Ricombinazione e trasposizione a livello molecolare

Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 17
Domande concettuali
C1. A livello molecolare, lo scambio tra cromatidi fratelli (SCE) e la ricombinazione che riguarda
gli omologhi sono molto simili. Segmenti di DNA identici (SCE) oppure simili
(ricombinazione omologa) si allineano e attuano un crossing-over. Sulla base delle similitudini
a livello molecolare dei due processi, ci si aspetterebbe che i due eventi siano catalizzati dagli
stessi tipi di proteine. Tuttavia, a livello genetico, gli eventi sono diversi. Gli SCE non
determinano la ricombinazione degli alleli, perché i cromatidi sono geneticamente identici. La
ricombinazione omologa solitamente porta a una nuova combinazione allelica dopo che è
avvenuto il crossing-over.
C2. La migrazione della ramificazione non porterà alla formazione di un eteroduplex durante l’SCE
perché i cromatidi fratelli sono geneticamente identici. Non dovrebbero esserci appaiamenti
errati tra filamenti complementari. La conversione genica non può avvenire perché i cromatidi
fratelli portano alleli identici tra loro.
C3. Le fasi sono descritte nella Figura 17.3.
A. Le estremità dei filamenti sottoposti a rottura non verrebbero riconosciute e degradate.
B. La proteina RecA non riconoscerebbe le estremità a singolo filamento, e l'invasione del
filamento nella doppia elica omologa non avverrebbe.
C. Non si formerebbero le giunzioni di Holliday.
D. Senza queste proteine non avverrebbe la migrazione della ramificazione, e non potrebbe
verificarsi la risoluzione delle eliche interconnesse.
C4. I due meccanismi molecolari che possono spiegare il fenomeno della conversione genica sono
la riparazione degli appaiamenti scorretti e la sintesi riparativa delle interruzioni. Entrambi i
meccanismi potrebbero verificarsi nel modello della rottura a doppio filamento.
C5. Solitamente, l'effetto netto generale della ricombinazione omologa non è quello di creare nuove
mutazioni in particolari geni. Tuttavia, la ricombinazione omologa crea delle nuove
combinazioni di alleli lungo particolari cromosomi. Questo può essere considerato come una
mutazione, perché la sequenza di un cromosoma è stata alterata in modo ereditabile.
C6. Un cromosoma ricombinante deriva da un crossing-over e contiene una combinazione di alleli
diversa da quella dei cromosomi parentali. Il cromosoma ricombinante è un ibrido tra i due
cromosomi parentali.
C7. Questo dipende dal modo con cui avvengono i tagli dei filamenti del DNA durante la fase di
risoluzione. Se le due rotture avvengono nei filamenti di DNA che hanno subito crossing-over,
ne risultano cromosomi non ricombinanti. Se i due tagli avvengono nei filamenti che non
hanno partecipato allo scambio, il risultato è una coppia di cromosomi ricombinanti.
C8. La conversione genica avviene quando una coppia di alleli diversi viene convertita in una
coppia di alleli identici. Per esempio, una coppia di alleli Bb potrebbe essere convertita in BB
oppure bb.
C9. Il modello di Holliday propone due rotture, una in ciascun cromatidio, e, in seguito, entrambi i
filamenti scambiano una porzione del DNA a singolo filamento. Il modello della rottura a
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
doppio filamento propone due tagli, entrambi nello stesso cromatidio. Come nel modello di
Holliday, la migrazione a singolo filamento avviene tre i due omologhi. Il modello della rottura
a doppio filamento propone anche la degradazione del filamento e la sintesi riparativa del
DNA. Infine, il modello della rottura a doppio filamento genera due giunzioni di Holliday, e
non semplicemente una.
C10. È probabile che la conversione genica avvenga vicino al punto di rottura. Secondo il modello
della rottura a doppio filamento, mediante la digestione di un filamento di DNA nella doppia
elica si può creare un’interruzione. La sintesi riparativa può risultare nella conversione genica.
Un secondo modo nel quale può avvenire la conversione genica è mediante la riparazione degli
appaiamenti errati. Dopo la migrazione del filamento di DNA può formarsi un eteroduplex che
può venire riparato in modo da causare la conversione genica.
