Espansione di triplette

Malattie da singolo gene non ereditate in modo mendeliano
(Mitocondriali)
Solo per queste
non si seguono
le leggi di Mendel
E' stato stimato che ogni cellula puo’ contenere da un centinaio a qualche migliaio di
mitocondri, e che ogni mitocondrio contiene approssimativamente cinque molecole di
DNA mitocondriale. Delle oltre 900 proteine mitocondriali, solo 13 sono codificate
dal genoma mitocondriale (fosforilazione ossidativa), 22tRNA e 2rRNA. E’ privo di
istoni, ha una scarsa capacita’ di riparazione (mutazioni 10 volte superiori a quello
nucleare), e’ esposto a ROS.
ETEROPLASMIA
Ci sono centinaia di molecole di DNA mitocondriale in ogni cellula, e in
generale le mutazioni patogenetiche sono presenti in alcuni ma non in
tutti questi genomi. Come conseguenza, le cellule e i tessuti del futuro
nascituro avranno sia DNA mitocondriale normale che mutato, una
situazione conosciuta come eteroplasmia.
EFFETTO SOGLIA
Nei soggetti con eteroplasmia, prima che compaiano disfunzioni
fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA
mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’
tanto piu’ basso quanto piu’ il tessuto o l'organo ha un elevato
fabbisogno energetico.
Trasmissione dei mitocondri mutati dalla madre ai figli. Quindi una madre con mutazioni
del DNA mitocondriale le trasferisce a tutta la sua progenie in modo variabile PERCHE’
IL DNA MITOCONDRIALE SEGREGA IN MODO CASUALE. Solo le figlie potranno a
loro volta trasferire la mutazione
Caratteristiche peculiari delle malattie dovute a mutazioni nel DNA mitocondriale
sono:
- l'ereditarieta’ materna (mitocondri solo da parte materna)
- l'eteroplasmia
- l’effetto soglia
Principali organi e tessuti colpiti dalle malattie mitocondriali. I mitocondri sono
ubiquitari, quindi potenzialmente ogni tessuto dell'organismo puo’ essere colpito dalla
presenza di mutazioni nel DNA mitocondriale. Questo e’ uno dei motivi per cui spesso le
patologie mitocondriali sono multisistemiche. Nei soggetti con eteroplasmia, prima che
compaiano disfunzioni fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA
mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’ tanto piu’ basso quanto
piu’ il tessuto o l'organo ha elevato fabbisogno energetico. Questo e’ anche il motivo per
cui le patologie mitocondriali colpiscono soprattutto il sistema nervoso, il muscolo
scheletrico e il cuore (tutti organi e tessuti ad elevato fabbisogno energetico).
Pedigree della Malattia di Leber
Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON)
E’ una malattia neurodegenerativa del nervo
ottico, che spesso si caratterizza per una
perdita improvvisa della vista nei giovani adulti.
Spesso tra i 18 e i 30 anni è descritta una
perdita della visione centrale improvvisa,
indolore, acuta o subacuta. Interessa
entrambi gli occhi simultaneamente o
sequenzialmente con perdita della vista nel
secondo occhio dopo alcune settimanemesi.
Mutazioni frequenti
Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON)
Mutazioni nelle posizioni 11778 G to A, 3460 G to A and 14484 T to C, nelle subunità
ND4, ND1 and ND6 del complesso I della catena della fosforilazione ossidativa
•Molti aspetti della sindrome LHON rimangono da
chiarire, quali l'estrema specificità tissutale delle lesioni
cliniche, la prevalenza nel sesso maschile, e le
conseguenze biochimiche di ciascuna mutazione.
• ROS: important for disease (studies with reducing
agents) idebenone
Malattie da Espansione di Triplette
Replication Slippage
Replication Slippage
http://www.dnatube.com/video/607/Tri-Nucleotide-Repeat
X-Fragile Syndrome
(penetranza ridotta)
Gene codificante
FMR-1
(fragile X mental retardation 1 )
Strozzatura
Necessario per lo
Sviluppo neuronale
Le ripetizioni inducono
Metilazione e repressione
X-Fragile Syndrome (II)
•Associata a ritardo mentale
• Non tutti I maschi portatori sono affetti
dalla malattia (affetti 80%)
• Il 50% delle femmine portatrici é affetto
dalla malattia
• Anticipazione: il fenotipo peggiora ad ogni generazione
X-Fragile Syndrome (III)
• Ripetizione di CGG nella regione 5’ UTR del gene FMR-1
• Individui:
Normali: 6-46 ripetizioni
Portatori sani: 50-230 (premutazione)
Malati: 230-4000 (Full mutation)
• I maschi trasmettono la mutazione
senza grandi alterazioni nel numero di triplette
• Le femmine amplificano le triplette
(amplificazione durante la gametogenesi)
Pedigree della sindrome dell’X
fragile
Lyonization? Non e’ chiaro.
