Sistema Nervoso - e-Learning
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Lezione 1 Lezione 2 Lezione 3 Lezione 4 Introduzione dei concetti generali. Rita L-M e scoperta di NGF Organizzazione del sistema nervoso – concetti di anatomia Caratteristiche principali dei neuroni Caratteristiche principali delle cellule gliali Lezione 5 Metabolismo cerebrale: barriera emato-encefalica e vie metaboliche principali Metabolismo energetico del sistema nervoso centrale. Dipendenza dell'attività cerebrale da glucosio e ossigeno. Trasmissione sinaptica: meccanismi della neurotrasmissione (potenziale d’azione, canali ionici) Classi di neurotrasmettitori e metabolismo, Recettori dei neurotrasmettitori e segnalazione intracellulare (proteine G, Ca2+, etc) Sistemi di neurotrasmissione (glutamatergico, GABAergico, catecolaminergico, serotoninergico, etc) Sistemi di neurotrasmissione (catecolamine, serotonina, etc) Gliotrasmissione: sinapsi tripartita (formazione e funzione), accoppiamento neuro-metabolico Sviluppo del sistema nervoso (Fattori neurotrofici e recettori: regolazione dei pathways di differenziazione, sopravvivenzamorte neuronale (apoptosi e autofagia) e dell’attività neurotrasmettitoriale. Biochimica dell’invecchiamento. Basi biochimico-molecolari delle patologie degenerative ed approcci terapeutici Ruolo di proteine misfoldate, supporto neurotrofico, stress ossidativo, glutammato (eccitotossicità) e gliosi reattiva Morbo di Alzheimer Morbo di Parkinson Sclerosi Multipla Sclerosi Laterale Amiotrofica Huntington e altre patologie da PolyQ Modelli di neurodegenerazione per il Drug Discovery (Neuroni e cellule gliali, immortalizzati o derivati da animali wild-type e transgenici come modelli sperimentali in vitro). Modelli farmacologici e chirurgici, topi transgenici, knock-out, knock-in e mutanti condizionali come modelli sperimentali di patologie del sistema nervoso Nuovi approcci terapeutici terapia genica, terapia cellulare con cellule staminali, vaccini, proteine ricombinanti umane, molecole mimetiche e nanoparticelle nel drug delivery Lezione 6 Corso di NEUROBIOCHIMICA Lezione 7 Lezione 8 Lezione 9 Lezione 10 Lezione 11 Lezione 12 Lezione 13 Lezione 14 Lezione 15 Lezione 16 Lezione 17 Lezione 18 Lezione 19 Lezione 20 Lezione 21 Sistema Nervoso Il cervello dell’uomo rappresenta il massimo prodotto dell’evoluzione dell’uomo perché riassume nella sua struttura e funzione (processo di co-evoluzione) tutte le premesse del processo evolutivo (esempio: la postura eretta, movimenti fini, capacità cognitive, etc) 1 THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM (CNS) lower -------------------------------- higher ORGANIZZAZIONE GERARCHICA DI DOMINI CEREBRAL CORTEX telencephalon BASAL FOREBRAIN HIPPOCAMPUS FOREBRAIN diencephalon THALAMUS HYPOTHALAMUS MIDBRAIN mesencephalon metencephalon MIDBRAIN NUCLEI CEREBELLUM PONS HINDBRAIN myelencephalon MEDULLA cervical SPINAL CORD thoracic lumbar sacral THE NERVOUS SYSTEM UN SOFISTICATO E COMPLESSO SISTEMA PER PROCESSARE INFORMAZIONI INPUTS STIMOLI ESTERNI (Sensory) INTERNI (Hormonal) ANALYSIS SONNO/SVEGLIA ATTENZIONE APPRENDIMENTO & MEMORIA CONCETTUALIZZAZIONE DRIVES PENSIERO RAGIONAMENTO EMOZIONI PERCEZIONE OUTPUTS RISPOSTE VOLONTARIE (Motor) INVOLONTARIE (Motor, Physiology) 2 PATHWAY SENSITIVO ASCENDENTE RAPPRESENTAZIONE SOMATOTOPICA DEL CORPO NELLA CEREBRAL CORTEX PATHWAYS DISCENDENTI DALLA CORTECCIA MOTORIA ALCUNI NEURONI CORTICALI PROIETTANO ASSONI CHE FANNO SINAPSI SUI MOTONEURONI SPINALI 3 THE NEURON DENDRITES UNITA’ CELLULARE ELETTRICA DEL SISTEMA NERVOSO AXON SOMA corpo 0.1 - 1,000 mm lunghezza sottili, larghezza uniforme V ACTION POTENTIAL time 1 - 100 m/sec Potenziale d’Azione: un impulso elettrico unidirezionale che si propaga