Thesis - Envirochange

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MODENA E REGGIO EMILIA
Facoltà di Agraria
Corso di Laurea Specialistica in Produzioni Vegetali Innovative
ISOLAMENTO DI POTENZIALI MICRORGANISMI
ANTAGONISTI DA CARPOFORI DI
Armillaria mellea (Vahl: Fr.) Kumm
Dissertazione di Laurea di
VALERIA GUALANDRI
Matr. n. 5421
Relatore: Chiar.mo Prof. MARIO FERRARI
Correlatore: Dott.ssa ILARIA PERTOT
Anno Accademico 2004/2005
Indice
INDICE
1. ABSTRACT/RIASSUNTO
pag. 2
2. INTRODUZIONE
pag. 4
3. SCOPO DELLA TESI
pag. 17
4. MATERIALI E METODI
pag. 18
5. RISULTATI E DISCUSSIONE
pag. 24
6. CONCLUSIONI
pag. 36
7. BIBLIOGRAFIA
pag. 38
8. RINGRAZIAMENTI
1
Abstract/riassunto
1. ABSTRACT/RIASSUNTO
1.1. ABSTRACT
Armillaria mellea is the causal agent of root rots of several perennial woody plants.
On grapevine A. mellea infections cause reduction of plant vigor, poor grape quality
and, in the last stage, the dead of the plant. Chemical control is not effective and the
available control measures are based on long rotations with non-susceptible crops.
The use of biocontrol agents could be an additional tool to prevent infections in the
new plantations. Several microorganisms were shown to be antagonistic to A. mellea,
in controlled conditions both in vitro and in planta, but in the field their effect is
usually weak and short lasting. To identify highly aggressive hyperparasites, 109
microrganism were colected from basidiocarps on infected grapevine (13) and on
apple (1), then isolated and identified. Their potential biocontrol activity against A.
mellea was preliminary screened in vitro in dual culture on Petri dishes. Then the
most effective microorganisms were tested on wood portions inoculated with the
pathogen at three different temperatures (the optimal temperature for A. mellea, the
most frequent high and low temperatures in the soil in infected vineyards in
Trentino). Finally the most promising ones were tested on artificially infected
strawberry plants. Filamentous fungi and bacteria were more frequent than yeasts on
A. mellea fruiting bodies. Aspergillus, Penicillium and Alternaria species, even if
effective in controlling the disease, were not selected because unsuitable as
biocontrol agents. The biocontrol efficacy was in general higher at the low
temperature (10 °C), mainly because the pathogen growth is strongly inhibited. Few
microorganisms
(Gliocladium
sp.,
Trichothecium
roseum,
Cladosporium
cladosporioides, an unidentified bacterium, an unidentified Actinomyces and a sterile
mycelium) showed a promising antagonistic activity against the pathogen. On
infected strawberry plants, only two microorganisms (Gliocladium sp. and
Trichothecium roseum) showed a promising biocontrol activity.
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Abstract/riassunto
1.2. RIASSUNTO
Armillaria mellea è agente causale di marciumi radicali di numerose piante erbacee e
arboree. Sulla vite le infezioni di A.mellea causano riduzione del vigore e calo nella
produzione, fino alla morte della pianta. Attualmente non esiste nessun tipo di
controllo chimico e l’unica misura di prevenzione si basa su lunghe rotazioni con
colture non suscettibili.
L’utilizzo di agenti di difesa biologica può essere un potenziale mezzo di lotta e
protezione delle piante da nuove infezioni. Diversi microrganismi hanno mostrato
un’azione di antagonismo nei confronti di A. mellea, sia in vitro sia in pianta, ma in
campo il loro effetto è di solito debole e di ridotta durata.
Al fine di identificare iperparassiti aggressivi, 14 corpi fruttiferi di A. mellea, sono
stati raccolti in Trentino, ai piedi di piante di vite (13) e di melo (1) infetti, e da
questi sono stati isolati 109 microrganismi.
La loro potenziale attività antagonistica nei confronti di A. mellea è stata
preliminarmente valutata in vitro con test in coltura duale. Quindi gli organismi
risultati migliori sono stati testati con test in coltura duale con tronchetto a tre diverse
temperature (la temperatura ottimale per A. mellea, la temperatura più alta e la più
bassa, rilevata con maggiore frequenza in suoli di vigneti infetti del Trentino). I
microrganismi risultati migliori a questa prova sono stati testati su piante di fragola
artificialmente infettate. Gli organismi isolati sono stati identificati, i funghi
filamentosi e i batteri sono i più rappresentati, rispetto ai pochi lieviti trovati Le
specie di Aspergillus, Penicillium e Alternaria pur mostrando un buon controllo del
patogeno non sono stati selezionati, perché non utilizzabili come agenti di difesa
biologica.
L’efficacia antagonistica è in genere elevata alla temperatura più bassa in esame
(10°C), probabilmente perché la crescita del patogeno è inibita a questa temperatura.
Pochi microrganismi (Gliocladium sp., Trichothecium roseum, Cladosporium
cladosporioides, un batterio, un Actinomyces e un micelio sterile) hanno mostrato
una promettente attività di antagonismo nei confronti del patogeno. Nel test in pianta
solo due microrganismi (Gliocladium sp., Trichothecium roseum) si sono dimostrati
potenziali organismi antagonisti.
3
Introduzione
2.INTRODUZIONE
2.1. I MARCIUMI RADICALI DELLA VITE (Armillaria mellea)
2.1.1. Agente causale
Il
genere
Armillaria
(Basidiomycota,
classe
Homobasidiomycetes,
ordine
Tricholomatales, famiglia Tricholomataceae) è composto da oltre 40 specie, delle
quali otto sono presenti in Europa (A. borealis, A. cepistipes, A. lutea, A. mellea, A.
ostoyae, A. ectypa, A. nigropunctata e A. tabascens), tutte agenti causali di marciumi
radicali in un ampio numero di ospiti, con livelli di patogenicità diversi in ognuno di
essi [Fox, 2000]. Le specie appartenenti al genere Armillaria possono causare
infezioni a più di 500 specie di piante forestali, sia conifere che latifoglie, come
quercia, frassino, abete rosso e larice, ed in numerose piante arboree coltivate. Il suo
aerale di distribuzione comprende: Europa, Nord America, Asia del Nord, Giappone
ed Africa. Le specie di Armillaria si possono trovare in una gran varietà di suoli
agrari e forestali [Ono, 1965]. In Trentino la presenza di A. mellea è stata segnalata,
oltre che su vite [Chini e Clauser, 1983], su susino, melo, ciliegio, albicocco [Pertot,
comunicazione personale] su kiwi, su mirtillo [De Luca e Pertot, 2004] e su mora e
lampone [De Luca et al., 2005].
A. mellea (Vahl: Fr.) Kummel [sin.: Armillariella mellea (Vahl: Fr.) Karsten] è un
fungo polifago e obiquitario che possiede comportamento sia parassita sia saprofita.
E’ il più comune e diffuso agente di marciumi radicali fibrosi di piante arboree ed
arbustive forestali ed agrarie [Matta, 1996]. Essendo in grado di attaccare più di 200
specie [Shaw e Kile, 1991] sono pochi gli alberi e gli arbusti che rimangono immuni
agli attacchi di questo patogeno [Raabe, 1962] ed i danni in ambito forestale ed
agrario possono essere elevati [Fox, 1990]. Il marciume radicale fibroso causato da
A. mellea è una malattia endemica nelle foreste. Può anche causare danni a frutteti
piantati su terreni disboscati.
4
Introduzione
2.1.2. Biologia ed epidemiologia
Tutte le specie di Armillaria sono eterotalliche, quindi, affinché si verifichi
un’infezione primaria, è necessario che due tipi sessualmente compatibili formino
un’ifa diploide. Soltanto dopo lo sviluppo del micelio diploide, il fungo è in grado di
sopravvivere e si svilupparsi nel terreno, su matrici vegetali morte, e propagarsi a
“macchia d’olio” tramite le rizomorfe [Goidànich et al., 1990].
