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Università degli Studi di Milano Dipartimento di Bioscienze e Istituto Nazionale di Genetica Molecolare Malattie genetiche da espansione di triplette Chiara Zuccato Milano, 5 novembre 2015 ! Outline La loro origine Classificazione Tre esempi: X fragile, Distrofia Miotonica, Malattia di Huntington Strategie terapeutiche Malattie da triplette Caratterizzate da un aumento eccessivo di ripetizioni di triplette nucleotidiche (CAG, CCG, CGG, GAA , CTG) in geni a funzione nota od ignota Causano in genere disordini neurologici (malattie neurologiche, neurodegenerative e neuromuscolari) Tendenza al rapporto lineare fra numero di numero di ripetizioni e gravità del quadro clinico Spesso associate al fenomeno dell’anticipazione genetica (= esordio più precoce da una generazione alla successiva e aggravamento dei sintomi) spiegato con la “genetica dinamica” Espansione di triplette in regioni non codificanti !Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Norm Patol cliniche Da perdita di funzione X fragile X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 >200 ritardo mentale alterazoni del comportamento FRAXE X-linked CCG AFF2 X 5'UTR 4-39 200-900 ritardo mentale autos. dominant. GAA Frataxin 9 Intron 6-32 200-1700 disturbi equilibrio, coordinazione, deambulazione, cardiopatia, diabete Atassia di Friedreich Da tossicità da RNA Distrofia miotonica tipo 1 autos. dominant. CTG DMPK 19 3’UTR 5-37 50-10.000 perdita di massa muscolare, miotonia, cataratta, difetti cardiaci, alterazioni endocrine, deficit cognitivi Distrofia miotonica tipo 2 autos. dominant. CCTG ZNF9 3 3’UTR 10-26 75-11.000 rigidità muscolare, miotonia, cardiomiopatia, cataratta, compromissione sistema endocrino, problemi respiratori X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 60-200 (pre-mut) atassia, tremore, parkinsonismo, demenza FXTAS Ipotesi sulla loro origine Il fenomeno dell’instabilità La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la formazione di strutture a forcina, assenti quando il numero di ripetizioni è nel range di normalità̀ Queste strutture causano problemi sia nei processi di replicazione (slippage della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA La conseguenza ultima è la tendenza all’incremento numerico delle ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!). Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni, ma per la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite Il fenomeno dell’instabilità Instabilità mitotica: presenza di espansioni di grandezze differenti all’interno dello stesso tessuto e tra tessuti diversi (mosaicismo tissutale) Instabilità meiotica: trasmissione alle generazioni successive di una espansione di diversa ampiezza. E’ alla base del meccanismo dell’anticipazione genetica. Slippage McMurray, 2011 Slippage McMurray, 2011 Slippage McMurray, 2011 Slippage McMurray, 2011 Classificazione Malattie da triplette Da espansione di triplette in regioni non codificanti La mutazione causa perdita di funzione o determina la produzione di un RNA tossico. Da espansione di triplette in regioni codificanti La mutazione porta ad una proteina mutata con guadagno di funzione tossica e/o perdita di funzionalità. Espansione di triplette in regioni non codificanti !Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Norm Patol cliniche Da perdita di funzione X fragile X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 >200 ritardo mentale alterazoni del comportamento FRAXE X-linked CCG AFF2 X 5'UTR 4-39 200-900 ritardo mentale autos. dominant. GAA Frataxin 9 Intron 6-32 200-1700 disturbi equilibrio, coordinazione, deambulazione, cardiopatia, diabete Atassia di Friedreich Da tossicità da RNA Distrofia miotonica tipo 1 autos. dominant. CTG DMPK 19 3’UTR 5-37 50-10.000 perdita di massa muscolare, miotonia, cataratta, difetti cardiaci, alterazioni endocrine, deficit cognitivi Distrofia miotonica tipo 2 autos. dominant. CCTG ZNF9 3 3’UTR 10-26 75-11.000 rigidità muscolare, miotonia, cardiomiopatia, cataratta, compromissione sistema endocrino, problemi respiratori X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 60-200 (pre-mut) atassia, tremore, parkinsonismo, demenza FXTAS Espansione di triplette in regioni codificanti ! Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Norm Patol cliniche Da acquisto di funzione tossica e/o perdita di funzione HD (Huntington) Autos. Dom. CAG IT15 4 coding 11-34 40-121 disturbi emotivi, cognitivi, alter. movimento SBMA (Kennedy’s) X-linked CAG Androgen receptor X coding 9-36 38-62 atrofia, disartria, disfonia, anomalie mov. DRPLA Autos. Dom. CAG Atrophin-1 12 coding 7-34 49-88 atassia, demenza SCA1 Autos. Dom. CAG Ataxin-1 6 coding 6-39 40-82 SCA2 Autos. Dom. CAG Ataxin-2 12 coding 15-24 32-200 SCA3 Autos. Dom. CAG Ataxin-3 14 coding 13-36 61-84 SCA6 Autos. Dom. CAG CACNA1A 19 coding 4-20 20-29 SCA7 Autos. Dom. CAG Ataxin-7 3 coding 4-35 37-306 SCA17 Autos. Dom. CAG TBP 6 coding 25-42 47-63 incoordinazione motoria, disturbi dell’equilibrio e del cammino, anomalie dei movimenti oculari, disartria, alterazioni della forza e del tono muscolare Malattie da espansioni di alanina Espansione di triplette (GCN) che codificano per l’aminoacido alanina normalmente in regioni codificanti (esoni) La maggior parte è autosomica dominante. Alcune hanno una trasmissione legata al cromosoma X Possono essere dovute sia ad un’acquisto di funzine tossica da parte della proteina mutata sia da parte di che ad una perdità di funzione della proteina normale Malattie da espansioni di alanina Primo esempio: X fragile Perdita di funzione Espansione di triplette in regioni non codificanti !Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Norm Patol cliniche Da perdita di funzione X fragile X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 >200 ritardo mentale alterazoni del comportamento FRAXE X-linked CCG AFF2 X 5'UTR 4-39 200-900 ritardo mentale autos. dominant. GAA Frataxin 9 Intron 6-32 200-1700 disturbi equilibrio, coordinazione, deambulazione, cardiopatia, diabete Atassia di Friedreich Da tossicità da RNA Distrofia miotonica tipo 1 autos. dominant. CTG DMPK 19 3’UTR 5-37 50-10.000 perdita di massa muscolare, miotonia, cataratta, difetti cardiaci, alterazioni endocrine, deficit cognitivi Distrofia miotonica tipo 2 autos. dominant. CCTG ZNF9 3 3’UTR 10-26 75-11.000 rigidità muscolare, miotonia, cardiomiopatia, cataratta, compromissione sistema endocrino, problemi respiratori X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 60-200 (pre-mut) atassia, tremore, parkinsonismo, demenza FXTAS Sindrome dell’X fragile (Sindrome di Martin-Bell o FRAX) E’ la forma ereditaria più diffusa di ritardo mentale e seconda sindrome ereditaria per frequenza dopo la Sindrome di Down Malattia causata dalla mutazione del gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation-1) situato sul braccio lungo del