dal segmento iniziale dell’assone alla sua estremità. I neuroni possono propagare ripetuti potenziali d’azione con una frequenza fino a 200 impulsi/sec Nel sistema nervoso dell’uomo ci sono 10 billioni di neuroni THE SYNAPSE PUNTO DI CONTATTO TRA NEURONI CHE PERMETTE LA COMUNICAZIONE axo-dendritic synapse V dendrite soma axo-somatic synapse time assone principale assone collaterale Un neurone può ricevere sinapsi da molti altri neuroni (neurone piramidale della corteccia cerebrale può ricevere fino a 1,000 sinapsi) L’assone di un neurone può avere diversi rami collaterali che fanno sinapsi su diversi neuroni (il potenziale d’azione si propagherà lungo tutti i rami collaterali) 4 UN NEURONE PUO’ RICEVERE SINAPSI ECCITATORIE ed INIBITORIE MULTIPLI STIMOLI SINAPTICI SONO INTEGRATI PER GENERARE LA FREQUENZA DEL POTENZIALE D’AZIONE NEL NEURONE POST-SINAPTICO STIMOLI RISPOSTE UN NEURONE SINTETIZZA ED UTILIZZA SOLO UN NEUROTRASMETTITORE NEURONE che produce NEURONE che produce NEURONE che produce NEUROTRASMETTITORE NEUROTRASMETTITORE NEUROTRASMETTITORE ECCITATORIO INIBITORIO ECCITATORIO DUE NEURONI STIMOLATI DUE NEURONI INIBITI INIBITO STIMOLATO UN NEURONE PUO’ INDIRETTAMENTE MEDIARE RISPOSTE ECCITATORIE ED INIBITORIE 5 EXCITATORY & INHIBITORY CHEMICAL SYNPASES Il rilascio di Neurotrasmettitore a livello di una sinapsi: Favorisce la generazione di potenziale d’azione nel neurone postsinaptico ECCITATORIA Sfavorisce la generazione di potenziale d’azione nel neurone postsinaptico INIBITORIA THE NERVOUS SYSTEM IS HARD-WIRED WITH ADAPTABLE FUNCTION INDIVIDUO “A” INDIVIDUO “B” OGNI PERSONA HA QUASI GLI STESSI CIRCUITI (NEURAL WIRING) EXPERIENCE L’ESPERIENZA MODIFICA LA FORZA DELLE CONNESSIONI SINAPTICHE BASIS OF LEARNING & MEMORY? 6 GENERAZIONE DI CORRENTE ELETTRICA A LIVELLO DELLE SINAPSI E LUNGO GLI ASSONI I neuroni sono come BATTERIE che conservano energia in forma di GRADIENTE IONICO e POTENZIALE ELETTRICO attraverso le membrane esterno [ Na+ ]e = 130 mM [ K+ ]e = 5 mM AXON [ Na+ ]i = 5 mM [ K+ ]i = 130 mM Le CORRENTI ELETTRICHE sono generate dall’apertura di CANALI IONICI-SELETTIVI, che permettono flusso di ioni e depolarizzazione della membrana THE ELECTRIC SYNAPSE TRASMISSIONE ELETTRICA DIRETTA ATTRAVERSO LE GAP JUNCTIONS DENDRITE AXON TERMINUS + - V V time Potenziale d’azione pre-sinaptico time Potenziale d’azione post-sinaptico Le Gap junctions permettono la diffusione libera di ioni tra cellule L’impulso elettrico del potenziale d’azione attraverso la sinapsi viene trasferito al dendrite del neurone post-sinaptico 7 THE CHEMICAL SYNAPSE RILASCIO DEL NEUROTRASMETTITORE DAL TERMINALE PRE-SINAPTICO NELLO SPAZIO SINAPTICO DENDRITE AXON TERMINUS NT vescicles NT receptors .... ..... V time Potenziale d’azione pre-sinaptico V time Potenziale d’azione post-sinaptico Il Potenziale d’Azione determina l’esocitosi delle vescicole Il Neurotrasmettitore lega i recettori sulla membrana post-sinaptica e determina la risposta elettrica post-sinaptica GLI ASSONI SONO RIVESTITI DI MIELINA UNA GUAINA ISOLANTE CHE AUMENTA LA VELOCITA’ DI PROPAGAZIONE DEL POTENZIALE D’AZIONE A LUNGA DISTANZA I Potenziali d’Azione si propagano lungo i nodi di Ranvier La guaina mielinica isola l’assone e genera una corrente “saltatoria che si propaga più velocemente 8 LE FIBRE MUSCOLARI, COME I NEURONI, SONO ECCITABILI IL POTENZIALE D’AZIONE MUSCOLARE DETERMINA CONTRAZIONE Il potenziale d’Azione viaggiando lungo le fibre muscolari induce aumento di concentrazione del Ca2+ citosolico Ca2+ e ATP guidano lo slittamento dei filamenti di miosina lungo i filamenti di actina, determinando così la contrazione GIUNZIONE NEUROMUSCULARE SINAPSI ECCITATORIA TRA ASSONE DEL MOTONEURONE E FIBRA MUSCOLARE La giunzione neuromuscolare (o placca motrice o sinapsi neuromuscolare) è la giunzione periferica tra una fibra nervosa (di un motoneurone) e una fibra muscolare striata scheletrica. Un’unica fibra nervosa innerva molte fibre muscolari. Prima di innervare la fibra muscolare, la fibra nervosa • si divide in due o più rami a livello di un nodo di Ranvier, • perde il suo rivestimento mielinico, • fonde la sua membrana basale con quella della fibra muscolare, • costituisce una serie di espansioni a forma di bottoncino (visibili con il microscopio ottico). 