A. mellea ha un micelio di colore biancastro, con una caratteristica forma a ventaglio
ed è in grado di produrre rizomorfe che si uniscono a formare una fitta ed estesa rete
nel terreno [Smith et al., 1992]. Le rizomorfe sono strutture altamente differenziate
composte da tre strati visibili al microscopio ottico e/od elettronico: corteccia,
sottocorteccia e midollo. La corteccia, lo strato più esterno, è circondata da materiale
mucillaginoso ed è formata da cellule molto compatte che proteggono la porzione
interna della rizomorfa dall’attacco di microrganismi antagonisti [Shaw III, 1991].
Allo strato sottocorticale segue una zona midollare composta da micelio biancastro,
costituito da ife con diametro maggiore e coinvolte nel trasporto di acqua e nutrienti
[Jennings e Rayner, 1984]. Tuttavia queste strutture non sono sempre evidenti
quando l’infezione è in atto [Fox et al., 1994]. Ioni ed altre sostanze in soluzione
vengono assorbiti dalle rizomorfe [Rizzo et al., 1992] e traslocati all’interno di
queste strutture [Granlund et al., 1985; Cainery et al., 1988; Gray et al., 1996].
L’abbondanza di produzione delle rizomorfe varia da specie a specie, A. lutea e A.
cepistipes producono più rizomorfe rispetto a A. ostoyae e A. mellea [Gregory, 1985;
Guillaumin et al., 1989]. Le diverse specie di Armillaria possono sviluppare
rizomorfe dicotomiche o monopodiali.
L’insediamento della malattia è favorito dalla presenza di lesioni radicali o da uno
stato di debilitazione della pianta ospite. La penetrazione avviene per azione
meccanica e litica, tramite le rizomorfe e l’azione di enzimi e tossine prodotte dal
micelio [Matta, 1996]. Superata la corteccia il fungo da avvio dell’infezione. Il
patogeno può agire da saprofita, degradando lo xilema di piante morte e, da
parassita, distruggendo il cambio di piante vive. A. mellea è un fungo decompositore
di tessuti lignificati e che abbisogna di un tessuto legnoso per sopravvivere. Può
sopravvivere nelle radici in decomposizione per oltre 50 anni [Shaw III, 1991].
Alla base delle piante deperenti o morte A. mellea può formare le fruttificazioni
(carpofori). Il gambo del carpoforo è slanciato, fibroso, elastico, midolloso,
5
Introduzione
assottigliato verso la base quando cresce in cespi, allargato e bulboso alla base se
solitario; roseo e striato in alto, brunastro e più scuro in modo crescente dall’anello al
piede, tipicamente alto dai 7 fino ai 18 cm. Il cappello misura 5-15 cm di diametro, è
convesso ma diventa piano e umbonato con l’età, con margine ondulato, striato ed
infine fessurato. Elastico e viscoso, è ricoperto talvolta a piccole squame irte presenti
nell'umbone centrale del cappello che in parte scompaiono con la maturità.
A. mellea è un fungo che produce carpofori ad elevata variabilità morfologica legata
soprattutto all’ospite, di colore variabile da giallo miele a olivaceo, gambo lungo
provvisto di anello [Matta, 1996] e imenio lamellare sulle cui lamelle sono portati i
basidi e le basidiospore. Comunemente i corpi fruttiferi di A. mellea sono conosciuti
con il nome di “chiodini” o “famigliole buone” o “funghi della ciocca” [Chini e De
Clauser, 1983]. Producono spore delle dimensioni di 7-9,5 x 5-7 µm, bianche, lisce,
ellittiche. I corpi fruttiferi si formano esclusivamente in tarda estate-autunno in
quanto vincolati a particolari condizioni di temperatura ed umidità, riscontrabili in
questo periodo dell’anno e rimangono presenti per poco tempo [Shigo e Tippett,
1981; Fox, 1990].
A. mellea predilige ambienti umidi e temperature moderate che vanno dai 20 ai
25°C, con un optimum di 23°C [Rischbeth, 1968].
Le sorgenti di inoculo per le nuove infezioni sono le rizomorfe ed il micelio
proveniente dalle ceppaie o dalle radici morte. Questa è una forma di disseminazione
abbastanza lenta e circoscritta alla sorgente d’inoculo, opposta a quella dalle
basidiospore che, sebbene in quantità pressoché irrilevante, possono diffondere il
parassita su lunga distanza [Matta, 1996]. La diffusione dipende da molti fattori:
umidità, temperatura, quantità di inoculo, sesto d’impianto, velocità di crescita
dell’apparato radicale, densità d’impianto, composizione chimica e microbica del
suolo della rizosfera. Eccessiva umidità del suolo, gli stress idrici sia in eccesso sia
in difetto, elevate densità d’impianto, elevate concentrazioni di inoculo tendono a
favorirne la diffusione della malattia.
2.1.3. Sintomatologia
Le piante infette da A. mellea manifestano uno stato di sofferenza generalizzato e,
dopo un certo intervallo di tempo, muoiono [Goidànich et al., 1990].
6
Introduzione
L’osservazione della radice fornisce un quadro più chiaro per l’identificazione della
malattia, Infatti, già ad un primo esame superficiale, la radice appare più scura,
friabile e facilmente estraibile dal terreno, rispetto ad una radice sana. Inoltre,
soprattutto in condizioni d’elevata umidità, annusando la radice è possibile percepire
un forte profumo di fungo fresco. Il micelio e le rizomorfe sono spesso visibili sulla
superficie.
L’unico sintomo specifico della malattia è la presenza di abbondante micelio
biancastro o bianco crema, fibroso o lanoso, nella zona sottocorticale del colletto e/o
delle radici. L’osservazione è facilitata dall’uso di un coltellino per rimuovere la
corteccia a livello del colletto e delle radici principali. La presenza del patogeno può
essere ulteriormente confermata dallo sviluppo dei corpi fruttiferi alla base delle
piante affette. Nel caso in cui si sospetti la presenza di A. mellea, ma non si
rinvengono prove evidenti come micelio o rizomorfe, è possibile stimolarne la
produzione di mettendo il campione in oggetto in camera umida per almeno due
settimane.
Su vite le piante malate hanno uno sviluppo stentato e, con l’inizio dei mesi più
caldi, manifestano avvizzimento generalizzato con precoce arrossamento o
ingiallimento del fogliame; le foglie si chiazzano di rosso intenso e tendono a
perdere turgore anticipatamente rispetto al classico viraggio fisiologico autunnale. I
tralci hanno difficoltà a lignificare e i pochi grappoli prodotti sono piccoli e spargoli,
le foglie sono più piccole e chiare, cresce la sensibilità a stress idrici e al freddo e
frequente è la presenza di disseccamenti di parti della pianta. Può manifestarsi con il
deperimento delle radici assorbenti fino alla perdita completa della funzionalità e
apoplessia. Aumenta in queste piante la sensibilità a stress idrici e danni da freddo.
Il tempo che intercorre tra comparsa dei sintomi e la morte della pianta non è
prevedibile. Molti sono i fattori che influenzano il decorso della malattia: la quantità
di inoculo presente, l’estensione e la zona di infezione, le condizioni ambientali e
pedoclimatiche e la microflora presente nello spazio circostante l’apparato radicale.
La morte della pianta infetta avviene principalmente in due periodi e secondo due
modalità: può realizzarsi lentamente dopo anni dall’infezione, in genere in tardo
inverno o primavera quando la richiesta di assorbimento da parte della pianta è
massima e la radice ormai compromessa non riesce a far fronte ad essa, o in tempi
più brevi, in genere in piena estate, per apoplessia o “colpo apoplettico”, quando la
vite collassa rapidamente con ancora foglie e grappoli attaccati. (Fig. 1, 2, 3, 4, 5, 6)
7
Introduzione
Fig.1 Micelio sottocorticale di A. mellea nella zona del colletto di una pianta malata.
Fig. 2 – Zona sottocorteccia degradata da A. mellea.
