Allergie e reazioni avverse a
farmaci: orientamento diagnostico
e test di attivazione dei basofili
Gennaro Maietta
Ambulatorio di Allergologiaaccr.to AUSL LE01, Lecce
Laboratorio di Immunologia, Istituto ‘’ Pasquale Pignatelli’’, Lecce
Allergie e reazioni avverse a farmaci:
orientamento diagnostico
e test di attivazione dei basofili
Gennaro Maietta - Lecce
Ipersensibilità a farmaci
allergica/non allergica
Allergica
Non allergica
Immunologicamente mediata (cellule T, IgE, IgG
verso farmaci o loro metaboliti
Non sono dimostrabili reazioni
immunologiche verso il farmaco
Altamente specifica
I sintomi possono comparire al primo
contatto
Dipende dalla struttara molecolare dell’allergene
Può essere particolarmente pericolosa
Attivazione delle cellule del sistema
immunitario (mastociti, basofili, altri leucociti,
ecc)
Possono comparire reazioni crociate con composti
strutturalmente simili
Reazioni crociate legate al meccanismo di
azione del farmaco e non alla sua struttura
La possibilità di dimostrare IgE specifiche è
occasionale (skin tests, RAST)
Skin tests e IgE specifiche negative
Allergia a farmaci: eterogeneità delle manifestazioni
cliniche e dei meccanismi fisiopatologici
Anafilassi e orticaria
Discrasie ematiche
Vasculiti
Esantema maculopapulare
Esantema pustoloso o bolloso
(AGEP)
Sindrome Stevens-Johnson(SJS),
necrolisi tossica epidermica(TEN)
Epatite, nefrite interstiziale,
polmonite
Patologie autoimmuni farmacoindotte(LES, pemfigo ...)
Sindromi da iperreattività
farmaco indotte (DiHS/DRESS)
Allergia a farmaci
T-cell
Esantema maculopapulare
(MPE)
Esantema bolloso
Sindrome di StevensJohnson(SJS), necrolisi tossica
epidermica (TEN)
Pustolosi esantematica acuta
generalizzata (AGEP)
Reazione a farmaci con
eosinofilia e sintomi sistemici
(DRESS)
Nefriti interstiziali,
pancreatiti, coliti, polmoniti,
epatiti
Orticaria, angioedema,
anafilassi, broncospasmo.
Discrasia ematica, anemia
emolitica, piastrinopenia,
agranulocitosi
Vasculiti
Patologie autoimmuni
farmaco-indotte(LES,
pemfigo ...)
IgE
IgG
&
Compl.
Reazioni da ipersensibilità indotte da anticorpi (IIII) e reazioni da ipersensibilità ritardate (IV a-d)
Mediatore
della reazione
Antigene
Meccanismo
effettore
Tipo I
Tipo II
Tipo III
IgE
IgG
IgG
IFNγγ, TNFα
(cellule TH1 )
IL-5, IL-4/IL-13
(celluleTH2 )
Perforine/
GranzymeB
(CTL)
Antigeni solubile
Antigeni legati a
membrane
cellulari
Antigeni solubili
Attivazione
cellule T MHC o
diretta
Attivazione
cellule T MHC o
diretta
Antigeni cellulari
o attivazione T
diretta
Attivazione dei
mastociti
Cellule FcR+
(fagociti, cellule
NK)
Cellule FcR+
Complemento
Attivazione
macrofagi
Eosinofili
Cellule T
blood
vessel
Tipo IV a
Esempio clinico
della reazione
Tipo IV d
CXCL-8.
GM-CSF, IL-17 (?)