?
Huntington Disease
• Corea di Huntington (còrea dal greco, danza)
• George Huntington 1872
• Gene presente sul cromosoma 4p16
Caratteristiche cliniche
• Trasmissione autosomica dominante penetranza quasi 100%
• Fenomeno dell’ anticipazione
• Insorgenza tardiva (inizio a 30-40 anni);
• Sintomi: perdita del controllo motorio (corea), cambi della
personalitá, amnesia, diminuite capacitá intellettive
(demenza); la morte sopraggiunge 15-20 anni dopo l’inizio dei
sintomi,
• Progressiva atrofia dello striato
HD
Sano
Degeneration of Striatum (pianificazione e modulazione dei movimenti):
• caudate nucleus
• putamen
Età di esordio vs numero di ripetizioni
Qual e’ la funzione della proteina wt?
Huntingtin
• Espansione di una tripletta -CAG- presente nel 1 esone
• Da11 a 34 Q nella popolazione
• da 40-100 nei malati di HD (correlazione:espansione, insorgenza,
severita’ fenotipo)
• L’espansione avviene durante la spermatogenesi
• La proteina naturale é essenziale per la neurogenesi (topi)
• La proteina wild-type é citoplasmica, quella mutata trasloca nel
nucleo
• La proteina e’ grande (348kd, 3144aa) e solubile
• Anche la perdita della proteina wt causa alcune manifestazioni
tipiche della malattia
• Importanza della funzione della proteina wt (RNA interference and
farmaci selettivi per la proteina mutata, NON DEVONO ridurre la
wt)
Apoptosi
Apoptosi
Toxicity
by NMDA
Apoptosi
Huntingtin Protein
Flessibilità strutturale:
• Differenti epitopi della proteina sono accessibili in differenti
compartimenti cellulari (alterazione causata da polyQ)
Quali sono i meccanismi
responsabili della perdita
progressiva di funzionalità e
morte neuronale in un
intervallo di tempo di 20 anni?
La Deregolazione Trascrizionale
è un meccanismo Centrale
nella Patogenesi della Corea di Huntington
RE1/NRSE
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)
(Neurotropina per le cellule dello striato)
REST= Repressor Element-1 Silencing Trascription factor
RE1 o NRSE=Neuron Restrictive Silencer Element (e’ la sequenza)
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) is a survival factor for the
striatal neurons that die in the disease.
Wild-type huntingtin inhibits the silencing activity of NRSE, increasing
transcription of BDNF. This effect occurs through cytoplasmic
sequestering of repressor element-1 transcription factor/neuron
restrictive silencer factor (REST/NRSF), the transcription factor that
binds to NRSE
Mutant Huntingnit Interagisce con fattori nucleari
a, PC12 cells induced to express 25QP-GFP or 103QP-GFP show a reduction in the
level of acetylation of both histones H3 and H4. b, A second strain of stably transfected
PC12 cells, grown in the absence of butyrate but induced to express F103QP-EGFP,
show a reduction in the level of acetylation of H4, which can be reversed by butyrate
treatment. Equivalent levels of histones are shown by Coomassie blue staining (a and b)
or with anti-histone H3 (a).
Histone acetylation/deacetylation
regulates nucleosomal conformation
and transcription
Ac
HAT s
Hypo-acetylated chromatin
Hypo-acetylated Histones
Transcriptional
Repression
HDACs
Ac
Ac
Ac
Hyper-acetylated histones
Transcriptional
activation
Diagnosi Malattie Genetiche
MALATTIE GENETICHE
La maggior parte delle malattie
possono considerarsi come
originate almeno in parte da
“disordini” genetici
Perche’ si Effettua un Test Genetico?