Fig. 3 – Carpofori di A. mellea alla base di una pianta di vite.
8
Introduzione
Fig. 4 – Foglia con arrossamento causato da A. mellea.
Fig. 5 – Colpo apopelttico causato da A. mellea.
Fig. 6 – Pianta di vite che manifesta vistoso arrossamento causato da A. mellea.
9
Introduzione
2.1.4. Profilassi e terapia
Il controllo chimico del patogeno è difficoltoso, poiché il micelio è solitamente
esteso e protetto dalla corteccia o all’interno dei tessuti legnosi, o si approfondisce
nel suolo come rizomorfa.
Attualmente non esiste nessun mezzo di lotta chimico o agronomico in grado di
curare la malattia in atto [Fox et al., 1994]. E’ una malattia a decorso molto lento e
con pochi sintomi evidenti nella fase iniziale per cui una diagnosi tardiva può
rendere difficile la difesa [Bray, 1970; Pawsey e Rahman, 1976; Filip e Roth, 1977].
La prevenzione rappresenta la migliore strategia attuabile al momento della stesura
della presente tesi.
In passato troviamo numerosi tentativi per mettere a punto mezzi di difesa nei
confronti di A. mellea basati sull’uso di fumiganti e sterilizzanti che però hanno
portato a risultati deludenti. esaconazolo, flutriafol e fenpropidin (fungicidi
sistemici) hanno un buon effetto in vitro su A. ostoyae, A. mellea e A. gallica [Turner
e Fox, 1988]. Maneb [Pawsey e Rahman, 1976] e acido borico [Hesko 1971]
applicati al colletto hanno un discreto successo sulla riduzione dello sviluppo delle
rizomorfe. In Australia trattando alberi di pesco con fosfato di potassio, si è avuta
una remissione dei sintomi dell’infezione nel 75% degli alberi trattati [Heaton e
Dullahide, 1989]. Il bromuro di metile garantiva una parziale efficacia [Filip e Roth,
1977] e, fino al divieto di impiego, era uno dei fumiganti più estensivamente
utilizzato soprattutto in quanto attivo nei confronti dei nematodi. L’attività di
cloropicrina nei confronti di A. mellea è stata dimostrata nel 1936 [Godfrey, 1936]
questa sostanza è in grado di distruggere gli agenti patogeni del terreno più resistenti,
e da poco è stata registrata sui fruttiferi in reimpianto. La sua azione è tale da ridurre
sensibilmente tutta la microflora presente nel terreno, inclusa quella benefica, e non è
sicuramente un rimedio compatibile con tecniche di lotta integrata e biologica.
Tante sono le problematiche che si incontrano in un controllo di tipo chimico del
patogeno: la bassa efficacia dovuta all’incapacità di penetrare per più di 50 cm nel
suolo, non raggiungendo efficacemente il fungo; l’azione negativa esercitata sulla
microflora del terreno, sterilizzando così fortemente il terreno da aprire la strada ad
A. mellea e l’elevata fitotossicità di tutti i composti di comprovata efficacia. A.
mellea possiede inoltre meccanismi di difesa che includono la produzione di
antibiotici e la formazione di pseudosclerozi [Fox, 2003]. Alla luce di questo
10
Introduzione
l’utilizzo dei soli agrofarmaci non garantisce un controllo efficace e duraturo del
patogeno.
L’accurata rimozione degli apparati delle piante infette dal terreno e di quelle
contigue è la tecnica maggiormente consigliata per contrastare la malattia [Gerig e
Strouts, 1983], purtroppo però le colonie di A. mellea sono così spesso estense
[Smith et al., 1992] che sarebbe estremamente laborioso e costoso rimuovere tutte le
fonti di inoculo nei residui legnosi presenti nel terreno.
Nella progettazione di un nuovo impianto, in terreni con presenza di patogeni
radicali, oltre a lavorazioni profonde e rimozione di ogni residuo radicale, il suolo
andrebbe lasciato a riposo per 3-5 anni in modo che l’inoculo si possa ridurre in
maniera significativa. In alternativa si può decidere anche per il “riposo attivo” del
terreno che in questo caso viene coltivato con colture non sensibili ad A. mellea
(leguminose e Brassicacea, ad esempio).
Relativamente alla possibilità di utilizzo di portinnesti resistenti per la vite, non sono
mai state segnalate piante resistenti [Fox, 2000].
E’ inoltre importante porre la massima attenzione alla evitare di diffondere la
malattia attraverso la movimentazione di terreno e pezzi di radice infetti che possono
facilmente aderire agli attrezzi di lavorazione ai quali possono facilmente rimanere
attaccati parti di terreno.
Per contrastare la malattia c’è l’esigenza di trovare nuovi metodi lotta efficaci. La
difesa biologica mediante l’uso di organismi antagonisti, usati singolarmente od
integrati a fungicidi, potrebbe rappresentare una potenziale alternativa [Onsando e
Waudo, 1994]. I più noti antagonisti di specie appartenenti al genere Armillaria sono
Trichoderma spp., i quali sono in grado di aggredire le rizomorfe [Fox, 2000].
Recenti ricerche sul controllo biologico di A. mellea riportano Dactylium dendroides,
come efficace antagonista [Raziq, 1998]. Questo organismo infatti ha garantito, su
piante di fragola inoculate con A. mellea, una sopravvivenza (oltre le 75 settimane)
del 41%, contro l’83% del testimone non trattato. L’antagonismo di Trichoderma
spp., nei confronti di A. mellea è stata dimostrata in molte colture [Fox et al., 1994;
Onsando e Waudo, 1992]. Gli antagonisti non sono abbastanza efficaci se utilizzati
da soli, ma migliorano la loro efficacia utilizzati in combinazione [Raziq, 2005].
11
Introduzione
2.1.5. Presenza di A.mellea in Italia e in Trentino
In Europa la presenza A.mellea è frequente e causa danni soprattutto a piante
forestali come quercia, faggio, larice, douglasia e abete rosso. A. mellea rappresenta
la più frequente specie del genere Armillaria in Italia meridionale [Luisi et al.,
1996]. Frisullo et al. (1997; 2002) hanno evidenziato in Italia un’elevata frequenza di
questo patogeno nelle drupacee. In actinidia A. mellea è stata riscontrata inizialmente
in Sicilia e successivamente anche in altre regioni, ove a volte ha assunto una
incidenza rilevante.
Attacchi significativi di A. mellea possono talvolta diventare una risorsa in alcune
regioni italiane, come in Veneto, dove la raccolta di questi funghi è importante fonte
di reddito, data la quantità che se ne raccoglie alla base di piante forestali e da frutto.
In Italia su vite A. mellea è stata segnalata come patogeno di interesse minore.
In Trentino negli ultimi anni, c’è stato un incremento delle segnalazioni della
presenza di marciumi radicali nelle colture agrarie. La diffusione è stata favorita
dall’assenza delle rotazioni colturali e dalla pratica del rimpiazzo di singole piante
morte all’interno degli appezzamenti [Pertot et al., 2003]. Nella Piana Rotaliana,
dove il vitigno prevalentemente è il Teroldego Rotaliano, i marciumi radicali sono
un problema in crescente diffusione. Le fotografie panoramiche effettuate nel
periodo della vendemmia in quest’area confermano una distribuzione a “macchia
d’olio” della malattia (Fig. 7). I marciumi radicali su vite sono in genere causati da
A. mellea, ma anche Rosellinia necatrix e Roesleria hypogea possono esserne
responsabili [Guillaumin, 1986]. In Trentino la presenza di A. mellea è elevata e in
preoccupante crescita, mentre R. necatrix è limitata a pochi casi segnalati e Roesleria
hypogaea è stata scoperta solo recentemente (2003).
Nella zona della Piana Rotaliana, su un totale di 140.37 ettari coltivati a vite è stato
stimato che il 13% dell’area coltivata, corrispondente a 18.25 ettari, è interessata
dalla presenza di marciumi radicali ascrivibili ad A. mellea [De Luca, 2003; Chini e
Clauser, 1983; Sannicolò et al., 2003] (Fig. 8). Il danno è stimabile in una forte
riduzione del vigore e della produttività, fino alla morte della pianta infetta.
