Il ciclo dell’acido citrico Il ciclo dell’acido citrico • Come visto in precedenza alcune cellule ricavano energia (ATP) dalla fermentazione in particolare digerendo il glucosio in assenza di ossigeno. Per molte cellule eucariotiche e molti batteri la glicolisi è solo il primo step della completa ossidazione del glucosio. Il piruvato prodotto dalla glicolisi, invece di essere fermentato a alcol etilico, acido lattico o altro è ulteriormente ossidato, in presenza di ossigeno, fino a dare anidride carbonica e acqua. • In presenza di ossigeno possiamo distinguere 3 fasi del catabolismo: Formazione dell’acetil CoA da vari substrati Ossidazione dell’acetil CoA durante il ciclo dell’acido citrico Fosforilazione ossidativa Il Coenzima A Acido pantotenico Il CoA è un importante coenzima formato (cominciando da destra) da una base purinica, l’adenina, il ribosio fosforilato in posizione 2’ due fosfati, l’acido pantotenico (che è una vitamina) e la cisteamina. Cisteamina e acido pantotenico insieme formano la cosidetta panteteina. Cisteamina Coenzima A • Il CoA ha la proprietà di formare tramite il suo gruppo SH legami tioestere con gruppi carbossilici. Si ricorda che il legame tioestere ha caratteristiche peculiari. Si tratta di un legame altamente energetico la cui idrolisi comporta un ∆G°’ di – 31 Kcal/mole. Vediamone il perché strutturale Legame tioestere Rispetto all’estere il tioestere non ha una stabilizzazione per risonanza. Questo comporta che la sua idrolisi libera più energia: quella che nell’estere con l’ossigeno è la stabilizzazione per risonanza (in celeste in figura) Legame tioestere • Ricordate, quindi, che come per l’ATP la formazione di un legame altamente energetico quale quello fosfoanidridico o tioesterico comporta sempre che ci sia una grande quantità di energia impiegata. Quando incontrate che si forma ATP o un tioestere chiedetevi sempre come si sia potuto formare, da quale processo chimico derivi l’energia chimica necessaria alla formazione di questi legami. La formazione dell’acetilCoA dal piruvato Questa reazione, apparentemente semplice, è invece molto complessa: come vedete viene decarbossilato l’acido piruvico che è il prodotto della glicolisi. La sua decarbossilazione ad acetile comporta l’uso di un complesso multienzimatico: la piruvico deidrogenasi. Piruvico deidrogenasi • Questo complesso multienzimatico richiede cinque coenzimi: il Coenzima A, la tiamina pirofosfato, l’acido lipoico, il FAD e il NAD. • Si ricorda che i coenzimi NAD e FAD sono i coenzimi delle deidrogenasi e, quindi, si trovano in reazioni di ossido-riduzione. In questo caso, il gruppo chetonico dell’acido piruvico viene ossidato a gruppo carbossilico acido con contemporanea decarbossilazione del gruppo in alfa del substrato piruvato Il Coenzima A L’Acido Lipoico L’Acido lipoico è un acido ottanoico con due gruppi SH separati da un CH2. La sua caratteristica è di poter formare legami tioestere e in più di potersi ossidare nella sua forma disolfuro (ponte –S—S-) La tiamina pirofosfato (derivato della vitamina B1) Il gruppo reattivo della tiamina pirofosfato è il carbonio indicato in rosso: l’idrogeno in rosso è un idrogeno acido. Il carbanione derivante dall’uscita del protone è stabilizzato dall’azoto e lo zolfo con un concomitante effetto elettron- attrattore dell’anello adiacente. Decarbossilazione dell’acido piruvico (Enzima 1, piruvico decarbossilasi) • Durante questa prima fase della reazione multienzimatica il piruvato si lega alla tiamina pirofosfato. Il carbanione dell’anello tiazolico della tiamina attacca il carbonio chetonico del piruvato come si vede nelle figure seguenti. • Una volta legato, il piruvato subisce una decarbossilazione con formazione di un intermedio detto idrossietil TPP che, se idrolizzato, darebbe acetaldeide. Quindi al coenzima TPP si legano delle cosidette aldeidi attivate. Questo coenzima si ritrova anche in altri processi che vedremo in seguito. Step 2: l’enzima diidrolipoiltransacetilasi. • L’idrossietil-TPP trasferisce a questo punto l’aldeide attivata sull’acido lipoico in forma ossidata che si riduce e forma un tioestere. Questo secondo step è uno step di ossidazione: il gruppo aldeidico attivato, infatti, viene ossidato a gruppo carbossilico acido che può reagire con il gruppo SH dell’acido lipoico per dare un tioestere. I due elettroni rimossi dall’aldeide durante l’ossidazione vengono trasferiti all’acido lipoico ossidato che si riduce e, quindi, può legare il gruppo carbossilico formando il tioestere. • Dunque: avviene un’ossidazione del substrato con contemporanea riduzione