C11. La proteina RecA si lega al DNA a singola elica e forma un filamento. Il filamento scivola
lungo un'altra regione del DNA fino a quando riconosce le sequenze omologhe. Dopo il
riconoscimento, la proteina RecA media il movimento del filamento invasore e la dislocazione
del filamento originale
C12. No, non coinvolge necessariamente la riparazione degli appaiamenti errati; la conversione
genica potrebbe coinvolgere anche la sintesi riparativa. Il modello della rottura a doppio
filamento comporta la migrazione dei filamenti di DNA e la digestione di un’interruzione.
Perciò, in questa regione interrotta solo un cromatidio fornisce i filamenti di DNA. Come si vede
nella Figura 17.5, il cromosoma in alto usa il filamento superiore del cromosoma posto in basso
nella regione interrotta. Il cromosoma in basso usa il filamento inferiore del cromosoma
superiore. Dopo la sintesi di DNA, entrambi i cromosomi possono presentare lo stesso allele.
C13. RecG e RuvABC si legano alle giunzioni di Holliday. Esse non riconoscono necessariamente
una sequenza di DNA, ma identificano una regione di crossing-over (cioè una struttura a
quattro filamenti).
C14. Primo, il riarrangiamento genico dei domini V, D, e J avviene all’interno dei geni per la catena
leggera e per quella pesante. Secondo, in una determinata cellula B sono possibili diverse
combinazioni di catene leggere e pesanti. Terzo, può verificarsi la fusione imprecisa tra i domini
V, D, e J.
C15. La funzione delle proteine RAG1 e RAG2 è quella di riconoscere le sequenze segnale per la
ricombinazione e generare due rotture a doppio filamento. Esse generano un taglio all'estremità
di una regione V e all'inizio di una regione J. Le proteine NHEJ riconoscono le estremità e le
saldano tra loro. Questa è una forma di splicing del DNA che crea combinazioni diverse delle
regioni V, J, D, e C, generando di conseguenza un’ampia gamma di diversità tra gli anticorpi
codificati.
C16. Un segmento di DNA che comprende alcuni domini variabili (V) e forse uno o più domini di
giunzione (J) viene rimosso dal gene per la catena leggera κ. Un segmento che può includere uno
o più domini J e la regione compresa tra il dominio J e il dominio C viene rimosso durante la
maturazione del pre-mRNA.
C17. L’integrasi è un enzima che riconosce le sequenze che costituiscono i siti di attacco all'interno
del DNA di λ e del cromosoma di E. coli. Esso mette in contatto il DNA di λ al cromosoma e
opera dei tagli sfalsati nei siti di attacco. I filamenti vengono scambiati, e le estremità legate tra
loro. In questo modo, il DNA di λ viene inserito in un sito preciso all'interno del cromosoma di
E. coli.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
C18. Le estremità di una breve regione sarebbero fiancheggiate da sequenze ripetute dirette. Questa
è una caratteristica universale di tutti gli elementi trasponibili. Inoltre, molti elementi contengono
IR oppure LTR che sono coinvolte nel processo della trasposizione. Si potrebbe anche cercare la
presenza di un gene per la trasposasi oppure per la trascrittasi inversa, sebbene questa non sia
una caratteristica necessaria, perché gli elementi trasponibili non autonomi tipicamente sono
privi della trasposasi oppure della trascrittasi inversa.
C19. Nella Figura 17.11, l’elemento trasponibile si è trasposto prima della replicazione del DNA. Il
trasposone è a singolo filamento in entrambe le localizzazioni. La replicazione del DNA (cioè
la sintesi riparativa) copia gli elementi a singolo filamento in elementi a doppio filamento.
Perciò, il risultato finale è di due elementi trasponibili a doppio filamento in due siti distinti.
C20. Le ripetizioni dirette si formano perché la trasposasi oppure l’integrasi producono tagli sfalsati
nei due filamenti di DNA cromosomico. L’elemento trasponibile viene poi inserito all’interno di
questo sito, che lascia temporaneamente due interruzioni, le quali vengono riempite dalla DNA
polimerasi. Siccome ciò avviene grazie alla complementarietà delle sequenze nucleotidiche, le
due interruzioni avranno infine la stessa identica sequenza.