(cellule T)
Attivazione
cellule T MHC o
diretta
Neutrofili
TH2
IFN-γ
TH1
Ag
IL-4
IL-5
Anemia emolitica,
piastrinopenia
(es, penicillina)
Tipo IV c
immune complex
piastrine
Rinite e asma
allergica, anafilassi
sistemica
Tipo IV b
Malattia da siero
fenomeno di
Arthus
Pichler W.J. Delayed drug hypersensitivity reactions, Ann Int Med 2003
eotaxin
Chemochine
Citochine
Citochine
Mediatori flogosi
Reazione alla
tuberculina , DAC
(insieme a IVc)
Asma cronica,
rinite allergica
cronica, esantema
maculo-papulare
con eosinofilia
CTL
CXCL8
GM-CSF
PMN
Citochine,
Mediatori flogosi
DAC, esantema
maculo-papulare e
bolloso,
epatite
AGEP,
Malattia d Bechet
Tempo di insorgenza
Entro 1-2 ore : reazioni immediate,
frequentemente IgE mediate
Orticaria, angioedema, broncospasmo, anafilassi
Dopo 1-2 ore* (frequentemente >6 ore-settimane):
reazioni ritardate, frequentemente mediate da
cellule T, occassionalmente mediate da IgG,
frequentemente caratterizzate da sintomi cutanei.
Comparsa del quadro clinico nelle reazioni
immediate e ritardate
Ritardate:
La sensibilizzazione ed I sintomi
compaiono spesso all’8°-10°
giorno di terapia (esantema)
↓↓
16
14
12
10
8
6
4
2
0
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
↓↓↓↓↓↓↓↓↓
1
2 3
4 5 6
7 8
13
7
13
5
13
3
13
1
12
9
5
3
↓↓↓↓↓
1
Immediate:
Sensibilizzazione silente nel corso
della quale il fermaco è ben
tollerato;
Alla ri-esposizione si osserva una
rapida comparsa dei sintromi
(orticaria, anafilassi)
(↓) (↓)
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Difficoltà diagnostiche
Tipologia della reazione immunologica
I farmaci possono stimolare un largo spettro di reazioni immunologiche,
ognuna delle quali richiede differenti tests per porre una diagnosi etiologica
Tipologia dell’epitopo
I farmaci agiscono come apteni e si legano a differenti proteine cellulari o
tissutali. Frequentemente l’esatto epitopo responsabile della reazione è
sconosciuto.
Correlazione clinica
I risultati dei tests in vivo o in vitro con differenti concentrazioni del farmaco
possono non correlare con il quadro clinico
Terapie associate e comorbidità
Il farmaco responsabile della reazione spesso viene somministrato in
combinazione con altri farmaci in pazienti affetti da molteplici malattie
Come identificare il farmaco responsabile ?
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Storia clinica (copper standard)
Conoscenza delle molecole farmacologiche e die loro effetti secondari
Meccanismo fisiopatologico implicato (IgE, cellule T, IgG)
Prove cutanee con concentrazioni non tossiche del farmaco
prick test (SPT); test intradermici (IDT)
IDT a lettura ritardata e patch tests
SIerologia/ IgE specifiche
IgE specifiche (disponibili e validate solo per alcuni farmaci)
Test di attivazione die basofili (in teoria disponibile per molti farmaci)
Test di Coomb in caso di anemia emolitica
Test di trasformazione linfocitaria
Test di scatenamento (gold standard) (quando I punti 4 -6 non sono
disponibilio non validati)
Diagnosi di reazione anafilattica
Dosaggio della
triptasi
(>25µg/L)
Sensibilità 64%,
Specificità
89,3%
PPV 92,6%,
NPV 54,3%
• Picco dopo 30 minuti dall’evento
• Emivita 90 minuti
• Dosaggio possibile fino a sei ore dopo evento
Farmaci responsabili di
reazioni potenzialmente gravi
Reazioni immediate
Antibiotici β-lattamici, pirazolonici, miorilassanti,
mezzi di contrasto
Reazioni ritardate
Antiepilettici: carbamazepina, lamotrigina,
phenobarbital
Allopurinolo
Sulfonamide/Sulfasalazina
Nevirapina, Abacavir
Alcuni chinolonici
Minociclina, diltiazem
Reazioni immediate
tests cutanei (prick tests e test intradermici)
Sono indicate nelle reazioni IgE mediate
Sensibilità varia
Nel caso di β-lattamici, 70% se vengono testati insieme
penicilloil sina (PPL), determinanti minori (MDM),
amoxicillina (AX) e ampicillina (AMP)
Miorilassanti = 97%
Specificità
β-lattamici = 97-99%
Miorilassanti = 97%
Reazioni Immediate
le IgE specifiche
Disponibili in commercio
Phadia CAP®/ ImmunoCAP
Penicilloyl G, penicilloyl V, amoxicilloyl,
ampicilloyl, cefaclor, suxametonio
Meno sensibili e specifiche se comparate con I tests
cutanei
Sensibilità per penicillina/ amoxicillina
38-54%
Specificità per penicillina/ amoxicillina
87-100%
Attivazione complemento
Nel caso delle
reazioni avverse a
farmaci il
meccanismo
fisiopatologico
spesso è
rappresentato dalla
liberazione diretta
di mediatori da
parte di mastociti e
basofili senza la
presenza di IgE
specifiche.
