cobas ampliprep/cobas taqman hbv test, v2.0 expt-ivd

COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test,
version 2.0
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV Test, v2.0
HBV V2.0
72 Tests
P/N: 04894570 190
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
Wash Reagent
PG WR
5.1 Liters
P/N: 03587797 190
USO PREVISTO
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV versione 2.0 (v2.0) è un test di amplificazione dell'acido
nucleico in vitro per la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) nel plasma umano e nel siero
tramite lo strumento COBAS® AmpliPrep per la preparazione automatizzata dei campioni e tramite
l'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48 per l'amplificazione e la rilevazione automatizzate.
Si tratta di un test utilizzato a sostegno del trattamento dei pazienti con infezione HBV cronica che sono
sottoposti a terapia antivirale. Il test può essere utilizzato per misurare i livelli di DNA dell'HBV in condizioni
normali e durante il trattamento come ausilio nella valutazione della risposta al trattamento. I risultati del
test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 devono essere interpretati alla luce di tutte le
pertinenti risultanze cliniche e di laboratorio.
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 non è destinato all'uso né come test di
screening della presenza dell'HBV nel sangue o negli emoderivati, né come test diagnostico per
la conferma dell'infezione da HBV.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il virus dell'epatite B (HBV) è uno dei tanti virus noti come responsabili dell'epatite virale. Oltre due miliardi
di individui in tutto il mondo sono risultati infetti da virus HBV, ed oltre 350 milioni di essi sono portatori
cronicamente infetti1,2. I portatori cronici sono ad alto rischio di complicanze a lungo termine dovute
all'infezione, quali l'epatite cronica, la cirrosi ed il carcinoma epatocellulare3,4,5. Marcatori sierologici
vengono usati comunemente come indicatori diagnostici e/o prognostici di infezioni da HBV acute
o croniche. Il più comune marcatore di infezione da HBV è la presenza dell'antigene di superficie dell'HBV
(HBsAg). Si è osservato che i portatori dell'infezione, anche una volta eliminato l'HBsAg e sviluppato
l'anticorpo specifico contro l'antigene di superficie del virus dell'epatite B, sono comunque a rischio di
successive gravi complicanze epatiche6,7. L'antigene “e” dell'HBV (HBeAg) viene generalmente considerato
un marcatore secondario di replicazione attiva dell'HBV associata a epatopatia progressiva. La mancata
eliminazione dell'HBeAg pare aumentare il rischio di epatopatia allo stadio terminale8,9. È possibile che
ceppi varianti dell'HBV producano HbeAg non rilevabile nel siero o che il ceppo perda la capacità di
produrre l'HbeAg, anche se l'infezione è attiva10. Pertanto l'impiego di questo marcatore per monitorare il
decorso della malattia può essere di utilità limitata11. È stato riportato che la capacità di rilevare il DNA
dell'HBV nel siero ha un valore prognostico per l'esito delle infezioni acute e croniche da HBV12-15.
La metodologia consente di rilevare il DNA dell'HBV in seguito all'eliminazione dell'HBsAg16 o di rilevare
HBV privo di marcatori sierologici17. Tuttavia, una relazione tra marcatori sierologici e livelli di DNA
dell'HBV non è ancora stata stabilita. Anche l'efficacia della terapia antivirale impiegata nel trattamento dei
pazienti affetti da HBV può essere determinata mediante la rilevazione dei marcatori sierologici o mediante
la valutazione dell'attività dell'enzima epatico. Si ritiene, tuttavia, che la misurazione più diretta e affidabile
della replicazione virale sia la quantificazione del DNA virale dell'HBV nel siero o nel plasma14,18-20. È stato
1
dimostrato che un abbassamento rapido e consistente dei livelli del DNA dell'HBV in pazienti sottoposti
a trattamento con alfa-interferone, Lamivudina, Ganciclovir o Adefovir Dipivoxil è un fattore predittivo
dell'esito favorevole del trattamento11,21-25. Il monitoraggio dei livelli di DNA dell'HBV può invece essere
predittivo dello sviluppo di una resistenza alla Lamivudina26. Pertanto, un test quantitativo che consenta la
misurazione del DNA dell'HBV è uno strumento prezioso che può essere usato insieme ad altri marcatori
sierologici nella gestione dell'infezione da HBV.
Il DNA dell'HBV nel plasma e nel siero può essere quantificato mediante tecniche di amplificazione
dell'acido nucleico quali la PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione polimerasica a catena)27-29. Il test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 utilizza la tecnica PCR per conseguire la massima
sensibilità e la massima gamma dinamica di rilevazione quantitativa del DNA dell'HBV nel plasma
anticoagulato con EDTA e nel siero.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è un test di amplificazione dell'acido nucleico per
la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) nel plasma e nel siero umani. Il test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 prevede due fasi principali: (1) preparazione dei campioni per
isolare il DNA dell'HBV e (2) amplificazione simultanea mediante PCR27 del DNA target e rilevazione della
sonda a rilevazione oligonucleotidica segmentata a doppia etichetta specifica al target.
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 consente la preparazione automatizzata dei
campioni seguita dall'amplificazione PCR automatizzata e dalla rilevazione automatizzata del DNA target
dell'HBV e del DNA dello standard di quantificazione (QS) dell'HBV. Il reagente Master Mix contiene
coppie di primer e sonde specifiche sia al DNA dell'HBV, sia al DNA dello standard di quantificazione (QS)
dell'HBV. Il Master Mix è stato sviluppato per assicurare la quantificazione equivalente dei genotipi da A a
H dell'HBV. La rilevazione del DNA amplificato viene effettuata mediante una sonda oligonucleotidica a
doppia etichetta specifica al target e una specifica allo standard di quantificazione, che consentano
l'identificazione indipendente dell'amplicon dell'HBV e dell'amplicon dello standard di quantificazione
dell'HBV.
La quantificazione del DNA virale dell'HBV viene eseguita con l'ausilio dello standard di quantificazione
dell'HBV, che compensa gli effetti dell'inibizione e controlla i processi di preparazione e amplificazione in
modo da garantire una quantificazione più accurata del DNA dell'HBV in ogni campione. Si tratta di un
costrutto di DNA non infettivo, contenente delle sequenze di HBV con siti di legame per il primer identici
a quelli del DNA target dell'HBV e un'unica regione di legame per la sonda che consente all'amplicon dello
standard di quantificazione dell'HBV di essere distinto dall'amplicon dell'HBV.
Lo standard di quantificazione dell'HBV viene aggiunto ad ogni campione in un numero di copie
conosciuto e accompagna le fasi successive di preparazione del campione, amplificazione simultanea
mediante PCR e rilevamento delle sonde a rilevazione oligonucleotidica segmentate a doppia etichetta.
L'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48 calcola la concentrazione del DNA dell'HBV nei
campioni del test confrontando il segnale dell'HBV e quello dello standard di quantificazione dell'HBV di
ciascun campione e controllo.
Selezione del target
La scelta di una sequenza target del DNA dell'HBV dipende dall'identificazione delle regioni che
evidenziano la massima conservazione della sequenza all'interno del genoma dell'HBV tra i vari genotipi
dell'HBV. Per catturare il DNA dell'HBV e il DNA dello standard di quantificazione dell'HBV viene usata una
preparazione generica basata sulla silice del campione, mentre come primer nell'amplificazione del DNA
dell'HBV e del DNA dello standard di quantificazione dell'HBV vengono usate sonde oligonucleotidiche
definite. Una sonda oligonucleotidica a doppia etichetta specifica al target e una specifica allo standard di
quantificazione consentono l'identificazione indipendente dell'amplicon dell'HBV e dell'amplicon dello
standard di quantificazione dell'HBV. Pertanto, l'appropriata selezione dei primer e della sonda
oligonucleotidica a doppia etichetta è cruciale ai fini della capacità del test di amplificare e rilevare
i genotipi dell'HBV. Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 utilizza tre primer di
amplificazione per la PCR. Una sonda a doppia etichetta che genera un segnale si ibridizza al filamento
antisense e viene segmentata dalla polimerasi del DNA Z05 durante l'estensione dei primer. L'amplicon dei
genotipi A-F e H è costituito da una sequenza di 145 nucleotidi. L'amplicon del genotipo G, tuttavia,
2
è costituito da una sequenza di 181 nucleotidi. Un inserimento a base 36 all'interno della regione
a filamento unico altamente conservata pre-core/core del genoma dell'HBV dà come risultato un amplicon
maggiore per il genotipo G31.
Preparazione dei campioni
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 prevede la preparazione automatizzata dei
campioni sullo strumento COBAS® AmpliPrep mediante una tecnica di cattura generica basata sulla silice.
La procedura prevede il trattamento di 500 μl di plasma o siero. Le particelle del virus dell'HBV vengono
lisate tramite incubazione ad elevata temperatura con una soluzione tampone proteasica e di lisi/legame
caotropico che rilascia acidi nucleici e protegge il DNA dell'HBV liberato dalle DNasi nel plasma o nel
siero. La proteasi ed un numero noto di molecole del DNA dello standard di quantificazione dell'HBV
vengono introdotti all'interno di ogni campione assieme al reagente di lisi e alle particelle di vetro
magnetizzate. In seguito, la miscela viene incubata e il DNA dell'HBV e il DNA dello standard di
quantificazione dell'HBV vengono legati alla superficie delle particelle di vetro. Le sostanze slegate, come
ad esempio sali, proteine e altre impurità cellulari, vengono eliminate tramite il lavaggio delle particelle di
vetro magnetizzate. Dopo aver separato le particelle e aver completato le fasi di lavaggio, gli acidi nucleici
adsorbiti vengono eluiti ad una elevata temperatura con una soluzione acquosa. Il campione trattato,
contenente sia le particelle di vetro magnetizzate che il DNA dell'HBV e il DNA del QS dell'HBV liberati,
viene aggiunto alla miscela di amplificazione e trasferito sull'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS®
TaqMan® 48.
Amplificazione PCR
La reazione di amplificazione PCR viene eseguita tramite polimerasi del DNA dell'enzima ricombinante
termostabile Thermus specie Z05 (Z05). In presenza di manganese (Mn2+) e in condizioni adeguate di
tampone, lo Z05 induce l'attività di polimerasi del DNA32, 33. Questo consente l'amplificazione PCR e la
rilevazione in tempo reale dell'amplicon.
I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione in apposite provette (provette K), dove
avviene l'amplificazione PCR. In presenza di Mn2+ e di un eccesso di trifosfati desossinucleosidi (dNTP),
comprendenti trifosfati di desossiadenosina, desossiguanosina, desossicitidina e desossiuridina, la
polimerasi del DNA dello Z05 estende i primer appaiati, formando un filamento di DNA.
