Lezione 1
Lezione 2
Lezione 3
Lezione 4
Introduzione dei concetti generali. Rita L-M e scoperta di NGF
Organizzazione del sistema nervoso – concetti di anatomia
Caratteristiche principali dei neuroni
Caratteristiche principali delle cellule gliali
Lezione 5
Metabolismo cerebrale: barriera emato-encefalica e vie
metaboliche principali
Metabolismo energetico del sistema nervoso centrale.
Dipendenza dell'attività cerebrale da glucosio e ossigeno.
Trasmissione sinaptica: meccanismi della neurotrasmissione
(potenziale d’azione, canali ionici)
Classi di neurotrasmettitori e metabolismo, Recettori dei
neurotrasmettitori e segnalazione intracellulare (proteine G, Ca2+,
etc)
Sistemi di neurotrasmissione (glutamatergico, GABAergico,
catecolaminergico, serotoninergico, etc)
Sistemi di neurotrasmissione (catecolamine, serotonina, etc)
Gliotrasmissione: sinapsi tripartita (formazione e funzione),
accoppiamento neuro-metabolico
Sviluppo del sistema nervoso (Fattori neurotrofici e recettori:
regolazione dei pathways di differenziazione, sopravvivenzamorte neuronale (apoptosi e autofagia) e dell’attività
neurotrasmettitoriale. Biochimica dell’invecchiamento.
Basi biochimico-molecolari delle patologie degenerative ed
approcci terapeutici
Ruolo di proteine misfoldate, supporto neurotrofico, stress
ossidativo, glutammato (eccitotossicità) e gliosi reattiva
Morbo di Alzheimer
Morbo di Parkinson
Sclerosi Multipla
Sclerosi Laterale Amiotrofica
Huntington e altre patologie da PolyQ
Modelli di neurodegenerazione per il Drug Discovery (Neuroni e
cellule gliali, immortalizzati o derivati da animali wild-type e
transgenici come modelli sperimentali in vitro). Modelli
farmacologici e chirurgici, topi transgenici, knock-out, knock-in e
mutanti condizionali come modelli sperimentali di patologie del
sistema nervoso
Nuovi approcci terapeutici terapia genica, terapia cellulare con
cellule staminali, vaccini, proteine ricombinanti umane, molecole
mimetiche e nanoparticelle nel drug delivery
Lezione 6
Corso di
NEUROBIOCHIMICA
Lezione 7
Lezione 8
Lezione 9
Lezione 10
Lezione 11
Lezione 12
Lezione 13
Lezione 14
Lezione 15
Lezione 16
Lezione 17
Lezione 18
Lezione 19
Lezione 20
Lezione 21
Sistema Nervoso
Il cervello dell’uomo rappresenta il massimo prodotto
dell’evoluzione dell’uomo perché riassume nella sua
struttura e funzione (processo di co-evoluzione) tutte le
premesse del processo evolutivo (esempio: la postura
eretta, movimenti fini, capacità cognitive, etc)
1
THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM (CNS)
lower -------------------------------- higher
ORGANIZZAZIONE GERARCHICA DI DOMINI
CEREBRAL CORTEX
telencephalon
BASAL FOREBRAIN
HIPPOCAMPUS
FOREBRAIN
diencephalon
THALAMUS
HYPOTHALAMUS
MIDBRAIN
mesencephalon
metencephalon
MIDBRAIN NUCLEI
CEREBELLUM
PONS
HINDBRAIN
myelencephalon
MEDULLA
cervical
SPINAL
CORD
thoracic
lumbar
sacral
THE NERVOUS SYSTEM
UN SOFISTICATO E COMPLESSO SISTEMA PER PROCESSARE INFORMAZIONI
INPUTS
STIMOLI
ESTERNI
(Sensory)
INTERNI
(Hormonal)
ANALYSIS
SONNO/SVEGLIA
ATTENZIONE
APPRENDIMENTO & MEMORIA
CONCETTUALIZZAZIONE
DRIVES
PENSIERO
RAGIONAMENTO
EMOZIONI
PERCEZIONE
OUTPUTS
RISPOSTE
VOLONTARIE
(Motor)
INVOLONTARIE
(Motor,
Physiology)
2
PATHWAY SENSITIVO ASCENDENTE
RAPPRESENTAZIONE SOMATOTOPICA DEL CORPO NELLA CEREBRAL CORTEX
PATHWAYS DISCENDENTI DALLA CORTECCIA MOTORIA
ALCUNI NEURONI CORTICALI PROIETTANO ASSONI CHE
FANNO SINAPSI SUI MOTONEURONI SPINALI
3
THE NEURON
DENDRITES
UNITA’ CELLULARE ELETTRICA DEL SISTEMA NERVOSO
AXON
SOMA
corpo
0.1 - 1,000 mm lunghezza
sottili, larghezza uniforme
V
ACTION POTENTIAL
time
1 - 100 m/sec
Potenziale d’Azione: un impulso elettrico unidirezionale che
si propaga dal segmento iniziale dell’assone alla sua estremità.
