SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN MEDICINA E CHIRURGIA

UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE
SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN
MEDICINA E CHIRURGIA
Curriculum “Patologie Immunometaboliche, Degenerative e Infettive”
I Polimorfismi del gene Recettore degli Androgeni e del
gene della Ossido Nitrico Sintetasi Endoteliale:
Applicazioni in Andrologia
Dottorando:
Tutor:
Dr. Nicola delli Muti
Prof. Giancarlo Balercia
XIII CICLO
SOMMARIO
Abstract ........................................................................................... 1
INTRODUZIONE.............................................................................. 1
Polimorfismi genetici: generalità .................................................... 1
Androgeni e Spermatogenesi ........................................................ 5
Il Recettore degli Androgeni ........................................................ 11
I polimorfismi CAG e GGC del gene AR ...................................... 15
Ipogonadismo e diabete mellito di tipo 2 ..................................... 18
Il sistema della Ossido Nitrico Sintetasi ....................................... 21
Genetica del gene eNOS ............................................................ 26
SCOPO DELLA TESI ..................................................................... 30
Studio 1 ....................................................................................... 31
Disegno dello studio ................................................................. 31
Studio 2 ....................................................................................... 32
Disegno dello studio ................................................................. 32
MATERIALI E METODI .................................................................. 33
Determinazione dei parametri biochimici ed ormonali ................. 33
Estrazione del DNA ..................................................................... 33
PCR e sequencing ...................................................................... 35
Analisi del liquido seminale ......................................................... 37
Analisi statistica........................................................................... 38
RISULTATI .................................................................................... 39
Studio 1 ....................................................................................... 39
Studio 2 ....................................................................................... 43
DISCUSSIONE .............................................................................. 48
BIBLIOGRAFIA ................................................................................. I
Abstract
In andrologia sono stati numerosi i tentativi di chiarire il ruolo del
polimorfismo CAG del gene recettore degli androgeni (AR) e della
variante Glu298Asp della ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS).
Allo scopo di meglio comprendere il ruolo ricoperto dalle due varianti
geniche nelle patologie del sistema riproduttivo maschile sono stati
condotti due tipi di esperimenti. Nel primo, abbiamo valutato la
possibile influenza della variante Glu298Asp del gene eNOS
sull'insorgenza del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) associato ad
ipogonadismo ad insorgenza tardiva. Nei soggetti in esame (n=110),
sono state analizzate le tre varianti genetiche risultanti dalla
transversione Glu298Asp (eNOSGG, eNOSGT, eNOSTT) e non è
stata rilevata alcuna differenza per i valori di età, di BMI e di
testosterone totale. Al contrario, il genotipo eNOSTT ha mostrato dei
valori significativamente più alti di glicemia, di Hb1Ac ed una
maggiore prevalenza di T2DM. L’analisi di regressione logistica ha
inoltre mostrato una evidente associazione positiva e significativa tra
il genotipo eNOSTT e T2DM. Nel secondo esperimento, abbiamo
ipotizzato che la presenza contemporanea delle due mutazioni
potesse influenzare i parametri seminali. A tale scopo sono stati
studiati
soggetti
oligoastenozoospermici
(n=34)
e
soggetti
normospermici (n=43). I polimorfismi del gene AR ed eNOS non
sono risultati chiaramente associati con i parametri seminali in
entrambe le popolazioni, ma effettuando le possibili combinazioni tra
i due geni è stato evidenziato un marcato peggioramento dei
parametri
seminali
nei
soggetti
che
presentavano
contemporaneamente le ripetizioni più corte del tratto CAG e il
genotipo eNOSTT. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che
il polimorfismo AR-CAG e la variante Glu298Asp del gene eNOS
rappresentano fattori di rischio in ambito andrologico, in particolare
per l’insorgenza di diabete mellito di tipo 2 in soggetti ipogonadici e
per l’infertilità maschile.
Abstract (english version)
Many studies have shown conflicting associations between CAG
polymorphism of the androgen receptor gene (AR), the endothelial
nitric oxide synthase gene (eNOS) variant Glu298Asp and male
reproductive system diseases. In order to understand the role
played by the two gene variants, were performed two types of
studies. In the first study, we evaluated the possible influence of
variant Glu298Asp on the onset of hypogonadism-associated type 2
diabetes mellitus (T2DM). We have analyzed the three genetic
variants
resulting
by
Glu298Asp
eNOS
gene
transversion
(eNOSGG, eNOSGT, eNOSTT) in 110 subjects affected by lateonset hypogonadism. Any difference was detected for age, BMI and
total testosterone. By contrast, the genotype eNOSTT showed
significantly higher values of glycemia, Hb1Ac and a greater
prevalence of T2DM. The logistic regression analysis also showed
an evident significant association between the genotype eNOSTT
and T2DM. In the second study, we hypothesized that the
simultaneous presence of two mutations could affect semen
parameters. For this purpose, oligoasthenozoospermic subjects (n =
34) and normospermic subjects (n = 43) were studied. Our results
showed no clear association of AR gene polymorphisms and eNOS
variant with semen parameters. Conversely, after splitting the
sample in the six possible combinations between the two genes, the
deterioration
of
semen
parameters
in
subjects
with
the
simultaneously presence of shorter CAG tract and eNOSTT
genotype was evident. In conclusion, our results suggest that the
polymorphism AR-CAG and the eNOS gene variant Glu298Asp
could represent risk factors in andrology and could be predictive
markers of diseases like diabetes mellitus type 2 and male infertility.
INTRODUZIONE
Polimorfismi genetici: generalità
Gran parte del genoma umano è costituito da sequenze ripetute di
vario genere, di cui non è ancora chiara la funzione. I geni non sono
uniformemente distribuiti ma tendono a concentrarsi su alcuni
cromosomi rispetto ad altri. Inoltre, la densità genica è maggiore in
aree ricche di citosina e guanina, rispetto a quelle contenenti
adenina e timina (1, 2).
La presenza di variabilià all’interno della specie umana non
consente di definire sequenze genomiche normali. Tuttavia, laddove
si rilevino variazioni di sequenza tra gli individui, si utilizza il termine
normale o wild-type, ad indicare la variante più comune in una data
popolazione. Nella forma più semplice, le variazioni di sequenza
hanno due differenti possibilità, definite “alleli”: se la frequenza
dell’allele meno rappresentato risulta essere maggiore dell’1%, la
variazione prende il nome di “polimorfismo genetico”.
Una mutazione si presenta generalmente nel momento in cui le
variazioni nella sequenza del DNA sono ritenute essere patologiche,
come ad esempio le mutazioni nel gene CFTR che causa la fibrosi
cistica, o per variazioni insorte de novo, come nel caso di una
1
variazione di una base del DNA tumorale, che non è presente nel
DNA germinale del soggetto.
I polimorfismi genetici si differenziano dalle mutazioni per le
seguenti caratteristiche:
 Non segregano con la malattia seguendo le modalità della
trasmissione ereditaria ma tendono ad associarsi ad essa in
varia misura;
 non sono necessari né sufficienti dal punto di vista
patogenetico;
 hanno ridotta penetranza fenotipica;
 conferiscono un basso rischio individuale.
La variabilità genomica è causata dai seguenti fattori, che possono
interessare porzioni esoniche, introniche o regolatorie del gene:
 variazioni di singole paia di basi (cosiddetti SNPs, dall’inglese
single nucleotide polymorphism);
 inserzioni o delezioni più (riguardanti la maggior parte del
gene, come per GSTM1, GSTT1 o CYP2D6) o meno estese (3
paia di basi per il gene GSTM3);
 riarrangiamenti
strutturali:
traslocazioni,
duplicazioni
e
amplificazioni geniche, conversioni geniche; variazioni del
2
numero delle ripetizioni tandem (VNTR, ad esempio per i geni
DAT1, HO-1 e EGFR).
I polimorfismi a carico di sequenze introniche e/o regolatorie sono
generalmente privi di conseguenze, a meno che non riguardino siti
critici come le giunzioni introne-esone o siti di legame di fattori
trascrizionali
o
siti
critici
di
sequenze
regolatorie,
che
provocherebbero rispettivamente l’assenza di prodotto proteico per
alterazione dei processi di maturazione del trascritto primario oppure
un’ interferenza con i meccanismi regolatori dell’espressione genica,
aumentando o riducendo la sintesi proteica.