C3a
C5a
Mc
Mezzi di
contrasto
I tests cellulari nascono per
questo…..
….nel tentativo di
riprodurre in vitro
quello che succede in
vivo, indipendente
dal meccanismo che
elicita la reazione
Principi del BAT
(Basophil Activation Test)
ALLERGEN
CD203c
p38 MAPH
fosforilazione
CD63
Principi del BAT
ALLERGEN
C5a
CD203c
p38 MAPH
fosforilazione
CD63
La citometria a flusso e i basofili
Marcatori di
identificazione
Marcatori di
attivazione
Anti IgE / anti CD63
Basofili
attivati
BASOTEST ORPENGEN
CD123 / HLA-DR / CD63
Il CD123 (recettore per la catena α
della IL-3) è espresso su una
sottopopolazione di cellule
dendritiche, di cellule progenitrici,
sui monociti, eosinofili, neutrofili e
basofili, su popolazioni di cellule B
che coesprimono CD5
L'HLA-DR è espresso su linfociti B,
monociti, macrofagi, linfociti T
attivati, cellule NK attivate e cellule
progenitrici.
Fastimmune BD
CD 203c
E-NPP3 (Neural Cell Surface
Differentiation Antigen)
Fa parte della famiglia degli ectopeptidi
pirofosfatasi/fosfodiesterasi
Metalloenzimi trasmembrana di tipo II
Scindono legami fosfosulfidrici e
fosfodiesterici di desossinucleotidi e dei
nucleosidi.
Nel sangue periferico è espresso
costitutivamente solo sulla superficie di
basofili
La sua espressione aumenta entro 5
minuti dalla attivazione allergenica o
dalla stimolazione con anti IgE e anti
FceRI
Dopo attivazione, il CD203c viene
“overespresso” fino al 350% in più,
contro il 100% del CD63.
CRTH2
Escludo eosinofili
Espresso su cellule associate alla
risposta TH2 (linfociti TH2,
eosinofili, basofili)
Chemoattractant Receptorhomologous molecule dei TH2
Definito anche DP2, secondo
recettore per la prostaglandina 2
E' altamente espresso sui
basofili
CRTH2 / CD203c
Coulter IL
CCR3/CD63
CCR3 espresso su
basofili ed eosinofili
Flow2CAST Buhlmann
Miorilassanti
Allergene
Test di
riferimento
Sensibilità
Specificità
Reference
miorilassanti
A
64
93
1
“
A + ST
54
100
2
“
A
79
100
3
“
A + ST
36-86
93
4
rocuronium
A + ST
92
100
5
miorilassanti
A + ST + IgE
68
100
6
Legenda: A = anamnesi; ST = Skin Test;
1. Abuaf N, Rajoely B, Ghazouani E, et al. Validation of a flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of muscle relaxant
allergy. J Allergy Clin Immunol 1999;104:411–8.
2. Monneret G, Benoit Y, Debard AL, et al. Monitoring of basophil activation using CD63 and CCR3 in allergy to muscle relaxant drugs. Clin Immunol 2002;
102(2):192–9.
3. Sudheer PS, Hall JE, Read GF, et al. Flow cytometric investigation of peri-anaesthetic anaphylaxis using CD63 and CD203c. Anaesthesia 2005;60(3):251–6.
