Malattie da singolo gene non ereditate in modo mendeliano (Mitocondriali) Solo per queste non si seguono le leggi di Mendel E' stato stimato che ogni cellula puo’ contenere da un centinaio a qualche migliaio di mitocondri, e che ogni mitocondrio contiene approssimativamente cinque molecole di DNA mitocondriale. Delle oltre 900 proteine mitocondriali, solo 13 sono codificate dal genoma mitocondriale (fosforilazione ossidativa), 22tRNA e 2rRNA. E’ privo di istoni, ha una scarsa capacita’ di riparazione (mutazioni 10 volte superiori a quello nucleare), e’ esposto a ROS. ETEROPLASMIA Ci sono centinaia di molecole di DNA mitocondriale in ogni cellula, e in generale le mutazioni patogenetiche sono presenti in alcuni ma non in tutti questi genomi. Come conseguenza, le cellule e i tessuti del futuro nascituro avranno sia DNA mitocondriale normale che mutato, una situazione conosciuta come eteroplasmia. EFFETTO SOGLIA Nei soggetti con eteroplasmia, prima che compaiano disfunzioni fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’ tanto piu’ basso quanto piu’ il tessuto o l'organo ha un elevato fabbisogno energetico. Trasmissione dei mitocondri mutati dalla madre ai figli. Quindi una madre con mutazioni del DNA mitocondriale le trasferisce a tutta la sua progenie in modo variabile PERCHE’ IL DNA MITOCONDRIALE SEGREGA IN MODO CASUALE. Solo le figlie potranno a loro volta trasferire la mutazione Caratteristiche peculiari delle malattie dovute a mutazioni nel DNA mitocondriale sono: - l'ereditarieta’ materna (mitocondri solo da parte materna) - l'eteroplasmia - l’effetto soglia Principali organi e tessuti colpiti dalle malattie mitocondriali. I mitocondri sono ubiquitari, quindi potenzialmente ogni tessuto dell'organismo puo’ essere colpito dalla presenza di mutazioni nel DNA mitocondriale. Questo e’ uno dei motivi per cui spesso le patologie mitocondriali sono multisistemiche. Nei soggetti con eteroplasmia, prima che compaiano disfunzioni fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’ tanto piu’ basso quanto piu’ il tessuto o l'organo ha elevato fabbisogno energetico. Questo e’ anche il motivo per cui le patologie mitocondriali colpiscono soprattutto il sistema nervoso, il muscolo scheletrico e il cuore (tutti organi e tessuti ad elevato fabbisogno energetico). Pedigree della Malattia di Leber Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) E’ una malattia neurodegenerativa del nervo ottico, che spesso si caratterizza per una perdita improvvisa della vista nei giovani adulti. Spesso tra i 18 e i 30 anni è descritta una perdita della visione centrale improvvisa, indolore, acuta o subacuta. Interessa entrambi gli occhi simultaneamente o sequenzialmente con perdita della vista nel secondo occhio dopo alcune settimanemesi. Mutazioni frequenti Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) Mutazioni nelle posizioni 11778 G to A, 3460 G to A and 14484 T to C, nelle subunità ND4, ND1 and ND6 del complesso I della catena della fosforilazione ossidativa •Molti aspetti della sindrome LHON rimangono da chiarire, quali l'estrema specificità tissutale delle lesioni cliniche, la prevalenza nel sesso maschile, e le conseguenze biochimiche di ciascuna mutazione. • ROS: important for disease (studies with reducing agents) idebenone Malattie da Espansione di Triplette Replication Slippage Replication Slippage http://www.dnatube.com/video/607/Tri-Nucleotide-Repeat X-Fragile Syndrome (penetranza ridotta) Gene codificante FMR-1 (fragile X mental retardation 1 ) Strozzatura Necessario per lo Sviluppo neuronale Le ripetizioni inducono Metilazione e repressione X-Fragile Syndrome (II) •Associata a ritardo mentale • Non tutti I maschi portatori sono affetti dalla malattia (affetti 80%) • Il 50% delle femmine portatrici é affetto dalla malattia • Anticipazione: il fenotipo peggiora