dell’acido lipoico; si forma un tioestere che per formarsi usa l’energia derivante dall’ossidazione del substrato. Questa reazione è molto efficiente perché oltre ad essere una ossidoriduzione anche l’energia derivante dalla ossidazione viene recuperata sottoforma di legame altamente energetico. SCHEMA DI REAZIONE DELLA PIRUVICO DIDROGENASI Step 3 diidrolipoil deidrogenasi • Lo step 3 che potete vedere nello schema precedente comporta la riossidazione dell’acido lipoico che riforma il ponte disolfuro, la contemporanea riduzione del FAD a FADH2 e il trasferimento del tioestere all’acetil CoA. • In sintesi il gruppo acetile che prima stava sull’acido lipoico legato tramite un tioestere viene trasferito al CoA, sempre legato al suo gruppo SH tramite un tioestere, Contemporaneamente i gruppi SH dell’acido lipoico vengono ossidati a ponte disolfuro e gli elettroni trasferiti al FAD che si riduce. Il FAD fa parte di questo terzo enzima. Trasferimento degli elettroni al NAD • Nell’ultima fase di questa complessa reazione gli elettroni dal FADH2 passano al NAD che così si riduce a NADH. • Ricordate che la riduzione del NAD da parte del FADH2 è un evento che può avvenire se e solo se le concentrazioni dei due reagenti lo permettono. Infatti guardando ai loro potenziali standard sarebbe possibile solo la riduzione del FAD da parte del NADH, ma cambiando le concentrazioni il potenziale reale può essere diverso da quello standard. In particolare il FAD in questa reazione risulata legato all’enzima mentre il NAD è libero. Schema generale del ciclo dell’acido citrico • Una volta che il piruvato derivante dalla glicolisi ma, come vedremo anche da altri processi metabolici, è stato trasformato in acetil-CoA, subisce una serie di reazioni che nell’insieme vengono dette “ciclo dell’acido citrico” o “ciclo di Krebs” nel quale, in ultimo, il gruppo acetile (che anch’esso può avere derivazioni diverse che quella dal piruvato) viene ossidato ad anidride carbonica ed acqua. • Un buon esercizio per voi studenti è di scrivere tutte le reazioni che adesso andremo ad esaminare colorando in rosso i carboni del gruppo acetile legato al CoA per vedere che fine fanno durante il ciclo. • Il ciclo viene detto dell’acido citrico perché la prima reazione che subisce il gruppo acetile è di condensazione con l’ossalacetato per dare, appunto, il citrato come si vede nella figura successiva. La reazione ha un ∆G negativo derivante dalla contemporanea condensazione e idrolisi del legame tioestere altamente energetico. L’idrolisi del legame tioestere rende la reazione fortemente spostata verso la formazione del citrato e forza il gruppo acetile a entrare nel suo ciclo di ossidazione L’enzima citrato sintasi Le figure riportano la struttura cristallografica dell’enzima citrato sintasi. La “a” è l’enzima libero, la “b” è l’enzima legato al substrato (in giallo l’ossalacetato in rosso un analogo del CoA). Si noti il cambiamento conformazionale dell’enzima dopo che lega il substrato. Quando l’enzima lega il primo substrato che è l’ossalacetato si ha un grande cambiamento conformazionale che porta alla creazione del sito di legame dell’acetil-CoA. Una volta che si è formato l’intermedio citroilCoa si ha un nuovo cambiamento conformazionale che porta un residuo di aspartato in una posizione cruciale che permette l’idrolisi del tioestere. Dal citrato all’isocitrato tramite l’enzima aconitasi Ricordate che l’aconitasi è una proteina Ferro-Zolfo. Questo tipo di proteine le rincontreremo anche in seguito. Nella figura che segue trovate la struttura del cosidetto CLUSTER ferro zolfo dell’enzima aconitasi. Domandatevi a quale classe di enzimi appartiene l’aconitasi L’ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato tramite la isocitrato deidrogenasi Notate che gli elettroni derivanti dall’ossidazione vengono trasferiti al NAD o al NADP (ripassate le strutture dei due coenzimi) e che la reazione ha una variazione di energia libera standard molto negativa. Notate che qui la decarbossilazione è più facile rispetto a quella del piruvato, infatti dopo l’ossidazione dell’isocitrato il carbonio interessato diviene chetonico da alcolico e il gruppo carbossilico che poi esce come anidride carbonica diviene un gruppo carbossilico in beta. Vi ricordo che i beta cheto-acidi decarbossilano spontaneamente La reazione dell’α-cheto glutarato deidrogenasi Questa reazione è del tuto simile a quella della piruvato deidrogenasi. Viene catalizzata da un sistema multienzimatico che ha esattamente gli stessi coenzimi di quelli visti per la decarbossilazione/ossidazione