Amplificazione del target
I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione in apposite provette (provette K), dove
avviene l'amplificazione PCR. Il termociclatore nell'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48
riscalda la miscela di reazione per denaturare il DNA a doppio filamento ed esporre le sequenze target
specifiche ai primer del genoma del DNA circolare dell'HBV e del DNA dello standard di quantificazione
dell'HBV. A mano a mano che la miscela si raffredda, i primer si appaiano al DNA target. La polimerasi
termostabile del DNA del Thermus specie Z05 (Z05), in presenza di Mn2+ e di un eccesso di trifosfati
desossinucleosidi (dNTP), comprendenti desossiadenosina, desossiguanosina, desossicitidina e
desossiuridina (al posto della timidina), estende i primer appaiati lungo lo stampo target, per produrre una
molecola di DNA a doppio filamento detta amplicon. L'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS®
TaqMan® 48 ripete automaticamente questa procedura per un determinato numero di cicli, raddoppiando
ad ogni ciclo la quantità di DNA amplicon. Il numero di cicli necessari è preimpostato nell'analizzatore
COBAS® TaqMan® o nell'analizzatore COBAS® TaqMan® 48. L'amplificazione ha luogo soltanto nella
regione del genoma dell'HBV compresa tra i primer; non ha luogo l'amplificazione dell'intero genoma
dell'HBV.
Amplificazione selettiva
L'amplificazione selettiva dell'acido nucleico target dei campioni è ottenuta dal test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 mediante l'uso dell'enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi) e del
trifosfato di deossiuridina (dUTP). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la reazione di distruzione dei
filamenti di DNA contenenti deossiuridina34, ma non del DNA contenente deossitimidina. La deossiuridina
non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicon, perché uno dei dNTP del reagente
Master Mix è il trifosfato di deossiuridina. Di conseguenza, soltanto l'amplicon contiene deossiuridina. La
deossiuridina rende l'amplicon contaminante suscettibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase
prima dell'amplificazione del DNA target. Inoltre, qualsiasi prodotto non specifico che si sia formato dopo
3
l'attivazione iniziale del Master Mix tramite manganese viene distrutto dall'enzima AmpErase. L'enzima
AmpErase, che è contenuto nel reagente Master Mix, catalizza la segmentazione del DNA contenente
deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosi nella posizione C1.
Quando viene sottoposta a riscaldamento nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA
dell'amplicon si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non
amplificabile. L'enzima AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato
esposto a temperature superiori a 55ºC, quindi durante le fasi del ciclo termico, pertanto non distrugge
l'amplicon target che si è formato durante l'amplificazione.
Rilevazione dei prodotti della PCR in un test COBAS® TaqMan®
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 prevede l'uso della tecnologia PCR in tempo
reale27,28. L'uso di sonde fluorescenti a doppia etichetta permette di rilevare in tempo reale l'accumulo dei
prodotti della PCR tramite monitoraggio dell'intensità di emissione dei coloranti fluorescenti del reporter
rilasciati durante il processo di amplificazione. Le sonde sono costituite da oligonucleotidi specifici per
l'HBV e per lo standard di quantificazione dell'HBV, marcati con un fluorocromo reporter e un fluorocromo
quencher. Nel test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0, le sonde dell'HBV e dello standard di
quantificazione dell'HBV sono etichettate con fluorocromi reporter fluorescenti diversi. Quando le sonde
sono integre, la fluorescenza del colorante del reporter viene soppressa dalla vicinanza del colorante del
quencher per effetto del trasferimento di energia di tipo Förster. Durante la PCR, la sonda si ibridizza a una
sequenza target e viene segmentata dall'attività della 5' → 3' nucleasi della polimerasi del DNA dell'enzima
termostabile Z05. Non appena i coloranti del reporter e del quencher vengono liberati e si separano, cessa
l'attività di soppressione (quenching) mentre si intensifica l'attività fluorescente del colorante del reporter.
L'amplificazione del DNA dell'HBV e del DNA del QS dell'HBV viene misurata indipendentemente a
lunghezze d'onda diverse. Questo processo viene ripetuto per un certo numero di cicli, aumentando
praticamente ad ogni ciclo l'intensità di emissione dei singoli fluorocromi reporter, permettendo
l'identificazione indipendente del DNA dell'HBV e del QS dell'HBV. Il ciclo PCR in cui una curva di crescita
innesca una crescita esponenziale è correlato alla quantità di materiale di partenza all'inizio della PCR.
Principi fondamentali della quantificazione del test COBAS® TaqMan®
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è quantitativo su un intervallo dinamico piuttosto
ampio, dato che il monitoraggio dell'amplicon viene effettuato durante la fase esponenziale
dell'amplificazione. Più il titolo dell'HBV di un campione è elevato, più è rapido il superamento del livello
della fluorescenza di riferimento da parte della fluorescenza del fluorocromo reporter della sonda HBV
(vedere la figura 1). Dal momento che la quantità di DNA dello standard di quantificazione dell'HBV
è costante in tutti i campioni, la fluorescenza del fluorocromo reporter della sonda QS dell'HBV dovrà
apparire in corrispondenza dello stesso ciclo per tutti i campioni (vedere la figura 2). Nei campioni in cui la
fluorescenza del QS risente di qualche influenza, la concentrazione viene regolata di conseguenza.
La comparsa dei segnali fluorescenti specifici viene documentata come valore di soglia critico (Ct). Il
valore Ct è definito come il numero frazionario di cicli in cui la fluorescenza del colorante del reporter
supera una soglia predefinita (il livello di fluorescenza assegnato) e innesca la fase di crescita
esponenziale di questo segnale (vedere la Figura 3). Un valore di Ct più alto indica un titolo più basso del
materiale target dell'HBV iniziale. Un aumento di 2 volte del titolo è legato ad una diminuzione di 1 Ct per il
DNA dell'HBV target, mentre un aumento di 10 volte del titolo è legato ad una diminuzione di 3,3 Ct.
Nella Figura 1 sono illustrate le curve di crescita del target con riferimento a una serie di diluizioni in un
intervallo di 5-log10. A mano a mano che la concentrazione del virus aumenta, le curve di crescita sono
anticipate ai cicli anteriori. La curva di crescita più a sinistra corrisponde quindi al livello di titolo virale più
elevato, mentre la curva di crescita più a destra corrisponde al livello di titolo virale più basso.
4
Figura 1
Curve di crescita del target per una serie di diluizioni del virus in un intervallo di 5-log10
9,00
Fluorescenza normalizzata
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
Titolo più alto
3,00
2,00
1,00
Titolo più basso
0,00
-1,00
0
10
20
30
40
50
Numero ciclo
Nella Figura 2 sono illustrate le curve di crescita dello standard di quantificazione (QS) con riferimento
a campioni preparati da una serie di diluizioni virali in un intervallo di 5-log10. La quantità di QS aggiunta
ad ogni campione è costante per ogni reazione. Il valore Ct del QS è simile indipendentemente dal
titolo virale.
Figura 2
Curve di crescita del QS per una serie di diluizioni del virus in un intervallo di 5-log10
35,00
30,00
Fluorescenza normalizzata
Titolo più alto
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
Titolo più basso
0,00
-5,00
0
10
20
30
Numero ciclo
5
40
50
Nella Figura 3 è documentato un esempio del modo in cui i valori di fluorescenza ad ogni ciclo vengano
normalizzati per ogni curva di crescita. Il numero frazionario di cicli (Ct) viene calcolato nel punto in cui il
segnale di fluorescenza interseca il livello di fluorescenza assegnato.
Figura 3
Normalizzazione dei valori di fluorescenza ad ogni ciclo per ogni curva di crescita
1
0,9
Fluorescenza normalizzata
0,8
Valore Ct = 27,1
Livello di fluorescenza
assegnato
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Numero ciclo
Quantificazione del DNA dell'HBV
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2,0 quantifica il DNA virale dell'HBV grazie all'aggiunta
al campione da analizzare di una seconda sequenza target (lo standard di quantificazione dell'HBV)
a concentrazione nota. Lo standard di quantificazione dell'HBV è un costrutto di DNA non infettivo,
contenente frammenti di sequenze di HBV con regioni di legame per i primer identiche a quelle della
sequenza target dell'HBV. Lo standard di quantificazione dell'HBV contiene regioni che legano i primer
dell'HBV e genera un prodotto di amplificazione della stessa lunghezza e della stessa composizione di base
del DNA target dell'HBV. La regione dell'amplicon dello standard di quantificazione dell'HBV che si lega
alla sonda di rilevazione è stata modificata per poter distinguere l'amplicon dello standard di
quantificazione dell'HBV dall'amplicon target dell'HBV.
Durante la fase di riassociazione della PCR nell'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48,
i campioni vengono illuminati ed eccitati da una luce filtrata; per ogni campione vengono raccolti i dati
relativi alla fluorescenza dell'emissione filtrata. Le letture eseguite per ogni campione vengono quindi
corrette per tenere conto delle fluttuazioni strumentali. Queste letture della fluorescenza vengono inviate
dallo strumento al software AMPLILINK e memorizzate in un database. Vengono utilizzati dei controlli
preventivi per stabilire se i dati relativi al DNA dell'HBV e al DNA dello standard di quantificazione dell'HBV
rappresentano delle serie valide e, nel caso in cui i dati superino i limiti preimpostati, vengono generati
degli avvisi. Dopo il completamento ed il superamento di tutti i controlli preventivi, le letture della
fluorescenza vengono elaborate in modo da generare dei valori Ct per il DNA dell'HBV e il DNA dello
standard di quantificazione dell'HBV. Le costanti di calibrazione specifiche al lotto fornite con il test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 vengono utilizzate per calcolare il valore del titolo per
i campioni e i controlli in base ai valori Ct del DNA dell'HBV e del DNA dello standard di quantificazione
dell'HBV. Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è standardizzato conformemente allo
Standard Internazionale dell'OMS per la rilevazione del DNA del virus dell'Epatite B mediante tecniche
basate sull'acido nucleico (Nucleic Acid-Based Techniques, NAT) (NIBSC 97/746)29, mentre i risultati dei
titoli sono espressi in Unità Internazionali (UI/ml).