cromosoma X Colpisce: 1 maschio su 4000 Portatori sani: 1 femmina su 6000 1 su 800 1 su 256 La mutazione del DNA modifica la struttura del cromosoma X Strozzatura in regione terminale (Xq27.3) dove è situato il gene FMR1 Sindrome dell’X fragile Sintomatologia Sviluppo mentale molto variabile, con capacità cognitive quasi normali oppure grave ritardo. Comportamenti simili all'autismo (iperattività, avversione al contatto fisico, comportamenti stereotipati) e da frequenti crisi epilettiche. Trattamento Attualmente non esiste alcun trattamento specifico Terapia riabilitativa motoria o psicopedagogica La mutazione del gene FMR1 Gene FMR1 metilazione citosine nel promotore blocco promotore mancata espressione gene FMR1 Costrizione e fragilità banda Xq27.3 Normale la tripletta CGG (esone 1 del gene FMR1) è ripetuta da 6 a 55 volte Portatori sani (premutazione) la tripletta CGG è ripetuta da 56 a 200 volte il gene FMR1 funziona ancora ! nessun sintomo Affetti (mutazione) la ripetizione della tripletta CGG supera le 200 copie Sindrome dell’X fragile La mutazione blocca la produzione della proteina FMRP (fragile X-mental retardation protein) Proteina implicata nello sviluppo delle connessioni neuronali del cervello Lega gli RNA (RNA-binding protein) Espressa soprattutto nei testicoli e nel cervello (i tessuti più colpiti) FMRP si associa a mRNA codificanti importanti proteine neuronali e ne regola aspetti essenziali: trasporto lungo i dendriti verso le sinapsi e traduzione in proteine. In assenza di FMRP, molti degli mRNA bersaglio sono deregolati, e maggiormente tradotti in proteine. Trasmissione (per via materna) portatrice sana La tendenza all’espansione si verifica maggiormente quando la premutazione è trasmessa per via materna. XY XX premutazione Durante la maturazione dell’ovulo la premutazione può espandersi e diventare mutazione completa. ! XY normale XX normale XY affetto XX liev. affetto Trasmissione (per via paterna) portatore sano Quando la premutazione è trasmessa dal padre rimane stabile. Le figlie femmine riceveranno la premutazione senza che avvengano variazioni nel numero delle XY triplette CGG. premutazione XX I figli maschi ricevono dal padre il cromosoma Y, pertanto non sono a rischio di ereditare la premutazione. XY XY XX XX premutazione premutazione normali portatrici sane Secondo esempio: distrofia miotonica Tossicità dell’RNA mutato Espansione di triplette in regioni non codificanti !Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Norm Patol cliniche Da perdita di funzione X fragile X-linked CGC FMR1 X 5’UTR 6-60 >200 ritardo mentale alterazoni del comportamento FRAXE X-linked CCG AFF2 X 5'UTR 4-39 200-900 ritardo mentale autos. dominant. GAA Frataxin 9 Intron 6-32 200-1700 disturbi equilibrio, coordinazione, deambulazione, cardiopatia, diabete Atassia di Friedreich Da tossicità da RNA Distrofia miotonica tipo 1 autos. dominant. CTG DMPK 19 3’UTR 5-37 50-10.000 perdita di massa muscolare, miotonia, cataratta, difetti cardiaci, alterazioni endocrine, deficit cognitivi Distrofia miotonica tipo 2 autos. dominant. CCTG ZNF9 3 3’UTR 10-26 75-11.000 rigidità muscolare, miotonia, cardiomiopatia, cataratta, compromissione sistema endocrino, problemi respiratori X-linked CGG FMR1 X 5’UTR 6-60 60-200 (pre-mut) atassia, tremore, parkinsonismo, demenza FXTAS Distrofia miotonica Genetica La mutazione è l’espansione della tripletta nucleotidica CTG presente nella regione non tradotta all’estremità 3’ del