E’ stato calcolato che solo l’1% dei polimorfismi genetici ha chiare
conseguenze funzionali sulla proteina codificata. Individui portatori
di un determinato allele per un polimorfismo possono essere
portatori di specifiche varianti di altri polimorfismi SNPs adiacenti
all’allele considerato, non necessariamente localizzati nelle regioni
codificanti del gene. Tale fenomeno è riconducibile al linkage
disequilibrium, definito come “l’associazione non casuale di alleli di
diversi loci, che discendono da un cromosoma singolo ed
ancestrale” (3). Da ciò ne consegue che l’associazione di uno SNP
con la patologia non implica necessariamente un’associazione con i
meccanismi patogenetici della stessa e studi di tipo caso-controllo
3
hanno consentito l’identificazione di associazioni tra SNPs, utilizzati
come markers di regioni cromosomiche (4).
4
Androgeni e Spermatogenesi
Il testicolo è costituito da una membrana fibrosa biancastra, detta
tonaca albuginea che lo avvolge. In corrispondenza dell’ilo il
testicolo si ispessisce costituendo il mediastino, da cui invia nella
profondità dell’organo numerosi setti, che lo suddividono in 250-300
piccoli lobuli. Ogni lobulo contiene da uno a tre tubuli seminiferi
contorti, piccoli canalicoli del diametro di 20µm lunghi fino ad 1
metro circa, avvolti ed attorcigliati ripetutamente su se stessi. Ai
tubuli seminiferi fanno seguito i tubuli retti, che convergono verso il
mediastino dove si anastomizzano tra loro costituendo la rete testis.
Tra i tubuli seminiferi è disposto un tessuto connettivo interstiziale,
che
contiene
cellule
particolari
aventi
funzione
endocrina,
denominate cellule interstiziali del Leydig. I testicoli rappresentano
quindi le ghiandole germinali maschili; la loro vascolarizzazione
origina dalle arterie spermatiche che nascono direttamente dalla
aorta: la vena spermatica destra, che raccoglie il sangue refluo dal
testicolo destro, va a confluire nella vena cava inferiore, mentre la
vena spermatica sinistra si unisce alla vena ipsilaterale. I tubuli
seminiferi costituiscono l’80% del tessuto testicolare adulto; il
restante 20% è costituito da tessuto connettivo di sostegno, in cui
sono contenute le cellule del Leydig. I tubuli seminiferi costituiscono
5
un sistema di anse, ciascuna di essa origina e termina in un singolo
dotto: il tubulo retto. I tubuli retti, a loro volta, si anastomizzano,
formando la rete del testicolo (rete testis) e confluiscono poi
mediante i condotti efferenti (ductuli efferenti) nell’epididimo (5).
La produzione degli ormoni da parte dei testicoli è evidente fin dalla
nascita, ma aumenta enormemente intorno alla pubertà e si
mantiene ad alto livello per tutta l'età adulta fino a manifestare una
diminuzione durante gli ultimi anni di vita. Gli ormoni steroidei
prodotti dal testicolo circolano nel sangue in forma libera e in forma
legata alla SHGB (Sex Hormone Binding Protein). Il Testosterone
(T) è prodotto dal testicolo sin dalle prime fasi di sviluppo
intrauterino, in seguito alla risposta all’ormone leutinizzante (LH) da
parte
delle
cellule
interstiziali.
Nell’embrione
il
T
presiede
all’organogenesi, favorisce l’involuzione degli abbozzi embrionali
femminili (canali di Muller), agisce nel feto a livello ipotalamico
favorendo la cosiddetta androgenizzazione; inoltre determina lo
sviluppo dei deferenti, epididimi e prostata (Figura 1). Dopo lo
sviluppo, il T favorisce lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari,
cioè i caratteri propri del sesso maschile, attraverso lo sviluppo dei
genitali esterni, delle masse muscolari, disposizione del grasso,
atteggiamento psicologico sessuale, che si manifestano dopo la
6
pubertà. L’attività anabolica degli androgeni porta alla ritenzione di
azoto, all’aumento della massa muscolare ed ossea e all’arresto
della crescita dopo la pubertà, mentre l’azione a livello cerebrale ha
effetti sul comportamento sessuale e l’aggressività maschile.
Sebbene l’ormone principale prodotto dai testicoli sia il testosterone,
l’ormone attivo in gran parte dei tessuti è un suo metabolita, il 5adiidrotestosterone (DHT). Il DTH stimola la maturazione e la crescita
del pene, dello scroto, dell’uretra peniena e della prostata ed il
testosterone quella dei deferenti, delle vescicole seminali e
dell’epididimo (6).
Figura 1 Regolazione del Testosterone.
7
La
spermatogenesi
(Figura
2)
rappresenta
il
processo
di
maturazione delle cellule germinali maschili, che avviene nelle
gonadi, sotto lo stimolo di segnali endocrini prodotti dalle ghiandole
gonadotrope. Lo spermatogonio subisce una metamorfosi che
avviene in diverse fasi, distinguibili dal punto di vista istologico, fino
a divenire spermatozoo. Le prime due divisioni mitotiche di uno
spermatogonio danno origine a quattro cellule: una di esse è una
cellula di riserva, che servirà a generare una successiva serie di
spermatozoi, e tre sono cellule attive. Queste ultime si dividono per
mitosi successive dando origine a spermatogoni di tipo B, che a loro
volta generano spermatociti primari, i quali entrano nella profase
della meiosi, in cui rimangono per circa venti giorni. Il complesso
processo di reduplicazione cromosomica, sinapsi, scambio (crossing
over), divisione e separazione si riflette anche dal punto di vista
istologico, conferendo agli spermatociti, nelle differenti fasi, un
aspetto caratteristico. Con il completamento della meiosi, le loro
cellule figlie, gli spermatociti secondari, si dividono nuovamente,
formando spermatidi contenenti 22 autosomi e un cromosoma
sessuale X o Y. Gli spermatidi sono localizzati in prossimità del lume
del tubulo seminifero, circondati dalle cellule del Sertoli e collegati
l’uno all’altro da ponti intercellulari. Successivamente gli spermatidi
8
subiscono il cosiddetto processo di spermiogenesi, durante il quale
si
verifica
la
condensazione
della
cromatina
nucleare,
il
restringimento del citoplasma, la formazione dell’acrosoma e lo
sviluppo della coda. Al termine della spermiogenesi, gli spermatidi
divengono spermatozoi flagellati. L’ultimo evento è rappresentato
dalla spermiazione, processo mediante il quale gli spermatozoi
vengono rilasciati nel lume del tubulo e durante il quale la maggior
parte del loro citoplasma rimane incluso nelle cellule di Sertoli. In
genere sono richiesti molti giorni per l’intera sequenza di sviluppo
degli spermatogoni a spermatozoi. Tuttavia i singoli spermatogoni in
fase di quiescenza non iniziano il processo di spermatogenesi
casualmente. Studi recenti hanno dimostrato che si verificano
contemporaneamente cicli distinti di spermatogenesi tra loro sfalsati
nel tempo. Gruppi contigui di spermatogoni iniziano un nuovo ciclo
ogni 16 giorni circa, costituendo così una “generazione” (7).
9
Figura 2 Rappresentazione schematica della spermatogenesi.
La testa degli spermatozoi contiene il nucleo e un cappuccio
acrosomiale, in cui sono concentrati enzimi idrolitici e proteolitici,
che facilitano la penetrazione nella cellula uovo e probabilmente
anche il passaggio attraverso il muco della cervice uterina della
femmina. La parte intermedia dello spermatozoo, o corpo, contiene
mitocondri, in cui viene prodotta l’energia necessaria al loro
movimento. La parte centrale della coda contiene ATP di deposito e
“9+2” paia di microtubuli, a funzione contrattile, lungo tutta la sua
estensione; un paio di microtubuli è situato al centro e nove paia
lungo
la
sua
circonferenza.
Un’ATPasi
libera
l’energia
immagazzinata, che consente ai microtubuli di impartire un
movimento flagellare allo spermatozoo (8).
10
Il Recettore degli Androgeni
Il gene dell’AR (Figura 3) è situato sul braccio lungo del cromosoma
X sessuale in posizione Xq11-q12 (MIM ID 313700). Ha una
dimensione di circa 90 kb ed è cosituito da otto esoni e di regioni 5' UTR
e
3'-UTR
entrambe
molto
estese
(1.1kb
e
6.8
kb
rispettivamente) codificante una proteina di circa 110 Kd (9) per un
totale di 90 aa (NCBI Reference Sequence: NP_000035.2)
Figura 3 Localizzazione del Recettore degli Androgeni.