ad ogni generazione X-Fragile Syndrome (III) • Ripetizione di CGG nella regione 5’ UTR del gene FMR-1 • Individui: Normali: 6-46 ripetizioni Portatori sani: 50-230 (premutazione) Malati: 230-4000 (Full mutation) • I maschi trasmettono la mutazione senza grandi alterazioni nel numero di triplette • Le femmine amplificano le triplette (amplificazione durante la gametogenesi) Pedigree della sindrome dell’X fragile Lyonization? Non e’ chiaro. ? Huntington Disease • Corea di Huntington (còrea dal greco, danza) • George Huntington 1872 • Gene presente sul cromosoma 4p16 Caratteristiche cliniche • Trasmissione autosomica dominante penetranza quasi 100% • Fenomeno dell’ anticipazione • Insorgenza tardiva (inizio a 30-40 anni); • Sintomi: perdita del controllo motorio (corea), cambi della personalitá, amnesia, diminuite capacitá intellettive (demenza); la morte sopraggiunge 15-20 anni dopo l’inizio dei sintomi, • Progressiva atrofia dello striato HD Sano Degeneration of Striatum (pianificazione e modulazione dei movimenti): • caudate nucleus • putamen Età di esordio vs numero di ripetizioni Qual e’ la funzione della proteina wt? Huntingtin • Espansione di una tripletta -CAG- presente nel 1 esone • Da11 a 34 Q nella popolazione • da 40-100 nei malati di HD (correlazione:espansione, insorgenza, severita’ fenotipo) • L’espansione avviene durante la spermatogenesi • La proteina naturale é essenziale per la neurogenesi (topi) • La proteina wild-type é citoplasmica, quella mutata trasloca nel nucleo • La proteina e’ grande (348kd, 3144aa) e solubile • Anche la perdita della proteina wt causa alcune manifestazioni tipiche della malattia • Importanza della funzione della proteina wt (RNA interference and farmaci selettivi per la proteina mutata, NON DEVONO ridurre la wt) Apoptosi Apoptosi Toxicity by NMDA Apoptosi Huntingtin Protein Flessibilità strutturale: • Differenti epitopi della proteina sono accessibili in differenti compartimenti cellulari (alterazione causata da polyQ) Quali sono i meccanismi responsabili della perdita progressiva di funzionalità e morte neuronale in un intervallo di tempo di 20 anni? La Deregolazione Trascrizionale è un meccanismo Centrale nella Patogenesi della Corea di Huntington RE1/NRSE Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) (Neurotropina per le cellule dello striato) REST= Repressor Element-1 Silencing Trascription factor RE1 o NRSE=Neuron Restrictive Silencer Element (e’ la sequenza) Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) is a survival factor for the striatal neurons that die in the disease. Wild-type huntingtin inhibits the silencing activity of NRSE, increasing transcription of BDNF. This effect occurs through cytoplasmic sequestering of repressor element-1 transcription factor/neuron restrictive silencer factor (REST/NRSF), the transcription factor that binds to NRSE Mutant Huntingnit Interagisce con fattori nucleari a, PC12 cells induced to express 25QP-GFP or 103QP-GFP show a reduction in the level of acetylation of both histones H3 and H4. b, A second strain of stably transfected PC12 cells, grown in the absence of butyrate but induced to express F103QP-EGFP, show a reduction in the level of acetylation of H4, which can be reversed by butyrate treatment. Equivalent levels of histones are shown by Coomassie blue staining (a and b) or with anti-histone H3 (a). Histone acetylation/deacetylation regulates nucleosomal conformation and transcription Ac HAT s Hypo-acetylated chromatin Hypo-acetylated Histones Transcriptional Repression HDACs Ac Ac Ac Hyper-acetylated histones Transcriptional activation Diagnosi Malattie Genetiche MALATTIE GENETICHE La maggior parte delle malattie possono considerarsi come originate almeno in parte da “disordini” genetici Perche’ si Effettua un Test Genetico? • Identificazione portatori