C21. I retroelementi hanno maggiore potenziale proliferativo, perché l'elemento viene trascritto
nell'intermedio a RNA. Possono essere trascritte molte copie di questo RNA e poi copiate in
DNA mediante la trascrittasi inversa. In teoria, in una singola generazione potrebbero essere
inserite nel genoma molte copie dell'elemento.
C22. Gli elementi trasponibili sono mutageni, perché essi alterano le sequenze dei cromosomi e dei
geni all’interno dei cromosomi, inserendosi all’interno dei geni.
C23. Ricorda che ogni tipo di trasposasi riconosce solamente le sequenze ripetute invertite di un
particolare tipo di elemento trasponibile. Le zanzare devono esprimere una trasposasi che
riconosca gli elementi Z. Questo spiega perché gli elementi siano mobili. Questa trasposasi
degli elementi Z non deve riconoscere le sequenze ripetute invertite degli elementi X; le
sequenze ripetute invertite degli elementi X e degli elementi Z devono avere sequenze diverse.
Questo stesso gruppo di zanzare non deve esprimere una trasposasi che inserisca gli elementi
X. Questo spiega perché gli elementi X siano molto stabili.
C24.
A. I retroelementi di tipo virale e quelli non virali
B. Sequenze di inserzione, trasposoni composti, e trasposoni replicativi
C. Tutti i cinque tipi hanno sequenze ripetute dirette
D. Le sequenze di inserzione, i trasposoni composti, e i trasposoni replicativi
C25. Un trasposone viene escisso come un segmento di DNA, e poi esso si traspone in una nuova
localizzazione grazie all'azione della trasposasi. Un retroelemento viene trascritto come RNA,
e poi la trascrittasi inversa lo trasforma in una copia di DNA a doppio filamento. L'integrasi poi
inserisce questa copia di DNA nel cromosoma. Tutti gli elementi trasponibili hanno sequenze
ripetute dirette. I trasposoni che si spostano sotto forma di DNA possiedono sequenze ripetute
invertite, e possono codificare una trasposasi (oltre ad altri geni). I retroelementi non
presentano sequenze ripetute invertite, ma possono possedere o meno LTR. I retroelementi
autonomi codificano la trascrittasi inversa e l'integrasi.
C26.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
A. Come mostrato nel problema risolto R2a, un crossing-over tra le sequenze ripetute dirette
(DR) porterà all’escissione della regione compresa tra le ripetizioni. In questo caso, verrà
escissa e perduta una grande regione cromosomica, che non contiene un centromero. La
porzione rimanente del cromosoma è illustrata di seguito. Essa presenta una sequenza
ripetuta diretta formata in parte dalla DR-1 e in parte dalla DR-4. Essa viene indicata come
DR-1/4.
B. Un crossing-over tra IR-1 e IR-4 determinerà un’inversione della regione che li separa.
Questo effetto è simile al crossing-over in un singolo elemento trasponibile, come descritto
nel problema risolto R2b. La differenza è che il crossing-over determina l’inversione di
un’ampia regione cromosomica.
Trasposone
Trasposone
C27. Un elemento trasponibile autonomo ha i geni necessari per la trasposizione. Per esempio, un
elemento trasponibile autonomo possiede anche il gene per la trasposasi. Un elemento
trasponibile non autonomo non possiede tutti i geni necessari per la trasposizione. Tuttavia, se
la cellula contiene un elemento autonomo e un elemento non autonomo dello stesso tipo,
l'elemento non autonomo può spostarsi. Per esempio, se una cellula di Drosophila possiede due
elementi P, uno autonomo e l’altro non autonomo, la trasposasi espressa dall'elemento P
autonomo potrebbe riconoscere l'elemento P non autonomo e catalizzarne la sua trasposizione.
C28. Con frequenza di circa 1 su 10 000, si verifica la ricombinazione tra le sequenze ripetute
invertite all’interno di questo trasposone. Come descritto nel problema risolto R2b, la
ricombinazione tra sequenze ripetute invertite determina l’inversione della sequenza all’interno
del trasposone. Se questo si verifica in un ceppo che esprimeva l’operone H2/rH1 il promotore
verrebbe ruotato nell’orientamento opposto, così che i geni H2 e rH1 non verrebbero espressi. La
proteina flagellare H2 non verrebbe prodotta, e nemmeno la proteina repressore H1. Sarebbe
invece prodotta la proteina flagellare H1, perché l’espressione del gene H1 non sarebbe repressa.