4. Kvedariene V, Kamey S, Ryckwaert Y, et al. Diagnosis of neuromuscular blocking agent hypersensitivity reactions using cytofluorimetric analysis of
basophils. Allergy 2006;61(3):311–5.
5. Ebo DG, Bridts CH, Hagendorens MM, et al. Flow-assisted diagnostic management of anaphylaxis from rocuronium bromide. Allergy 2006;61(8):935–9.
6. Sainte-Laudy J, Orsel I. [Interest of a new flow cytometric protocol applied to diagnosis and prevention of per anaesthetic accidents induced by
neuromuscular blockers]. Revue francaise d’allergologie at d’immunologie clinique 2008; 48:470–5 [in French].
Miorilassanti disponibili
Atracurium
Cisatracurium
Mivacurium
Pancuronium
Propofol
Rocuronium
Suxamethonium
Vecuronium
Antibiotici β -lattamici
Allergene
Test di
riferimento
Sensibilità
Specificità
Reference
β-lattamici
A + ST
50
93
7
“
A + ST + IgE
+ PT
50
93
8
“
A + ST
49
91
9
Legenda: A = anamnesi; ST = Skin Test; PT = test di provocazione
RAST
Se 38% Sp 86,7% *
7. Sanz ML, Gamboa PM, Antepara I, et al. Flow cytometric basophil activation test by detection of CD63
expression in patients with immediate-type reactions to betalactam antibiotics. Clin Exp Allergy 2002;32(2):277–
86.
8. Torres MJ, Padial A, Mayorga C, et al. The diagnostic interpretation of basophil activation test in immediate
allergic reactions to betalactams. Clin Exp Allergy 2004;34(11):1768–75.
9. Abuaf N, Rostane H, Rajoely B, et al. Comparison of two basophil activation markers CD63 and CD203c in the
diagnosis of amoxicillin allergy. Clin Exp Allergy 2008;38(6):921–8.
* M.L. Sanz e coll. Anales del sistema sanitario de Navarra, Vol.26, Suppl, 2, 2003
Antibiotici β –lattamici disponibili
Penicillina G e V
PPL e MDM
Cefalosporina C
Cefamandolo
Cefazolina
Cefuroxime
Cefaclor
Ceftriaxone
Sulfametossazolo
Trimethoprin
Tetraciclina
Ciprofloxacina
Ampicillina
Amoxicillina
Claritromicina
Rifampicina
ASA e FANS
Allergene
Test di
riferimento
Sensibilità
Specificità
Reference
Metamizolo
A + PT
42
100
10
ASA e FANS
A + PT
15-55
74-100
11
FANS
A
43
100
12
Legenda: A = anamnesi; ST = Skin Test; PT = test di provocazione
10. Gamboa PM, Sanz ML, Caballero MR, et al. Use of CD63 expression as a marker of in vitro basophil
activation and leukotriene determination in metamizol allergic patients. Allergy 2003;58(4):312–7.
11. Gamboa P, Sanz ML, Caballero MR, et al. The flow-cytometric determination of basophil activation induced
by aspirin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is useful for in vitro diagnosis of the NSAID
hypersensitivity syndrome. Clin Exp Allergy 2004;34(9):1448–57.
12. Rodriguez-Trabado A, Camara-Hijon C, Ramos-Cantarino A, et al. Basophil activation test for the in vitro
diagnosis of nonsteroidal anti-inflammatory drug hypersensitivity. Allergy Asthma Proc 2008;29(3):241–9.