9 SVILUPPO DEL SISTEMA NERVOSO INIZIA DURANTE GLI STADI INIZIALI DELL’EMBRIOGENESI E CONTINUA FINO ALL’ADOLESCENZA TASKS DA REALIZZARE PER LO SVILUPPO Dove si devono sviluppare i neuroni? Come sono specificati i tipi e le forme dei neuroni? Come crescono gli assoni per proiettare ed innervare il target corretto? Gli stadi tardivi dello sviluppo sono plasmati dall’esperienza? MECCANISMI CELLULARI UTILIZZATI Durante lo sviluppo i neuroni ricevono istruzioni, segnali, da altre cellule I segnali di instruzione sono proteine specifiche presentate: a) mediante contatto diretto cellula-cellula b) come proteine della matrice extracellulare c) come fattori diffusibili (es. Fattori neurotrofici, come NGF, BDNF, etc) Lab. di Neuroscienze “Rita Levi-Montalcini” NGF: la scoperta che ha rivoluzionato la Neurobiologia !! 10 NGF: la scoperta che ha rivoluzionato la Neurobiologia !! Cos’è il Nerve Growth Factor (NGF) ? Come nasce la scoperta del NGF? Quali erano le conoscenze di allora? Quali erano gli strumenti di allora? Qual è la funzione del NGF? Perché la sua scoperta ha rivoluzionato la neurobiologia? Si potrebbe fare a meno di questa scoperta? Cosa si sta facendo OGGI per utilizzarla? Perché studiare ANCORA il NGF? Quali sono le prospettive FUTURE? … il laboratorio nella stanza da letto con il prof Giuseppe Levi e gli altri ex-allievi A parte il microtomo per fare le sezioni dei tessuti inclusi in paraffina ed un microscopio binoculare Zeiss corredato di obiettivi e di macchina fotografica, il resto delle apparecchiature era essenzialmente di tipo casalingo. Un termostato a circolazione d’aria fungeva da incubatore per le uova di pollo, ed un altro termostato ad alta temperatura serviva per l’inclusione degli embrioni in paraffina. Suo fratello Gino le costruì una camera termoregolata con due aperture sulla parte frontale, che fungeva da cappa “sterile” per le operazioni di microchirurgia, mentre gli strumenti chirurgici includevano pinzette da orologiaio, microforbici da oftalmologia e comuni aghi trasformati in microbisturi. “… La giungla che mi si presentava davanti in quel momento era più affascinante di una foresta vergine: si trattava del sistema nervoso, con i suoi miliardi di cellule, aggregate in popolazioni le une differenti dalle altre e rinserrate nel viluppo apparentemente inestricabile dei circuiti nervosi che si intersecano in tutte le direzioni nell’asse cerebro-spinale. Si aggiungeva, al piacere che pregustavo, quello di attuare il progetto nelle condizioni proibitive create attorno a noi dalle leggi razziali”. 11 Ruolo del territorio periferico sull'entità dell'innervazione Si osservava una stretta relazione fra questi due parametri: quanto maggiore era il territorio tanto superiore era l'innervazione, quanto minore il territorio altrettanto ridotta l'innervazione. Due ipotesi funzionali al riguardo: 1) le fibre nervose in crescita ed espansione 'sentivano' la dimensione del territorio da innervare e si comportavano di conseguenza (Hans Speeman e Victor Hamburger) 2) il territorio periferico dell'embrione rilasciava un fattore diffusibile che induceva la crescita delle fibre nervose (R LeviMontalcini). La presenza o l’assenza di questo fattore determinava lo sviluppo