I neuroni possono propagare ripetuti potenziali d’azione
con una frequenza fino a 200 impulsi/sec
Nel sistema nervoso dell’uomo ci sono 10 billioni di neuroni
THE SYNAPSE
PUNTO DI CONTATTO TRA NEURONI CHE PERMETTE LA COMUNICAZIONE
axo-dendritic synapse
V
dendrite
soma
axo-somatic synapse
time
assone
principale
assone collaterale
Un neurone può ricevere sinapsi da molti altri neuroni
(neurone piramidale della corteccia cerebrale può ricevere fino a 1,000 sinapsi)
L’assone di un neurone può avere diversi rami collaterali
che fanno sinapsi su diversi neuroni
(il potenziale d’azione si propagherà lungo tutti i rami collaterali)
4
UN NEURONE PUO’ RICEVERE
SINAPSI ECCITATORIE ed INIBITORIE
MULTIPLI STIMOLI SINAPTICI SONO INTEGRATI
PER GENERARE LA FREQUENZA DEL POTENZIALE D’AZIONE
NEL NEURONE POST-SINAPTICO
STIMOLI
RISPOSTE
UN NEURONE SINTETIZZA ED UTILIZZA
SOLO UN NEUROTRASMETTITORE
NEURONE che produce NEURONE che produce NEURONE che produce
NEUROTRASMETTITORE NEUROTRASMETTITORE NEUROTRASMETTITORE
ECCITATORIO
INIBITORIO
ECCITATORIO
DUE NEURONI
STIMOLATI
DUE NEURONI
INIBITI
INIBITO STIMOLATO
UN NEURONE PUO’ INDIRETTAMENTE MEDIARE
RISPOSTE ECCITATORIE ED INIBITORIE
5
EXCITATORY & INHIBITORY CHEMICAL SYNPASES
Il rilascio di Neurotrasmettitore a livello di una sinapsi:
Favorisce la
generazione di
potenziale d’azione
nel neurone postsinaptico
ECCITATORIA
Sfavorisce la
generazione di
potenziale d’azione
nel neurone postsinaptico
INIBITORIA
THE NERVOUS SYSTEM IS HARD-WIRED
WITH ADAPTABLE FUNCTION
INDIVIDUO “A”
INDIVIDUO “B”
OGNI PERSONA HA QUASI GLI STESSI CIRCUITI (NEURAL WIRING)
EXPERIENCE
L’ESPERIENZA MODIFICA LA FORZA DELLE CONNESSIONI SINAPTICHE
BASIS OF LEARNING & MEMORY?
6
GENERAZIONE DI CORRENTE ELETTRICA
A LIVELLO DELLE SINAPSI E LUNGO GLI ASSONI
I neuroni sono come BATTERIE che conservano energia in forma
di GRADIENTE IONICO e POTENZIALE ELETTRICO
attraverso le membrane
esterno
[ Na+ ]e = 130 mM
[ K+ ]e = 5 mM
AXON
[ Na+ ]i = 5 mM
[ K+ ]i = 130 mM
Le CORRENTI ELETTRICHE sono generate dall’apertura di
CANALI IONICI-SELETTIVI, che permettono flusso di ioni e
depolarizzazione della membrana
THE ELECTRIC SYNAPSE
TRASMISSIONE ELETTRICA DIRETTA ATTRAVERSO LE GAP JUNCTIONS
DENDRITE
AXON TERMINUS
+
-
V
V
time
Potenziale d’azione
pre-sinaptico
time
Potenziale d’azione
post-sinaptico
Le Gap junctions permettono la diffusione libera di ioni tra cellule
L’impulso elettrico del potenziale d’azione attraverso la sinapsi
viene trasferito al dendrite del neurone post-sinaptico
7
THE CHEMICAL SYNAPSE
RILASCIO DEL NEUROTRASMETTITORE DAL
TERMINALE PRE-SINAPTICO NELLO SPAZIO SINAPTICO
DENDRITE
AXON TERMINUS
NT vescicles
NT receptors
....