12
Introduzione
Fig. 7 – Foto aerea Piana Rotaliana con manifestazione evidente di
rossore causato da A.mellea.
Fig. 8 - Zone della Piana Rotaliana maggiormente colpite dalla malattia.
13
Introduzione
2.2. MICRORGANISMI ANTAGONISTI E BIOAGROFARMACI
La difesa delle colture da patogeni, parassiti e malerbe, costituisce una fase della
produzione agricola in cui gli input chimici sono ancora piuttosto elevati. Un
interessante contributo alla riduzione degli input chimici potrebbe venire dalla
possibilità di impiegare microrganismi antagonisti ai patogeni per la difesa dalle
malattie [Vecchione et al., 2002], sfruttando il naturale equilibrio biologico esistente
in natura.
Per “controllo biologico” s’intende la riduzione della densità dell’inoculo e
dell’attività del patogeno o del parassita in attività o in fase di dormienza/riposo,
grazie a uno o più organismi, attuato naturalmente o tramite manipolazione
dell’ambiente, dell’ospite, dell’antagonista o per introduzione di massa di uno o più
antagonisti” [Baker e Cook, 1974].
Il controllo biologico limita il patogeno/parassita tramite: la riduzione dell’inoculo,
la riduzione dell’infezione e la riduzione della gravità degli attacchi del patogeno
[Fox et al., 1994]
Per antagonista o agente di biocontrollo, si intende un organismo presente in natura
che può limitare la crescita del patogeno e mantenerlo al di sotto della soglia
economica di danno, quindi l’antagonista non elimina totalmente il patogeno ma ne
riduce lo sviluppo e, i danni alla coltura.
Il controllo biologico di patogeni delle piante si concretizza in: riduzione
dell’inoculo del patogeno, riduzione dell’infezione, riduzione della gravità
dell’attacco del patogeno.
Le modalità di azione degli agenti di biocontrollo possono essere di vari tipi [Elad,
1996].
-
Antibiosi e lisi. Per antibiosi si intende la produzione da parte dell’antagonista di
antibiotici o altre sostanze tossiche, diversi per struttura e modalità di azione. La
lisi è la completa o parziale distruzione delle cellule operata da enzimi; si
distinguono due tipi di lisi: endolisi o esolisi. La endolisi è il collasso del
citoplasma della cellula operata da enzimi cellulari con successiva morte, causata
da deperimento per scarso nutrimento o da antibiotici o da tossine. L’esolisi è la
distruzione della cellula da parte di altri organismi. Tipica esolisi è la rottura
della parete da parte di un altro organismo per produzione di chitinosi, cellulasi
14
Introduzione
ecc, ed è frequente che si risolva nella morte delle cellule attaccate [Campbell,
1989].
-
Competizione. La competizione si ha quando due o più organismi richiedono la
stessa risorsa. L’utilizzo di essa da parte di uno limita il quantitativo disponibile
per l’altro [Campbell, 1989]. La risorsa può essere costituita da nutrenti, acqua o
spazio.
-
Parassitismo e predazione. Questi sono meccanismi per cui l’antagonista vive
nutrendosi direttamente del patogeno e attaccando o uccide e si nutre della preda.
-
Induzione di resistenza nelle piante ospiti del patogeno. Questo meccanismo che
aumenta la capacità di difesa della pianta è ancora oggetto di studi.
-
Effetti tossici diretti e indiretti sul patogeno. Gli effetti diretti riguardano la
produzione di sostanze antibiotiche (antibiosi). Ogni antagonista produce
antibiotici o altre sostanze tossiche che differiscono per struttura e modalità di
azione. Quelli indiretti sono invece dovuti, ad esempio alla produzione di
sostanze volatili, rilasciate dall’attività metabolica dell’antagonista.
L’antagonista ideale deve produrre un eccesso di inoculo, resistere, tollerare gli altri
antagonisti, germinare e crescere rapidamente, invadere e insediarsi facilmente nel
substrato organico [Baker and Cook, 1974].
I potenziali organismi antagonisti vengono isolati in laboratorio con modalità diverse
a partire da diversi materiali in campo. Una volta ottenuti in coltura pura, sono
valutati per stimare la potenziale efficacia, prima in vitro poi in vivo.
I principali vantaggi che derivano dall’utilizzo di agenti di biocontrollo sono dovuti
al fatto che, essendo organismi presenti naturalmente nell’ambiente, possono essere
facilmente degradati e non lasciano residui sui prodotti destinati all’alimentazione,
inoltre non provocano inquinamento delle risorse ambientali in quanto la loro
persistenza è generalmente molto bassa. Poiché questi agenti sono scelti tra quelli
che non producono antibiotici o sostanze tossiche per l’uomo, sono totalmente privi
di rischi per la salute umana.
Essi costituiscono un vantaggio per anche per l’agricoltore che non è esposto a
sostanze chimiche nell’effettuare i trattamenti antiparassitari.
Questi organismi possono essere formulati come i normali fungicidi e quindi sono di
facile applicazione sulle culture con le normali macchine per i trattamenti.
15
Introduzione
In accordo con United States Department of Agriculture definiamo i bioagrofarmaci
come “funghi e batteri ad azione benefica che attaccano e limitano i patogeni delle
piante e di conseguenza le malattie da essi causate”.
I bioagrofarmaci utilizzabili come anticrittogamici sono prodotti a base di organismi
antagonisti, quindi di batteri, virus o funghi. Quelli a base di ceppi fungini
antagonisti vengono prodotti, registrati e commercializzati soprattutto per la lotta
biologica, nei confronti di diverse patologie, come: agenti di marciumi, morie nei
semenzai, tracheomicosi, infezioni radicali di specie arboree da frutto, muffa
dell’uva e di colture ortive, moniliosi e marciumi acquosi di pomacee e drupacee.
L’utilizzo di bioagrofarmaci a base di funghi antagonisti è quantitativamente
modesto rispetto a quello dei agrofarmaci di sintesi, tuttavia esso è in continua
crescita.
Diverse sono le tipologie di prodotti (bioprotettori, biostimolanti e biofertilizzanti) il
cui principio attivo è costituito da funghi o batteri antagonisti, utilizzati all’estero. Si
riporta ad esempio, i prodotti commerciali a base di funghi: Trichoderma spp.,
commercializzati come Binab T™ in Svezia, UK, USA, Trichodex™ in Italia,
Israele e USA, Trichoderma 2000™ in Israele e AQ10 a base di Ampelomyces
quisqualis. Mentre tra quelli a base di batteri, un esempio è il Serenade a base di
Bacillus subtilis.
Nonostante le evidenti potenzialità, vi sono tuttavia ostacoli che limitano lo sviluppo
e l’applicazione di questi biofitofarmaci: la limitata disponibilità di ceppi realmente
efficaci e ben formulati, la carenza di informazioni necessarie alla registrazione
come ad esempio i meccanismi d’azione e informazioni riguardo la produzione di
eventuali metaboliti tossici da parte di questi funghi [Lorito, 2003].
Molti microrganismi hanno anche azione di promozione dello sviluppo della pianta,
si tratta dei cossidetti “Plant Growth Promoting Rhizobacteria”(PGPR) [Kloepper e
Schroth, 1978]. I PGPR aumentano lo sviluppo di pianta attraverso azioni dirette ed
indirette, anche se i meccanismi specifici in questione non sono stati ancora del tutto
caratterizzati [Glick, 1995].
16
Scopo della tesi
3. SCOPO DELLA TESI
Negli ultimi anni, in patologia vegetale, lo studio e l’applicazione di metodi di lotta,
quali quelli biologici, alternativi a quelli chimici sta riscontrando un notevole
interesse. Molti studi riguardano l’impiego di funghi e/o batteri antagonisti per il
contenimento di patogeni fungini. Poiché i prodotti chimici sono inefficaci per il
controllo del patogeno A. mellea che sta incrementando la sua dannosità in
viticoltura, si presenta l’esigenza di individuare nuovi strumenti per la difesa da
questa malattia. L’uso di microrganismi antagonisti potrebbe costituire una possibile
tecnica per la difesa da A. mellea.