La struttura del recettore androgenico include un dominio Nterminale di trans-attivazione (TAD - amino-terminal transactivation
domain, parte dell'esone 1), un dominio centrale per il legame del
DNA (DBD - DNA binding domain, esoni 2 e 3), ed un dominio Cterminale di binding per il ligando (LBD - ligand binding domain,
dall'esone 4 fino a parte dell'esone 8) (10). Tra il dominio DBD e
LBD è localizzata l'hinge regione (HR - regione cerniera). Il legame
degli androgeni sul dominio LBD causa una traslocazione nucleare
del complesso ligando-recettore ed innesca una serie di eventi
molecolari che culminano nell'interazione del domino DBD con
11
elementi affini di risposta e con l'attivazione di geni di risposta agli
androgeni. L’attività trascrizionale del recettore risiede nel dominio
amino-terminale della proteina, che è codificata dall’esone 1. Il
dominio di trans-attivazione amino-terminale (AR TAD) rappresenta
più della metà della sequenza codificante del recettore e, all’interno
dei suoi 254 amminoacidi, contiene il dominio AF-1 e il dominio AF5, importanti rispettivamente per la trans attivazione dell’intero AR e
per
la
trans
attivazione
di
un
recettore
degli
androgeni
costituzionalmente attivo (11). AF-1 media l'interazione con i coregolatori trascrizionali, con elementi del sistema basale della
trascrizione e contiene motivi che interagiscono con la regione LBD
dopo il suo legame, portando ad interazioni amino-carbossi-terminali
intra e/o inter molecolari, che possono essere critiche per
l'attivazione della trascrizione (12).
Le regioni richieste per il legame dell’LBD sono state mappate in
due unità essenziali: la prima a 36 aa e l’altra tra i residui 370-494.
La regione AR-DBD (DNA Binding Domain) è caratterizzata da nove
residui di cisteina, otto dei quali coordinano due atomi di zinco per
formare la caratteristica forma chiamata zinc fingers; la sua
lunghezza è di circa 80 aminoacidi . Il dominio ha una struttura
compatta, globulare. Il primo zinc-finger contiene un P-box deputato
12
al riconoscimento degli elementi denominati ARE (Androgen
Response Elements) per il legame diretto con il DNA. La seconda
zinc finger, chiamata D-box, è coinvolta nell’interazione proteinaproteina e stabilizza le unità per la dimerizzazione dei recettori.
Attraverso l’interazione con il solco maggiore dell’elica di DNA, le
zinc fingers sono in grado di legare il recettore degli androgeni ai
suoi geni bersaglio. Ulteriori funzioni operate da questi domini
includono la dimerizzazione, il legame con proteine co-regolatorie,
l’interazione con heat-shock proteins e la regolazione della
trascrizione (13). I due cluster di zinco sono strutturalmente e
funzionalmente differenti e sono codificati da due differenti esoni
(14).
Tra i domini DBD e il dominio LBD (precisamente tra l'ultima α-elica
del dominio DBD e la prima del dominio LBD) è localizzata la
regione cerniera, variabile nelle dimensioni nei differenti recettori
steoidei. La regione cerniera contiene una serina in posizione 650
che può essere fosforilata dalla MEKK-chinasi e che sembra essere
coinvolta nella regolazione della traslocazione di AR (15, 16).
La regione denominate AR-LBD (Ligand Binding Domain) media le
interazioni dell'AR con i suoi ligandi steroidei e non steroidei ed è
importante per le interazioni dell'AR con gli chaperoni (17). AR-LBD
13
è composto da 12 α-eliche che formano un "tasca" per il legame con
il ligando (Fig. 9). Al momento del legame avviene un cambiamento
di conformazione della proteina, che provoca la stabilizzazione
dell'elica e la formazione della proteina AF-2 sulla superficie di
questo dominio. AF-2 svolge un ruolo essenziale per le interazioni
N/C intra e intermolecolari, che possono ulteriormente stabilizzare il
complesso ormone-recettore, giocando un ruolo importante sulla
sua dimerizzazione (18, 19).
14
I polimorfismi CAG e GGC del gene AR
L’esone 1 del gene AR contiene un tratto altamente polimorfico,
caratterizzato da un numero variabile di triplette CAG e GGC (Figura
4), che codificano rispettivamente per una coda di poliglutammine e
una di poliglicine nel dominio N-terminale della proteina AR, i quali
sembrerebbero modulare la funzione dello stesso recettore. E’ stato
definito un “range di normalità” del numero delle ripetizioni di CAG e
GGC, fissato rispettivamente tra 10 e 35 (con una media di 21±2) e
tra 4 e 24 (con una media di 16±2) (20, 21).
Figura 4 Rappresentazione grafica dei tratti polimorfici CAG e GGC del gene AR (24).
Ripetizioni più lunghe di CAG sono state correlate ad una riduzione
dell'attività trascrizionale dell'AR sia in vivo che in vitro. Si è visto
infatti che un tratto di CAG maggiore di 40 ripetizioni si associa con
un raro disordine neuromuscolare (Atassia spino-bulbare muscolare
(SBMA) o Sindrome di Kennedy), il quale è inoltre associato alla
diminuzione della virilizzazione, ad atrofia testicolare, a ridotta
15
produzione di spermatozoi ed infertilità (22). Al contrario, tratti minori
di 9 ripetizioni (e quindi una maggiore attività trascrizionale da parte
dell'AR), sono stati associati all’insorgenza precoce di cancro
prostatico (23). Una moderata espansione del tratto di CAG dell'AR
può alterare la sua funzione, influenzando varie condizioni cliniche
quali la densità ossea, la spermatogenesi, la variazione d’umore,
l’ipogonadismo, le funzioni cognitive, le condizioni pre-Alzheimer e
lo sviluppo del pelo in entrambi uomini e donne.
Per quanto riguarda il tratto GGC, pochi studi riportano differenze
rispetto la popolazione normale (25, 26) e risulta generalmente
meno investigato, a causa della difficoltà nella sua analisi mediante
PCR.
Gli studi che hanno esaminato il numero delle ripetizione CAG in
uomini infertili hanno riportato risultati contrastanti. Infatti alcuni di
essi (27-32) non hanno mostrato alcuna correlazione, mentre altri
(25, 33-35) riportano un espansione maggiore del tratto CAG,
seppur compresa nel range di normalità. Studi riguardanti soggetti
singaporiani, australiani, nord americani e giapponesi hanno
mostrato un'associazione tra la lunghezza del polimorfismo CAG e
infertilità maschile, mentre questo non è stato evidenziato in studi
europei, evidenziando l’etnicità del suddetto tratto (36).
16
A questo proposito, nelle popolazioni africane l’espansione del tratto
CAG è risultata in media ta 18 e 20 ripetizioni (37). In contrasto, le
popolazioni caucasiche ed asiatiche sono risultate avere un
espansione più lunga del tratto CAG con una media del numero di
ripetizioni CAG rispettivamente di 21–22 per i caucasici (21) e 23
per gli asiatici (38).
La correlazione tra l'attività trascrizionale dell'AR e la lunghezza del
tratto GGC è invece poco chiara, anche se la delezione del tratto
delle
poliglicine
riduce
l'attività
trascrizionale
del
recettore
androgenico (39). Anche se brevi tratti di GGC sembrano essere
correlati con il rischio di malattie, non sono state raggiunte delle
adeguate conclusioni. Diversi studi hanno riportato un’associazione
significativa tra l’incidenza del cancro prostatico e la lunghezza del
polimorfismo GGC (40-43). Nella popolazione Caucasica, si è
evoluto un allele dominante di 23 ripetizioni, che è espresso dalla
maggioranza dei soggetti. Invece, nella maggior parte dei pazienti
affetti da criptorchidismo o da ipospadia peniena, il numero di
ripetizioni GGC riscontrate è maggiore o uguale a 24 (44). Studi in
vitro hanno dimostrato che alleli GGC con lunghezza diversa da 23
si associano con una minore capacità di transattivazione dell’AR in
risposta agli androgeni (26, 39, 44).