.....
V
time
Potenziale d’azione
pre-sinaptico
V
time
Potenziale d’azione
post-sinaptico
Il Potenziale d’Azione determina l’esocitosi delle vescicole
Il Neurotrasmettitore lega i recettori sulla membrana post-sinaptica e
determina la risposta elettrica post-sinaptica
GLI ASSONI SONO RIVESTITI DI MIELINA
UNA GUAINA ISOLANTE CHE AUMENTA LA VELOCITA’
DI PROPAGAZIONE DEL POTENZIALE D’AZIONE A LUNGA DISTANZA
I Potenziali d’Azione
si propagano lungo
i nodi di Ranvier
La guaina mielinica
isola l’assone e genera
una corrente “saltatoria
che si propaga più
velocemente
8
LE FIBRE MUSCOLARI, COME I NEURONI, SONO ECCITABILI
IL POTENZIALE D’AZIONE MUSCOLARE DETERMINA CONTRAZIONE
Il potenziale d’Azione viaggiando lungo
le fibre muscolari induce aumento di
concentrazione del Ca2+ citosolico
Ca2+ e ATP guidano lo slittamento dei
filamenti di miosina lungo i filamenti
di actina, determinando così
la contrazione
GIUNZIONE NEUROMUSCULARE
SINAPSI ECCITATORIA TRA ASSONE DEL MOTONEURONE E FIBRA MUSCOLARE
La giunzione neuromuscolare (o placca
motrice o sinapsi neuromuscolare)
è la giunzione periferica tra una fibra
nervosa (di un motoneurone) e una fibra
muscolare striata scheletrica.
Un’unica fibra nervosa innerva molte
fibre muscolari.
Prima di innervare la fibra muscolare, la
fibra nervosa
• si divide in due o più rami a livello di
un nodo di Ranvier,
• perde il suo rivestimento mielinico,
• fonde la sua membrana basale con
quella della fibra muscolare,
• costituisce una serie di espansioni a
forma di bottoncino (visibili con il
microscopio ottico).
9
SVILUPPO DEL SISTEMA NERVOSO
INIZIA DURANTE GLI STADI INIZIALI DELL’EMBRIOGENESI
E CONTINUA FINO ALL’ADOLESCENZA
TASKS DA REALIZZARE PER LO SVILUPPO
Dove si devono sviluppare i neuroni?
Come sono specificati i tipi e le forme dei neuroni?
Come crescono gli assoni per proiettare ed innervare il target corretto?
Gli stadi tardivi dello sviluppo sono plasmati dall’esperienza?
MECCANISMI CELLULARI UTILIZZATI
Durante lo sviluppo i neuroni ricevono istruzioni, segnali, da altre cellule
I segnali di instruzione sono proteine specifiche presentate:
a) mediante contatto diretto cellula-cellula
b) come proteine della matrice extracellulare
c) come fattori diffusibili (es. Fattori neurotrofici, come NGF, BDNF, etc)
Lab. di Neuroscienze “Rita Levi-Montalcini”
NGF: la scoperta che ha rivoluzionato la Neurobiologia !!
10
NGF: la scoperta che ha rivoluzionato la Neurobiologia !!
Cos’è il Nerve Growth Factor (NGF) ?
Come nasce la scoperta del NGF?
Quali erano le conoscenze di allora?
Quali erano gli strumenti di allora?
Qual è la funzione del NGF?
Perché la sua scoperta ha rivoluzionato la neurobiologia?
Si potrebbe fare a meno di questa scoperta?
Cosa si sta facendo OGGI per utilizzarla?
Perché studiare ANCORA il NGF?
Quali sono le prospettive FUTURE?