Con questo lavoro di tesi ci si è proposti di valutare la potenziale attività di controllo
biologico di microrganismi isolati da corpi fruttiferi parzialmente degradati di A.
mellea nei confronti del patogeno medesimo.
Il lavoro di tesi è stato articolato in tre parti:
− raccolta e caratterizzazione della comunità microbica proveniente da
carpofori di A. mellea,
− Valutazione dell’efficacia nei confronti di A. mellea, degli organismi isolati
in vitro,
− Valutazione dell’efficaci nei confronti di A. mellea, degli organismi isolati in
vivo su un sistema modello in serra.
− Il lavoro è stato svolto presso il Centro SafeCrop dell’Istituto Agrario di San
Michele all’Adige.
17
Materiali e metodi
4. MATERIALI E METODI
4.1. ISOLAMENTO DI POTENZIALI ORGANISMI ANTAGONISTI DI A. mellea
Nell’ottobre del 2003 durante il monitoraggio della presenza di A. mellea in Piana
Rotaliana sono stati raccolti, alla base del tronco di piante di vite (13) e di melo, (1),
diversi corpi fruttiferi del patogeno (Fig. 9 ).
Zona
Codice Pinata
Pianta
Carpofori N° Isolati
Campacci - Zona 13C Tava Lino pianta 1
vite
1
4
Campacci - Zona 13C Tava Lino pianta 2
vite
1
4
Campacci - Zona 13C Tava Lino pianta 3
vite
1
1
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 1
vite
1
7
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 2
vite
1
9
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 3
vite
1
13
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 41-42
vite
1
17
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 43-44
vite
1
3
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 47-48
vite
1
2
Novali Est- Zona 32
Novali pianta 49-50
vite
1
13
Paese
Tait 1
melo
1
12
Pozze-Zona 33
Tait 2
vite
1
3
Novali Ovest- Zona 4
pianta 4
vite
1
2
Novali Ovest- Zona 5
pianta 5
vite
1
19
totale
14
109
Fig. 9 - Descrizione della raccolta dei carpofori e del numero di organismi da questi
isolati.
Da ogni basidiocarpo sono state prelevate casualmente porzioni di lamelle, queste
sono state macinate in mortaio con acqua distillata sterile fino ad ottenere una
poltiglia che è stata sottoposta a successive diluizioni seriali. Le diverse diluizioni,
1:10-7, 1:10-6 e 1:10-5, sono state seminate uniformemente in piastre petri contenenti
Malt Exctract Agar (MEA, Oxoid) (50g/l) e Potato Destrose Agar (PDA, Oxoid)
(39g/l).
Le piastre sono state mantenute a 23°C per alcuni giorni e da queste sono stati isolati
i singoli organismi che nel frattempo erano cresciuti.
Sono stati isolati 109 organismi diversi, conservati in tubi contenenti PDA a 4°C.
18
Materiali e metodi
4.2. IDENTIFICAZIONE E CLASSIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI
ISOLATI
I microrganismi cresciuti su PDA, sono stati suddivisi in tre gruppi: funghi
filamentosi, lieviti e batteri. Dei batteri e dei lieviti si sono fatti vetrini con fucsina
acida e identificati a microscopio ottico.
I funghi filamentosi sono stati cresciuti su terreno PDA e MEA e incubati a 25°C.
Dopo colorazione con lattofenol [CBS, 1998], per le Dematiaceae, fucsina acida
[CBS, 1998], e cotton blue [CBS, 1998],
per gli altri funghi si è proceduto
all’osservazione al microscopio ottico. Per i funghi che presentavano difficoltà di
sporulazione su PDA ed MEA è stato necessario ripetere l’inoculo su terreno
costituito da Agar Acqua (5% Agar Technical, Oxoid) insieme a pezzetti di carta per
stimolare la sporulazione. Qualora anche questa metodica non garantisse la
sporulazione si è proceduto all’inoculo su erba sterile, sempre per stimolare la
sporulazione del fungo.
L’identificazione è stata fatta con l’aiuto della Dott.ssa Claudia Longa, (Centro
SafeCrop), Istituto agrario di S. Michele all’Adige) utilizzando la chiave semplificata
del genere (Barnett e Hunter, 1998; Ellis e Ellis 1971; 1976).
Ogni organismo è stato siglato con un codice numerico identificativo a quattro cifre.
4.3. VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA IN COLTURA DUALE
L’inoculo di A. mellea è stato preparato utilizzando l’isolato 7A di A. mellea
conservato nella collezione del Centro SafeCrop [De Luca, 2002]. Le piastre di
PDA inoculate sono state mantenute a 25°C per 30 giorni.
Al termine la colonia che aveva occupato tutta la piastra è stata sezionata in cubetti
di uguali dimensioni (0,4x0,4), usati come inoculo nei test successivi.
Il cubetto di micelio di A. mellea è stato posto in piastra di MEA a 1,5 cm dal bordo
e incubato a 25°C per 7 giorni. Al termine di questo periodo una porzione di
microrganismo da valutare è stata inoculata dalla parte opposta, alla medesima
distanza dal bordo (Fig. 10).
19
Materiali e metodi
A.mellea
Microrganismo
Fig. 10 – Schema di inoculo per test in coltura duale.
Le piastre sono state messe ad incubare a 23°C e valutate dopo 5, 10, 15 e 20 giorni
misurando l’espansione del patogeno verso il bordo e verso l’antagonista (in cm),
l’espansione dell’antagonista verso il bordo e verso il patogeno (in cm), la presenza,
di rizomorfe e il comportamento dell’antagonista e del patogeno. Sono state fatte due
repliche per ogni microrganismo e due piastre di controllo con la sola A. mellea
L’efficacia d’inibizione è stata calcolata come efficacia d’inibizione attraverso la
formula la formula: [(C-T)/C]x100, dove C rappresenta la crescita del patogeno nel
controllo e T la crescita del patogeno in presenza dell’antagonista [Sivakumar et al.,
2000].
Tra gli organismi testati sono stati selezionati solo quelli avevano determinato
un’efficacia
d’inibizione
superiore
al
30%,
e
contemporaneamente
un
comportamento interessante. I ceppi appartenenti ad Alternaria sp., Penicillium sp. e
Aspergillus sp., anche se mostrano elevata efficacia, non sono presi in
considerazione perché inutilizzabili come agenti di controllo biologico in quanto
produttori di allergeni.
4.4.
VALUTAZIONE
DELL’EFFICACIA
IN
COLTURA
DUALE
CON
TRONCHETTO
La prova è stata effettuata utilizzando i migliori 15 organismi derivanti dalla prova
precedente: 2932, 2933, 2964, 2966, 2978, 3020, 3022, 3025, 3027, 3031, 3032,
3033, 3040, 3041 e 3049.
La prova è stata condotta a tre diverse temperature:
20
Materiali e metodi
-
23°C rappresenta la temperatura ottimale per A. mellea;
-
20°C è la temperatura massima più frequente in Piana Rotaliana nell’ultimo triennio
(2001-2003);
-
10°C è la temperatura minima più frequente in Piana Rotaliana nell’ultimo triennio
(2001-2003);
Tronchetti di melo di 5 cm di lunghezza, di uguale diametro (1cm), sezionati
longitudinalmente e sterilizzati in autoclave a 121°C per un’ora, sono stati inseriti al
centro di piastre (diametro pari a 90 mm) con MEA.
Un cubetto di substrato agarizzato inoculato con A. mellea (preparato come
precedentemente descritto) è stato posto ad un lato del tronchetto e fatto crescere a
23°C per 7 giorni, trascorsi i quali il microrganismo da valutare è stato inoculato
dalla parte opposta del tronchetto (Fig. 11). Le piastre inoculate con i microrganismi
sono mantenute nelle tre temperature sopraelencate.