o la morte dei neuroni. Nel piccolo laboratorio domestico intuì per la prima volta ciò che l’avrebbe portata al premio Nobel Metodo: studio di embrioni operati a cui era amputato l’arto e impregnati con il metodo argentico ……. Osservazione: 1) scomparsa delle cellule motorie nel midollo spinale 2) riduzione delle fibre sensitive nei gangli che innervano l’arto. Negli embrioni operati di ablazione di arto, le cellule nervose andavano infatti incontro ad una normale differenziazione, ma un processo degenerativo, seguito da morte delle cellule, si instaurava non appena le fibre emergenti dal midollo o dai gangli si trovavano di fronte al moncone. Conclusioni: la morte dei neuroni era dovute all’assenza di un fattore trofico, rilasciato dai tessuti periferici e convogliato verso i corpi cellulari tramite le fibre nervose che innervano questi tessuti. 12 Nerve Growth Factor (NGF): un’intuizione diventata “scoperta” Original drawing (Rita LeviMontalcini, 1952) describing the “alo of neurites” of sensory ganglia (DRG) in co-colture with Sarcoma S37 or S180. Regolazione della differenziazione e della funzionalità neuronale Nasce la moderna Neurobiologia L’osservazione al microscopio di sezioni seriali di embrioni preparati con la tecnica dell’impregnazione argentica le fecero intuire che lo sviluppo del sistema nervoso era il risultato di un processo ben più complesso di quanto fino ad allora ipotizzato, e caratterizzato da: • migrazione di cellule in fase di differenziazione • contemporanea degenerazione di quelle che “eccedevano il fabbisogno”. Furono queste le prime evidenze di: • Target-driven Innervation • apoptosis 13 Nerve Growth Factor (NGF): un’intuizione diventata “scoperta” NGF - CTR CTR NGF NGF NGF CTR CTR NGF CTR alte [NGF] NGF è una proteina La caratterizzazione del NGF fu ottenuta in collaborazione con il biochimico Stanley Cohen che si unì al gruppo di ricerca di Rita a St. Louis Cohen non solo estrasse la sostanza dai tumori S180 e S37, quanto, nel tentativo di discriminare se l’attività biologica fosse dovuta alla frazione proteica, piuttosto che quella nucleica degli estratti, sfruttò l’attività fosfodiesterasica del veleno di serpente. L’effetto differenziativo dell’estratto tumorale in presenza di veleno di serpente fu ancora maggiore, rivelando così la natura proteica del NGF. In seguito si scoprì che il NGF è presente in grandi quantità anche nelle ghiandole sottomascellari di topi maschi 14 NGF - capostipite di una grande famiglia di fattori di crescita L'osservazione di alcuni effetti aberranti a livello epidermico condusse poi all'identificazione di un altro fattore presente in preparazioni parzialmente purificate di NGF Questo secondo fattore fu denominato Epidermal Growth Factor (EGF) NGF e EGF diventarono poi i capostipiti di una grande famiglia di fattori di crescita: IGF1, IGF2, TNF, etc altri fattori neurotrofici: Fibroblast Growth Factor (FGF), Plateletderived Growth factor (PDGF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), etc, e soprattutto la famiglia delle NEUROTROFINE NGF e Neurotrofine hNGF: homodimeric protein of 26 kDa formed by two β-chains of 118 aa derived from a precursor of 241 aa pre (18aa) pro (103aa) mature NGF (118aa) Neurotrophins: highly related proteins expressed at very low levels. They regulate differentiation and funtion of distinct neuronal population during development and in the adult brain. • Nerve Growth Factor (NGF) • • • • Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Neurotrophin-3 (NT-3) Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) Neurotrophin-6 (NT-6) (nei pesci) 15 Recettori L’attività neurotrofica del NGF e delle altre Neurotrofine è mediata dall’interazione con due classi di recettori: un recettore