… il laboratorio nella stanza da letto
con il prof Giuseppe Levi e gli altri ex-allievi
A parte il microtomo per fare le sezioni dei tessuti inclusi in paraffina ed
un microscopio binoculare Zeiss corredato di obiettivi e di macchina
fotografica, il resto delle apparecchiature era essenzialmente di tipo
casalingo. Un termostato a circolazione d’aria fungeva da incubatore
per le uova di pollo, ed un altro termostato ad alta temperatura serviva
per l’inclusione degli embrioni in paraffina. Suo fratello Gino le costruì
una camera termoregolata con due aperture sulla parte frontale, che
fungeva da cappa “sterile” per le operazioni di microchirurgia, mentre
gli strumenti chirurgici includevano pinzette da orologiaio, microforbici
da oftalmologia e comuni aghi trasformati in microbisturi.
“… La giungla che mi si presentava davanti in quel momento era più
affascinante di una foresta vergine: si trattava del sistema nervoso, con i suoi
miliardi di cellule, aggregate in popolazioni le une differenti dalle altre e
rinserrate nel viluppo apparentemente inestricabile dei circuiti nervosi che si
intersecano in tutte le direzioni nell’asse cerebro-spinale. Si aggiungeva, al
piacere che pregustavo, quello di attuare il progetto nelle condizioni proibitive
create attorno a noi dalle leggi razziali”.
11
Ruolo del territorio periferico sull'entità dell'innervazione
Si osservava una stretta relazione fra questi due parametri: quanto
maggiore era il territorio tanto superiore era l'innervazione,
quanto minore il territorio altrettanto ridotta l'innervazione.
Due ipotesi funzionali al riguardo:
1) le fibre nervose in crescita ed espansione 'sentivano' la
dimensione del territorio da innervare e si comportavano di
conseguenza (Hans Speeman e Victor Hamburger)
2) il territorio periferico dell'embrione rilasciava un fattore
diffusibile che induceva la crescita delle fibre nervose (R LeviMontalcini). La presenza o l’assenza di questo fattore
determinava lo sviluppo o la morte dei neuroni.
Nel piccolo laboratorio domestico intuì per la prima
volta ciò che l’avrebbe portata al premio Nobel
Metodo: studio di embrioni operati a cui era amputato l’arto e
impregnati con il metodo argentico …….
Osservazione: 1) scomparsa delle cellule motorie nel midollo spinale
2) riduzione delle fibre sensitive nei gangli che
innervano l’arto.
Negli embrioni operati di ablazione di arto, le cellule nervose andavano
infatti incontro ad una normale differenziazione, ma un processo
degenerativo, seguito da morte delle cellule, si instaurava non appena le
fibre emergenti dal midollo o dai gangli si trovavano di fronte al
moncone.
Conclusioni: la morte dei neuroni era dovute all’assenza di un fattore
trofico, rilasciato dai tessuti periferici e convogliato verso i corpi
cellulari tramite le fibre nervose che innervano questi tessuti.
12
Nerve Growth Factor (NGF):
un’intuizione diventata “scoperta”
Original drawing (Rita LeviMontalcini, 1952) describing the
“alo of neurites” of sensory
ganglia (DRG) in co-colture with
Sarcoma S37 or S180.
Regolazione della
differenziazione e
della funzionalità
neuronale
Nasce la moderna Neurobiologia
L’osservazione al microscopio di sezioni seriali di embrioni preparati
con la tecnica dell’impregnazione argentica le fecero intuire che lo
sviluppo del sistema nervoso era il risultato di un processo ben più
complesso di quanto fino ad allora ipotizzato, e caratterizzato da:
• migrazione di cellule in fase di differenziazione
• contemporanea degenerazione di quelle che
“eccedevano il fabbisogno”.
Furono queste le prime evidenze di:
• Target-driven Innervation
• apoptosis
13
Nerve Growth Factor (NGF):
un’intuizione diventata “scoperta”
NGF - CTR
CTR
NGF
NGF
NGF
CTR
CTR
NGF
CTR
alte [NGF]
NGF è una proteina
La caratterizzazione del NGF fu ottenuta in collaborazione con il
biochimico Stanley Cohen che si unì al gruppo di ricerca di Rita a
St. Louis
Cohen non solo estrasse la sostanza dai tumori S180 e S37,
quanto, nel tentativo di discriminare se l’attività biologica fosse
dovuta alla frazione proteica, piuttosto che quella nucleica degli
estratti, sfruttò l’attività fosfodiesterasica del veleno di serpente.
L’effetto differenziativo dell’estratto tumorale in presenza di veleno
di serpente fu ancora maggiore, rivelando così la natura proteica
del NGF.