Sono state fatte quattro repliche per ogni microrganismo e quattro repliche di
Microrganismo
controllo con la sola A. mellea per ogni temperatura.
La valutazione è stata fatta dopo 5, 10, 15 e 20 giorni come nella prova precedente.
A. mellea
Microrganismo
Fig. 11. Schema di inoculo per test in coltura duale con tronchetto
4.5. VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA SU PIANTA
Si è scelto di condurre questa prova sui sette migliori organismi della prova
precedente: 2932, 2933, 2966, 2978, 3022, 3025, 3027.La prova è stata condotta su
piante di fragola, cv. Elsanta, in quanto anche la fragola ha elevata suscettibilità
21
Materiali e metodi
dell’apparato radicale al patogeno, possiede un ciclo breve e dimensioni contenute, e
può rappresentare pertanto un buon sistema modello..
La prova è stata condotta in serra in condizioni controllate, pari a 20°C durante la
notte e 25°C durante il giorno.
L’inoculo di A. mellea è stato preparato inserendo in piastre (90mm di diametro) di
MEA, circa 7-9 tronchetti (lunghezza 5 cm) di melo interi e pezzetti di micelio di A.
mellea, preparato come sopra, posti ad incubare a 23°C per 30 giorni
I microrganismi da testare sono stati fatti crescere in brodi di coltura Malt Exctract
Broth (Oxoid)(13 g/l) arricchito con saccarosio (16 g/l), in agitazione per quattro
giorni.
Si è proceduto poi all’inoculo (4 ottobre 2004): sono state scoperte le radici delle
piante vicino a loro è stato posto un tronchetto infetto sopra al quale è sono stati
versati 50ml della coltura liquida del microrganismo da valutare (Fig.12).
Fig. 12 – Fasi di inoculo di A. mellea e del microrganismo da testare su
pianta.
Sono state fatte nove repliche (piante) per ogni microrganismo, nove repliche del
testimone con A. mellea, 9 repliche del testimone non inoculato e posizionate in serra
secondo lo schema sperimentale dei blocchi completamente randomizzati. Ogni sette
22
Materiali e metodi
giorni per i successivi sei mesi si sono valutati soggettivamente: vigoria (indice: alta:
1, media: 2, bassa: 3), indice di colore (verde intenso:1, verde giallastro: 2, giallo:3),
numero di foglie e presenza o meno di piante morte.
Sulle piante morte durante i sei mesi e a al termine della prova per le rimanenti (9
maggio 2005), si è verificata la presenza del patogeno decorticando la zona del
colletto ed eventualmente risolando il patogeno.
4.6. IDENTIFICAZIONE DEGLI ORGANISMI EFFICACI CONTRO A. mellea
L’identificazione delle specie fungine interessanti è stata condotta in collaborazione
con la Dott.ssa Claudia Longa, (Centro SafeCrop IASMA), mediante chiavi
analitiche (Domsch e Gams, 1980; De Hoog, 1972; Nelson et al., 1983).
Per quanto riguarda le specie batteriche la Dott.ssa Elisabetta Pellegrini, Centro
SafeCrop IASMA, ha effettuato l’identificazione mediante tecniche microbiologiche
e di biologia molecolare.
Gli isolati riportati nella presente tesi con il codice identificativo a quattro numeri
sono depositati nella collezione del Centro SafeCrop IASMA. Non viene riportata la
specie in quanto tali organismi saranno oggetto di richiesta di brevetto e vincolati
dalle regole di confidenzialità del Progetto SafeCrop, FU della Provincia Autonoma
di Trento.
23
Risultati e discussione
5. RISULTATI E DISCUSSIONE
5.1. ISOLAMENTO DI POTENZIALI ORGANISMI ANTAGONISTI DI A. mellea
La microflora epifita presente su carpofori, si presenta costituita prevalentemente da
batteri (55,6%) e funghi filamentosi (39,81%) e in bassa percentuale da lieviti
(4,63%) (Fig.13 e 14).
4,55%
39,09%
54,55%
BATTERI
FUNGHI
Distribuzione degli organismi isolati
LIEVITI
Fig. 13 - Distribuzione degli organismi isolati entro le tre categorie.
Zona
Campacci - Zona 13C
Campacci - Zona 13C
Campacci - Zona 13C
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Novali Est- Zona 32
Paese
Pozze-Zona 33
Novali Ovest- Zona 4
Novali Ovest- Zona 5
Codice Pinata
Pianta N° Isolati
Tava Lino pianta 1 vite
4
Tava Lino pianta 2 vite
4
Tava Lino pianta 3 vite
1
Novali pianta 1
vite
7
Novali pianta 2
vite
9
Novali pianta 3
vite
13
Novali pianta 41-42 vite
17
Novali pianta 43-44 vite
3
Novali pianta 47-48 vite
2
Novali pianta 49-50 vite
13
Tait 1
melo
12
Tait 2
vite
3
pianta 4
vite
2
pianta 5
vite
19
109
totale
Batteri Lieviti Funghi
1
3
4
1
2
5
6
3
6
1
5
12
3
2
3
2
10
3
8
4
2
1
1
1
11
9
61
5
43
Fig. 14 - Distribuzione degli organismi isolati in relazione alle diverse zone di
raccolta
24
Risultati e discussione
5.2. VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA IN COLTURA DUALE
Dalla prima prova in coltura duale (Fig.15) risulta che dei 109 microrganismi
iniziali, 15 (sei batteri, un lievito e otto funghi filamentosi) sono considerati
promettenti in quanto hanno determinato competizione nei confronti di A. mellea.
Questi organismi selezionati (2932, 2933, 2964, 2966, 2978, 3020, 3022, 3025,
3027, 3031, 3032, 3033, 3040, 3041 e 3049) sono stati sottoposti al secondo test in
coltura duale con tronchetti (Fig. 16).
lettura1
90
lettura2
lettura3
efficacia d'inibizione
75
lettura4
60
45
30
15
3049
3041
3040
3033
3032
3031
3027
3025
3022
3020
2978
2966
2964
2933
2932
0
-15
organismo
Fig. 15- Efficacia di inibizione di A.mellea da parte dei 15 su 109 microrganismi
risultati migliori al test in coltura duale,dopo 5, 10, 15, 20 giorni.
Fig. 16 – In ordine da sinistra a destra 2978, 3022, 3025, 3027, 3031 e 3040
25
Risultati e discussione
5.3. IDENTIFICAZIONE DEI 15 ORGANISMI CHE HANNO MANIFESTATO
UNA BUONA EFFICACIA NEI TEST IN COLTURA DUALE
I 15 organismi ritenuti interessanti dopo la prima valutazione in coltura duale sono
stati identificati (Fig.17), arrivando quando è possibile fino alla specie. Batteri e
lieviti sono stati identificati attraverso metodi di biologia molecolare. Non vengono
riportati in questa tesi in quanto in fase di richiesta di brevetto.
Codice
Organismo
2932
Batterio
2933
Gliocladium sp. (cfr. solani)
2964
Engyodontium album (Limber) de Hoog
2966
Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de Vries
2978
Micelio sterile
3020
Batterio
3022
Actinomycete
3025
Fusarium Link ex Fr.