tirosin kinasico (Trk) e p75, che in quanto membro della famiglia del Tumor Necrosis factor(TNF)α, possiede un dead domain che è responsabile della sua attività nell’apoptosis NGF TrkA Pro-NT sortilin p75 BDNF NT-4/5 NT-3 NT p75 Trk TrkB P PI3K/Akt P Ras/MAPK P PLC-γ DD TrkC apoptosis NT Proliferation Differentiation Survival Recettori delle neurotrofine 16 SIGNIFICATO FUNZIONALE del NGF nel SISTEMA NERVOSO CENTRALE • • • • ESPRESSIONE di NGF nel SCN • Hippocampus (granule layer of the dentate gyrus) • Cerebral Cortex (superficial layers II and III) • Hypothalamus • Olfactory Bulb • Basal Forebrain (GABAergic neurons) • Striatum • Cerebellum FUNZIONI del NGF nel SNC Previene la degenerazione dei neuroni colinergici dovuta a lesione dell’asse setto-ippocampale Riduce l’atrofia dei neuroni del nuclei basali dello striato durante l’invecchiamento Migliora l’apprendimento e la memoria, sia in seguito a lesione dell’asse setto-ippocampale, sia durante l’invecchiamento Previene i danni neuronali causati da agenti neurotossici NGF-dependent systems and Therapeutic Potential Target Functional role Cholinergic neurons Development/surviv of the basal forebrain al, neuroprotection Central Nervous System Astrocytes and Oligodendrocytes Re-myelination Peripheral Nervous System Sensory and sympathetic neurons Development/surviv of paravertebral al, neuroprotection ganglia (DRG and SCG) Immune System Macrophages, mast cells, lymphocytes Modulation of inflammatory responses Neuroendocrine System Hypotalamic-pituitaryadrenocortical system Modulation of stress responses Disease Alzheimer age-related dementia Demyelinating diseases (Multiple Sclerosis) Peripheral neuropathies Allergies Cutaneous ulcers Ophthalmic diseases 17 NGF e Romantic love Pubblicazioni scientifiche su NGF: 13008 18 Perché la sua scoperta ha rivoluzionato la neurobiologia? 2008 - Laurea Honoris causae in Biotecnologie – Univ Milano-Bicocca Laudatio – “Per avere aperto la strada, con la scoperta e caratterizzazione molecolare e funzionale del NGF, alla comprensione dei meccanismi con i quali le cellule di organismi complessi comunicano tra loro e coordinano le loro funzioni durante tutta la vita” "La mia intelligenza? Più che mediocre. I miei unici meriti sono stati impegno e ottimismo" Perché studiare ancora il NGF? Ann. Neurol. 1991 Dec;30(6):831-40 Human nerve growth factor prevents degeneration of basal forebrain cholinergic neurons in primates Koliatsos VE, Clatterbuck RE, Nauta HJ, Knüsel B, Burton LE, Hefti FF, Mobley WC, Price DL Dept. of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21205-2181 19 Dalla scoperta alle applicazioni cliniche Ulcere cutanee in pazienti che non rispondono alle terapie convenzionali Prima del trattamento con NGF Dopo trattamento con NGF Cheratite neurotrofica Stage 1 Stage 3 Stage 2 Corneal perforation 20 Neurotrophic keratitis (post neurosurgery) Pre-NGF treatment At the end of 10 days NGF treatment 6 months post-NGF treatment Neurotrophic keratitis (da diabete) Before NGF treatment At the end of 2 weeks NGF treatment 21 From ANTERIOR to POSTERIOR OCULAR DISEASES Retinitis Pigmentosa Photoreceptors degeneration A Lambiase Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1995 L Lenzi Vision Res 2005 Optic nerve diseases traumatic, ischemic, toxic, multiple sclerosis HK Yip Brain Res 1982 G Carmignoto J Neurosci 1989 R Siliprandi IOVS 1993 Glaucoma Neuroprotection/ neuroregeneration A Lambiase Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1997 M Rudzinski J Neurobiol 2004 WS Lambert BMC Neurosci 2004 A Lambiase IOVS 2005 Different approaches for NGF-based therapy GC NE cAMP+ PPi GR hsp90 hsp90 GR (+) ? AC PKA ATP ? P C/EBPδ βAR-2 PKA CREB CREB (+) GRE p50 p65 NF-kB -790 -719 GR P