In seguito si scoprì che il NGF è presente in grandi quantità anche
nelle ghiandole sottomascellari di topi maschi
14
NGF - capostipite
di una grande famiglia di fattori di crescita
L'osservazione di alcuni effetti aberranti a livello epidermico condusse
poi all'identificazione di un altro fattore presente in preparazioni
parzialmente purificate di NGF
Questo secondo fattore fu denominato Epidermal Growth Factor (EGF)
NGF e EGF diventarono poi i capostipiti di una grande famiglia di
fattori di crescita:
IGF1, IGF2, TNF, etc
altri fattori neurotrofici: Fibroblast Growth Factor (FGF), Plateletderived Growth factor (PDGF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF),
etc,
e soprattutto la famiglia delle NEUROTROFINE
NGF e Neurotrofine
hNGF: homodimeric protein of 26 kDa
formed by two β-chains of 118 aa derived
from a precursor of 241 aa
pre (18aa)
pro (103aa)
mature NGF (118aa)
Neurotrophins: highly related proteins expressed at very low levels.
They regulate differentiation and funtion of distinct neuronal population
during development and in the adult brain.
• Nerve Growth Factor (NGF)
•
•
•
•
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)
Neurotrophin-3 (NT-3)
Neurotrophin-4/5 (NT-4/5)
Neurotrophin-6 (NT-6) (nei pesci)
15
Recettori
L’attività neurotrofica del NGF e delle altre Neurotrofine è mediata
dall’interazione con due classi di recettori: un recettore tirosin
kinasico (Trk) e p75, che in quanto membro della famiglia del
Tumor Necrosis factor(TNF)α, possiede un dead domain che è
responsabile della sua attività nell’apoptosis
NGF
TrkA
Pro-NT
sortilin
p75
BDNF
NT-4/5
NT-3
NT
p75
Trk
TrkB
P PI3K/Akt
P Ras/MAPK
P
PLC-γ
DD
TrkC
apoptosis
NT
Proliferation
Differentiation
Survival
Recettori delle neurotrofine
16
SIGNIFICATO FUNZIONALE del NGF nel SISTEMA
NERVOSO CENTRALE
•
•
•
•
ESPRESSIONE di NGF nel SCN
• Hippocampus (granule layer of the dentate gyrus)
• Cerebral Cortex (superficial layers II and III)
• Hypothalamus
• Olfactory Bulb
• Basal Forebrain (GABAergic neurons)
• Striatum
• Cerebellum
FUNZIONI del NGF nel SNC
Previene la degenerazione dei neuroni colinergici dovuta a lesione
dell’asse setto-ippocampale
Riduce l’atrofia dei neuroni del nuclei basali dello striato durante
l’invecchiamento
Migliora l’apprendimento e la memoria, sia in seguito a lesione
dell’asse setto-ippocampale, sia durante l’invecchiamento
Previene i danni neuronali causati da agenti neurotossici
NGF-dependent systems and
Therapeutic Potential
Target
Functional role
Cholinergic neurons Development/surviv
of the basal forebrain al, neuroprotection
Central Nervous
System
Astrocytes and
Oligodendrocytes
Re-myelination
Peripheral Nervous
System
Sensory and
sympathetic neurons Development/surviv
of paravertebral
al, neuroprotection
ganglia (DRG and
SCG)
Immune System
Macrophages, mast
cells, lymphocytes
Modulation of
inflammatory
responses
Neuroendocrine
System
Hypotalamic-pituitaryadrenocortical system
Modulation of
stress responses
Disease
Alzheimer
age-related
dementia
Demyelinating
diseases
(Multiple
Sclerosis)
Peripheral
neuropathies
Allergies
Cutaneous ulcers
Ophthalmic
diseases
17
NGF e Romantic love
Pubblicazioni scientifiche su NGF: 13008
18
Perché la sua scoperta ha rivoluzionato la neurobiologia?
2008 - Laurea Honoris causae in
Biotecnologie – Univ Milano-Bicocca
Laudatio – “Per avere aperto la strada,
con la scoperta e caratterizzazione
molecolare e funzionale del NGF, alla
comprensione dei meccanismi con i
quali le cellule di organismi
complessi comunicano tra loro e
coordinano le loro funzioni durante
tutta la vita”
"La mia intelligenza? Più che
mediocre. I miei unici meriti sono
stati impegno e ottimismo"
Perché studiare ancora il NGF?