3027
Trichothecium roseum (Pers.) Lik ex Gray
3031
Batterio
3032
Lievito
3033
Batterio
3040
Batterio
3041
Batterio
3049
Acremonium strictum W. Gams
Fig. 17 – Identificazione dei microrganismi che sono risultati migliori dopo il primo
test in coltura duale
5.4. VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA IN COLTURA DUALE CON
TRONCHETTO
Dalla seconda prova in coltura duale con tronchetto condotta alle tre diverse
temperature risulta che l’efficacia è generalmente più alta alla temperatura più bassa
(10°C), probabilmente dovuta all’inibizione della bassa temperatura sulla crescita di
A. mellea. L’efficacia di antagonismo a 10°C in alcuni organismi è superiore al 40%
ad esempio: 2932 (Batterio), 2978 (Micelio sterile), 3022 (Actynomycetes), 3049 (A.
strictum). Promettenti sono risultati anche il 2966 (C. cladosporioides) e 3027 (T.
roseum). La restante parte degli organismi mostra valori di efficacia d’inibizione tra
il 10 e il 40% (Fig.18 e 19). Per quanto riguarda il comportamento, 2932, 3022,
26
Risultati e discussione
3049, 2966 limitano moltissimo la crescita di A. mellea. I microrganismi 2978 e
3027 (Fig. 20) crescono con molta velocità e ben presto arrivano a coprire tutto lo
spazio disponibile e il micelio di A. mellea vira verso un colore più scuro quando
entra in contatto con il microrganismo e non cresce oltre la metà del tronchetto.
lettura 1
lettura2
lettura3
lettura4
80
70
efficacia d'inibizione (%)
60
50
40
30
20
10
3049
3041
3040
3033
3032
3031
3027
3025
3022
3020
2978
2966
2964
2933
2932
0
organismo
Fig. 18 – Efficacia di inibizione di A. mellea determinata dai diversi organismi a
10°C dopo 5, 10, 15 e 20 giorni.
70
efficacia d'inibizione media (%)
60
50
40
30
20
10
0
2932
2933
2964
2966
2978
3020
3022
3025
3027
3031
3032
3033
3040
3041
3049
-10
-20
-30
organismo
Fig. 19 – Media delle quattro letture dell’efficacia d’inibizione di A.mellea da parte
dei microrganismi nella prova condotta a 10°C
27
Risultati e discussione
Fig. 20 - In ordine da sinistra a destra:2932, 3022, 3049, 2966, 2978 e 3027, test
condotto a 10°C.
Alla temperatura di 23°C i migliori microrganismi per quanto riguarda la capacità
antagonista (Fig. 21 e 22) sono il 2978 (Micelio sterile), il 3041 (Batterio) e 3025
(Fusarium). Per quanto riguarda il comportamento, il 2978 cresce molto
velocemente e le rizomorfe di A. mellea sbiancano nelle prossimità della colonia del
microrganismo, mentre con il 3041 e il 3025 le rizomorfe diventano marcatamente
più scure e arrestano la crescita vicino al microrganismo (Fig. 23).
80
lettura1
70
lettura2
efficacia d'inibizione (%)
60
lettura3
50
lettura4
40
30
20
10
3049
3041
3040
3033
3032
3031
3027
3025
3022
3020
2978
2966
2964
2933
2932
0
organismo
Fig. 21 Efficacia di inibizione di A. mellea determinata dai diversi organismi a 23°C
dopo 5, 10, 15 e 20 giorni.
28
Risultati e discussione
70
efficacia d'inibizione media (%)
60
50
40
30
20
10
0
2932
2933
2964
2966
2978
3020
3022
3025
3027
3031
3032
3033
3040
3041
3049
-10
-20
-30
organismo
Fig. 22 – Media delle quattro letture dell’efficacia d’inibizione di A. mellea da parte
dei microrganismi nella prova condotta a 23°C
Fig. 23 In ordine da sinistra a destra:2978, 3025, 3041, test condotto a 23°C.
Alla temperatura di 20°C la maggior parte degli organismi mostra bassa efficacia
(Fig.24 e 25) e i migliori risultano essere il 2978 (Micelio sterile), il 3025 (Fusarium
sp.), 3027 (T. roseum) e il 2933 (Gliocladium sp.) (Fig. 26).
29
Risultati e discussione
80
lettura1
70
lettura2
efficacia d'inibizione (%)
60
lettura3
50
lettura4
40
30
20
10
3049
3041
3040
3033
3032
3031
3027
3025
3022
3020
2978
2966
2964
2933
2932
0
organismo
Fig. 24 Efficacia di inibizione di A. mellea determinata dai diversi organismi a 20°C
dopo 5, 10, 15 e 20 giorni.
70
60
efficacia d'inibizione
media (%)
50
40
30
20
10
0
2932
2933
2964
2966
2978
3020
3022
3025
3027
3031
3032
3033
3040
3041
3049
-10
-20
-30
organismo
Fig. 25 – Media delle quattro letture dell’efficacia d’inibizione di A. mellea da parte
dei microrganismi nella prova condotta a 20°C
30
Risultati e discussione
Fig. 26 – In ordine da sinistra a destra:2978, 3025, 3027 e 2933, test condotto a
20°C.
Ciò è probabilmente dovuto dal fatto che 20°C sono la temperatura di crescita
ottimale per A. mellea che quindi risulta avvantaggiata nella sua crescita. Per quanto
riguarda il comportamento, il 2933, il 3027 e il 3025 crescono molto velocemente e
le rizomorfe di A. mellea imbruniscono diventando più sottili quando entrano in
contatto con il microrganismo Il microrganismo 2978 si espande velocemente a
occupare tutto lo spazio disponibile e blocca lo sviluppo del micelio di A. mellea. Il
comportamento descritto per ogni organismo a 10 e 20 giorni dall’inoculo, associato
ai valori di efficacia hanno determinato la scelta degli organismi migliori da testare
su pianta, che di conseguenza sono stati: 2932, 2933, 2966, 2978, 3022, 3025 e 3027.
5.5. VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA SU PIANTA
Nella valutazione effettuata su pianta risulta che un nessun organismo è in grado di
prevenire totalmente le infezioni e lo sviluppo di A. mellea, ma Gliocladium sp.
(2933) e T. roseum (3027) inibiscono significativamente l’infezione di A. mellea
rispetto al testimone non trattato e quindi possono essere considerati promettenti
agenti di biocontrollo (Fig.27).
31
Risultati e discussione
120
a
100
b
ab
ab
80
infezione(%)
ab
ab
ab
60
b
40
20
c
0
2932
2933
2966
2978
3022
3025
3027
trattato con non trattato
A.mellea
ANOVA, Duncan test, a uguale lettera corrisponde una differenza non significativa con P>0,05
Fig. 27 – Percentuale di piante infette trattate con i microrganismi e inoculate con A.
mellea.
5.6. VALUATAZIONE DELLA CRESCITA DELLE PIANTE INOCULATE CON
A. mellea E TRATTATE CON I MICRORGANISMI
Dal grafico che descrive la curva di crescita delle piante infettate rispetto alle sane
(Fig. 28) si nota un andamento nella crescita della foglie delle piante infette (trattate
o meno con i microrganismi) simile a quello del testimone non trattato.
Si nota una riduzione del ritmo di crescita intorno alla quarta settimana tipico del
periodo della fioritura e una successiva riduzione in concomitanza della produzione
di frutti che però è anche coinciso con un periodo di stress idrico per le piante. In
seguito le piante hanno ripreso la crescita vegetativa, che è rimasta elevata fino al
termine della prova.
32
Risultati e discussione
17
15
numero di foglie
13
2932
2933
2966
2978
3022
3025
3027
trattato con A.mellea
non trattato
11
9
7
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
settimane
Fig. 28 - Curva di crescita delle piante inoculate con A. mellea e con il
microrganismo risulatate sane al termine della prova
Tra piante infette e piante sane non si nota una differenza della velocità di sviluppo
di nuove foglie (Fig. 29). Ciò è in accordo con quanto accade in altri sistemi, dove le
piante infette appaiono più stentate e clorotiche, ma il ritmo di sviluppo di nuove
foglie non risulta alterato. Inoltre può essere anche spiegato dal fatto che le infezioni
di A. mellea a partire dai tronchetti dell’inoculo non si sono avviate immediatamente.
Sulle piante a fine prova si è potuto osservare che le infezioni al colletto erano ad
uno stadio iniziale e non era presente una pesante alterazione delle radici. Solamente
un danno elevato all’apparato radicale potrebbe, infatti influire sulla velocità di
produzione di nuove foglie.
33
Risultati e discussione
Se si considera l’Area sottesa alla Curva di Crescita (ACC) (Fig. 30) si vede che non
ci sono differenze significative tra piante infette (trattate o meno con i
microrganismi) e le piante sane.