del piruvato. La formazione del primo GTP Il GTP è analogo all’ATP e contiene i legami altamente energetici utili poi per moltissimi scopi. In questa reazione il gruppo fosfato libero si lega al GDP usando l’energia derivante dall’idrolisi del legame altamente energetico presente come tioestere sul succinil CoA. Vi ricordo che il GTP è un nucleotide formato da Guanina, ribosio e tre gruppi fosfato La succinato deidrogenasi produce FADH2 e fumarato La fumarasi produce malato La malato deidrogenasi produce NADH e ossalacetato, chiudendo il ciclo Schema riassuntivo Resa • Come avete potuto studiare durante un intero ciclo nel quale l’acetilCoa si condensa con l’ossalacetato e si ossida a CO2, si hanno in uscita: due molecole di anidride carbonica, un GTP (che poi è un ATP), 3 NADH e un FADH2. • Cosa vuol dire questo? • • Vi ricordo che negli organismi anaerobi o in condizione anaerobie, dopo la glicolisi il piruvato viene fermentato. Questo accade anche nei nostri muscoli scheletrici in carenza di ossigeno dove il iruvato viene ridotto a lattato con contemporanea ossidazione del NADH. Perché avviene ciò? Il NADH e il FADH2 devono essere in continuazione riossidati per dar modo ai vari cicli ossidativi di andare avanti. Se non fossero efficientemente riossidati ben presto non si avrebbe più nella cellula neanche una molecola di coenzima ossidato disponibile per le attività di ossidazione proprie del metabolismo. Gli organismi aerobi in condizioni normali riossidano questi cofattori trasportando gli elettroni sottratti all’ossigeno molecolare che con quattro elettroni può ridursi ad acqua. Questo processo, che nelle cellule eucariotiche avviene nei mitocondri, è molto efficiente. Il trasporto degli elettroni avviene a step durante i quali lo stesso trasporto è accoppiato, tramite un meccanismo che vedremo in seguito, alla sintesi di ATP. Per ogni NADH che viene ossidato si generano nel trasporto degli elettroni 3 ATP e 2 ne provengono invece dal FADH2. Quindi si può facilmente calcolare che un ciclo di Krebs produce quando è efficiente 12 ATP, per ciascun acetil-CoA che entra, non usando nessun legame altamente energetico per attivare il substrato. • La tabella che segue vi illustra proprio la resa in ATP dell’intero processo di ossidazione di una molecola di glucosio, a partire dalla sua attivazione a glucosio-6-fosfato a finire alla produzione di CO2 nel ciclo di Krebs. Vi faccio notare che in tabella a partire dalla gliceraldeide-3-fosfato tutte le rese sono raddoppiate. Da una molecola di glucosio, infatti, a 6 atomi di carbonio, si producono due molecole di gliceraldeide e conseguentemente due molecole di Acetil-CoA che si ossida nel ciclo dell’acido citrico. • Noterete anche che per ogni NADH vengono calcolate 2,5 molecole di ATP che si formano durante la riossidazione e dal FADH2 1,5. Questo perché l’autore tiene conto dell’efficienza media del processo. Questo aspetto lo vedremo bene studiando la catena di trasporto degli elettroni. Altre caratteristiche del ciclo di Krebs. • • • • Il ciclo appena visto è un ciclo che serve sì a ossidare l’acetile legato al CoA, ma anche a produrre importanti intermedi catabolici. Un esempio per tutti. Prendiamo ad esempio l’ossalacetato che viene prodotto dall’ossidazione del malato: Si tratta di una molecola organica a quattro atomi di carbonio che contiene due gruppi carbossilici acidi. Se ci pensate bene l’acido ossalacetico somiglia molto all’acido aspartico, uno dei venti aminoacidi che abbiamo studiato. Se solo al gruppo chetonico sostituite un gruppo aminico Vedremo in seguito che l’ossalacetato può essere trasformato in aspartato da un processo di transaminazione. Lo stesso dicasi per l’α−chetoglutarato che può essere transaminato a glutammato. Isnomma gli intermedi del ciclo di Krebs sono importanti nel nostro metabolismo. Quando gli intermedi del ciclo vengono rimossi per altri scopi essi stessi possono essere reintegrati attarverso reazioni anaplerotiche e per mezzo di questi meccanismi le concentrazioni degli intermedi del ciclo romangono pressochè costanti. Alcune reazioni anaplerotiche sono mostrate nella tabella che segue la figura • REAZIONI DI CARBOSSILAZIONE: Esse dipendono da una vitamina, la Biotina che solitamente è legata all’enzima che catalizza la reazione attraverso il gruppo εaminico di una lisina. La Biotina è capace di legare lo ione bicarbonato attivandolo poi per il trasferimento sul substrato da carbossilare. • Il legame della molecola inorganica alla biotina ha bisogno di energia che viene fornita attraverso l’idrolisi di ATP ad ADP + Pi