Ann. Neurol. 1991 Dec;30(6):831-40
Human nerve growth factor prevents degeneration of basal forebrain
cholinergic neurons in primates
Koliatsos VE, Clatterbuck RE, Nauta HJ, Knüsel B, Burton LE, Hefti FF, Mobley WC, Price DL
Dept. of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21205-2181
19
Dalla scoperta alle applicazioni cliniche
Ulcere cutanee in pazienti che non rispondono alle
terapie convenzionali
Prima del trattamento
con NGF
Dopo trattamento
con NGF
Cheratite neurotrofica
Stage 1
Stage 3
Stage 2
Corneal perforation
20
Neurotrophic keratitis (post neurosurgery)
Pre-NGF treatment
At the end of
10 days NGF treatment
6 months
post-NGF treatment
Neurotrophic keratitis (da diabete)
Before NGF treatment
At the end of 2 weeks
NGF treatment
21
From ANTERIOR to POSTERIOR OCULAR DISEASES
Retinitis Pigmentosa
Photoreceptors
degeneration
A Lambiase Graefes Arch
Clin Exp Ophthalmol, 1995
L Lenzi Vision Res 2005
Optic nerve diseases
traumatic, ischemic,
toxic, multiple sclerosis
HK Yip Brain Res 1982
G Carmignoto J Neurosci
1989
R Siliprandi IOVS 1993
Glaucoma
Neuroprotection/
neuroregeneration
A Lambiase Graefes Arch
Clin Exp Ophthalmol, 1997
M Rudzinski J Neurobiol
2004
WS Lambert BMC Neurosci
2004
A Lambiase IOVS 2005
Different approaches for NGF-based therapy
GC
NE
cAMP+ PPi
GR
hsp90
hsp90
GR
(+)
?
AC
PKA
ATP
?
P
C/EBPδ
βAR-2
PKA
CREB
CREB
(+)
GRE
p50
p65
NF-kB
-790
-719
GR
P
C/EBPδ
c-Fos
CREB
c-Jun
GC- C/EBPδ CRE TATA
AP-1
box Bind. site
box
-90
-72
-60
+16
Sp1
(+/-)
In alternative:
• Intraventricular injection of 2.5S mNGF (clinical trial in human (3 patients)
• Gene therapy: engraft of cells engineered to express rhNGF (clinical trial in 8
patients)
• Nasal and intraocular delivery of 2.5S mNGF (Lambiase A, 2007)
22
Different approaches for NGF-based therapy
Biotechnological interest for
NGF-molecules for NGF-based therapies
DRG from chicken embryos
CTR
SCG in neonatal mice
NGF
23
Experimental strategy:
Cloning of the hNGF gene
hNGF cDNA constructs:
HindIII
AA
TT
hNGF
AA
TT
a)HindIII
AA
TT
hNGF
AA
TT
XhoI
XhoI
Hippocampal PCR
human cDNA
library
b)
HindIII
AA
TT
hNGF
AA
TT
XhoI
b) In the pTRE vector (TetOff System, Clontech),
the hNGF cDNA is cloned downstream of a minimal
CMV promoter. The pTRE vector contains,
upstream of the pCMV, a seven repeats of a tetO
sequence for binding of the regulatory protein tTA
uncoded by the regulatory pTet-Off plasmid
(Gossen M & Bujard H, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 5547-5551, 1992).