sani (eterozigoti recessivi) • Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD) • Diagnosi prenatale (amniocentesi, villocentesi) • Diagnosi presintomatica per predire l’insorgenza di malattie a sviluppo tardivo (nell’eta’ adulta come la Corea di Huntington) • Diagnosi presintomatica per valutare il fattore di rischio nello sviluppo di malattie come tumore al seno/ovaio • Diagnosi di conferma di individui sintomatici Quando viene fatta Diagnosi Genetica Preimpianto Coppie ad alto rischio per trasmissione di malattie ereditarie (autosomiche dominanti, recessive, X-linked) Screening di aneuploidie per le coppie che utilizzano IVF per aumentare la probabilita’ di impianto e di successo della gravidanza Le tecniche utilizzate normalmente per la diagnosi sono PCR (malattie monogeniche) e la FISH (per anomalie cromosomiche) Esempi di tumori ereditari diagnosticabili mediante PGD (Pre-implantation genetic diagnosis) • Neurofibromatosis (NF1/NF2) • Familial breast/ovarian cancer tumor suppressor (BRCA1/BRCA2) tumor suppressor • Von Hippel Lindau sindrome (VHL) (Kidney cancer) tumor • Retinoblastoma (RB1) tumor suppressor suppressor • Familial melanoma (p16) • Li-Fraumeni sindrome (p53) tumor suppressor • Familial adenomatous polyposis (APC) tumor suppressor • Multiple endocrine neoplasia (MEN1-MEN2-FMCT) • Tuberous sclerosis (TSC1-TSC-2) • Hereditary colon cancer (MSH2/MLH1) Legislazione in Italia • La legge 40/2004 disciplina, in Italia, l’accesso e l’uso delle tecniche di PMA (procreazione medicalmente assistita), imponendo severe restrizioni per i pazienti e gli operatori del settore • La legge in questione limita a 3 il numero di ovociti che possono essere fertilizzati durante ciascun ciclo di IVF ed obbliga il trasferimento simultaneo in utero di tutti e tre i possibili embrioni • La crioconservazione di zigoti ed embrioni e’ vietata, mentre quella degli ovociti e’ permessa • La legge 40, inoltre, vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica sull’embrione; quindi in Italia non sarebbe possibile eseguire la diagnosi preimpianto • La legge italiana sulla IVG (Interruzione Volontaria della Gravidanza) è la Legge n.194 del 22 maggio 1978 La legge 40/2004 Modificazioni • In 11 anni la legge 40 che regola la procreazione medicalmente assistita in Italia ha già visto per almeno 28 volte l'intervento dei tribunali • Divieto di produzione di più di tre embrioni, • Obbligo di impianto contemporaneo di tutti gli embrioni prodotti • Divieto di diagnosi pre-impianto • Divieto di fecondazione eterologa La legge 40/2004 Modificazioni • Possibilità di ricorrere alle tecniche di PMA viene estesa anche alla coppia in cui l’uomo o la donna siano portatori di malattie virali sessualmente trasmissibili, e in particolare del virus HIV e di quelli delle Epatiti B e C • L’eliminazione dei commi delle precedenti linee guida che limitavano la possibilità di indagine a quella di tipo osservazionale ha introdotto la possibilità di effettuare la diagnosi genetica preimpianto anche per le coppie portatrici di malattie geneticamente trasmissibili • Facoltà di creare un numero variabile di embrioni (in base alle singole problematiche delle coppie – es. età della donna) con possibilità di crioconservare quelli non impiantati in utero • Possibilita’ di di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo • Resta vietata la soppressione degli embrioni frutto di fecondazione assistita Malattie Genetiche In funzione dell’estensione della mutazione posso essere suddivise in: 1) Mutazioni genomiche (ANEUPLOIDIA): perdita o acquisto di interi cromosomi (ex. Sindrome di Down) 2) Mutazioni cromosomiche (riarrangiamento di materiale genomico, ex. traslocazioni) Definite anche come: Aberrazioni Cromosomiche 3) Mutazioni Geniche Analisi Citogenetica (Cariotipo) Colchicina Down’s Syndrome or Trisomy 