detection different diagnostic methods, protocols and reagents have been compared
in five laboratories, using the same target and non-target reference samples. Methods
of conventional and real time PCR have been selected and developed to determine
the performance characteristics for the validation under the standard ISO 17025. The
results show that the accuracy and sensitivity of conventional and real time PCR are
comparable, whereas real time RT-PCR is recommendable to increase the analytical
sensitivity. The reference protocols are available under www.strateco.it.
Key words: reference protocol, ESFY, AP, rtPCR, PCR
Ringraziamenti / Acknowledgements
Il lavoro è stato svolto nell’ambito del P.F. ARNADIA, finanziato dal MiPAAF. Si
ringraziano: Thomas Letscha, Centro Sperimentale Laimburg; Gianluca Bianchi (SFR
Friuli); Paola Gotta e Giovanna Mason (SFR Piemonte); Andrea Taddei e Marica
Calvi (SFR Lombardia); Patrizia Grillini (SFR Emilia-Romagna); Annamaria Repetto
(SFR Sardegna); Lucio Flamini (SFR Marche) per aver partecipato ai ringtest.
Lavori citati / References
Baric s., J. DaLLa-via, 2004. A new approach to apple proliferation detection: a
highly sensitive real-time PCR assay. Journal of Microbiological Methods, 57,
135-145.
DenG s., G. Hiruki, 1991. Amplification of 16 rRNA genes from culturable and
nonculturable mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
GaLetto L., D. Bosco, c. MarZacHì, 2005. Universal and group-specific real-time
PCR diagnosi of flavescence dorée (16Sr-V), bois noir (16Sr-XII) and apple
proliferation (16Sr-X) phytoplasmas from field-collected plant hosts and insect
vectors. Annals of Applied Biology, 147, 191-201.
177
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Lee i-M., M. Martini, c. Marcone, s.f. ZHu, 2004. Classification of phytoplasma
strains in the elm yellows group (16SrV) and proposal of ‘Candidatus
Phytoplasma ulmi’ for the phytoplasma associated with elm yellows.
International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 54, 337-347.
LorenZ K.H., B. Schneider, U. Ahrens, E. Seemüller, 1995. Detection of the Apple
Proliferation and Pear decline Phytoplasmas by PCR amplification of
ribosomal and nonribosomal DNA. The American Phytopathological Society,
85(7), 771-776.
Martini M., n. Loi, P. erMacora, L. carraro, M. Pastore, 2007. A real-time PCR
method for detection and quantification of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
in its natural hosts. Bulletin of Insectology, 60(2), 251-252.
MinGuZZi s., c. ratti, c. LanZoni, c. ruBies autoneLL, n. reGGiani, c. PoGGi-PoLLini,
2010. Detection and relative quantification of ‘candidatus Phytoplasma
prunorum’ by spot real time RT-PCR TaqMan assay. Petria, 20, 219-220.
osMan f., c. LeuteneGGer, D. GoLino, a. roWHani, 2007. Real-time RT-PCR
(TaqMan®) assays for the detection of Grapevine Leafroll associated viruses
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PiGnatta D., c. PoGGi-PoLLini, M. GoBBer, P. MioreLLi, f. forno, L. MatteDi, e.
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European Stone Fruit yellows phytoplasma (ESFYP) in plant propagation
material. Acta Horticulturae, 781, 499-503.
sMart c.D., B. scHneiDer, c.L. BLoMQuist, L.J. Guerra, n.a. Harrison, u. aHrens,
k.H. LorenZ, e. seeMuLLer, B.c. kirkPatrick, 1996. Phytoplasma-Specific
PCR primers based on sequences of the 16S-23S rRNA spacer region. Applied
Environmental Microbiology, 62(8), 2988-2993.
Yvon M., G. tHéBauD, r. aLarY, G. LaBonne, 2009. Specific detection and
quantification of the phytopathogenic agent ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’. Molecular and Cellular probes, 23, 227-234.
178
Petria 23 (1), 1-180 (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi
Indice degli autori / Index of authors
Abbà S.
97
Abdeen A.
57
Abou-Jawdah Y.
21-53-79
Alma A.
21-53-57-79-153-157
Angelini E.
83-87-101
Arocha Y.
139
Babini A.R.
165
Bagnoli B.
127
Barba M.
171
Bellardi M.G.
37-113
Benabid R.
139
Bertaccini A. 13-25-37-45-71-109-113
127-135-139-171
Bertin S.
97
Bianco P.A.
21-53-57-79-161-171
Bortolamai E.
83
Bosco D.
97-105
Bozzano G.
37
Braccini P.
127
Bulgari D.
57
Caciagli P.
117
Casati P.
21-53-57-79-171
Cavicchi L.
37-113
Choueiri E.
21-53
Collodel P.
87
Cominetti A.
21
Contaldo N. 13-25-37-45-71-113-127
135
Conti M.
67
Costantini E.
33-61-123-131-171
Cozzolino L.
33
Crotti E.
153
D’Urso V.
91
Daffonchio D.
153
Dallara M.
165
De Salvador F.R.
25
Duduk B.
135-139
Ermacora P.
29-145
Feliziani E.
149
Ferrandino A.
117
Ferretti L.
33-61-123
131-171
Ferrini F.
29
Filippin L.
83
Firrao G.
97
Forte V.
83-87
Galetto L.
97-105
Gargani E.
127
Gentili A.
33-61-123-131-171
Gonella E.
153
Granata G.
45
Kube M.
109
Landi L.
149
Lanzoni C.
165
Lessio F.
157
Loi N. 29145
Loschi A.
29
Mancini V.
149
Mandrioli M.
153
Marcone C.
49
Margaria P.
117
Martini M.
29-75-145-171
Marzachì C.
41-91-97-105-171
Mattarelli P.
113
Mejia J.F.
45-135
Michelutti R.
139
Miotti L.
101
Mitrović J.
139
Molino Lova M.
21-53-79
Monti M.
75
Mori N.
71-83-87-161
Moruzzi S.
29
Murolo S.
149
Musetti R.
101-145
Nissen L.
113
Osler R.
29-145
Pacifico D.
97
Palmano S.
97-117-171
Paltrinieri S.
25-45-71-109-127-171
Parrella G.
37
Pasquini G.
33-61-123-131-171
Pavan F.
29-71
Picciau L.
21-79
Piergiacomi M.
25
179
Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases
Poggi Pollini C.
Posenato G.
Prati S.
Punelli F.
Quaglino F.
Quiñones M.L.
Rashidi M.
Ratti C.
Reinhardt R.
Rizza S.
Romanazzi G.
Salem N.M.
Schubert A.
Scott J.
165
161
21
61-123-131
21-53-57-79-161
135
97-105
165
109
41-91
149
57
117
139
Seemüller E.
Serwaa R.A.
Spallino R.E.
Spigno P.
Tedeschi R.
Tessari F.
Tessitori M.
Veratti F.
Vizzaccaro L.
Windsor D.
Windsor H.
Zamora L.
Zoina A.
180
49
109
41
33
21-53-75-79
161
41-91
105
131
13
13
135
33