MiniPerm bioreactor system
1
2
3
b)
a)
c)
Purchased from International PBI
24
rhNGF induces differentiation
and TrkA phosphorylation in PC12 cells
rhNGF (MEF 10ng/ml)
rhNGF (HeLa 10ng/ml)
2.5S NGF (10 ng/ml)
rhNGF (MEF)
rhNGF (HeLa)
2.5S NGF (5 ng/ml)
K252a (100nM)
2.5S NGF (10 ng/ml)
rhNGF
B
cont
Mock
K252a (100nM)
A
175
p-TrkA
83
62
rhNGF induces survival and differentiation
of Dorsal Root Ganglia (DRG)
Control
mNGF
rhNGF
rhNGF
25
Peptidi NGF-like versus rhNGF
Limitazioni all’uso terapeutico di rhNGF:
•
•
•
•
•
Pessima farmacocinetica
Azione pleiotropica
Proprietà antigeniche
Degradazione proteolitica (MMP9)
Difficoltà alla produzione su larga scala (la
presenza di un cystein-knot rende complessa
la produzione in sistemi cellulari normalmente
usati per proteine ricombinanti)
Requisiti per molecole NGF-like con attività neurotrofica:
• Identificare i determinanti di sequenza e struttura
responsabili dell’interazione NGF/TrkA vs NGF/p75
• Elevata omologia di sequenza e struttura con le altre
neurotrofine (>50%)
• Specificità NGF/TrkA è basata sui:
domini iper-variabili del NGF: loop-1 (aa 29-35), loop-2 (aa
43-48), loop-4 (aa 92-98), le regioni C- e N-terminali
domini iper-variabili del TrkA (dominio 5)
MODELLO MOLECOLARE
dell’interazione NGF-TrkA(d5)
Loop-3
N-terminale
d5-TrkA
d5-TrkA
Loop-1
Loop-4
Loop-2
26
The NGF-like peptide BB14
d5-trkA
NGF
N-terminus
Hydrophobic
pocket
d5-trkA
Loop1
(Ile31, Lys32, Lys34)
• Analisi del complesso NGF-TrkA
• Studi di mutagenesi sito-specifiche
• Analisi della struttura dei peptidi
pubblicati
mediante
modelli
di
Dinamica Molecolare (MD) (InsideII
software- Biosym)
Loop4
(Gly94, Lys95, Gln96)
BB14 (17 aa)
Loop1
NMR structure of BB14:
rigid loops connected by
a flexible linker
Loop4
C---CTGAC---C-COOH
T K
D Q
D G
G---K
I----K
Differentiation/survival of DRG
Activity of the
NGF-like peptide BB14
CTR
ED50=1 µM
TrkA receptor phosphorylation
CTR
BB14
NGF
P-TrkA
BB14
BB14 does not interact with TrkB
BDNF
C 10 20
NGF
L1L4
3
6
NGF
10 10 100
P-TrkB
TrkB
27
Peripheral nerve injury models
Behavioral tests
Chronic constriction injury
(CCI)
Three ligatures (3-0 gut) are
tied loosely around the sciatic
nerve proximal to the sciatic
nerve
trifurcation.
The
distance between ligatures is
1 mm (i.e. length of the
treated nerve, 2–3 mm).
Spared Nerve Injury (SNI)
It involves a lesion of two of
the three terminal branches
of the sciatic nerve (tibial
and common peroneal),
leaving the remaining sural
nerve intact. The common
peroneal and tibial branches
of the left sciatic nerve are
ligated and transected. A 3
mm portion of the nerve is
removed.
tactile allodynia
thermal hyperalgesia
NGF and BB14 reduce neuropathic behavior in
peripheral nerve injury models of CCI and SNI
NGF
BB14: 37.5 µg/µl/hr= 3.6 mg/Kg body weight
Bibliography
Colangelo et al (2008). J Neurosci 28(11):2698-709
Cirillo et al. (2010). Cell Mol Neurobiol 30(1):51-62. Epub 2009
Cirillo et al (2011). Neurobiol Dis 41(3):630-9. Epub 2010 Nov 25
Cirillo et al. (2012). Biotechnol Advances
Colangelo et al. (2012). Biotechnol Advances
• Azione NGF-like
• Attività anti-gliosi
28
The tripartite synapse
Neuroprotection by NGF and BB14
also involves modulation of glial activation
BB14
BB14
Other effects of NGF
Glial changes: reduces microglial activation
DRG structure: neuronal size
size and N° of satellite cells
Myelin tickness of sciatic nerve stump
fibers