Allergy
Volume 63 Issue 5 Page 624-626, May 2008
M. Viola, G. Maietta, D. Quaratino, G. Rumi, F. Gaeta, A.
Romano (2008) Selective hypersensitivity to nimesulide
Allergy 63 (5) , 624–626
ASA e FANS disponibili
LYS-aspirina
Diclofenac
Ibuprofen
Indometacina
Acetaminofene
Acido mefenamico
Fenilbutazone
Propifenazone
Metamizolo
Naprossene
Mezzi di contrasto e
attivazione dei basofili
Legame non specifico a recettori di membrana di
mastociti e basofili (attivazione diretta)
Attivazione da parte di frazioni del complemento
o del sistema fibrinolitico (attivazione indiretta)
IgE mediata
Mezzi di contrasto disponibili
Iobitridolo
Iodixanolo
Iohexol
Iomeprol
Iopamidolo
Iopromide
Ioxaglato
Ioxitalamato
1
1
Altre applicazioni del BAT
Clorexidina
Gelatine
Carbossimetilcellulosa
Plasma-expanders
Cremoforo (emulsionante della ciclosporina per via ev)
BSA
Omeprazolo
Eparine a basso peso molecolare
Patent blue
Ialuronidasi
Sali di platino
Vaccino HB ricombinante
Valaciclovir
Conclusioni
Il BAT rappresenta un nuovo strumento nella diagnosi delle
reazioni immediate a farmaci.
Trova la sua ideale collocazione in quei casi in cui la normale
routine in vitro non offre alternative e la conferma del
sospetto diagnostico richiede metodi di provocazione
potenzialmente dannosi per il paziente.
Nell’ottica di una sempre maggiore validazione, L’EUROBAT,
organismo della EAACI, si prefigge l’obiettivo di armonizzare i
differenti protocolli del BAT con la finalità di dettare i criteri
per una corretta selezione del paziente, di stabilire le
concentrazioni del farmaco da utilizzare nel test, di identificare
il valore soglia di positività per ogni farmaco.
Take home message
Il BAT è un simulatore della reazione dei basofili e mastociti a
molecole allergeniche, tra le quali anche i farmaci.
La sua grande versalità risiede nel fatto che è in grado di
studiare le reazioni avverse a farmaci da parte dei basofili,
anche se IgE indipendenti.
La selezione del paziente, l’utilizzazione di una molecola pura,
la concentrazione del farmaco da utilizzare nel test, il tempo di
esecuzione del test e il valore soglia che discrimini per ogni
farmaco i negativi dai positivi, rappresentano variabili
fondamentali per un risultato affidabile.
Grazie per
l’attenzione!
Reazioni Ritardate
Lymphocyte transformation test (LTT)
Picher WJ, et al. Allergy 2004: 59: 809–820
Valutazione del LTT
I risultati del Test di Trasformazione Linfocitario vengono espressi come
Indice di Stimolazione (S.I.)
Quale S.I. deve essere considerato come indicativo di una
sensibilizzazione rimane ancora un problema controverso
In genere il test viene considerato positivo per valori > 2, per i β-lattamici
positivo per valori > 3.
Alcuni farmaci inducono una reazione proliferativa anche in soggetti non
sensibilizzati (vancomicina, a volte paracetamolo, mezzi di contrasto)
LTT nelle reazioni a farmaci
Soggetti non allergici e soggetti esposti al farmaco ma non allergici
non evidenziano risposte proliferative al farmaco.
E' stata dimostrata una assenza di reattività a molti differenti
farmaci con selettiva reattività solo ad uno specifico farmaco nei
soggetti studiati.
Sensibilità 71.4% e specificità 81.8% in pazienti con esantema da
farmaci antiepilettici1
Sensibilità 74% in pazienti con reazioni a β-lattamici2.
LTT in DRESS da carbamazepina e lamotrigina ha evidenziato
sensibilità pari al 97% e specificità del 100%3.
1)
2)
3)
Bircher J. Allergie aux medicaments, 2006
Pichler WJ Drug Hypersensitivity, 2007
Naisbitt DJet al. Mol Pharmacol 2003
Marcatori di proliferazione
Beeler A et al. Drug Hypersensitivity, Karger 2007
Elispot nello studio della risposta
ritardata a farmaci
Elispot
Diagnostica allergologica:
i tests cellulari
Rispetto a 10 anni fa, oggi abbiamo a disposizione
nuovi tests cellulari per la diagnosi delle reazioni
allergiche di tipo immediato e ritardato.
Tali tests necessitano ancora di una completa
validazione e in alcuni settori sono ancora in fase di
studio.
L’utilizzazione di allergeni standardizzati permette di
raggiungere maggiori sensibilità e specificità dei tests.
I tests devono essere eseguiti seguendo in maniera
rigida i protocolli indicati dai gruppi di studio
dell’EAACI.