21 FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION Mutazioni Cromosomiche (Traslocazioni) CITOGENETICA MOLECOLARE SKY: Spectral Karyotyping Mutazioni Geniche Possono verificarsi nelle regioni codificanti, regolatorie (ex promotori) e nei siti di splicing • Mutazioni puntiformi: sostituzione di aa, stop codon • Frame-shift: delezione o inserzione di nucleotidi • Inserzione/delezione di triplette: aggiunta o eliminazione di aa • Espansione di triplette: caratterizzate dall’essere dinamiche (perchè aumentano durante la gametogenesi, fenomeno dell’ anticipazione ) La loro identificazione richiede metodiche diagnostiche fini: • PCR (Polymerase chain reaction) • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Sequenziamento Easy tests : Single gene - common mutations Difficult tests : multiple mutations - Private mutations Easy tests Disease Gene Mutation Fragile X FMR1 Repeat FRAXE FMR2 Repeat Friedreich ataxia FRDA Repeat Haw River DRPLA Repeat Huntington type 1 HD Repeat Kennedy AR Repeat Myotonic dystrophy type 1 DMPK Repeat Spinocerebellar ataxia SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17 Repeat Alpha 1 antitrypsin PI 2 common mutations Charcot-Marie-Tooth Type 1A PMP22 1 common mutation Cystic fibrosis CFTR Common mutations Deafness GJB2 1 common mutation Hemochromatosis type1 HFE 2 common mutations Hereditary neuropathy (HNPP) PMP22 1 common mutation Sickle cell anemia HBB 1 common mutation Spinal muscular atrophy SMN1 1 common mutation Beta thalassemia HBB 1 exon Direct Detection of Mutations RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V) Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi Questa mutazione rende insensibile e resistente il fattore V verso il proprio antagonista, la proteina C attivata (APC). Cosa ci aspettiamo? Direct Detection of Mutations • Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V) Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi Esone 10 Corea di Huntington: espansione di una tripletta in una sequenza codificante PCR http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk&feature=related Mutazioni che interessano la lunghezza del gene PCR (ex. Corea di Huntington) 1 2 3 4 5 6 Perche’ ci sono 2 bande? 7 8 9 Difficult tests Disease Gene Mutation Breast cancer BRCA1 Private BRCA2 Private MLH1 Private MSH2 Private MSH6 Private Colon cancer BRCA testing • BRCA1 : 23 exons, 1863 AA, 6.200 bp22 • BRCA2 : 28 exons, 3418 AA, 10.300 bp • Total : > 17.000 bp sequence • 1600 mutazioni in BRCA1 • 1800 mutazioni in BRCA2 Una donna su dieci nel mondo occidentale è candidata ad ammalarsi di tale malattia entro gli 85 anni di età, con una mortalità pari al circa 25% delle donne affette Soltanto il 5% dei tumori della mammella sono ereditari e solo l'80% di essi possono essere ricondotti a mutazioni a carico di due geni: BRCA1 e BRCA2 Test genetici specifici per BRCA1 e BRCA2 hanno valore predittivo. Assegnano un fattore di rischio al portatore della mutazione. I test per questi geni si trovano ormai in protocolli internazionali particolarmente attenti anche agli aspetti di natura etica The haploid human genome occupies a total of just over 3 billion DNA base pairs DNA Sequencing 1980-1990 Radio - gel Thousand bp / day 1990-2005 Fluorescent - capillary Million bp / day > 2005 Next generation Billion bp / day DNA SEQUENCING SANGER’S METHOD http://www.youtube.com/watch?v=UT9wqaVCH5s DNA SEQUENCING ILLUMINA http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk Single Nucleotide Polymorphism (SNP) • A single nucleotide polymorphism (SNP),is a DNA sequence variation occurring when a single nucleotide, in the genome, differs between members of a species • Variations in the DNA sequences of humans can affect how humans develop diseases and respond to pathogens, chemicals, drugs, vaccines and other agents