6
REAGENTI
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0
(P/N: 04894570 190)
HBV2 CS1
(Cassetta reagenti con particelle di vetro magnetizzate HBV)
Particelle di vetro magnetizzate
93% Isopropanolo
Xi
93% Isopropanolo (p/p)
HBV V2.0
72 test
1 x 72 test
1 x 7,0 ml
Irritante
F
93% Isopropanolo (p/p)
Facilmente infiammabile
HBV2 CS2
(Cassetta reagente di lisi HBV)
Diidrato di citrato di sodio
42,5% Tiocianato di guanidina
< 5% Polidocanolo
0,9% Ditiotreitolo
Xn
42,5% Tiocianato di guanidina (p/p)
1 x 72 test
1x 78 ml
Nocivo
N
< 5% Polidocanolo (p/p)
Pericoloso per l'ambiente
HBV2 CS3
Cassetta multireagente HBV contenente:
1 x 72 test
Pase
(Soluzione di proteinasi)
Tampone Tris
< 0,05% EDTA
Cloruro di calcio
Acetato di calcio
- 7,8% Proteinasi
Glicerolo
Xn
- 7,8% Proteinasi (p/p)
1 x 3,8 ml
Nocivo
EB, v2.0
(Tampone di eluizione, v2.0)
Tampone Tris base
0,2% Metilparabene
1 x 7,3 ml
7
HBV2 CS4
Cassetta di reagente specifico al test HBV contenente:
1 x 72 test
HBV QS, v2.0
(Standard di quantificazione dell'HBV, v2.0)
Tampone Tris-HCl
EDTA
< 0,005% Poly rA RNA (di sintesi)
< 0.001% DNA plasmidico non infettivo, linearizzato, a doppio
filamento contenente un inserto con sequenze di legame per
il primer HBV ed una regione unica di legame della sonda
0,05% Sodio azide
1 x 3,6 ml
HBV MMX, v2.0
(Master Mix HBV, v2.0)
Tampone tricina
Acetato di potassio
Idrossido di potassio
0,09% Sodio azide
Glicerolo
< 0,04% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0.003% Primer a monte e a valle per HBV
< 0,003% Aptamero oligonucleotidico
< 0,003% Sonde oligonucleotidiche con marcatura fluorescente
specifiche per HBV e per lo standard di quantificazione
dell'HBV
< 0,05% Polimerasi del DNA Z05 (batterica)
< 0,1% Enzima uracil-N-glicosilasi AmpErase (batterico)
1 x 3,4 ml
HBV Mn2+
(Soluzione di manganese HBV)
< 0,5% Acetato di manganese
Acido acetico glaciale
0,09% Sodio azide
1 x 19,8 ml
HBV H(+)C, v2.0
(Controllo positivo alto HBV, v2.0)
< 0.001% DNA plasmidico linearizzato, a doppio filamento,
contenente sequenze di HBV
Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la
determinazione degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV-1/2,
dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'HIV-1, RNA dell'HCV e
DNA dell'HBV non rilevabili mediante metodiche PCR
0,1% Conservante ProClin® 300
6 x 1,0 ml
HBV L(+)C, v2.0
(Controllo positivo basso HBV, v2.0)
< 0.001% DNA plasmidico linearizzato, a doppio filamento,
contenente sequenze di HBV
Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la
determinazione degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV-1/2,
dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'HIV-1, RNA dell'HCV e
DNA dell'HBV non rilevabili mediante metodiche PCR
0,1% Conservante ProClin® 300
6 x 1,0 ml
8
CTM (–) C
[Controllo negativo COBAS® TaqMan® (plasma umano)]
Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la
determinazione degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV-1/2,
dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'HIV-1, RNA dell'HCV e
DNA dell'HBV non rilevabili mediante metodiche PCR
0,1% Conservante ProClin® 300
6 x 1.0 ml
HBV H(+)C, v2.0 Clip
(Fermaglio con codice a barre del controllo positivo alto HBV, v2.0)
1 x 6 fermagli
HBV L(+)C, v2.0 Clip
(Fermaglio con codice a barre del controllo positivo basso HBV, v2.0)
1 x 6 fermagli
HBV (-) C Clip
(Fermaglio con codice a barre del controllo negativo HBV)
1 x 6 fermagli
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Reagente di lavaggio COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
1 x 5,1 l
PG WR
(Reagente di lavaggio COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®)
Diidrato di citrato di sodio
< 0,1% N-Metilisotiazolone-HCI
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
A.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
B.
Questo test è destinato all'uso con plasma o siero umano raccolto in anticoagulante EDTA.
C.
Non pipettare con la bocca.
D.
Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Durante la manipolazione dei
campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti monouso, camici da laboratorio e protezioni per gli
occhi. Dopo aver manipolato i campioni e i reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani.
E.
Evitare la contaminazione microbica e da ribonucleasi dei reagenti durante il prelievo
delle aliquote dai flaconi di controllo.
F.
Si consiglia di utilizzare pipette sterili monouso e puntali per pipette privi di DNasi.
G.
Non combinare controlli di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto.
H.
Non miscelare cassette di reagenti o controlli da kit diversi.
I.
Non aprire le cassette COBAS® AmpliPrep né scambiare, mischiare, rimuovere o aggiungere
flaconi.
J.
Smaltire i reagenti inutilizzati, i rifiuti e i campioni in conformità alle normative vigenti.
K.
Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza.
L.
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su
richiesta presso l'ufficio Roche locale.
9
M.
I campioni e i controlli devono essere trattati come se fossero infettivi, adottando procedure di
sicurezza del laboratorio analoghe a quelle descritte nella pubblicazione Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories35 e nel documento CLSI M29-A336. Pulire e disinfettare accuratamente
tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca, a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua
deionizzata o distillata.
Nota: la candeggina liquida per uso domestico contiene in genere una concentrazione
di ipoclorito di sodio del 5,25%. Diluendo la normale candeggina per uso domestico
con un rapporto 1:10 è possibile ottenere una soluzione di ipoclorito di sodio
allo 0,5%.
N.
ATTENZIONE: i reagenti CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0 contengono plasma
umano derivato da sangue umano. Il materiale di origine è stato analizzato ed è risultato non
reattivo alla presenza dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), degli anticorpi anti-HIV-1/2
e anti-HCV e dell'antigene p24 dell'HIV. L'analisi del plasma umano negativo mediante le tecniche
PCR non ha evidenziato la presenza di quantità rilevabili di RNA dell'HIV-1, RNA dell'HCV e DNA
dell'HBV. Nessun metodo di analisi attualmente disponibile è in grado di garantire con certezza
assoluta che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Di conseguennza,
tutti i materiali di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. I reagenti
CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0 devono essere trattati come se fossero infettivi,
adottando procedure di sicurezza del laboratorio analoghe a quelle descritte nella pubblicazione
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories35 e nel documento CLSI M29-A336. Pulire
e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca, a base di
ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata.
O.
I reagenti HBV QS, v2.0, HBV Mn2+ e HBV MMX, v2.0 contengono sodio azide. La sodio azide
può reagire con le tubature di piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive.
Quando le soluzioni contenenti sodio azide vengono smaltite nei lavelli del laboratorio, è necessario
sciacquare gli scarichi con abbondanti quantità d'acqua per impedire l'accumulo di azidi.
P.
Durante la manipolazione dei reagenti, indossare camici da laboratorio, guanti monouso e una
protezione adeguata per gli occhi. Evitare il contatto di questi materiali con la pelle, gli occhi o le
membrane mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua. Intervenire
tempestivamente per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita accidentale dei reagenti,
diluire con acqua prima di asciugare.
Q.
Evitare che il reagente HBV CS2 e i rifiuti liquidi prodotti dallo strumento COBAS® AmpliPrep, che
contengono tiocianato di guanidina, vengano a contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio
(candeggina). Tali miscele possono produrre gas altamente tossici.
R.
Evitare che le unità SPU (Specimen Processing Units, unità di trattamento campioni) COBAS®
AmpliPrep utilizzate, che contengono tiocianato di guanidina, vengano a contatto con la soluzione
di ipoclorito di sodio (candeggina) durante il loro smaltimento. Tali miscele possono produrre gas
altamente tossici.
REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE
A.
Non congelare i reagenti o i controlli.
B.
Conservare i reagenti HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 e HBV2 CS4 a 2-8ºC. Se sigillati, questi
reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperti, questi reagenti sono stabili
per 56 giorni a 2-8°C o fino alla data di scadenza indicata, se precedente. I reagenti HBV2 CS1,
HBV2 CS2, HBV2 CS3 e HBV2 CS4 possono essere usati rimanendo per non più di 64 ore
complessive sullo strumento COBAS® AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8°C tra un
ciclo dello strumento e il successivo.
C.
Conservare i reagenti HBV H(+)C, v2.0, HBV L(+)C, v2.0 e CTM (–) C a 2-8ºC. I controlli sono
stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via le parti
inutilizzate.
10
D.
Conservare i fermagli con codice a barre [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip
e HBV (–) C Clip] a 2-30ºC.
E.
Conservare il reagente di lavaggio PG WR a 2-30°C. Il reagente PG WR è stabile fino alla data
di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 28 giorni a 2-30°C o fino alla data di
scadenza, se precedente.
MATERIALI FORNITI
A.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0
(P/N: 04894570 190)
HBV V2.0
HBV2 CS1
(Cassetta reagenti con particelle di vetro magnetizzate HBV)
HBV2 CS2
(Cassetta di reagente di lisi HBV)
HBV2 CS3
(Cassetta di multireagente HBV)
HBV2 CS4
(Cassetta reagente specifico per test HBV)
HBV H(+)C, v2.0
(Controllo positivo alto HBV, v2.0)
HBV L(+)C, v2.0
(Controllo positivo basso HBV, v2.0)
CTM (–) C
[Controllo negativo COBAS® TaqMan® (plasma umano)]
HBV H(+)C, v2.0 Clip
(Fermaglio con codice a barre per controllo positivo alto HBV, v2.0)
HBV L(+)C, v2.0 Clip
(Fermaglio con codice a barre per controllo positivo basso HBV, v2.0)
HBV (–) C Clip
(Fermaglio a codice a barre per controllo negativo HBV)
B.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Reagente di lavaggio COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
(Reagente di lavaggio COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®)
MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Strumentazione e software
•
Strumento COBAS® AmpliPrep
•
Analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48
•
Opzionale: Docking Station
•
software AMPLILINK
11
PG WR
•
Stazione dati del software AMPLILINK, con stampante
•
Manuali del software AMPLILINK versione 3.2:
– Manuale dello strumento - Strumento COBAS® AmpliPrep per l'uso con
l'analizzatore COBAS® TaqMan® o l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48, l'analizzatore
COBAS® AMPLICOR® e il software AMPLILINK versione 3.2
– Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS® TaqMan® (con Docking Station
opzionale) per l'uso con il manuale dell'applicazione del software AMPLILINK
versione 3.2
– Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS® TaqMan® 48 per l'uso con il
manuale dell'applicazione del software AMPLILINK versione 3.2
– Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione 3.2 per l'uso con lo
strumento COBAS® AmpliPrep, l'analizzatore COBAS® TaqMan®, l'analizzatore
COBAS® TaqMan® 48 e l'analizzatore COBAS® AMPLICOR®
Materiali di consumo
•
Unità di trattamento dei campioni: SPU
•
Provette per campioni iniziali (provette S) con fermagli a codice a barre
•
Rack per puntali K
•
Confezione di provette K da 12 x 96
ALTRI MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
•
Rack per campioni (rack SK 24)
•
Rack per reagenti
•
Rack per SPU
•
Carrier K
•
Trasportatore di carrier K
•
Rack per carrier K
•
Pipettatori con puntali muniti di barriera antiaerosol o ad erogazione positiva, privi
di DNasi (da 1000 μl)*
•
Guanti monouso, senza talco
•
Vortex
* I pipettatori devono garantire un'accuratezza entro il 3% del volume dichiarato. Laddove specificato,
è necessario usare puntali muniti di barriera antiaerosol o ad erogazione positiva, privi di DNasi, in modo da
evitare la contaminazione crociata del campione e dell'amplicon.
PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Nota: manipolare tutti i campioni e i controlli come se fossero in grado di trasmettere agenti
infettivi.
Nota: questo test è stato validato per l'uso con plasma o siero umano raccolto in anticoagulante
EDTA. L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non
accurati.
12
A.
Prelievo dei campioni
Il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 deve essere utilizzato con campioni di plasma
o siero. Il sangue deve essere raccolto in provette SST® per la separazione del siero o in provette sterili
usando EDTA (parte superiore lavanda) come anticoagulante.
Conservare il sangue intero a 2-25°C per non più di 24 ore. Separare il plasma o il siero dal sangue intero
entro 24 ore dal prelievo, tramite centrifugazione a 800-1600 x g per 20 minuti a temperatura ambiente
(15-30°C). Trasferire il plasma o il siero in una provetta sterile di polipropilene. Nelle figure 4 e 5 sono
illustrati i dati sulla stabilità dei campioni, provenienti da studi svolti con il test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0.
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 4
Stabilità dell'HBV nel sangue intero (in provette di plasma con EDTA)
Campione
2-8°C < 1 ora
25-30°C 24 ore
2-8°C 24 ore
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 5
Stabilità dell'HBV nel sangue intero (in provette con separatore di siero)
Campione
2-8°C < 1 ora
25-30°C 24 ore
13
2-8°C 24 ore
B.
Trasporto dei campioni
Il trasporto di sangue intero, di plasma o di siero deve avvenire in conformità alle normative vigenti per il
trasporto degli agenti eziologici37. Il sangue intero deve essere trasportato a 2-25°C e centrifugato entro
24 ore dal prelievo. Il plasma o il siero possono essere trasportati a 2-8°C o congelati a temperature
comprese tra -20°C e -80°C.
C.
Conservazione dei campioni
I campioni di plasma o siero possono essere conservati a 25-30°C per un massimo di 3 giorni, a 2-8°C per
un massimo di 7 giorni oppure congelati tra -20°C e -80°C per almeno sei settimane. Si consiglia di
conservare i campioni in aliquote di 800-900 μl in provette sterili da 2,0 ml con tappo a vite in
poliprolpilene (ad esempio, Sarstedt 72.694.006). Nelle figure 6 e 7 sono illustrati i dati sulla stabilità dei
campioni, provenienti da studi sulla conservazione dei campioni svolti con il test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0.
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 6
Stabilità dell'HBV in plasma con EDTA
Campione
2-8°C < 2 ore 25-30°C 3 giorni 2-8°C 7 giorni
-20°C 6 settimane
-70°C 6 settimane
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 7
Stabilità dell'HBV nel siero
Campione
2-8°C < 2 ore 25-30°C 3 giorni 2-8°C 7 giorni
-20°C 6 settimane -70°C 6 settimane
14
I campioni di plasma e siero possono essere congelati e scongelati non più di 5 volte senza alcuna perdita
di DNA dell'HBV. Nelle figure 8 e 9 sono illustrati i dati provenienti da studi sul congelamento
e scongelamento dei campioni svolti con il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0.
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 8
Risultati dell'HBV dopo max cinque cicli di Congelamento/Scongelamento (C/S) del plasma
con EDTA
Campione
0x Congelamento/Scongelamento
3x Cong./Scong.
5 x Cong./Scong.
Titolo in log10 (UI/ml)
Figura 9
Risultati dell'HBV dopo max cinque cicli di Congelamento/Scongelamento (C/S) del siero
Campione
0 x Congelamento/Scongelamento
15
3 x Cong./Scong.
5 x Cong./décong.
ISTRUZIONI PER L'USO
Nota: per le istruzioni operative dettagliate, una descrizione approfondita dei possibili flussi
di lavoro, la stampa dei risultati e l'interpretazione di avvisi (flag), commenti e messaggi
di errore, consultare (1) Manuale dello strumento - Strumento COBAS® AmpliPrep per
l'uso con l'analizzatore COBAS® TaqMan® o l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48,
l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® e il software AMPLILINK versione 3.2; (2) Manuale
dello strumento - Analizzatore COBAS® TaqMan® (con Docking Station opzionale) per l'uso
con il Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK versione 3.2; (3) Manuale dello
strumento - Analizzatore COBAS® TaqMan® 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione
del software AMPLILINK versione 3.2; (4) Manuale dell'applicazione del software
AMPLILINK versione 3.2 per l'uso con lo strumento COBAS® AmpliPrep, l'analizzatore
COBAS® TaqMan®, l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 e l'analizzatore COBAS®
AMPLICOR®.
Dimensioni dei lotti
Ogni kit contiene reagenti sufficienti per 72 test, che possono essere suddivisi in lotti da 12-24 test
cadauno. È necessario che in ogni lotto sia incluso almeno un replicato per ogni controllo (CTM (–) C,
HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0), come descritto nella sezione "Controllo di qualità".
Flusso di lavoro
Non appena i campioni e i controlli sono pronti, è necessario avviare l'analizzatore COBAS® TaqMan®
o l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 entro 120 minuti.
Nota: non congelare, né conservare a 2-8°C i campioni e i controlli trattati.
Preparazione dei campioni e dei controlli
Nota: se i campioni sono congelati, lasciarli a temperatura ambiente (15-30°C) fino al loro
completo scongelamento e agitarli in Vortex per 3-5 secondi prima dell'uso. Prelevare
i controlli dal luogo in cui sono conservati a 2-8°C e lasciare che raggiungano
la temperatura ambiente prima dell'uso.
Configurazione dello strumento COBAS® AmpliPrep
Parte A.
Manutenzione e priming
A1.
Lo strumento COBAS® AmpliPrep è pronto per il funzionamento in modalità stand-by.
A2.
Accendere la stazione dati del software AMPLILINK (posizione ON). Preparare la stazione dati
come segue:
a.
Aprire una sessione del sistema operativo Windows® XP.
b.
Fare doppio clic sull'icona del software AMPLILINK.
c.
Aprire una sessione del software AMPLILINK specificando l'ID utente e la password
assegnati.
A3.
Controllare il livello del reagente di lavaggio PG WR nello schermo di stato (Status). Rabboccare
secondo necessità.
A4.
Eseguire tutte le attività di manutenzione elencate (scheda Due). Lo strumento COBAS® AmpliPrep
eseguirà automaticamente il priming del sistema.
16
Parte B.
Caricamento delle cassette di reagenti
Nota: prelevare tutte le cassette di reagenti dal luogo in cui sono conservate a 2-8°C, caricarle
immediatamente sullo strumento COBAS® AmpliPrep e attendere per almeno 30 minuti
che raggiungano la temperatura ambiente sullo strumento, prima di avviare il trattamento
del primo campione. Evitare che le cassette di reagenti raggiungano la temperatura
ambiente all'esterno dello strumento, in quanto potrebbe formarsi della condensa sulle
etichette con il codice a barre. Non tentare di asciugare l'eventuale condensa strofinando
le etichette del codice.
B1.
Collocare HBV2 CS1 sul rack reagenti. Collocare HBV2 CS2, HBV2 CS3 e HBV2 CS4 su un rack
reagenti separato.
B2.
Caricare il rack contenente il reagente HBV2 CS1 nella posizione rack A dello strumento COBAS®
AmpliPrep.
B3.
Caricare il rack reagente contenente HBV2 CS2, HBV2 CS3 e HBV2 CS4 nelle posizioni B, C, D
o E dello strumento COBAS® AmpliPrep (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1).
Parte C.
Caricamento dei materiali monouso
Nota: calcolare il numero necessario di cassette di reagenti COBAS® AmpliPrep, unità SPU,
provette per campioni iniziali (provette S), puntali K e provette K. Per ogni campione
o controllo servono: una unità SPU, una provetta S, un puntale K e una provetta K.
Per quanto riguarda l'utilizzo dello strumento COBAS® AmpliPrep con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
o COBAS® TaqMan® 48, i possibili flussi di lavoro sono molteplici. Consultare la Tabella 1 per riferimento.
A seconda del flusso di lavoro impostato, caricare il numero appropriato di rack con le cassette dei
reagenti, rack per campioni con le provette S, rack per SPU, rack per puntali K, rack per provette K
e carrier K sui rack per carrier K, nelle posizioni riservate a questi tipi di rack sullo strumento COBAS®
AmpliPrep (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1).
C1.
Caricare le unità SPU sull'apposito rack per SPU e caricare quest'ultimo nella posizione J, K o L
dello strumento COBAS® AmpliPrep.
C2.
A seconda del flusso di lavoro impostato, caricare il rack o i rack pieni di provette K nella posizione
rack M, N, O o P dello strumento COBAS® AmpliPrep.
C3.
Caricare il rack o i rack pieni di puntali K nella posizione rack M, N, O oppure P dello strumento
COBAS® AmpliPrep.
C4.
Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48, caricare i carrier K sull'apposito
rack per carrier K nella posizione rack M, N, O oppure P dello strumento COBAS® AmpliPrep.