gene DMPK (DM proteina chinasi) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 19 (19q13.3). Si produce un RNA messaggero con tratto di triplette espanso che determina tossicità. Sequestra proteine necessarie per il processamento nucleare dell’RNA, sottraendole ad altri trascritti e inibendo così importanti funzioni cellulari. Anticipazione Aumento della lunghezza del tratto di triplette quando la trasmissione è materna piuttosto che paterna. Distrofia miotonica Espansione di triplette in regioni codificanti ! Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Norm Patol cliniche Da acquisto di funzione tossica e/o perdita di funzione HD (Huntington) Autos. Dom. CAG IT15 4 coding 11-34 40-121 disturbi emotivi, cognitivi, alter. movimento SBMA (Kennedy’s) X-linked CAG Androgen receptor X coding 9-36 38-62 atrofia, disartria, disfonia, anomalie mov. DRPLA Autos. Dom. CAG Atrophin-1 12 coding 7-34 49-88 atassia, demenza SCA1 Autos. Dom. CAG Ataxin-1 6 coding 6-39 40-82 SCA2 Autos. Dom. CAG Ataxin-2 12 coding 15-24 32-200 SCA3 Autos. Dom. CAG Ataxin-3 14 coding 13-36 61-84 SCA6 Autos. Dom. CAG CACNA1A 19 coding 4-20 20-29 SCA7 Autos. Dom. CAG Ataxin-7 3 coding 4-35 37-306 SCA17 Autos. Dom. CAG TBP 6 coding 25-42 47-63 incoordinazione motoria, disturbi dell’equilibrio e del cammino, anomalie dei movimenti oculari, disartria, alterazioni della forza e del tono muscolare Nucleo caudato, putamen, globo pallido, corteccia Cervelletto, globo pallido, putamen, nucleo caudato, talamo, nucleo subtalamico, sostanza nera Globo pallido, cervelletto, ponte, sostanza nera, corna anteriori del midollo Cervelletto, nucleo olivare inferiore (midollo allongato), ponte, corna anteriori del midollo, via piramidale Motoneuroni, gangli dorsali, muscolo scheletrico Ross C.A. (1995) Neuron 15:493-496 Meccanismi di patologia comuni Gli aggregati Il sovraccarico del proteosoma Il proteosoma non è in grado di degradare in modo efficiente le proteine con tratti polyQ espansi che quindi si accumulano ed aggregano Aggregati tossici o fenomeno protettivo? Tossici: gli aggregati reclutano proteine sottraendole ai loro pathways fisiologici nella cellula. Protettivi: le proteine mutate e/o i loro frammenti in forma solubile (non aggregata) sono tossici. Gli aggregati sono protettivi perché sottraggono alle cellule frammenti solubili e tossici. Meccanismi di patologia comuni Proteolisi della proteina mutata Alterazioni del metabolismo energetico Difetti della trascrizione genica Disfunzioni della sinapsi Terzo esempio: Malattia di Huntington Da acquisto di funzione tossica e/o Perdita di funzione Espansione di triplette in regioni codificanti ! Ripetiz Ripetiz Caratteristiche Malattia Ered Tripletta Gene Chr Loc$ Norm Patol cliniche Da acquisto di funzione tossica e/o perdita di funzione HD (Huntington) Autos. Dom. CAG IT15 4 coding 11-34 40-121 disturbi emotivi, cognitivi, alter. movimento SBMA (Kennedy’s) X-linked CAG Androgen receptor X coding 9-36 38-62 atrofia, disartria, disfonia, anomalie mov. DRPLA Autos. Dom. CAG Atrophin-1 12 coding 7-34 49-88 atassia, demenza SCA1 Autos. Dom. CAG Ataxin-1 6 coding 6-39 40-82 SCA2 Autos. Dom. CAG Ataxin-2 12 coding 15-24 32-200 SCA3 Autos. Dom. CAG Ataxin-3 14 coding 13-36 61-84 SCA6 Autos. Dom. CAG CACNA1A 19 coding 4-20 20-29 SCA7 Autos. Dom. CAG Ataxin-7 3 coding 4-35 37-306 SCA17 Autos. Dom. CAG TBP 6 coding 25-42 47-63 incoordinazione motoria, disturbi dell’equilibrio e del cammino, anomalie