17
Ipogonadismo e diabete mellito di tipo 2
L'asse Ipotalamo-Ipofisi-Gonadi (HPG) regola lo sviluppo, la
funzione endocrina e riproduttiva delle gonadi durante tutte le fasi
della vita. Nell'ipotalamo, neuroni specializzati stimolano il rilascio
ormonale di GnRH, il quale modula la secrezione di gonadotropine
da parte dell’ipofisi. Inoltre, gli ormoni luteinizzante (LH) e follicolo
stimolante (FSH), prodotti nella regione anteriore della ghiandola
pituitaria, stimolano la secrezione di steroidi e di cellule germinali nei
testicoli. L'attività dell'asse HPG è altamente regolata da una
complessa integrazione di input endogeni, segnali temporali e stress
esogeno. Questo riflette il profondo cambiamento che avviene nella
funzione gonadica durante tutta la vita. Alla nascita, i livelli di
gonadotropine sono elevati, e questi diminuiscono gradualmente
durante i primi dieci anni di vita. In soggetti maschi in età prepuberale, gli impulsi ipotalamici provocano un aumento della
secrezione di LH durante il sonno seguito da un'elevazione dei livelli
sierici di LH e FSH. Nella vita post-puberale, i livelli di GnRH
permetto il mantenimento del tono di gonadotropine richieste per
una normale funzione gonadica. Infine durante la senescenza, il
meccanismo a feedback dell'asse HPG risulta alterato, con una
diminuizione dei segnali neuronali degli steoridi sessuali, una
18
pulsatilità disorganizzata del GnRH ed un aumento dei livelli di LH e
FSH, provocato da un difetto della reattività testicolare (45).
L'ipogonadismo maschile è definito dalla inadeguata funzione
gonadica, causata dalla mancata secrezione di ormoni gonadici e/o
da una gametogenesi difettiva (46). Gli ipogonadismi possono
essere distinti in tre forme:
i.
ipogonadismo primitivo (ipergonadotropo) in cui il danno delle
cellule di Leydig compromette la produzione di androgeni
(testosterone) e/o altera la struttura dei tubuli seminiferi, con
conseguente oligospermia o azoospermia e aumento delle
gonadotropine;
ii.
ipogonadismo secondario (ipogonadotropo) nel quale le
alterazioni
della
ghiandola
ipofisi
o
dell'ipotalamo
compromettono la secrezione delle gonadotropine e questo
può determinare impotenza e/o sterilità;
iii.
ipogonadismo
ad
esordio
tardivo
(LOH,
Late
Onset
Hypogonadism, anche noto come TDS, sindrome da deficienza di
testosterone, associata all’età)è caratterizzato dall’abbassamento
dei livelli di testosterone, condizione associata all'avanzamento
dell'età, che può compromettere la funzione di svariati organi e
19
inoltre determinare un significativo peggioramento nella qualità della
vita (47).
Studi epidemiologici hanno dimostrato come gli uomini con bassi
livelli di testosterone abbiano una maggiore suscettibilità a
sviluppare diabete mellito e/o insulino resistenza. Il diabete mellito e
l’ipogonadismo sono caratterizzati da disfunzione endoteliale, che
comporta una ridotta attività biologica di monossido d’azoto (NO), il
più potente vasodilatatore conosciuto. Una ridotta sintesi di NO, già
peraltro in presenza di insulino-resistenza, non solo si associa a
ridotta vasodilatazione, ma anche ad aumentata aggregazione
piastrinica e ad un’aumentata adesività leucocitaria alla parete
arteriosa. Tale meccanismo fisiopatologico può essere associato ad
una riduzione dell’ormone SHBG e di LH, determinando un
aggravamento della patologia. (48). Infatti risultati ottenuti da studi
animali ed epidemiologici suggeriscono che il testosterone gioca un
ruolo cruciale nella regolazione della sensibilità all’insulina e di
conseguenza i bassi livelli di testosterone caratteristici dei soggetti
ipogonadici comportano alterazioni glicometaboliche (49).
20
Il sistema della Ossido Nitrico Sintetasi
Il monossido di azoto (NO) è un radicale libero gassoso generato da
vari sistemi biologici, il quale rappresenta un potente messaggero
biologico nei mammiferi, ricoprendo importanti ruoli fisiologici e
fisiopatologici. Infatti, nell’ambito del sistema vascolare, NO induce
la vasodilatazione, inibisce l’aggregazione delle piastrine, previene
l’adesione dei neutrofili e delle piastrine alle cellule endoteliali,
inibisce la proliferazione delle cellule della muscolatura liscia e la
loro migrazione, regola la morte cellulare programmata (apoptosi)
(Figura 5). NO generato dai neuroni agisce come neurotrasmettitore
ed è coinvolto nella formazione della memoria, mentre nell’ambito
del sistema immunitario, ha proprietà antivirali e battericide, riduce
l’adesione dei neutrofili, l’attivazione dei linfociti (50).
21
Figura 5 Rappresentazione schematica del meccanismo di regolazione per l'attivazione
indotta da stress del gene eNOS (51).
Gli enzimi responsabili della sintesi di NO costituiscono una famiglia
con almeno tre distinte isoforme, Le NOS (Ossido Nitrico Sintase),
prodotte
da
tre
differenti
geni,
con
distinta
localizzazione,
regolazione, proprietà catalitiche e sensibilità all’inibizione:
22
 nNOS (anche conosciuta come Tipo I, NOS-I e NOS-1),
predominante nel tessuto nervoso;
 iNOS (anche conosciuta come Tipo II, NOS-II e NOS-2),
inducibile in un ampio range di cellule e tessuti;
 eNOS (anche conosciuta come Tipo III, NOS-III e NOS-3), la
prima ad essere stata scoperta nelle cellule endoteliali.
Le suddette isoforme sono state differenziate in passato sulla base
della loro espressione costitutiva (nNOS e eNOS) o inducibile
(iNOS) e la loro dipendenza (nNOS e eNOS) o indipendenza (iNOS)
dallo ione Ca2+ (52). Le tre isoforme della NOS sono codificate da
geni differenti che mostrano un’omologia del 50-60% in aminoacidi
(53) e possiedono la seguente struttura a due domini: il dominio Nterminale ad attività ossigenasica, che contiene i siti di legame per il
gruppo eme, la tetraidrobiopterina (BH4) e la L-arginina, legata
mediante un sito di riconoscimento per la calmodulina al dominio Cterminale ad attività reduttasica, la quale contenente i siti di legame
per il flavin-adenin-dinucleotide (FAD), il flavina mononucleotide
(FMN) e la nicotina adenina dinucleotide fosfato (NADPH) (52)
(Figura 3). Delle tre isoforme, la regolazione della eNOS è stata la
meglio caratterizzata. L’associazione con la calmodulina (CaM) e la
caveolina (Cav) ha profondi effetti sulla localizzazione intra-cellulare
23
e sull’attività dell’eNOS; la fosforilazione dell’enzima può essere
modulata da una serie di reazioni segnale regolate da specifiche
kinasi e fosfatasi. Gli stimoli che portano all’attivazione della eNOS
sono molteplici e di varia natura: meccanici (shear stress), umorali
(fattore di crescita endoteliale vascolare) e farmacologici (statine).
Numerosi studi hanno dimostrato che la localizzazione della eNOS
all’interno della cellula determina la sua attività. Un particolare sito
cellulare che sembra di importanza fondamentale per la funzionalità
dell’eNOS è il caveolo: invaginazioni della membrana plasmatica
specializzate e presenti in molti tipi di cellule, in particolar modo
nelle endoteliali, negli adipociti, nei fibroblasti e nelle cellule della
muscolatura liscia. I principali componenti dei caveoli sono
colesterolo, glicosfingolipidi e alcune proteine strutturali, come la
caveolina; i fosfolipidi sono praticamente assenti. L’enzima eNOS è
stato individuato all’interno dei caveoli (Figura 6) e ciò rende
l’enzima inattivo, a causa della presenza della caveolina-1 (Cav-1).
Questa proteina non è localizzata esclusivamente nei caveoli, ma si
trova anche nell’apparato del Golgi.
24
Figura 6 Il sito di legame per la caveolina risiede tra il sito di legame per l’eme e quello
per la calmodulina ed è adiacente al residuo di glutammato che è necessario per il
legame con la L-arginina.
Cav-1 è una proteina intrinseca di membrana, palmitolata in
maniera irreversibile ed in grado di legarsi, oltre che alla eNOS,
anche
con
se
stessa,
creando
dei
complessi
oligomerici.