17
Tabella 1
Possibili flussi di lavoro per l'uso dello strumento COBAS® AmpliPrep
con l'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48
Flusso di lavoro
1
2
3
Strumento COBAS®
AmpliPrep con
Docking Station
e analizzatore
COBAS® TaqMan®
Strumento COBAS®
AmpliPrep con
analizzatore
COBAS® TaqMan®
Strumento COBAS®
AmpliPrep con
analizzatore/
i COBAS®
TaqMan® 48
Modalità di
trasferimento verso
l'analizzatore COBAS®
TaqMan® o COBAS®
TaqMan® 48
Trasferimento
automatico del
carrier K
Trasferimento
manuale delle
provette K tramite
i rack per campioni
sull'analizzatore
COBAS® TaqMan®
Trasferimento
manuale del carrier K
tramite il rack o i rack
per carrier K
sull'analizzatore
COBAS® TaqMan® 48
18
Rack, carrier e materiali di
consumo
Provette K in rack contenenti
provette K
Puntali K in rack contenenti
puntali K
Provette S contenenti
campioni e controlli nei rack
per campioni
Unità SPU nei rack per SPU
CS1 nel rack per cassette
CS2, CS3, CS4 nel rack per
cassette
Provette K in rack contenenti
provette K
Puntali K in rack contenenti
puntali K
Provette S contenenti
campioni e controlli nei rack
per campioni
Unità SPU nei rack per SPU
CS1 nel rack per cassette
CS2, CS3, CS4 nel rack per
cassette
Al termine del trattamento dei
campioni:
provette K nei rack per
campioni (pronti per il
trasferimento manuale)
Provette K nei rack per
campioni
Puntali K in rack contenenti
puntali K
Provette S contenenti
campioni e controlli nei rack
per campioni
Unità SPU nei rack per SPU
CS1 nel rack per cassette
CS2, CS3, CS4 nel rack per
cassette
Carrier K vuoto, con codice
a barre, nel rack per carrier K
Al termine del trattamento dei
campioni:
provette K nel carrier K sul
rack per carrier K
Posizione
sullo
strumento
COBAS®
AmpliPrep
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
Come sopra
(F – H)
F-H
M-P
F-H
J-L
A
B-E
M-P
Come sopra
(M – P)
Parte D.
Ordine e caricamento dei campioni
D1.
Preparare i rack per campioni come segue: applicare un fermaglio a codice a barre in ogni
posizione del rack per campioni in cui si intende caricare un campione (provetta S). Applicare uno
dei fermagli specifici con codice a barre per i controlli [CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 e HBV
H(+)C, v2.0] in ogni posizione del rack per campioni in cui si intende caricare i controlli (provetta
S). I fermagli a codice a barre dei controlli dovranno riportare lo stesso numero di lotto stampato sui
flaconi di controllo nel kit. Fare attenzione ad assegnare il controllo corretto alla posizione con il
fermaglio a codice a barre del controllo appropriato. Inserire una provetta S in ogni posizione
contenente un fermaglio a codice a barre.
D2.
Utilizzando il software AMPLILINK, creare gli ordini per ogni campione e ogni controllo nella
scheda Sample della finestra Orders. Selezionare il file del test opportuno e salvare per
completare l'operazione.
D3.
Nella cartella Sample Rack della finestra Orders, assegnare gli ordini per i campioni e i controlli
alle posizioni del rack riservate ai campioni. Il numero del rack per campioni deve corrispondere
a quello del rack preparato al punto D1.
D4.
Stampare il rapporto Sample Rack Order per utilizzarlo come foglio di lavoro.
D5.
Preparare i rack per i campioni e i controlli nell'area designata per l'aggiunta di campioni e controlli
come segue: agitare in Vortex ogni campione e controllo [CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 e HBV
H(+)C, v2.0] per 3-5 secondi. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei
campioni e dei controlli.
D6.
Trasferire 650 μl di ogni campione e controllo [CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0]
nella provetta S appropriata, dotata di etichetta con codice a barre, utilizzando un micropipettatore
con puntale a barriera antiaerosol o ad erogazione positiva, privo di DNasi. Evitare di trasferire
sostanze particellari e/o coaguli di fibrina dal campione originario alla provetta S iniziale.
I campioni e i controlli devono essere trasferiti nelle posizioni delle provette loro assegnate e il tutto
deve essere annotato nel foglio di lavoro di cui al punto D4. I fermagli a codice a barre dei controlli
dovranno riportare lo stesso numero di lotto stampato sui flaconi di controllo nel kit. Assegnare il
controllo corretto alla posizione con il fermaglio a codice a barre del controllo appropriato. Evitare
di contaminare la parte superiore delle provette S con campioni o controlli.
D7.
Per i flussi di lavoro 1 e 2, caricare il rack o i rack per campioni carichi di provette S iniziali nella
posizione rack F, G oppure H dello strumento COBAS® AmpliPrep.
D8.
Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48, caricare il rack o i rack per
campioni con le provette S iniziali e le provette K (una per ogni provetta S iniziale, caricata nella
posizione corretta adiacente alle provette S iniziali) nella posizione rack F, G oppure H dello
strumento COBAS® AmpliPrep.
Part E.
E1.
Avvio della seduta sullo strumento COBAS® AmpliPrep
Avviare lo strumento COBAS® AmpliPrep utilizzando il software AMPLILINK.
19
Parte F.
Fine della seduta sullo strumento COBAS® AmpliPrep e trasferimento dei campioni
sull'analizzatore COBAS® TaqMan® o sull'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 (solo
per i flussi di lavoro 2 e 3)
F1.
Verificare la presenza di avvisi (flag) o messaggi di errore.
F2.
Rimuovere i campioni e i controlli trattati dallo strumento COBAS® AmpliPrep sui rack per campioni
(per l'analizzatore COBAS® TaqMan® senza Docking Station) o sui rack per carrier K (per
l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48), a seconda del flusso di lavoro impostato (per ulteriori dettagli,
consultare la Parte G).
F3.
Rimuovere i rifiuti dallo strumento COBAS® AmpliPrep.
Nota: i campioni e i controlli trattati non dovrebbero essere esposti alla luce al termine della
preparazione.
Amplificazione e rilevazione
Configurazione dell'analizzatore COBAS® TaqMan® o dell'analizzatore COBAS® TaqMan® 48
Non appena i campioni e i controlli sono pronti, è necessario avviare l'analizzatore COBAS® TaqMan®
o l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 entro 120 minuti.
Nota: non congelare, né conservare a 2-8°C i campioni e i controlli trattati.
Parte G.
G1.
A seconda del flusso di lavoro impostato, eseguire le procedure appropriate per trasferire le
provette K sull'analizzatore COBAS® TaqMan® o sull'analizzatore COBAS® TaqMan® 48:
Flusso di lavoro 1.
Trasferimento automatizzato del carrier K verso l'analizzatore COBAS®
TaqMan® attraverso la docking station. Non è richiesto l'intervento
manuale dell'operatore.
Flusso di lavoro 2.
Trasferimento manuale delle provette K nei rack per campioni verso
l'analizzatore COBAS® TaqMan®.
Flusso di lavoro 3.
Trasferimento manuale del carrier K nei rack per carrier K verso
l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48. Trasferimento manuale dei carrier
K dentro l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 mediante trasportatore di
carrier K.
Parte H.
H1.
Caricamento dei campioni trattati
Avvio della seduta sull'analizzatore COBAS® TaqMan® o sull'analizzatore COBAS®
TaqMan® 48
Avviare l'analizzatore COBAS® TaqMan® o l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 scegliendo una delle
opzioni descritte di seguito, a seconda del flusso di lavoro impostato:
Flusso di lavoro 1.
Non è richiesto nessun intervento.
Flusso di lavoro 2.
Avvio automatico dell'analizzatore COBAS® TaqMan® dopo l'inserimento
dei rack per campioni.
Flusso di lavoro 3.
Riempire il carrier K di provette K vuote se ne contiene meno di 6.
L'operazione è guidata dal software AMPLILINK. Aprire il coperchio del
termociclatore, caricare il carrier K nel termociclatore e chiudere il
coperchio. Avviare la seduta dell'analizzatore COBAS® TaqMan® 48.
20
Fine della seduta sull'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48
Parte I.
I1.
Al termine della seduta dell'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48, stampare un
rapporto con i risultati. Controllare se sono presenti avvisi (flag) o messaggi di errore nel rapporto
con i risultati. I campioni con avvisi (flag) e commenti vengono interpretati secondo la modalità
descritta nella sezione Risultati. Dopo avere accettato i risultati, memorizzare i dati in archivio.
I2.
Rimuovere le provette K utilizzate dall'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48.
RISULTATI
L'analizzatore COBAS® TaqMan® o COBAS® TaqMan® 48 determina automaticamente la concentrazione
del DNA dell'HBV per campioni e controlli. La concentrazione del DNA dell'HBV viene espressa in
unità di misura internazionali (UI)/ml. Il fattore di conversione tra copie/ml dell'HBV e UI/ml
dell'HBV è pari a 5,82 cp/UI, conformemente allo Standard Internazionale dell'OMS per la
rilevazione del DNA del virus dell'epatite B mediante tecniche basate sull'acido nucleico (Nucleic
Acid-Based Techniques, NAT) (NIBSC 97/746)29.
Se necessario, i risultati possono essere convertiti manualmente in copie/ml, utilizzando il calcolo
di conversione come segue:
Concentrazione di DNA dell'HBV in UI/ml x 5,82 copie/UI = DNA dell'HBV in copie/ml
Esempio: 1,23E+04 UI/ml x 5,82 copie/UI = 7,16E+04 copie/ml
Nota: l'intervallo di misurazione dei valori degli analiti che può essere misurato direttamente su
un campione senza diluizione usando il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV
v2.0 è compreso tra 20 e 1,7E+08 UI/ml.
Nota: l'intervallo di misurazione per i valori degli analiti che può essere misurato direttamente su
un campione con diluizione massima tra uno e dieci usando il test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è compreso tra 20 e 1,7E+09 UI/ml.
Software AMPLILINK:
•
Determina il valore di soglia del ciclo (Ct) per il DNA dell'HBV e il DNA del QS dell'HBV.
•
Determina la concentrazione del DNA dell'HBV in base ai valori di Ct per il DNA dell'HBV e il
DNA del QS dell'HBV e i coefficienti di calibrazione specifici per il lotto forniti sui codici a
barre delle cassette.
•
Verifica che i titoli UI/ml calcolati per HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0 rientrino negli
intervalli assegnati.
Convalida del lotto
Controllare la finestra o la stampa dei risultati del software AMPLILINK per individuare eventuali avvisi
(flag) o commenti sulla validità del lotto. Nel caso di ordini di controllo, viene effettuato un controllo per
determinare se il valore UI/ml relativo al controllo rientra nel suo intervallo specificato. Nel caso in cui il
valore UI/ml per il controllo non rientri nel suo intervallo, viene generato un AVVISO per mostrare che il
controllo non è riuscito.