dei movimenti oculari, disartria, alterazioni della forza e del tono muscolare Corea di Huntington Woody Guthrie La famiglia Wexler CAG (9-35) gene sano CAG (>36) gene mutato number!of!chormosomese! Il CAG del gene HD nella popolazione umana Individui$con$(27.35$CAG):$5.8%$ Allele$ intermedio$ mala?a$ CAG!size! 2012 2012 278 soggetti sani: a CAG lunghi nel range sano si associa un aumento di materia grigia nel globo pallido. Pazienti HD presintomatici ottengono punteggi migliori dei soggetti sani nei test di percezione visiva 2009 Pazienti HD che portano l’allele sano con alto CAG hanno meno difetti cognitivi Funzioni del gene HD embrione Essenziale per lo sviluppo del SNC adulto E’ neuroprotettiva ed implicata nell’attività sinaptica CAG lunghi nel range sano come modulatori positivi della funzione neuronale del gene Huntington? ! Sequenze ricche in glutammina (Q): - Sono presenti frequentemente negli eucarioti. Si ritrovano nei lieviti e il loro numero aumenta negli invertebrati e nei mammiferi, indicando che gli organismi più complessi necessitano di queste sequenze ripetute. - Si ritrovano in proteine importanti per lo sviluppo e in domini proteici funzionali - Non si conosce ancora il loro significato, vi sono diverse ipotesi: modulare nuovi domini proteici modulare lo sviluppo e aggiungere nuove diversità nella specie. The conviction has been growing that much of this extra DNA is ‘junk’, in other words, that it has little specificity and conveys little or no selective advantage to the organism. Orgel&Crick (1980) Nature Although SSRs are commonly regarded as ‘junk’, evidence for many molecular and phenotypic effects of CAG repeat-number variation has lent support to the hypothesis that CAG could have a positive role in adaptive evolution. Kashi et al. (2006) Trends in Genetics number!of!chromosomes! Il CAG del gene HD nella popolazione umana Individui$con$(27.35$CAG):$5.8%$ Allele$ intermedio$ mala?a$ Incidenza: 12,3 su 100.000 CAG!size! Meccanismi patogenetici Eccitotossicità e attività sinaptica Disfunzioni mitocondriali Alterazioni trascrizione genica Proteolisi Aggregati Strategie terapeutiche La prima via Farmaci che contrastano meccanismi di patologia Alterazioni del metabolismo energetico Difetti della trascrizione genica Disfunzioni della sinapsi Dalla ricerca alla clinica: nuove molecole ricerca di base Eccitotossicità e attività sinaptica Riluzolo memantina Tetrabenazina ACR-16 (Huntexil) Disfunzioni mitocondriali Creatina Coenzima Q10 Eicosapentaenoic acid (EPA) Cisteamina Alterazioni trascrizione genica Sodiofenilbutirrato HDACi 4b Proteolisi Minociclina Inibitori di caspasi-6 Aggregati Trealosio C2-8 Farmaci che stimolano clearance pre-clinica fase 1 fase 2 fase 3 disponibile La seconda via 1998 Scoperta degli RNA interferenti Nobel per la Medicina o la Fisiologia 2006 Craig Mello Andrew Fire Fire et al., Nature 1998 Bloccare la produzione di proteina mutata: molecole interferenti mutazione gene RNA messaggero proteina Bloccare la produzione di proteina mutata: molecole interferenti mutazione gene RNA messaggero proteina Bloccare la produzione di proteina mutata: molecole interferenti mutazione gene RNA messaggero proteina ss-siRNA shRNA ASO miRNA membrana cellulare citoplasma siRNA pre-mRNA pri-miRNA RNAsi H Drosha splicing degradazione pre-miRNA mRNA Exportina-5 pre-miRNA Dicer mRNA RNAsi H miRNA/siRNA degradazione RISC Totale complementarità Parziale complementarità degradazione