L’interazione tra la eNOS e la caveolina riduce fortemente l’attività
dell’enzima in quanto cav-1 interferisce con il legame della
calmodulina alla eNOS in presenza di bassi livelli di calcio citosolico
(52).
25
Genetica del gene eNOS
L’espressione di eNOS è regolata da una varietà di stimoli e la sua
espressione basale è ampiamente tessuto-dipendente (54).
Il c-DNA dell’eNOS umano ha un open reading frame (ORF) di 3609
nucleotidi che codificano per una proteina di 1203 aminoacidi ed un
peso molecolare complessivo di 133kDa. Il gene umano è
approssimativamente di 21kb ed è costruito da 26 esoni e 25 introni
ed è presente in singola copia nel genoma aploide. L’eNOS umana
ha un’omologia del 94% circa con la stessa proteina bovina e circa il
50% di omologia con la nNOS umana (Figura 7).
Figura 7 1: Zanchi A, Moczulski DK, Hanna LS, Wantman M, Warram JH, Krolewski AS.
Risk of advanced diabetic nephropathy in type 1 diabetes is associated with endothelial
nitric oxide synthase gene polymorphism. Kidney Int. 2000 Feb;57(2):405-13. PubMed
PMID: 10652017.
26
La caratterizzazione della regione che affianca il 5’ indica che il
promotore della eNOS è “TATA-less” ed esibisce elementi del
promotore prossimale Sp1 e GATA che sono coerenti con i geni
costitutivamente espressi delle cellule endoteliali. Inoltre questo
promotore contiene sequenze consenso per il legame di fattori di
trascrizione,come AP-1, AP-2, NF-1, metalli pesanti, il fattore
nucleare IL6, PEA3, così come gli elementi cis CACCC-, CCAAT-,
elementi per la risposta dell’INF-γ, elementi regolatori degli
steroli,elementi di risposta cAMP. E’ stata dimostrata una rilevanza
funzionale solo per alcuni di questi potenziali siti di legame. Saggi di
mutagenesi sito-diretta hanno identificato motivi di sequenza
funzionali per un sito GATA a -230 e il sito Sp1 a -103 che
contribuiscono alla trascrizione basale del core del promotore della
eNOS (55).
La delezione di un frammento (posizionato da -1548 a + 240) che
contiene due siti di legame per Sp1 nel 5’-UTR del cDNA porta ad
una quasi totale perdita di attività del promotore, sug-gerendo che il
fattore di trascrizione Sp1 è importante per la trascrizione del gene
dell’eNOS non solo nell’uomo, ma anche nei bovini (56).
Sono stati descritti tre tipi di polimorfismo del gene eNOS (Figura 7):
27
 il polimorfismo G894T, in cui l’acido glutammico è sostituito al
codone 298 con l’acido aspartico, nell’esone 7 (57);
 il polimorfismo T-786C, una mutazione puntiforme di una
timina (T) in una citosina (C) all’altezza del nucleotide -786
nella regione che affianca il 5’ (58) è associato con una ridotta
attività del promotore, la soppressione della trascrizione del
gene eNOS e una diminuita produzione di NO;
 un numero variabile di ripetizioni in tandem, note come
polimorfismo 4a/4b, all’interno dell’introne 4 (59).
Il numero variabile di ripetizioni in tandem nell’introne 4 è importante
per la produzione di più del 25% di NO plasmatico. In aggiunta ai
controlli trascrizionali e post-trascrizionali dei geni NOS, esiste
anche una significativa regolazione post-traduzionale. Tutte e tre le
isoforme
della
NOS
condividono
delle
caratteristiche
nella
modificazione post-traduzionale. Meccanismi di controllo posttraduzionale
comprendono
la
stabilità
delle
proteine
NOS,
dimerizzazione, fosforilazione, localizzazione subcellulare, legame
con i cofattori e disponibilità dei substrati (L-arginina e ossigeno
molecolare) (50).
NO ricopre inoltre un’importante ruolo nella riproduzione maschile e
femminile [Rosselli et al., 1998]. In particolare, la eNOS è
28
fortemente
espressa
nei
miofibroblasti
della
lamina
propria
peritubulare e nelle cellule dell’endotelio e della muscolatura liscia
dei grandi vasi sanguigni dei testicoli (60). Le cellule del Sertoli
hanno evidenziato un debole immunostaining per la eNOS; pertanto
le cellule peritubulari, le cellule del Sertoli e quelle dei vasi sanguigni
del testicolo sembrano essere i siti di produzione e di attività di NO
(61).
29
SCOPO DELLA TESI
L’obiettivo della tesi è stato quello di analizzare i polimorfismi
genetici a carico dei geni del Recettore degli Androgeni (AR) e
dell’Ossido Nitrico Sintetasi (eNOS), per individuare un loro
eventuale ruolo in ambito andrologico.
1. La prima applicazione riguarda uno studio retrospettivo
eseguito su soggetti affetti da ipogonadismo ad insorgenza
tardiva, in cui è stato caratterizzato il polimorfismo del gene
della ossido nitrico sintasi Glu298Asp allo scopo di studiarne
l’effetto sul rischio di insorgenza di diabete mellito di tipo 2.
2. Data l'inconsistenza dei dati in letteratura, nella seconda
applicazione, sono stati caratterizzati gli SNPs CAG del gene
recettore degli androgeni e Glu298Asp del gene eNOS su un
gruppo di soggetti affetti da infertilità di tipo idiopatico e su un
gruppo di controllo, allo scopo di valutare gli effetti di essi sui
parametri seminali, considerando i due polimorfismi sia
singolarmente che in combinazione, per valutare il possibile
effetto sinergico delle due varianti genetiche sui parametri
seminali.
30
Studio 1
Disegno dello studio
Sono
stati
valutati
retrospettivamente
i
pazienti
affetti
da
ipogonadismo ad insorgenza tardiva (n=110) afferenti presso il
nostro centro di Andrologia nel periodo tra il 2010 e 2013. Sono stati
adottati i seguenti criteri di inclusione:
i.
Diagnosi di ipogonadismo ad insorgenza tardiva, basata sui
ridotti valori di testosterone sierico (testosterone totale <2.31
ng/ml) e sui sintomi comuni dell’ipogonadismo (62);
ii.
Ipogonadismo
non
diagnosticato
e
non
trattato
precedentemente.
Criteri di esclusione:
i.
Presenza di altre tipologie di ipogonadismo o di resistenza
ormonale periferica;
ii.
Evidenze di Diabete Mellito di tipo I.
Lo studio è stato condotto in accordo con i principi della
Dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti allo studio hanno fornito
il proprio consenso informato.
31
Studio 2
Disegno dello studio
Sono stati studiati i soggetti oligoastenozoospermici (n=34) e
normozoospermici (n=43), afferenti presso il nostro centro di
Andrologia. Sono stati reclutati soggetti oligoastenozoospermici con
cariotipo normale, escludendo quelli con microdelezioni a carico del
cromosoma Y. Sono inoltre stati esclusi dallo studio i soggetti che
presentavano
le
seguenti
patologie:
ipogonadismo,
iperprolattinemia, malattie croniche, varicocele, testicolo retrattile,
infezioni a carico delle ghiandole accessorie, orchiti traumi genetilali,
consumo di droghe o trattamento ormonale concomitante.
32
MATERIALI E METODI
Determinazione dei parametri biochimici ed ormonali
Sono stati considerati i seguenti parametri biochimici ed ormonali:
ormone follicolo-stimolante (FSH), ormone luteinizzante (LH),
testosterone totale, glicemia ed emoglobina glicata (HbA1c). I valori
di riferimento per i parametri biochimici sono stati i seguenti:
o glucosio plasmatico, 70–99 mg/dl;
o Hba1c, <6.0%;
o FSH, 1.7–6.9 IU/l;
o LH, 1.6– 10.0 IU/l ;
o Testosterone totale, 3–8.5 ng/ml.