• Identificazione portatori sani (eterozigoti recessivi)
• Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD)
• Diagnosi prenatale (amniocentesi, villocentesi)
• Diagnosi presintomatica per predire l’insorgenza di malattie
a sviluppo tardivo (nell’eta’ adulta come la Corea di Huntington)
• Diagnosi presintomatica per valutare il fattore di rischio nello sviluppo
di malattie come tumore al seno/ovaio
• Diagnosi di conferma di individui sintomatici
Quando viene fatta Diagnosi Genetica Preimpianto
Coppie ad alto rischio per trasmissione di malattie ereditarie
(autosomiche dominanti, recessive, X-linked)
Screening di aneuploidie per le coppie che utilizzano IVF per aumentare
la probabilita’ di impianto e di successo della gravidanza
Le tecniche utilizzate normalmente per la diagnosi sono PCR
(malattie monogeniche) e la FISH (per anomalie cromosomiche)
Esempi di tumori ereditari diagnosticabili
mediante PGD (Pre-implantation genetic diagnosis)
• Neurofibromatosis (NF1/NF2)
• Familial breast/ovarian cancer
tumor suppressor
(BRCA1/BRCA2) tumor suppressor
• Von Hippel Lindau sindrome
(VHL) (Kidney cancer) tumor
• Retinoblastoma (RB1) tumor
suppressor
suppressor
• Familial melanoma (p16)
• Li-Fraumeni sindrome (p53)
tumor suppressor
• Familial adenomatous
polyposis (APC) tumor suppressor
• Multiple endocrine neoplasia
(MEN1-MEN2-FMCT)
• Tuberous sclerosis
(TSC1-TSC-2)
• Hereditary colon cancer
(MSH2/MLH1)
Legislazione in Italia
• La legge 40/2004 disciplina, in Italia, l’accesso e l’uso delle tecniche di
PMA (procreazione medicalmente assistita), imponendo severe
restrizioni per i pazienti e gli operatori del settore
• La legge in questione limita a 3 il numero di ovociti che possono essere
fertilizzati durante ciascun ciclo di IVF ed obbliga il trasferimento
simultaneo in utero di tutti e tre i possibili embrioni
• La crioconservazione di zigoti ed embrioni e’ vietata, mentre quella
degli ovociti e’ permessa
• La legge 40, inoltre, vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica
sull’embrione; quindi in Italia non sarebbe possibile eseguire la diagnosi
preimpianto
• La legge italiana sulla IVG (Interruzione Volontaria della Gravidanza)
è la Legge n.194 del 22 maggio 1978
La legge 40/2004
Modificazioni
• In 11 anni la legge 40 che regola la procreazione medicalmente assistita in Italia
ha già visto per almeno 28 volte l'intervento dei tribunali
• Divieto di produzione di più di tre embrioni,
• Obbligo di impianto contemporaneo di tutti gli embrioni prodotti
• Divieto di diagnosi pre-impianto
• Divieto di fecondazione eterologa
La legge 40/2004
Modificazioni
• Possibilità di ricorrere alle tecniche di PMA viene estesa anche alla coppia in cui
l’uomo o la donna siano portatori di malattie virali sessualmente trasmissibili, e in
particolare del virus HIV e di quelli delle Epatiti B e C
• L’eliminazione dei commi delle precedenti linee guida che limitavano la
possibilità di indagine a quella di tipo osservazionale ha introdotto la possibilità di
effettuare la diagnosi genetica preimpianto anche per le coppie portatrici di
malattie geneticamente trasmissibili
• Facoltà di creare un numero variabile di embrioni (in base alle singole
problematiche delle coppie – es. età della donna) con possibilità di crioconservare
quelli non impiantati in utero
• Possibilita’ di di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo
• Resta vietata la soppressione degli embrioni frutto di fecondazione
assistita
Malattie Genetiche
In funzione dell’estensione della mutazione posso essere suddivise in:
1) Mutazioni genomiche (ANEUPLOIDIA): perdita o acquisto di interi
cromosomi (ex. Sindrome di Down)
2) Mutazioni cromosomiche (riarrangiamento di materiale genomico,
ex. traslocazioni)
Definite anche come: Aberrazioni Cromosomiche
3) Mutazioni Geniche
Analisi Citogenetica
(Cariotipo)
Colchicina
Down’s Syndrome