Il lotto è valido se non è presente nessun avviso (flag) per i controlli [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0
e CTM (–) C].
21
Il lotto non è valido se per i controlli dell'HBV appare qualcuno dei seguenti avvisi:
Controllo negativo
Avviso
Risultato
_N_NC_INVALID
Invalid
Significato
Un risultato non valido o un risultato “valido” che non
era negativo per il target HBV
Controllo positivo basso HBV, v2.0
Avviso
Risultato
Significato
_L_LPCINVALID
<2.00E+01 IU/mL
Controllo inferiore all'intervallo
_L_LPCINVALID
Target Not Detected
Controllo inferiore all'intervallo
_L_LPCINVALID
Un titolo numerico,
X.XXE+XX IU/mL
Controllo al di fuori dell'intervallo
_L_LPCINVALID
> 1.70E+08 IU/mL
Controllo superiore all'intervallo
_L_LPCINVALID
Invalid
Risultato non valido
Controllo positivo alto HBV, v2.0
Avviso
Risultato
Significato
_H_HPCINVALID
<2.00E+01 IU/mL
Controllo inferiore all'intervallo
_H_HPCINVALID
Target Not Detected
Controllo inferiore all'intervallo
_H_HPCINVALID
Un titolo numerico,
X.XXE+XX IU/mL
Controllo al di fuori dell'intervallo
_H_HPCINVALID
> 1.70E+08 IU/mL
Controllo superiore all'intervallo
_H_HPCINVALID
Invalid
Risultato non valido
Se il lotto non è valido, ripetere tutte le fasi di preparazione, amplificazione e rilevazione dei campioni e dei
controlli.
Interpretazione dei risultati
Per determinare la validità di un lotto, controllare la presenza di avvisi (flag) o commenti sulla stampa dei
risultati di ogni campione. Interpretare i risultati nel modo seguente:
•
Un lotto valido può includere risultati sia validi sia non validi, a seconda degli avvisi e/o dei
commenti relativi ai singoli campioni.
22
I risultati dei campioni devono essere interpretati nel modo seguente:
Risultato del titolo
Significato
Target Not Detected
Valore Ct per HBV superiore al limite per il dosaggio oppure nessun valore
Ct ottenuto per HBV. Il rapporto dà come risultato ”HBV DNA not detected”
(DNA dell'HBV non rilevato).
<2.00E+01 IU/mL
Il valore di UI/ml calcolato è inferiore al limite di sensibilità del test.
Il rapporto dà come risultato "HBV DNA detected, less than 20 HBV DNA
IU/mL" (Rilevato DNA dell'HBV, inferiore a 20 UI/ml).
' 2.00E+01 IU/mL e
- 1.70E+08 IU/mL
I risultati calcolati maggiori o uguali a 20 UI/ml e minori o uguali a
1,70E+08 UI/ml rientrano nell'intervallo lineare dell'analisi.
> 1.70E+08 IU/mL
Il valore di UI/ml calcolato è superiore all'intervallo del test. Il rapporto dà
come risultato "greater than 1.70E+08 HBV DNA IU/mL" (maggiore di
1,70E+08 UI/ml di DNA dell'HBV). Se si desiderano risultati quantitativi,
è necessario diluire il campione originale con siero o plasma con EDTA
umani HBV-negativi, a seconda della sua matrice, e ripetere il test.
Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.
Nota: i campioni con valori al di sopra dell'intervallo del test possono anche produrre un risultato
non valido con il flag "QS_INVALID". Se si desiderano risultati quantitativi, è necessario
diluire il campione originale con siero o plasma con EDTA umani HBV-negativi, a seconda
della sua matrice, e ripetere il test. Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.
CONTROLLO DI QUALITÀ
In ogni lotto di test è necessario includere un replicato del Controllo negativo COBAS® TaqMan®, un
replicato del Controllo positivo basso HBV, v2.0 e un replicato del Controllo positivo alto HBV, v2.0. Il lotto
è valido se non è presente nessun avviso (flag) per i controlli [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0
e CTM (–) C].
La posizione dei controlli sul rack campioni è del tutto facoltativa.
Controllare la stampa del lotto per individuare eventuali avvisi (flag) o commenti a conferma della validità
del lotto.
Controllo negativo
Il controllo CTM (–) C deve generare un risultato "Target Not Detected". Se il controllo CTM (–) C genera
l'avviso "Invalid", l'intero lotto non è valido. Ripetere tutte le fasi di preparazione, amplificazione
e rilevazione dei campioni e dei controlli. Se il controllo CTM (–) C genera risultati che sono
costantemente non validi in più lotti, richiedere assistenza tecnica all'ufficio Roche locale.
23
Controlli positivi
Gli intervalli dei titoli assegnati per HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0 sono indicati nei codici a barre
delle cassette dei reagenti del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0.
I titoli UI/ml del DNA dell'HBV calcolati per HBV L(+)C, v2.0 e HBV H(+)C, v2.0 devono rientrare negli
intervalli assegnati. Se uno o entrambi i controlli positivi generano il flag "Invalid", l'intero lotto non
è valido. Ripetere tutte le fasi di preparazione, amplificazione e rilevazione dei campioni e dei controlli. Se il
titolo del DNA dell'HBV relativo a uno o entrambi i controlli positivi genera risultati che sono
costantemente al di fuori dell'intervallo assegnato in più lotti, richiedere assistenza tecnica all'ufficio
Roche locale.
PRECAUZIONI RELATIVE ALLA PROCEDURA
Com'è auspicabile per qualsiasi procedura di analisi, è necessario attenersi alla buona prassi di laboratorio
per lo svolgimento di questo test.
LIMITI RELATIVI ALLA PROCEDURA
1.
Questo test è stato validato per l'uso con siero o plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA.
L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non accurati.
2.
L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure di prelievo, trasporto,
conservazione e trattamento dei campioni.
3.
La presenza dell'enzima AmpErase nel Master Mix del COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV v2.0 riduce il rischio di contaminazione dell'amplicon. Tuttavia, la contaminazione da parte di
controlli e di campioni clinici HBV-positivi può essere evitata soltanto grazie ad una buona prassi di
laboratorio ed all'attenta aderenza alle procedure specificate in questo inserto.
4.
L'uso di questo prodotto dovrebbe essere riservato a personale specializzato nell'applicazione delle
tecniche PCR.
5.
Questo prodotto può essere utilizzato soltanto con lo strumento COBAS® AmpliPrep e con gli
analizzatori COBAS® TaqMan® e COBAS® TaqMan® 48.
6.
Anche se rare, le mutazioni della regione altamente conservata del genoma virale coperta dai
primer e/o dalla sonda del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 possono dare
luogo a risultati sottostimati o alla mancata identificazione del virus.
7.
L'identificazione del DNA dell'HBV dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione
e può essere influenzata dal metodo di prelievo del campione e da fattori legati al paziente
(ad esempio età, presenza di sintomi e/o stadio dell'infezione).
8.
A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli utenti, prima di passare
da una tecnologia a un'altra, svolgano studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla
scopo di quantificare tali differenze.
24
SOSTANZE INTERFERENTI
È stato dimostrato che livelli elevati di trigliceridi, bilirubina e albumina nei campioni non interferiscono
nella quantificazione del DNA dell'HBV da parte di questo test. Livelli elevati di emoglobina nei campioni
con una concentrazione massima di 250 mg/dl hanno dimostrato di non interferire con la quantificazione
del DNA dell'HBV da parte di questo test.
È dimostrato che i composti farmaceutici elencati di seguito, analizzati con un valore 3 volte superiore al
livello plasmatico di picco (Cmax), non interferiscono con la quantificazione del DNA dell'HBV del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0.
Inibitori nucleosidici della trascrittasi
inversa e della DNA polimerasi
Inibitori nucleosidici della DNA polimerasi
Tenofovir
Adefovir dipivoxil
Lamivudina
Telbivudina
Zidovudina
Stavudina
Abacavir
Didanosina
Entecavir
Inibitori non nucleosidici della trascrittasi
inversa dell'HIV
Inibitori della proteasi per HIV
Indinavir
Saquinavir
Nevirapina
Ritonavir
Efavirenz
Inibitori della fusione dell'HIV
Amprenavir
Lopinavir/Ritonavir
Enfurvitide
Immunomodulatori
Antidepressivi
Interferone alfa-2a
Paroxetina HCl
Ribavirina
Fluoxetina
Interferone alfa-2b
Sertralina
PegInterferone alfa-2a
Composti per il trattamento dei virus
dell'herpes
PegInterferone alfa-2a + Ribavirina
Interferone alfa-2b + Ribavirina
Ganciclovir
PegInterferone alfa-2b
Valganciclovir HCl
Acyclovir
25
VALUTAZIONE DEL RENDIMENTO NON CLINICO
A.
Limite di sensibilità determinato mediante lo Standard internazionale dell'OMS
Il limite di sensibilità del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è stato determinato per il
DNA dell'HBV utilizzando diluizioni dello Standard Internazionale dell'OMS per la rilevazione del DNA del
virus dell'epatite B mediante tecniche basate sull'acido nucleico (Nucleic Acid-Based Techniques, NAT)
(NIBSC 97/746)29, genotipo A in plasma con EDTA umano o siero umano HBV-negativi. Per ogni matrice
sono state analizzate tre serie di diluizioni. In totale sono stati analizzati 72 replicati per ogni livello di
concentrazione per ogni tipo di matrice.
La concentrazione di DNA dell'HBV rilevabile con un tasso di positività superiore al 95%, secondo quanto
determinato dall'analisi PROBIT, è pari a 9 UI/ml per il plasma con EDTA (vedere la tabella 2) e a 19 UI/ml
per il siero (vedere la tabella 3).
Tabella 2
Limite di sensibilità nel plasma con EDTA del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0,
determinato mediante lo Standard Internazionale dell'OMS
Input nominale
(HBV DNA UI/ml)
30
20
10
5
2,5
Tasso di positività
PROBIT del 95%
N. di replicati
N. di positivi
% di positività
72
71
72
72
72
72
100%
71
100%
68
94%
63
88%
38
53%
9 UI/ml
(intervallo di confidenza al 95%: 6,8 – 12,1 UI/ml)
Tabella 3
Limite di sensibilità nel siero del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0,
determinato mediante lo Standard Internazionale dell'OMS
Input nominale
(HBV DNA UI/ml)
30
20
10
5
2,5
Tasso di positività
PROBIT del 95%
B.