17
15
numero di foglie
13
trattato con A.mellea
non trattato
11
9
7
31
29
27
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
5
settimane
Fig. 29 Curva di crescita delle piante inoculate con A. mellea e con il microrganismo
risulatate sane al termine della prova
3000
2500
a
a
a
a
2000
a
a
a
a
a
1500
ACC
1000
500
0
2932
2933
2966
2978
3022
3025
3027
trattato con non trattato
A.mellea
ANOVA, Tukey test, a uguale lettera corrisponde una differenza non significativa con P<0,05.
Fig. 30 - Area sottesa alla curva di crescita delle piante di fragole inoculate conA.
Mellea e con i microrganismi.
34
Risultati e discussione
Si nota che l’andamento della curva di crescita è simile per tutte le piante sane
trattate o meno con gli organismi.
Si distingue solo l’andamento di tre microrganismi (2932, 2966 e 3025). Questi tre
organismi determinano un incremento del numero di foglie per settimana fino alla
dodicesima settimana, mentre poi solo il 2932 determina una crescita elevata che si
evidenza rispetto alla globalità delle altre piante trattate con gli altri organismi.
Dato l’esiguo numero di piante non è possibile effettuare delle analisi statistiche.
I dati raccolti di vigoria e indice di colore non mostrano nessuna differenza tra le
diverse tesi.
35
Conclusioni
6. CONCLUSIONI
Diverse sono le considerazioni che possono essere fatte al termine di questo lavoro
di tesi.
Il lavoro di ricerca di agenti di controllo biologico è un lavoro lungo e
complesso, difficile è determinare la fonte adeguata dalla quale ottenere gli isolati e
alto è il numero di organismi da testare prima di ottenerne di interessanti. Pertanto il
lavoro svolto e i dati ottenuti apportano un’informazione utile, confermando che
l’utilizzo di corpi fruttiferi del patogeno come fonte di potenziali antagonisti è una
scelta valida. Infatti tra i 109 organismi isolati ben due risultano promettenti quali
antagonisti di A. mellea.
Il microrganismo 2933 (Gliocladium spp.) e il 3027 (T. roseum) hanno
dimostrato un’attività di antagonismo promettente, sia nelle prove in vitro sia in
quielle in pianta dove riducono la percentuale di infezione al 44,4 e al 55,6%
rispettivamente.
I tre tipi di indagine confermano che nessuno dei 109 microrganismi testati
nei confronti del patogeno A. mellea garantisce un controllo totale della malattia,
come già evidenziato da altri autori [Fox, 2004]. L’applicazione in mistura di diversi
organismi antagonisti potrebbe in futuro, garantire una protezione più elevata nei
confronti della malattia, rispetto all’utilizzo dei singoli isolati.
Interessante è che due funghi del genere Gliocladium, nello specifico le
specie G. catenulatum e G. virens negli USA sono già commercializzati come
biofungicidi per il controllo di patogeni radicali e che il 2933, uno dei due organismi
risultati interessanti in questo lavoro, appartiene proprio a questo genere.
Se analizziamo i dati di efficacia d’inibizione del test in coltura duale con
tronchetto, alle tre diverse temperature, troviamo che parecchi organismi, si sono
dimostrati attivi a basse temperature (10°C), ma sono poco attivi alla temperatura
media più frequente nell’area di interesse che sono più elevate. Bisogna ricordare
che in campo le piante dei vecchi vigneti vengono solitamente estirpate in ottobre e il
nuovo impianto realizzato in maggio, quindi si potrebbe ipotizzare l’applicazione di
questi organismi in autunno, quando troverebbero le condizioni di temperatura a loro
più favorevoli, ma nel contempo sfavorevoli per A. mellea.
36
Conclusioni
Questa ricerca non può considerarsi terminata: sono necessari altri studi per
verificare la possibile applicazione in campo dei due potenziali antagonisti ed il loro
meccanismo d’azione nei confronti di A. mellea.
37
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42
RINGRAZIAMENTI
Arrivare fino a qui non è stato molto facile, tanti sono stati i momenti di sconforto e
tante le occasioni in cui l’istinto ti diceva di mollare, ma così non è andata, alla fine
ho tenuto duro, ho strinto i denti e ci sono qui con la tesi in mano. Non è solo merito
mio, è così che alla fine di questo mio percorso vorrei ringraziare di cuore le persone
che mi hanno aiutato a concretizzare questo piccolo sogno.
A Ilaria che mi ha seguito, permesso di realizzare questo lavoro, mi ha sempre
spronato e pazientemente e generosamente aiutato nella stesura della tesi.
A Mario Ferrari che mi ha fatto innamorare di questa materia, che c’è sempre e non
manca mai di impegnarsi per me.
Alla Prof.ssa Bonatti e al Prof. Pellegrini per la loro premura e per la gioia con cui
mi hanno spronato a questo traguardo.
A Silvia, la carissima segretaria che tanto ci ha sopportato in questi anni.
A Federica De Luca, che mi ha accompagnato e seguito in tutta la realizzazione di
questo lavoro, per le risate, per le insolazioni e le polmoniti prese a contar viti, ma
soprattutto perché mi ha trasmesso la sua grande passione per il lavoro di ricerca per
il dono grande della sua amicizia e per la gratuità con cui mi hai sempre donato il tuo
tempo e le tue parole.
Per i ragazzi di San Michele,del passato e del presente, Giuseppe, Gianfranco,
Kathrin, Ivan, Sabrina, Alessandro, Giorgia, Federica S., Federica F., Silvia,
Cristina, Oliviero, Monica, Silvia, Federica T., Jenny, Manuela e Daniele P. e B.,
capaci di accompagnarmi in questa bella esperienza.
A Rosaly, Federico e Valeria, perché mi sopportano ogni giorno, perché ci sono
sempre e perché lavorare con loro è bello.
A Elisa, Paolo e il piccolo Pietro, per l’esperienza della Vita che abbiamo condiviso
e per la bellissima amicizia che è nata.
A Elisabetta e Claudia per l’aiuto che mi hanno dato nella realizzazione di questo
lavoro, grazie di cuore!
Ai ragazzi di Safecrop, tutti, passati e futuri.
A Antonella e Luca e la piccola Asia che sta arrivando, per la premura e le attenzioni
che non mi hanno ci fatto mancare.
A Laura, un dono meraviglioso.
A Chiara Luca e Alice, per il dono grande della loro amicizia, per il loro esempio e
per il sostegno che mi hanno sempre dimostrato.
A Dani, alla Manu, al Bedo, all’Elena, all’Elisa e a Don Gianni, per l’Amicizia
A Oreste, Ileana, Davide, Peppa, Gianni, Carla, Roberto, Francesca e Daniele, per
l’amore con cui mi hanno accolto nella loro famiglia.
A Teresa a Giuliano e alla piccola Viola, per il cammino e la fatica condivisa.
Ai miei fratelli, Lorenzo e Beniamino perché sia questo traguardo un esempio perché
anche voi sappiate sempre puntare alto, nonostante la fatica.
Ai miei nonni che non ci sono più ma sono sicura da lassù mi hanno guidato e
protetto.
Alla mia mamma e al mio papà, al loro grande amore, al dono della vita, alle
preoccupazioni che vi ho dato, eh da genitori si capiscono tante cose, grazie!
A Raffaele, marito di un amore unico, grazie per tutta la pazienza che hai avuto, per
tutte le cene, le lavatrici e le pulizie che hai fatto al posto mio, grazie perché mi hai
sempre spronato e non hai mai perso fiducia nelle mie capacità.
Al mio meraviglioso Samuele, dono dell’Amore di Dio, per il tempo che ti ho
sottratto per studiare, per gli appunti che mi hai disegnato, per le qua qua e i bu,
grazie, quando sarai grande ti racconterò che è stata dura ma è stato bello farlo anche
per te.
A te che sei lassù, mi tieni sulla tua mano e non manchi mai di darmi prova del tuo
grande Amore.