Anche il ceppo che esprime il gene H1 potrebbe cambiare con una frequenza di 1 su 10 000
mediante lo stesso meccanismo. Se si verificasse un crossing-over tra le sequenze ripetute
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
invertite dell’elemento trasponibile, il promotore verrebbe ruotato nuovamente, e i geni H2 e rH1
sarebbero nuovamente espressi.
C29.La formazione delle delezioni e delle inversioni è descritta anche nella risposta alla domanda
concettuale C26. Una delezione può presentarsi quando avviene la ricombinazione tra due
Trasposone
Trasposone
Dopo la ricombinazione
elementi diversi che si allineano nella stessa direzione. Questa regione compresa tra gli
elementi viene deleta. Un'inversione si ha quando la ricombinazione coinvolge due elementi
diversi orientati in direzioni opposte. Una traslocazione avviene quando la ricombinazione
coinvolge elementi trasponibili localizzati in cromosomi non omologhi. In altre parole, gli
elementi trasponibili posti in cromosomi diversi si allineano e avviene un crossing-over.
Questo produrrà una traslocazione, come illustrato di seguito:
Domande sperimentali
S1. A causa del meccanismo semiconservativo della replicazione del DNA, uno dei cromatidi
fratelli contiene BrdU nei due filamenti di DNA, mentre l'altro cromatidio fratello la contiene
BrdU solamente in uno dei due filamenti di DNA.
S2. Concluderesti che il substrato è un mutageno. Le sostanze che danneggiano il DNA
aumentano il livello degli scambi genetici quali gli SCE.
S3. Dovresti aggiungere il mutageno dopo il secondo ciclo di replicazione ma prima che avvenga il
crossing-over durante la mitosi (quindi aggiungerlo durante la fase G2). In questo esperimento
stai cercando gli scambi tra cromatidi fratelli (SCE) che si verificano dopo il secondo ciclo di
replicazione del DNA. Se il mutageno può persistere nelle cellule per un lungo periodo,
potresti aggiungerlo in una fase precedente.
S4. Il disegno di seguito illustra la progressione attraverso tre cicli di esposizione alla BrdU.
Dopo una replicazione, tutti i cromosomi saranno colorati in modo omogeneo. Dopo due cicli di
replicazione, tutti i cromosomi saranno arlecchino. Dopo tre replicazioni, il numero di cromatidi
fratelli chiari sarà il doppio del numero di cromatidi fratelli chiari presenti dopo due cicli di
replicazione.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
Dopo la
seconda
replicazione
Un singolo
scambio tra
cromatidi
fratelli
Dopo la
seconda
replicazione
S5. Come descritto nel Capitolo 8, il legame del colorante Giemsa ai cromosomi produce le bande
G, che sono scure. I cromatidi in cui entrambi i filamenti contengono BrdU appaiono chiari, a
indicare che la BrdU inibisce il legame del colorante Giemsa.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
S6. Quando McClintock iniziò con un ceppo incolore contenente Ds, identificò 20 casi in cui Ds si
era spostato in un nuovo sito per produrre chicchi rossi e raggrinziti. L’identificazione fu
possibile perché i 20 ceppi manifestavano rotture cromosomiche in un sito specifico con
frequenza maggiore, grazie alla mutabilità di particolari geni. McClintock identificò anche un
ceppo dove Ds era inserito in un gene per la produzione del colore rosso, determinando un
fenotipo incolore, così che la sua escissione dal gene determinava un settore rosso.
Nell’insieme, la sua analisi dei dati stabilì che la presenza dei settori (quindi la mutabilità) era
in accordo con la trasposizione di Ds.
S7. Il fenotipo rosso è determinato dall’escissione di un elemento trasponibile. Questa conclusione
si basa sulla reversione del fenotipo (cioè da incolore a rosso), che suggerisce un recupero della
funzione genica e assenza di mutazioni fenotipica.