mRNA blocco traduzione Tools Modello MH miRNA N171-82Q Somministrazione Specificità Referenze virus AAV1 umana CAG140 shRNA siRNA ASO McBride 2008 umana R6/1 virus AAV5 R6/2 adenovirus Huang 2007 N171-82Q virus AAV1 Harper 2005 HD190QG virus AAV5 Machida 2006 CAG140 virus AAV5 McBride 2008 Lenti-N171-82Q Lenti-N853-82Q lentivirus Drouet 2009 Rat AAV-HD70d virus AAV1 Franich 2008 R6/2 liposomi AAV-Htt100Q colesterolo R6/2 minipompa osmotica umana Hdh Q150 Rodriguez-Lebron 2005 Wang 2005 Di Figlia 2007 umana Kordasiewicz 2012 Carrol 2011 BACHD YAC128 ss-siRNA Boudreau 2009 Stanek 2013 minipompa osmotica umana Yu 2012 2012 ASO efficaci in 3 modelli animali MH UCSD Don Cleveland ISIS Genzyme Frank Bennett Seng Cheng ISIS-HTTRX non selettivi per l’huntingtina mutata 2012 ASO al Rhesus macaca Somministrati IT nel CSF. Dopo 21 giorni si osserva: - Robusta diminuzione di HTT nella spina dorsale e in corteccia - 20% di riduzione HTT in caudato - non ci sono dati sul putamen 2015 ASO, studio clinico per la MH Sarah Tabrizi, University College London in collaborazione con ISIS Pharmaceutical ISIS-HTTRX – ASO non selettivo per HTT mutata 2015 Edward Wild Michael Hayden HTT nel CSF I problemi da risolvere Colpire in modo selettivo l’allele mutato preservando quello sano Funzioni del gene HD embrione Essenziale per lo sviluppo del SNC adulto E’ neuroprotettiva ed implicata nell’attività sinaptica Il gene Huntington gene normale CAG (9-35) gene mutato CAG (>36) Silenziare HTT mutata attraverso 2 approcci: Colpire il tratto CAG espanso Colpire SNPs (polimorfismo a singolo nucleotide) specifici per l’allele mutato 2012 ss-siRNA per HTT mutata David Corey gene sano gene MH mRNA sano mRNA MH 2014 ASO che riconoscono SNPs Michael Hayden Esoni UTR Introni SNPs gene sano gene MH mRNA sano mRNA MH degradazione mRNA MH I problemi da risolvere Somministrazione e biodistribuzione Tempi di trattamento e monitoraggio Metodo di somministrazione Somministrazione intratecale (IT) (Miller et al., 2013) per ASO ma non per siRNA. Pompe per infondere gli ASO direttamente nel cervello Alnylam Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA) Medtronic (Minneapolis, MN, USA). Sviluppo di sistemi per permettere ad ASO (e siRNA) di superare meglio le barriere biologiche (nucleasi, RES, membrana plasmatica, sistema endosomi/lisosomi). Tempi Molto lunghi visto il decorso MH? decenni? Somministrazioni multiple? La terza via Le cellule staminali embrionali cellula uovo zigote spermatozoo morula blastocisti trofoblasto cellula muscolare cellule del sangue paziente epatociti massa cellulare interna neurone cellule staminali embrionali trapianto cellule del pancreas cellule dell’intestino Nucleo caudato, putamen, globo pallido, corteccia Danno cerebrale localizzato favorevole al trapianto di nuovi neuroni Cervelletto, globo pallido, putamen, nucleo caudato, talamo, nucleo subtalamico, sostanza nera Globo pallido, cervelletto, ponte, sostanza nera, corna anteriori del midollo Cervelletto, nucleo olivare inferiore (midollo allongato), ponte, corna anteriori del midollo, via piramidale Motoneuroni, gangli dorsali, muscolo scheletrico Ross C.A. (1995) Neuron 15:493-496 Da staminale embrionale a neurone dello striato 0 15 45 80 giorni Neuroni striatali I prossimi obiettivi Ottimizzare le procedure di differenziamento per ottenere neuroni striatali funzionali Capire se questi neuroni possono sostituire le cellule che degenerano Grazie per l’attenzione