Estrazione del DNA
L'estrazione di DNA genomico da sangue è stata effettuata
attraverso la tecnica della lisi osmotica delle cellule, basata sulla
sedimentazione
frazionata
dei
componenti
mediante
centrifugazione. Il primo passaggio permette la rottura della
membrana cellulare per shock osmotico; di seguito è stato eliminato
il sovranatante, conservando solo gli acidi nucleici che restano sul
fondo della provetta nel pellet. Quest'ultimo è stato trattato con
proteinasi K e sodio dodecil solfato (SDS) per consentire la lisi della
33
membrana nucleare, l’inattivazione delle proteine e la liberazione
degli acidi nucleici. Il DNA è stato precipitato con isopropanolo,
lavato con etanolo e infine risospeso in TE (Tris 0,01M; EDTA
0,001M). In questo lavoro si è proceduto estraendo il DNA genomico
da 2 ml di sangue conservato a –20°C. Il sangue è stato scongelato
a temperatura ambiente fino a totale liquefazione per eliminare
eventuali coaguli. Ad ogni campione sono stati aggiunti 25 ml di
Buffer di lisi (sucrosio 0,6M, Triton X-100 1%, MgCl2 0,01M e TrisHCl 0,01M pH 7,5) per permettere la lisi cellulare. Dopo aver
mescolato per inversione, i campioni sono stati lasciati in ghiaccio
per 15 minuti e centrifugati a 3200 rpm per 20 minuti a 4°C per far
precipitare gli elementi figurati del sangue.
Eliminato il sovranatante, al pellet sono stati aggiunti 10 ml di Buffer
(EDTA 0,002 M pH 8, NaCl 0,08 M) ed i campioni sono stati
centrifugati a 3200 rpm per 20 minuti a 4°C. Quest’ultimo lavaggio
con il buffer è stato ripetuto per due volte consecutive.
Di seguito sono stati aggiunti al pellet 3 ml di Buffer A (EDTA
0,002M pH 8, Tris-HCl 0,02M pH 8), 50 µl di SDS 20% e 250 µl di
proteinasi K 1 mg/ml. Quest’ultima soluzione è stata infine incubata
per 1 ora in un bagno termostatato a 65°C.
34
In seguito ad incubazione, sono stati aggiunti 0,500 ml di NaCl 5,5
M e si é risospeso il tutto con il vortex. I campioni sono stati quindi
centrifugati a 2700 rpm per 15 minuti a temperatura ambiente e al
sovranatante recuperato è stato aggiunto un pari volume di
isopropanolo. Il campione è stato centrifugato per 10 minuti a 3200
rpm e il DNA recuperato è stato lavato con etanolo al 70%. Dopo
un’ultima centrifuga di 10 minuti a 3200 rpm il DNA è stato risospeso
in una soluzione di Tris-EDTA (Tris 0,01 M, EDTA 0,001 M) e
conservato a 4°C.
PCR e sequencing
L’analisi di entrambi I polimorfismi a carico dei geni AR ed ENOS è
stata eseguita utilizzando la tecnica della PCR, utilizzando coppie di
primers oppurtune per amplificare il frammento di circa 248 bp
comprendente la variante G894T di eNOS ed il frammento di circa
500 bp contenente il polimorfismo CAG del gene AR. La seguente
miscela di reazione è stata ottimizzata per l’amplificazione di 50 ng
di DNA genomico a doppio filamento:
o 2,5 mM ogni dNTP (deossiribonucleotidi) (Invitrogens);
o 10 pmol per ogni oligonucleotide senso e antisenso (Sigma
Co, St Louis, Mo., U-SA);
35
o 2 U/µL di DNA polimerasi DNA-dipendente (Phusion Hot Start,
FINNZYMES);
o MgCl2 7.5 mM;
o buffer di reazione (Tris-HCl 20 mM pH 7.4 a 25°C, EDTA 0.1
mM, DTT 1 mM, KCl 100 mM, stabilizers, BSA 200 µg/ml e
glicerolo)
Per ogni reazione di amplificazione sono state ottimizzate le
condizioni di temperatura ed il numero di cicli utilizzando il Thermal
Cycler 2700 (Applied Biosystem, Norwoalk, Conn., USA). La
reazione di PCR, medisima per entrambi i polimorfismi, consisteva
in una denaturazione a 98°C per 10 secondi, annealing a 68°C per
15 secondi ed un’estensione a 72°C per un totale di 35 cicli. Ogni
reazione di PCR inizia con una denaturazione a 98°C per 1 minuto e
termina con una estensione a 72°C per 7 minuti. Sono stati
impiegati per il polimorfismo CAG i primers A0 (5’-GTG GTT GCT
CCC GCA AGT TTC C-3’) ed A2 (5’-GCT GTG AAG GTT GCT GTT
CCT C-3’) (21). Per il polimorfismo del gene eNOS sono stati invece
impiegati i primers precedentemente descritti (63).
La reazione di sequenza dei prodotti di PCR è stata eseguita
utilizzando il kit BigDye e quindi le sequenze ottenute sono state
36
lette attraverso il sequenziatore automatico CEQ 2000 XL (Beckman
Coulter, Fullerton, CA, USA).
Analisi del liquido seminale
L’inclusione nei gruppi oligoastenozoospermici e normozoospermici
è stata basata sui criteri della World Health Organization (WHO)
(64). I campioni di liquido seminale sono stati ottenuti per
masturbazione dopo tre giorni di astinenza, raccolti in contenitori
sterili ed analizzati secondo le linee guida del manuale WHO 2010
(64).
Nell’analisi
sono
state
considerate
la
concentrazione
nemaspermica (valore di riferimento > 15x106 milioni/mL) e la
motilità progressiva nemaspermica (valore di riferimento, > 32 %)
(64). Due complete analisi seminali sono state eseguite per i
campioni oggetto del nostro studio per accertare le caratteristiche di
motilità e parametri cinetici degli spermatozoi, nonché la loro
concentrazione. Brevemente, 3µl di liquido seminale sono stato
caricati in una camera di conta 20-mm cell VU chamber (Conception
Technologies, La Jolla, California). Sono stati caricati due lati della
camera di conta (A e B) per ogni campione e almeno 300
spermatozoi sono stati contati fino a 6 differenti campi visivi per lato
di camera. La motilità spermatica è stata valutata mediante il
sistema C.A.S.A system (Computer-Assisted Semen Analysis).
37
Analisi statistica
Sono stati considerati significativi i valori di P < 0.05. Sono stati
utilizzati i seguenti strumenti statistici (SPSS 16.0):
o Per verificare la distribuzione normale delle variabili continue è
stato utilizzato il test Shapiro–Wilk’s test;
o Le variabili categoriche sono state riportate come frequenze;
o La comparazione fra i tre gruppi per variabili continue è stata
eseguita con metodo ANOVA, seguita dal test di Fisher;
o Le variabili non distribuite normalmente sono state analizzate
con il metodo Kruskal–Wallis test seguito dal Mann– Whitney’s
U-test;
o La prevalenza di diabete mellito è stata comparata fra i tre
gruppi di varianti geniche utilizzando il v2-test;
o Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per comparare le
frequenze fra gruppi;
o La correzione della significatività p è stata eseguita utilizzando
il metodo Bonferroni–Holm (65).
o L’associazione tra le varianti del gene eNOS con il diabete
mellito è stata valuta utilizzando la regressione logistica,
correggendo per i valori di età, indice di massa corporea (BMI)
e testosterone totale.
38
RISULTATI
Studio 1
La tabella 1 mostra i parametri generali, ormonali e genetici dei
soggetti studiati. Nei pazienti affetti da ipogonadismo ad insorgenza
tardiva, sono stati individuati 8 soggetti in sovrappeso (7,2%) [BMI ≥
25 e <30 Kg / m2] e 25 soggetti obesi (22,7%) (BMI ≥ 30 kg / m2).
La prevalenza di diabete mellito di tipo 2 è stata del 40% (Tabella 1).
Il genotipo eNOSGG è stato individuato in 32 soggetti, eNOSGT in
46 ed eNOSTT in 32 (Tabella 1).
Eta’ (yr)
60 ± 4.12
BMI (kg/m2)
23.8 (22.1-28.6)
FSH (IU/L)
3.3 (3.2-4.92)
LH (IU/L)
5.1 (3.3-5.9)
Testosterone Totale
2.02 ± 0.33
(ng/ml)
Glicemia (mg/dl)
96.1 (85-156.3)
HbA1c (%)
5.28 (4.48-8.23)
DM (si/no)
44/66
eNOSGG/eNOSGT/eNOSTT
32/46/32
Tabella 1 Profilo ormonale, glicemico e genetico della popolazione studiata. I dati sono
espressi come media ± dev. Standard. BMI, body mass index; FSH, follicle-stimulating
hormone; LH, luteinis-ing hormone; HbA1c, glycated haemoglobin; DM, diabetes
mellitus; eNOS, endothelial nitric oxide synthase.