or Trisomy 21
FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION
Mutazioni Cromosomiche (Traslocazioni)
CITOGENETICA MOLECOLARE
SKY: Spectral Karyotyping
Mutazioni Geniche
Possono verificarsi nelle regioni codificanti, regolatorie (ex promotori)
e nei siti di splicing
• Mutazioni puntiformi: sostituzione di aa, stop codon
• Frame-shift: delezione o inserzione di nucleotidi
• Inserzione/delezione di triplette: aggiunta o eliminazione di aa
• Espansione di triplette: caratterizzate dall’essere dinamiche
(perchè aumentano durante la gametogenesi, fenomeno dell’
anticipazione )
La loro identificazione richiede metodiche diagnostiche fini:
• PCR (Polymerase chain reaction)
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
• Sequenziamento
Easy tests :
Single gene - common mutations
Difficult tests :
multiple mutations - Private mutations
Easy tests
Disease
Gene
Mutation
Fragile X
FMR1
Repeat
FRAXE
FMR2
Repeat
Friedreich ataxia
FRDA
Repeat
Haw River
DRPLA
Repeat
Huntington type 1
HD
Repeat
Kennedy
AR
Repeat
Myotonic dystrophy type 1
DMPK
Repeat
Spinocerebellar ataxia
SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17
Repeat
Alpha 1 antitrypsin
PI
2 common mutations
Charcot-Marie-Tooth Type 1A
PMP22
1 common mutation
Cystic fibrosis
CFTR
Common mutations
Deafness
GJB2
1 common mutation
Hemochromatosis type1
HFE
2 common mutations
Hereditary neuropathy (HNPP)
PMP22
1 common mutation
Sickle cell anemia
HBB
1 common mutation
Spinal muscular atrophy
SMN1
1 common mutation
Beta thalassemia
HBB
1 exon
Direct Detection of Mutations
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
• Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V)
Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi
Questa mutazione rende insensibile e resistente il fattore V
verso il proprio antagonista, la proteina C attivata (APC).
Cosa ci aspettiamo?
Direct Detection of Mutations
• Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V)
Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi
Esone 10
Corea di Huntington:
espansione di una tripletta in una sequenza codificante
PCR
http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk&feature=related
Mutazioni che interessano la lunghezza del gene
PCR
(ex. Corea di Huntington)
1 2 3
4 5 6
Perche’ ci sono 2 bande?
7 8 9
Difficult tests
Disease
Gene
Mutation
Breast cancer
BRCA1
Private
BRCA2
Private
MLH1
Private
MSH2
Private
MSH6
Private
Colon cancer
BRCA
testing
• BRCA1 : 23 exons, 1863 AA, 6.200 bp22
• BRCA2 : 28 exons, 3418 AA, 10.300 bp
• Total : > 17.000 bp sequence
• 1600 mutazioni in BRCA1
• 1800 mutazioni in BRCA2
Una donna su dieci nel mondo occidentale è candidata ad
ammalarsi di tale malattia entro gli 85 anni di età, con una
mortalità pari al circa 25% delle donne affette
Soltanto il 5% dei tumori della mammella sono ereditari e
solo l'80% di essi possono essere ricondotti a mutazioni a carico di
due geni: BRCA1 e BRCA2
Test genetici specifici per BRCA1 e BRCA2
hanno valore
predittivo. Assegnano un fattore di rischio al portatore della
mutazione.
I test per questi geni si trovano ormai in protocolli internazionali
particolarmente attenti anche agli aspetti di natura etica
The haploid human genome occupies a
total of just over 3 billion DNA base pairs
DNA Sequencing
1980-1990
Radio - gel
Thousand bp / day
1990-2005
Fluorescent - capillary
Million bp / day
> 2005
Next generation
Billion bp / day
DNA SEQUENCING SANGER’S METHOD
http://www.youtube.com/watch?v=UT9wqaVCH5s
DNA SEQUENCING ILLUMINA
http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
• A single nucleotide polymorphism (SNP),is a DNA sequence
variation occurring when a single nucleotide, in the genome, differs
between members of a species
• Variations in the DNA sequences of humans can affect how humans
develop diseases and respond to pathogens, chemicals, drugs,
vaccines and other agents