S8. Il transposon tagging è un metodo sperimentale il cui scopo è quello di clonare i geni. Con
questo approccio, un trasposone viene introdotto in un ceppo, e i ricercatori identificano gli
individui nei quali la funzione di un gene di interesse viene inattivata. In molti casi la perdita di
funzione avviene perché il trasposone si è inserito nel gene. Se questo si verifica, il DNA può
essere isolato, digerito in frammenti, e clonato in vettori virali, per creare una libreria di DNA.
La libreria viene poi analizzata usando un frammento di DNA marcato radioattivamente
complementare al trasposone (una sonda), allo scopo di identificare i cloni nei quali si è inserito
il trasposone.
S9. Si potrebbe iniziare con l'assunzione che l'inattivazione di un gene oncosoppressore causi la
crescita delle cellule cancerose. Se è questo il caso, si potrebbe iniziare con una linea cellulare
umana normale e introdurre un trasposone. Il passaggio successivo sarebbe quello di
identificare le cellule che sono diventate immortali. Questo può essere fatto identificando gli
aggregati cellulari che hanno perso l'inibizione da contatto. Si potrebbe quindi coltivare queste
cellule e costruire, a partire da queste, una libreria genomica di DNA. La libreria sarà poi
vagliata usando il trasposone come sonda marcata.
S10. Un trasposone crea un sito mutabile perché l’escissione di un trasposone determina una rottura
cromosomica se le due estremità non vengono ricongiunte. Dopo la rimozione dal suo locus
originale (che determina la rottura cromosomica), esso può essere inserito in un nuovo locus.
Potresti determinare questo evento, analizzando un ceppo nel quale si è verificata una rottura
cromosomica nel primo locus. Potresti esaminare al microscopio numerose cellule con un
cromosoma rotto e vedere se si è formato un nuovo locus. Questo nuovo locus corrisponderebbe
al sito nel quale si è inserito il trasposone. Se è questo il caso, ci sarebbe una rottura
cromosomica nel nuovo sito, che potrebbe venire osservata al microscopio.
S11. Il primo passaggio è quello di iniettare il plasmide che porta l'elemento P e il gene rosy+ negli
embrioni omozigoti per l'allele recessivo rosy (cioè rosy rosy). Dopo che questi embrioni sono
diventati moscerini adulti, questi vengono incrociati con moscerini rosy rosy. Analizza il colore
degli occhi della progenie F1. Se essi sono rossi, almeno una copia dell'elemento P è saltata nel
cromosoma di questi moscerini. Possibilmente, l'elemento P è saltato in un gene coinvolto
nello sviluppo delle ali. Tuttavia, a questo punto, questo tipo di moscerini avranno una copia
normale del gene e una copia inattivata dall'elemento P. Se l'inattivazione del gene fosse
ereditata come dominante, questi moscerini dovrebbero manifestare ali deformate. In
alternativa (e con maggiore probabilità), tuttavia, l'inattivazione di una copia della maggior
parte dei geni verrà ereditata come un carattere recessivo. Se si verifica questo, le ali dei
moscerini con gli occhi rossi avranno un aspetto normale.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
Per identificare questi geni recessivi, incrocia ogni individuo della progenie F1 con occhi rossi
(e ali normali) con moscerini rosy rosy. Circa ¼ della generazione F2 dovrebbe avere occhi
rossi (assumendo che un elemento P sia saltato nel genoma dei moscerini con occhi rossi).
Incrocia tra loro gli individui della progenie F2 con occhi rossi (derivanti da ogni singolo
incrocio). Da questi incroci, ¼ dei moscerini della generazione F3 dovrebbe avere occhi di
colore rosato, ½ dovrebbe avere una copia dell'elemento P rosy+ e occhi rossi, e ¼ dovrebbe
essere omozigote per l'elemento P e avere occhi rossi. Se l'elemento P si è inserito in un gene
necessario per lo sviluppo delle ali, ¼ della progenie dovrebbe avere ali deformate e occhi
rossi. In questo modo, potresti identificare i geni che sono coinvolti nello sviluppo delle ali.
Nota: questo esperimento richiede un grande lavoro! Dovrai identificare migliaia di moscerini
con occhi rossi e allestire migliaia di incroci per identificare i pochi geni che svolgono un ruolo
chiave nello sviluppo delle ali. Tuttavia, questo approccio ha permesso l'identificazione dei
geni che svolgono un ruolo importante in molti aspetti dello sviluppo di Drosophila.