39
Dopo aver suddiviso il campione in base alle suddette varianti
genetiche, non è stata riscontrata alcuna differenza evidente per i
valori di età, BMI e testosterone totale (Figura 8).
Figura 8 Risultati ottenuti per i valori di età, testosterone totale e BMI, in base alle varianti geniche
GG, GT, TT del gene eNOS. Dati analizzati con il test del chi-quadro.
Al contrario, i valori di glicemia, HbA1c e la prevalenza di DM sono
risultati significativamente più alti nei pazienti portatori del genotipo
eNOSTT rispetto a quelli portatori di eNOSGT ed eNOSGG.
40
Figura 9 Risultati ottenuti per i valori di HbA1C(%), prevalenza di diabete mellito (si/no) e glicemia,
in base alle varianti geniche GG, GT, TT del gene eNOS. Dati analizzati con il test del chi-quadro. *
P < 0.05
L'analisi di regressione logistica ha inoltre mostrato che, in seguito
alla correzione dei dati per i valori di età, indice di massa corporea e
testosterone totale, il genotipo eNOSTT è stato positivamente e
significativamente associato alla presenza di DM (tabella 2), al
contrario è risultata una correlazione negativa e statisticamente
significativa tra il genotipo eNOSGG e la presenza di DM. Inoltre,
nessuna associazione significativa è stata riscontrata tra il genotipo
eNOSGT e DM (tabella 2). Infine, il testosterone totale è risultato
negativamente e significativamente associato con DM e, al
41
contrario, l'età e il BMI non hanno alcuna influenza su questa
condizione (Tabella 2)
VARIABILE
BETA
SIGNIFICATIVITA’
ENOSTT
2.013
< 0.001
ENOSGG
-1.190
0.052
ENOSGT
0.629
0.428
TESTOSTERONE
-0.377
0.012
ETA’
1.254
0.263
BMI
0.310
0.578
TOTALE
Tabella 2 Risultati della regressione logistica.
42
Studio 2
Le caratteristiche generali, ormonali e seminali della popolazione in
esame sono riportati nella Tabella 3.
Soggetti
Soggetti
p
astenospermici normozoospermici
(n=34)
(n=43)
Età
32 (19-48)
37 (20-45)
NS
FSH (mIU/ml)
3.3 (1.8-6.8)
3.2 (2.2-6.7)
NS
LH (mIU/ml)
5.1 (1.7-9.7)
4.5 (1.8-9.7)
NS
T (mIU/ml)
5.5 (3.3-8.3)
4.6 (3.2-8.4)
NS
21.5 (15.7-80)
<
Concentrazione 8.4 (2-14.4)
nemaspermica
0.001
(×106
spermatozoi/ml)
Motilità
20.5 (5-31)
38 (33-55)
nemaspermica
<
0.001
(%)
Tabella 3 Caratteristiche generali, ormonali e seminali delle popolazione studiata. I valori
sono espressi come mediana (range totale); NS, non-significant; LH, luteinizing
hormone; FSH, follicle-stimulating hormone; T, testosterone.
Il valore mediano della lunghezza del tratto CAG (CAG=22) è stato
adottato come valore di cut-off, al fine di suddividere l'intero
campione in due gruppi, composti da soggetti portatori di un tratto
più corto (CAG <22) o più lungo CAG > 22) di ripetizioni. Le
43
frequenze genotipiche dei polimorfismi eNOS (Glu298Asp), vale a
dire GG, GT e TT, erano in equilibrio Hardy-Weinberg, sia nel
campione
totale
che
nei
soggetti
oligoastenozoospermici
e
normozoospermici considerati separatamente.
Dai risultati ottenuti dal confronto della frequenza delle ripetizioni, è
stata
riscontrata
una
differenza
significativa
tra
i
soggetti
oligoastenozoospermici e normozoospermici nella frequenza delle
ripetizioni più corte CAG [8 su 43 (18,6%) vs 21 su 34 (61,7%)
rispettivamente, p <0.001]. Entrambi i gruppi (CAG < 22 e CAG >
22) non mostravano una correlazione per i valori dei parametri
seminali.
I soggetti portatori dei genotipi eNOSGG, eNOSGT e eNOSTT,
sono stati rispettivamente 16 (47%), 11 (32,4%), 7 (20,6%) tra i
soggetti oligoastenozoospermici e 16 (37,2%), 19 (44,2%), 8
(18,6%) tra i soggetti di controllo. Non sono state osservate
differenze tra le frequenze dei genotipi eNOS tra i due gruppi.
Inoltre, considerando l'intero campione (n=77) non è stata
riscontrata alcuna differenza significativa tra le tre varianti del gene
eNOS ed i parametri nemaspermici (Tabella 4).
44
Tratto
Concentrazione
CAG Tratto
CAG p
corto (n=29)
lungo (n=48)
10.7 (2-80)
18.6 (3.4-42.6)
NS
29 (5-55)
33 (7-51)
NS
nemaspermica
(×106
spermatozoi/ml)
Motilità
nemaspermica
(%)
Concentrazione
eNOSGG
eNOSGT
eNOSTT
(n=32)
(n=30)
(n=15)
15 (3.4-50)
17
nemaspermica
80)
p
(7.1- 16.7 (2- NS
31.3)
(×106
spermatozoi/ml)
Motilità
nemaspermica
32 (7-54)
33
55)
(15- 33
(5- NS
46)
(%)
Tabella 4 Associazione dei polimorfismi dei geni AR ed ENOS con i parametri
nemaspermici. I valori sono espressi come mediana (range totale); NS, non-significant;
AR, androgen receptor; eNOS, endothelial nitric oxide synthase.
Valutando la combinazione dei due polimorfismi del gene AR e di
eNOS, si riporta di seguito (Tabella 5) il profilo seminale all'interno
dei sei gruppi, derivanti da tutte le possibili combinazioni dei sei
45
possibili genotipi fra AR-CAG e le varianti del gene eNOS. Una
diminuzione
dei
valori
di
motilità
e
della
concentrazione
nemaspermica è risultata dal gruppo 1 (G1) al gruppo 6 (G6) (Figura
10).
Figura 10 Concentrazione (panel A) e motilità (panel B) nemaspermica nei sei gruppi di
genotipi derivanti dalle possibili combinazioni tra AR (ripetizioni CAG) ed eNOS (variante
Glu298Asp).
Tuttavia, si è evidenziata solamente nel gruppo 6 una differenza
statisticamente significativa nei valori nemaspermici rispetto agli altri
cinque gruppi (Tabella 5).
46
G1
G2
G3
G4
G5
G6
(n=20) (n=20) (n=8)
(n=12) (n=10) (n=7)
Sperm
15*
19.9*
18.8*
18*
concentration
(3.4-
(7.1-
(×106
29.9)
Progressive
sperm motility
9.9*
3.8
(16.7- (10.7-
(7.1-
(2-
42.6)
31.3)
50)
80)
5.6)
30.5*
35*
35*
33*
26*
9
(7-44)
(15-
(33-
(29-
(16-
(5-
51)
46)
54)
55)
13)
spermatozoa/ml)
(%)
Tabella 5 parametri nemaspermici nei sei gruppi di genotipi derivanti dalle possibili
combinazioni tra AR (ripetizioni CAG) ed eNOS (variante Glu298Asp). I valori sono
espressi come mediana (range totale) AR, androgen receptor; eNOS, endothelial nitric
oxide synthase. Comparazione statistica fra I sei gruppi: *p < 0.001 vs G6; Valori non
significativi se non specificato. Legenda combinazioni genotipi: G1, CAGlungo/eNOSGG;
G2,
CAGlungo/eNOSGT;
G3,
CAGlungo/eNOSTT;
G4,
CAGcorto/eNOSGG;
G5,
CAGcorto/eNOSGT; G6, CAGcorto/eNOSTT.