N. di replicati
N. di positivi
% di positività
72
72
72
72
72
72
100%
70
97%
58
81%
29
40%
24
33%
19 UI/ml
(intervallo di confidenza al 95%: 11,0 – 107,1 UI/ml)
Limite di sensibilità determinato usando campioni clinici di tutti i genotipi
Sono state inoltre analizzate diluizioni di campioni clinici in plasma con EDTA e siero umani HBV-negativi,
che rappresentavano i genotipi A-H. L'analisi del tasso di positività indica una percentuale di positività che
supera il 95% per tutti i genotipi a 20 UI/ml sia nel plasma con EDTA che nel siero (vedere la tabella 4).
Sono stati analizzati 56 replicati per livello, genotipo e matrice.
26
Tabella 4
Limite di sensibilità nel plasma con EDTA e nel siero del test COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® HBV v2.0, determinato mediante i genotipi A-H
Tasso positività [%] a
24 UI/ml
Plasma con
Siero
EDTA
Tasso positività [%] a
22 UI/ml
Plasma con
Siero
EDTA
Tasso positività [%] a
20 UI/ml
Plasma con
Siero
EDTA
Genotipo A
100
100
100
100
100
100
Genotipo B
100
100
98,21
98,21
100
100
Genotipo C
100
100
100
100
100
98,21
Genotipo D
100
100
100
100
100
100
Genotipo E
100
100
98,21
100
96,43
100
Genotipo F
100
100
100
100
100
100
Genotipo G
100
100
100
100
100
98,21
Genotipo H
100
100
100
98,21
96,43
100
C.
Precisione
La precisione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è stata determinata attraverso
l'analisi di diluizioni in serie di campioni clinici di HBV (genotipo A) in plasma con EDTA e siero umani
HBV-negativi. L'assegnazione del titolo dei campioni clinici (concentrazioni degli stock) è stata effettuata
tramite un metodo che assicura la conformità allo Standard Internazionale dell'OMS per la rilevazione del
DNA del virus dell'Epatite B mediante tecniche basate sull'acido nucleico (Nucleic Acid-Based Techniques,
NAT) (NIBSC 97/746)29. Sono state eseguite 15 sedute per ogni matrice, ciascuna composta da 6 livelli di
diluizione e 3 replicati a ogni livello. Ogni campione è stato sottoposto all'intera procedura di analisi
prevista dal test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0, incluse preparazione, amplificazione
e rilevazione. Pertanto la precisione qui riferita è rappresentativa di tutti gli aspetti della procedura del test.
Lo studio è stato effettuato utilizzando tre lotti di reagenti del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV v2.0. I risultati sono mostrati nella tabella 5 (plasma con EDTA) e nella tabella 6 (siero).
Tabella 5
Precisione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
(campioni di plasma con EDTA)
Titolo
(UI/ml)
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
Lotto n. 1
% CV
totale
26
17
12
8
11
14
DS
totale
in log
0,12
0,07
0,05
0,04
0,05
0,06
Lotto n. 2
% CV
totale
28
17
11
8
11
12
27
DS
totale
in log
0,13
0,07
0,05
0,04
0,05
0,06
Lotto n. 3
% CV
totale
25
20
14
13
12
18
DS
totale
in log
0,11
0,09
0,06
0,06
0,05
0,08
Tabella 6
Precisione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 (campioni di siero)
Lotto n. 1
Titolo
(UI/ml)
D.
DS
totale
in log
0,13
0,06
0,05
0,04
0,05
0,07
% CV
totale
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
Lotto n. 2
27
13
11
10
11
15
Lotto n. 3
DS
totale
In log
0,11
0,06
0,04
0,05
0,05
0,07
% CV
totale
22
15
10
12
12
15
DS
totale
In log
0,13
0,08
0,06
0,05
0,05
0,06
% CV
totale
28
17
14
11
11
13
Intervallo lineare
Come illustrato nelle figure 10 e 11, il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 ha presentato
una risposta lineare da 20 (Log10 = 1,30) UI/ml di DNA dell'HBV a 1,7E+08 (Log10 = 8,24) UI/ml di DNA
dell'HBV sia nel plasma con EDTA che nel siero. Lo studio di valutazione, condotto secondo le Linee Guida
EP6-A del CLSI, è stato eseguito con due lotti di reagenti del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV v2.0 e diluizioni seriali di un campione di plasma con EDTA o siero di DNA dell'HBV (+) con titolo
elevato. Sono stati analizzati tredici livelli di concentrazione per il plasma con EDTA e dodici livelli per il
siero, con 10 replicati per livello.
Risultati del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
Figura 10
Linearità del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
(campioni di plasma con EDTA)
10
9
8
7
6
5
Media
4
3
2
y = 1,0183x - 0,0182
1
2
R = 0,9987
0
0
1
2
3
4
5
6
Concentrazione nominale
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
28
7
8
9
10
Risultati del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
Figura 11
Linearità del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 (campioni di siero)
9
8
7
6
5
Media
4
3
2
y = 1,0202x - 0,1142
1
2
R = 0,9987
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Concentrazione nominale
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
E.
Quantificazione del titolo del genotipo
Ad oggi, sono state proposte otto categorie di genotipi per l'HBV in base alla divergenza dei nucleotidi
all'interno del genoma superiore all'8%38, 39, 40. Questi genotipi sono designati da lettere dell'alfabeto
maiuscole dalla A alla H. I genotipi dell'HBV hanno delle distribuzioni geografiche caratteristiche41.
Le prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 sui genotipi dell'HBV sono state
valutate attraverso l'analisi di 25 DNA plasmidici purificati, linearizzati e quantificati contenenti inserti
rappresentativi di sequenze da genotipi dell'HBV dalla A alla H (vedere la tabella 7). L'assegnazione di
concentrazioni nominali delle soluzioni stock plasmidiche è stata effettuata con il metodo PicoGreen. Ogni
DNA plasmidico è stato diluito a concentrazioni nominali di 3,00E+03, 3,00E+05 e 3.00E+07 copie
PicoGreen/ml, sia nel plasma con EDTA che nel siero. Le concentrazioni (UI/ml) sono state determinate
tramite il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 usando due lotti di reagenti e i risultati
ottenuti per tutti i plasmidi sono stati messi a confronto.
La valutazione dei 25 plasmidi analizzati tramite il test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
dimostra la quantificazione equivalente di tutti i plasmidi e i genotipi per il plasma con EDTA e il siero.
29
Tabella 7
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 - Test di inclusività –
DNA plasmidici tipizzati testati
Designazione
plasmide
p8423-c1
p1115-c1
p3952-c1
p4199-c2
p1764-c1
p1767-c1
p3958-c1
p830-c1
p3982-c1
p1786-c1
p11549-1
p3872-c1
p1103-c1
p3953-c2
p18-c1
p30893-5
p4244-c1
p3217-c1
p3963-c2
p9203-c1
p479-c1
p1009-c1
p00042975-4
pEFHBV20
pITmut1896
Genotipo
A
B
C
D
E
F
G
H
Mutante
pre-core
Origine del campione
iniziale
India
Burundi
Camerun
Norvegia
Cina
Cina
Asia Orientale
Isole della Società
Vietnam
Cina
Bangladesh
Iran
Tunisia
Nord Africa
Svezia
Svezia
Danimarca
Senegal
Nigeria
Colombia
Venezuela
Spagna
Stati Uniti
Nicaragua
Italia
Inoltre per otto di questi plasmidi, che rappresentano la totalità dei genotipi, è stata dimostrata l'inclusività
su un intervallo lineare (figure 12 e 13). Per ogni plasmide, sono stati analizzati tre livelli di concentrazione
per il plasma con EDTA e il siero, con 10 replicati per livello.
30
Figura 12
Prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
sui genotipi HBV da A ad H di plasma con EDTA
0,4
Deviazione
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
0,3
Genotipo A
0,2
Genotipo B
0,1
Genotipo C
Genotipo D
Genotipo E
Genotipo F
Genotipo G
Genotipo H
+/- 0,3 log
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
7,5
Concentrazione nominale
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
Figura 13
Prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
sui genotipi HBV da A ad H di siero
0,4
Deviazione
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
0,3
Genotipo A
0,2
Genotipo B
0,1
Genotipo C
Genotipo D
Genotipo E
Genotipo F
Genotipo G
Genotipo H
+/- 0,3 log
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
2,5
3,5
4,5
5,5
Concentrazione nominale
Log10 (UI/ml di DNA dell'HBV)
31
6,5
7,5
F.
Specificità clinica
La specificità del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è stata determinata attraverso
l'analisi del plasma con EDTA e del siero HBV-negativi ricavati da donatori di sangue. In totale sono stati
sottoposti al test 647 singoli campioni di plasma con EDTA e 649 campioni di siero. I risultati di tutti
i campioni sono risultati negativi al DNA dell'HBV. Sulla base di questi risultati, la specificità del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 corrisponde al 100% con un limite di confidenza
di 99,54%.
G.
Reattività crociata
La specificità analitica del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è stata valutata mediante
l'aggiunta di organismi in coltura (virus, batteri, lieviti) o DNA (HTLV-2, 2,5E+07 cp/PCR) in plasma umano
con EDTA HBV-negativo (vedere la Tabella 8).
Nessuno degli organismi non HBV testati è risultato positivo al DNA dell'HBV.
Tabella 8
Campioni di specificità analitica
Virus
Adenovirus tipo 5
Cytomegalovirus
Virus di Epstein Barr
Virus dell'Herpes umano tipo 6
Virus dell'Herpes simplex tipo 1
Virus dell'Herpes simplex tipo 2
Virus linfotropico delle cellule T umane
tipo 1
Virus linfotropico delle cellule T umane
tipo 2
Influenza A
Virus dell'epatite A
Virus dell'epatite C
HIV-1
32
Batteri
Staphylococcus aureus
Propionibacterium acnes
Lievito
Candida albicans
H.
Correlazione di plasma con EDTA e siero
La correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 è stata valutata attraverso
l'analisi di campioni di plasma con EDTA e siero HBV-positivi. Sono stati analizzati 279 gruppi
corrispondenti di campioni prelevati da pazienti affetti da HBV. I risultati del test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 hanno mostrato una correlazione elevata tra i campioni di plasma
con EDTA e i campioni di siero (figura 14).
Figura 14
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 in plasma con EDTA
e siero Campioni ricavati da pazienti affetti da HBV (n=279)
Campione di plasma con EDTA (titolo in Log10)
9
8
7
y = 0,9834x + 0,0073
R2 = 0,9915
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
Campione di siero (titolo in Log10)
33
6
7
8
9
I.
Prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 raffrontate a quelle
del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV
Le prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 sono state confrontate con quelle
del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test30 tramite l'analisi di campioni clinici HBV-positivi
(' 54 UI/ml). Sono stati analizzati campioni di plasma con EDTA avanzati dalle diagnosi di routine presso
due laboratori esterni. I titoli dei campioni sono rientrati nell'intervallo dinamico del test COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0. L'analisi di regressione lineare è stata effettuata su 275 campioni
validi (143 testati presso un laboratorio e 132 presso l'altro) (figura 15).
Figura 15
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV su campioni di plasma con EDTA
ricavati da pazienti affetti da HBV (n=275)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Titolo del DNA dell'HBV in Log10
9,00
8,00
7,00
6,00
y = 0,9958x + 0,0443
R 2 = 0,9743
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1.,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV
Titolo del DNA dell'HBV in Log10
®
®
34
®
7,00
8,00
9,00
J.
Correlazione tra i metodi
Le prestazioni del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 sono state confrontate a quelle del
test COBAS® TaqMan® HBV per utilizzo con il sistema High Pure (HPS HBV, figure 16 e 17), a quelle del
test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR (COBAS® AMPLICOR® HBV, figure 18 e 19) e a quelle del test
VERSANT HBV DNA 3.0 Assay (figure 20 e 21) tramite analisi della regressione di campioni clinicamente
caratterizzati non diluiti, ricavati da pazienti affetti da HBV. I campioni sono stati ottenuti dalla Teragenix
(Fort Lauderdale, FL, USA). L'analisi della regressione è stata effettuata su campioni di siero e plasma con
EDTA che hanno fornito risultati all'interno dell'intervallo lineare.
Figura 16
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del test
COBAS® TaqMan® HBV per utilizzo con il sistema High Pure su campioni di plasma
con EDTA ricavati da pazienti affetti da HBV (n=146)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di plasma (titolo in Log10)
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
Y = 0,974 * X + 0,107
2
R = 0,964
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
Test HBV per utilizzo con sistema High Pure
Campione di plasma (titolo in Log10)
35
10,0
Figura 17
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del
test COBAS® TaqMan® HBV per utilizzo con il sistema High Pure
su campioni di siero ricavati da pazienti affetti da HBV (n=142)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di siero (titolo in Log10)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
Y = 0,987 * X + 0,023
2
R = 0,967
1
0
0
2
4
6
8
Test HBV per utilizzo con sistema High Pure
Campione di siero (titolo in Log10)
36
10
Figura 18
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del
test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR su campioni di plasma
con EDTA ricavati da pazienti affetti da HBV (n=143)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di plasma (titolo in Log10)
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Y = 0,899 * X + 0,546
R 2 = 0,872
0,5
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
Test COBAS AMPLICOR HBV
Campione di plasma (titolo in Log10)
®
37
®
5,0
Figura 19
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del
test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR su campioni di siero ricavati
da pazienti affetti da HBV (n=154)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di siero (titolo in Log10)
6
5
4
3
2
1
Y = 0,911 * X + 0,461
2
R = 0,821
0
0
1
2
3
4
Test COBAS® AMPLICOR® HBV
Campione di siero (titolo in Log10)
38
5
6
Figura 20
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0 e del
test VERSANT HBV DNA 3.0 Assay su campioni di plasma
con EDTA ricavati da pazienti affetti da HBV (n=138)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di plasma (titolo in Log10)
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
Y = 0,892 * X + 0,260
R 2 = 0,810
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Test VERSANT HBV DNA 3.0 Assay
Campione di plasma (titolo in Log10)
39
7,0
8,0
Figura 21
Correlazione del test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV v2.0
e del test VERSANT HBV DNA 3.0 Assay su campioni di siero
ricavati da pazienti affetti da HBV (n=138)
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Campione di siero (titolo in Log10)
8
7
6
5
4
3
2
Y = 0,913 * X + 0,125
R 2 = 0,837
1
0
0
1
2
3
4
5
6
Test VERSANT HBV DNA 3.0 Assay
Campione di siero (titolo in Log10)
40
7
8
BIBLIOGRAFIA
1.
Lee, W. 1997. Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337:1733-1745.
2.
http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf.
3.
Beasley, R.P. 1988. Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer.
61:1942-1956.
4.
Wong, D.H.K., Cheung, A.M., O'Rourke, K., et al. 1993. Effect of alpha-interferon treatment in
patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal
Medicine. 119:312-323.
5.
Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D. 1999. Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look
promising. British Medical Journal. 319:799-800.
6.
McMahon, B.J. 1998. Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are
they really "off the hook"? Hepatology. 28:265-267.
7.
Huo, T., Wu, J., Lee, P. et al. 1998. Sero-clearance of hepatitis B surface antigen in chronic carriers
does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28:231-236.
8.
Niederau, C., Heintges, T., Lange, S. et al. 1996. Long-term follow-up of HBeAg-positive patients
treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334:14221427.
9.
Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G. et al. 1997. Long term outcome of hepatitis B e antigen-positive
patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26:1338-1342.
10.
Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C. 1992. The clinical significance of molecular variation
within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15:144-148.
11.
Hoofnagle, J.H. 1990. Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and
recommendations. Hepatology. 11:S100-S107.
12.
Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J. et al. 1985. Hepatitis B virus DNA in serum from patients
with acute hepatitis B. Hepatology. 5:10-13.
13.
Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F. et al. 1996. The value of quantitative detection of HBV-DNA
amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24:680-685.
14.
Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M. et. al. 1997. Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase
chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus
carriers. American Journal of Gastroenterology. 92:119-123.
15.
Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R. et al. 1995. Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide
range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent
infection. Hepatology. 21:1492-1499.
16.
Mason, A.L., Xu, L., Guo, L. et al. 1998. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in
the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27:1736-1742.
17.
Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T. et al. 1999. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B
viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology.
58:325-331.
18.
Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G. et al. 1989. Natural course and response to interferon of chronic
hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10:198-202.
19.
Saracco, G., Mazzella, G., Rosina, F. et al. 1989. A controlled trial of human lymphoblastoid
interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10:336-341.
20.
Perrillo, R., Schiff, R., Davis, G. et al. 1990. A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone
and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of
Medicine. 323:295-301.
21.
Perez, V., Tanno, H., Villamil, F. et al. 1990. Recombinant interferon alfa-2b following prednisone
withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S117.
22.
Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M. et al. 1997. Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B
Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology.
25:241-244.
23.
Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V. et al. 1999. The role of HBV DNA quantitative PCR in
monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of
Hepatology. 30:965-969.
41
24.
Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K., and Papakonstantinou, A. 1999. Oral ganciclovir treatment in
chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31:210-214.
25.
Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G. et al. 2003. Adefovir Dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e
antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348:808-816.
26.
Puchhammer-Stockl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J. et al. 2000. Monitoring the virus load can predict
the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during
lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181:2063-2066.
27.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection
of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
28.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome
Research 6:986-994.
29.
Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A., and the WHO Collaborative
Study Group. 2001. An international collaborative study to establish a World Health Organization
international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox
Sanguinis 80:63-71.
30.
Hochberger, S., Althof, D., Gallegos de Schrott, R., Nachbaur, N., Röck, H. and Leying, H. 2006. Fully
automated quantitation of Hepatitis B virus (HBV) DNA in human plasma by the COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® System. Journal of Clinical Virology 35:373-380.
31.
Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, Fried M, Schinazi RF, Rossau R. 2000. A new genotype
of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. Journal of General Virology
81:67-74.
32.
Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H. and Myers, T.M. 2003. Amplification of RNA:
Hightemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated
Thermostable DNA Polymerase. PCR Primer, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring
Harbour Laboratory Press: Section 16.
33.
Meng, Q., Wong, C., Rangachari, A. et al. 2001. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous
Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus
Type 1 RNA. Journal of Clinical Microbiology. 39:2937-2945.
34.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control
carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
35.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
36.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From
Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3
Wayne, PA:CLSI, 2005.
37.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
38.
Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M. 1988.
Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen
subtypes. Journal of General Virology 69:2575-2583.
39.
Norder H, Courouce AM, Coursaget P, Echevarria JM, Leef S-D, Mushahwar IK, Robertson BH,
Locarnini S, Magnius LO. 2004. Genetic Diversity of Hepatitis B Virus Strains Derived Worldwide:
Genotypes, Subgenotypes, and HBsAG Subtypes . Intervirology 47:289-309.
40.
Schaefer S. 2007. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol
13(1):14-21.
41.
Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Courouce AM, Mushahwar IK, Magnius LO. 1993. Genetic
relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the
primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74: 1341-1348.
42
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Un membro del Gruppo Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics S.L.
Av. de la Generalitat, s/n
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, COBAS, AMPLIPREP, HIGH PURE e TAQMAN sono marchi
Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER è un marchio di servizio Roche.
Armored RNA è una tecnologia brevettata co-sviluppata da Ambion, Inc. e da Cenetron Diagnostics, LLC.
Brevetti USA n. 5,677,124, n. 5,919,625, n. 5,939,262, n. 6,214,982, n. 6,399,307 e altre richieste di brevetti
in corso di approvazione. Armored RNA® è un marchio registrato di Ambion e Cenetron.
Microsoft e Windows sono marchi o marchi registrati di Microsoft Corporation negli Stati Uniti d'America
e/o in altre nazioni.
ProClin® è un marchio registrato di Rohm and Haas Company.
SST® è un marchio depositato di Becton Dickinson and Co.
VERSANT® è un marchio registrato di Bayer Corporation.
I coloranti a base di cianino di questo prodotto sono coperti da brevetto intestato a GE Healthcare BioSciences Corp. e Carnegie Mellon University e sono concessi in licenza a Roche esclusivamente per l'uso
nei componenti dei kit di ricerca e nei kit di diagnostica in-vitro. Qualsiasi impiego di tali kit per scopi
diversi dalla ricerca e dalla diagnostica in vitro dovrà essere approvato tramite il rilascio di licenze
secondarie da parte di GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. e di Carnegie
Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, U.S.A.
43
Alcuni componenti di questo prodotto sono protetti da uno o più brevetti USA e dai brevetti esteri
corrispondenti, di proprietà di Isis Pharmaceuticals e concessi in licenza a Roche Molecular Systems, Inc.
La tecnologia per la prevenzione del carryover, protetta dal Brevetto USA 5,035,996 e dai brevetti corrispondenti
all'estero di proprietà di Life Technologies, Inc., è concessa in licenza a Roche Molecular Systems, Inc.
Copyright 2009, Roche Molecular Systems, Inc. Tutti i diritti riservati.
3/2009
05382874001-02
Doc Rev. 2.0
44