Dorsal horns: expression of NGF and receptors (TrkA
and p75)
29
Increasing endogenous NGF or BB14 restore
vesicular neurotransmitter transporters
Tripartite synapse: functional role of NGF in modulating
glial function in synaptic homeostasis and neuroprotection
pre (18aa)
pro (103aa)
mature NGF (118aa)
Glial activation determines:
MMPs activation
Decrease of NGF
Increase of proNGF
Increase of p75
NGF and BB14 reduce glial
activation and restore:
• glial and neuronal
Glutamate transporters
• GABAergic markers
• GSH levels
Normalization of
synaptic homeostasis,
glial neuroprotection,
and reduction of
Neuropathic behavior
30
Systems Biology for the Biology of a System
• Complex system: structural organization and function
~ 100 billion (1011) neurons (different types)
10× more glial cells (different types)
1016 synapses
each protoplasmic astrocyte can enwrap ~ 2x106 synapses
huge number of functional neuro-glial networks
NGF
IGF-1
IGF-R
Wnt
TrkA
proNGF p75
P
ras
PI3K
Aβ
FasL
TRAF6
FADD
NRIF
RIP2
P
PLC-γ
Fas
Plasma membrane
sphingomyelinase
Shc P P
ceramide
NADE
ROS
Ca2+
NRAGE
Calpain
Survivin
IAP
ERK1/2
JNK
p53
Akt
ROS
Bax
Caspase-12
P
Bad
14-3-3
FKH
P
Procaspase-8
Bid
Bcl-xl
p10
GSK-3β
p25
cdk5
Cki
Survivin
Cyclins
IAP
cdk
Apaf-1 Procaspase-9
CytochromeC
Bad
Bcl-xl
Bax
Bak
Gene
Transcription
Caspase-3
AIF
EndoG
IAP/Survivin/Cki
Procaspase-7
Caspase-7
Survivin
IAP
Cytochrome c
Cell cycle
Procaspase-3
Caspase-9
Bax
Bax
NF-kB
MnSOD
p23
p15
Anti-apoptotic
Bcl-xl
Bcl-2
Procaspase-2
tBid
Bax
Akt
p27Kip
Caspase-2
p35
Caspase-8
Bim
Aβ
NFT
Procaspase-12
Smac/DIABLO
Mitochondrial
dysfunction
Procaspase-6
Caspase-6
Caspases
cascade
Apoptotic
Degradation of
DNA, proteins, etc.
31
Models of Neurodegeneration
•
In-vitro: neuronal PC12 (expressing TrkA and p75)
Primary cortical neurons
Primary astrocytes and microglia
β-III tubulin-TrkA
β-III tubulin
•
GFAP
Iba-1
In vivo: perypheral nerve injury:
chronic constriction injury (CCI)
SNI (spared nerve injury)
CTR
LPS 24h
Morphology and mitochondrial membrane potential (∆Ψm)
in NGF-differentiated PC12 cells: effect of NGF deprivation
A
B
C
D
E
F
Mitochondrial mass and potential (∆Ψm) by double-staining with
MitoTracker Green and Red. (A, B and C) mass, potential and merge of PC12
cells in DMEM (low serum) plus mNGF (10ng/ml), (D, E and F) NGF-differentiated
PC12 cells after NGF withdrawal for 24 hr.
32
Autophagy and longevity: neuroprotection in
neurological disorders
Wiring neuron survival:
Crosstalk between autophagy and apoptosis
Glial activation
Pro-NGF
NGF Trk
Glu
sphingomyelinase
DD ceramide
NGF
P
CycD1
IkB
CREB
NF-kB
Bad
Bad
P
Bcl-2
Bcl-XL
RXR
p38MAPKi
14-3-3
Bcl-XL
BAX
BAX
Mitochondrial
dysfunction
Caspase-9
Caspase-3
apoptosis
IP3
No NGF
Ca2+
ER
degradation of
GLT-1, GLYT1, EAAC
H2O2 150 µM
CTR
RSV
ROS
LA
NAC
CRC
ALCAR
QRC
Flav 1µM
Sel 50 nM
∆Ψm
cytochrome c
Transcription
Survival genes
(Mn-SOD
APOE)
NGF
Selenium/
selenoproteins
Bcl-XL
↑BAX
MEF
PPARγ
Ca2+
calpain
JNKi
GSK3β
AP-1
Pro-NGF
ROS
JNK/p38MAPK
PI3K/Akt
metabotropic
GluR
Ca2+
ras/MAPK
survival
AMPA
GluR
MMP-9
p75
P
P
P
Glu
NMDA
GluR
apoptosome
Pro-caspase-9
TUNEL
NGF
Necrosis
P-AMPK
Nutrient
deprivation
Annexin V
In: Colangelo & Alberghina (2010). Apoptotic
Mechanisms Involved in Neurological Disorders
+++
Mitochondrial
dysfunction
Adaptation
Neuron death
Stress events
Apoptosis
Autophagy
Misfolded
proteins
Reciprocal
interplay
33