47
DISCUSSIONE
Gli androgeni svolgono un ruolo fondamentale nella spermatogenesi
regolando il completamento della meiosi e la transizione da
spermatociti a spermatidi. Tale processo è possibile grazie
all’azione del Recettore degli Androgeni (AR), il quale agisce come
un
fattore
di
trascrizione
ligando-dipendente
che
media
l’espressione dei geni bersaglio in risposta a specifici ligandi. Infatti,
l'inibizione del testosterone o il knock-out di AR nelle cellule del
Sertoli è associato con una compromissione della integrità della
barriera emato-testicolare, con conseguente esposizione delle
cellule germinali a fattori autoimmuni e citotossici, ad arresto della
spermatogenesi ed a fagocitosi delle cellule germinali da parte delle
cellule del Sertoli. Inoltre, AR localizza nel tessuto epididimale,
contribuendo alla maturazione degli spermatozoi e co-localizza con i
mitocondri nella regione intermedia degli spermatozoi, suggerendo
che l'interazione androgeni-recettore a livello mitocondriale potrebbe
incidere direttamente sulla loro motilità (66). L'attività trascrizionale
di AR può variare a seconda della lunghezza del tratto di
poliglutammine, il quale è codificato da una serie di ripetizioni della
sequenza CAG all’interno dell’esone 1 del gene AR stesso (67). Il
48
numero di ripetizioni CAG si estende da un minimo di 10 ad un
massimo di 35 in individui normali, con una lunghezza media di 2122 ripetizioni nella popolazione caucasica (21, 68). Tratti di
poliglutammine più lunghi risultano in una diminuzione dell’attività
trascrizionale in vitro dell’AR (69), determinando modificazioni di
legame tra il recettore ed i propri co-attivatori, fattori di trascrizione e
co-repressori. Ad esempio, un'espansione del tratto CAG da 25 a 49
ripetizioni potrebbe risultare in una conformazione anomala della
regione N-terminale del recettore, in seguito alla riduzione delle
interazioni tra AR e la proteina ARA-24 (AR-associated protein 24)
(43, 70, 71).
La NOS-3 (eNOS) è un'enzima presente nelle cellule endoteliali,
piastrine e cellule muscolari lisce, identificata come la sorgente della
sintesi basale e continua di ossido nitrico (NO), necessaria per
mantenere il tono vascolare di riposo. La produzione di NO avviene
a partire dall’aminoacido L-arginina, convertito in L-citrullina
dall’enzima eNOS (72). L’ossido nitrico rappresenta un importante
messaggero
in
vasodilatazione,
numerosi
l’inibizione
processi
biologici,
dell’attivazione
e
tra
cui
la
aggregazione
piastrinica, l’inibizione dell’espressione delle molecole di adesione,
l’inibizione della proliferazione delle cellule muscolari lisce, la
49
riduzione dell’ossidazione del colesterolo LDL, l’aumento della
sensibilità all’insulina. Inoltre, recentemente è stato evidenziato un
ruolo
importante
di
NO
capacitazione
e
reazione
concentrazioni
di
NO
nella
motilità
acrosomiale
possono
provocare
degli
spermatozoi,
(73).
Infatti,
stress
alte
ossidativo
inducendo danni agli spermatozoi stessi, a causa del legame di
questo mediatore con lo ione superossido e conseguente
iperproduzione di perossinitrito, che reagisce rapidamente con
proteine, lipidi e acidi nucleici, modificando la membrana plasmatica
(63). eNOS è costitutivamente espressa nel sistema vascolare
endoteliale del muscolo scheletrico, tessuto adiposo, pancreas,
cuore e fegato, e costituisce il percorso attraverso il quale l'insulina
esercita la sua azione vasodilatatrice periferica (74). NO consente,
attraverso il suo effetto vasodilatatore, l’assorbimento del glucosio
insulino-mediato da parte del muscolo, durante il lavoro muscolare
(74). La ridotta biodisponibilità di NO causa vasocostrizione,
trombosi, infiammazione e ipertrofia vascolare, fattori che insieme
portano alla disfunzione endoteliale (75). Tale condizione è presente
in numerose patologie come ad esempio l’ipercolesterolemia,
l’ipertensione (76), il diabete mellito (77). Nel diabete mellito, la
mancata attivazione della eNOS a causa dell’inibizione della via
50
della PI3 chinasi/Akt, normalmente attivata dall’insulina, causa
l’insulino-resistenza (72). La ridotta vasodilatazione con minore
perfusione
tissutale
comporta
dunque
una
riduzione
del
reclutamento di cellule in grado di metabolizzare il glucosio (unità
metaboliche) con conseguente minore estrazione di glucosio
(insulino-resistenza). Il polimorfismo 894 G/T consiste in una
sostituzione di glutammato con aspartato rispettivamente, in
posizione 298 nella proteina eNOS ed è correlato con varie
condizioni patologiche. In particolare, secondo i risultati di Noiri e
colleghi, gli effetti funzionali del polimorfismo Glu298Asp del gene
eNOS potrebbero tradursi in una minore produzione di NO, con
conseguente aumento della vasocostrizione, adesione dei leucociti,
aggregazione piastrinica e proliferazione cellulare (78).
Dai nostri risultati è stato osservata per la prima volta una
correlazione positiva e significativa tra il genotipo eNOS TT e la
presenza del diabete mellito, indipendentemente dai livelli di T, età e
grado di obesità (Tabella 2 e 3). Al contrario il genotipo eNOS GG
sembra avere un effetto protettivo nei confronti del diabete mellito,
mentre il genotipo eterozigote GT non ha mostrato alcuna
associazione. Sebbene i meccanismi alla base non siano chiari, la
compromissione della secrezione di NO potrebbe essere provocata
51
dalla sostituzione della guanina in timina nell' esone 7 del gene
eNOS, causando la sostituzione del glutammato con aspartato e
determinando quindi una modificazione dell'alfa elica della proteina,
con
un
conseguente
aumento
della
sua
suscettibilità
al
degradazione (79).
Inoltre, come evidenziato nello studio 2, considerando i possibili
genotipi derivanti dalle due varianti polimorfiche dei geni studiati, la
presenza simultanea di un tratto più breve di AR CAG e della
variante eNOS TT darebbe origine ad un profilo nemaspermico
nettamente peggiorato rispetto alle altre combinazioni (Tabella 3),
mostrando un effetto sinergico fra i due geni. Una certa tendenza
alla progressiva diminuzione dei valori medi dei parametri
spermatici, anche se non statisticamente significativo tra tutti i
gruppi, è risultato evidente dal gruppo 1 (tratto lungo AR e selvaggio
tipo eNOSGG) al gruppo 6 (breve AR CAG repeat polimorfismo e
eNOSTT) (Figura 1).
Le ripetizioni di poliglutammine CAG possono modulare le
interazioni proteina-proteina e la lunghezza di tali ripetizioni (20, 69)
in AR possono compromettere la forza delle interazioni recettoreproteina. E’ perciò plausibile che il numero delle ripetizioni di CAG
possano compromettere il signaling androgenico e l’androgenicità
52
dei livelli endogeni degli androgeni agendo sulla stabilità proteica
oppure attraverso gli mRNA di AR.
A supporto dei nostri risultati, recenti studi hanno evidenziato
un'associazione tra il polimorfismo del gene eNOS, la presenza di
diabete di tipo 2 e la disfunzione erettile, causata probabilmente
dalla down-regulation di NO nel tessuto erettile, impedendo la
tumescenza del pene (79-81). Si è inoltre riscontrata una
correlazione tra i polimorfismi del gene eNOS con la motilità
nemaspermica, in particolar modo per i soggetti portatori del
genotimo mutato omozigote TT. Infatti nei soggetti in esame è stata
riscontrata
una
maggiore
compromissione
della
motilità
nemaspermica nei confronti dei soggetti portatori del genotipo wildtype (GG) ed una maggiore associazione ad infertilità di tipo
idiopatico, con maggiore frequenza in pazienti con azoospermia (63,
82).
In conclusione, i nostri dati suggeriscono che il polimorfismo
Glu298Asp del gene eNOS rappresenta un fattore di rischio per
l’insorgenza del diabete di tipo 2 associato ad ipogonadismo ad
insorgenza tardiva e la possibile esistenza di un effetto sinergico tra
la variante genetica del gene AR e del gene eNOS sui parametri
spermatici.
53
Alla luce delle potenziali implicazioni diagnostiche, è necessario che
i nostri risultati siano validati da ulteriori studi per meglio
comprendere le basi genetiche ed il ruolo dei geni studiati
nell’ipogonadismo ad insorgenza tardiva e nell’infertità di tipo
idiopatico.
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