C/EBPδ c-Fos CREB c-Jun GC- C/EBPδ CRE TATA AP-1 box Bind. site box -90 -72 -60 +16 Sp1 (+/-) In alternative: • Intraventricular injection of 2.5S mNGF (clinical trial in human (3 patients) • Gene therapy: engraft of cells engineered to express rhNGF (clinical trial in 8 patients) • Nasal and intraocular delivery of 2.5S mNGF (Lambiase A, 2007) 22 Different approaches for NGF-based therapy Biotechnological interest for NGF-molecules for NGF-based therapies DRG from chicken embryos CTR SCG in neonatal mice NGF 23 Experimental strategy: Cloning of the hNGF gene hNGF cDNA constructs: HindIII AA TT hNGF AA TT a)HindIII AA TT hNGF AA TT XhoI XhoI Hippocampal PCR human cDNA library b) HindIII AA TT hNGF AA TT XhoI b) In the pTRE vector (TetOff System, Clontech), the hNGF cDNA is cloned downstream of a minimal CMV promoter. The pTRE vector contains, upstream of the pCMV, a seven repeats of a tetO sequence for binding of the regulatory protein tTA uncoded by the regulatory pTet-Off plasmid (Gossen M & Bujard H, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551, 1992). MiniPerm bioreactor system 1 2 3 b) a) c) Purchased from International PBI 24 rhNGF induces differentiation and TrkA phosphorylation in PC12 cells rhNGF (MEF 10ng/ml) rhNGF (HeLa 10ng/ml) 2.5S NGF (10 ng/ml) rhNGF (MEF) rhNGF (HeLa) 2.5S NGF (5 ng/ml) K252a (100nM) 2.5S NGF (10 ng/ml) rhNGF B cont Mock K252a (100nM) A 175 p-TrkA 83 62 rhNGF induces survival and differentiation of Dorsal Root Ganglia (DRG) Control mNGF rhNGF rhNGF 25 Peptidi NGF-like versus rhNGF Limitazioni all’uso terapeutico di rhNGF: • • • • • Pessima farmacocinetica Azione pleiotropica Proprietà antigeniche Degradazione proteolitica (MMP9) Difficoltà alla produzione su larga scala (la presenza di un cystein-knot rende complessa la produzione in sistemi cellulari normalmente usati per proteine ricombinanti) Requisiti per molecole NGF-like con attività neurotrofica: • Identificare i determinanti di sequenza e struttura responsabili dell’interazione NGF/TrkA vs NGF/p75 • Elevata omologia di sequenza e struttura con le altre neurotrofine (>50%) • Specificità NGF/TrkA è basata sui: domini iper-variabili del NGF: loop-1 (aa 29-35), loop-2 (aa 43-48), loop-4 (aa 92-98), le regioni C- e N-terminali domini iper-variabili del TrkA (dominio 5) MODELLO MOLECOLARE dell’interazione NGF-TrkA(d5) Loop-3 N-terminale d5-TrkA d5-TrkA Loop-1 Loop-4 Loop-2 26 The NGF-like peptide BB14 d5-trkA NGF N-terminus Hydrophobic pocket d5-trkA Loop1 (Ile31, Lys32, Lys34) • Analisi del complesso NGF-TrkA • Studi di mutagenesi sito-specifiche • Analisi della struttura dei peptidi pubblicati mediante modelli di Dinamica Molecolare (MD) (InsideII software- Biosym) Loop4 (Gly94, Lys95, Gln96) BB14 (17 aa) Loop1 NMR structure of BB14: rigid loops connected by a flexible linker Loop4 C---CTGAC---C-COOH T K D Q D G G---K I----K Differentiation/survival of DRG Activity of the NGF-like peptide BB14 CTR ED50=1 µM TrkA receptor phosphorylation CTR BB14 NGF P-TrkA BB14 BB14 does not interact with TrkB BDNF C 10 20 NGF L1L4 3 6 NGF 10 10 100 P-TrkB TrkB 27 Peripheral nerve injury models Behavioral tests Chronic constriction injury (CCI) Three ligatures (3-0 gut) are tied loosely around the sciatic nerve proximal to the sciatic nerve trifurcation. The distance between ligatures is 1 mm (i.e. length of the treated nerve, 2–3 mm). Spared Nerve Injury (SNI) It involves a lesion of two of the three terminal branches of the sciatic nerve (tibial and common peroneal), leaving the remaining sural nerve intact. The common peroneal and tibial branches of the left sciatic nerve are ligated and transected. A 3 mm portion of the nerve is removed. tactile allodynia thermal hyperalgesia NGF and BB14 reduce neuropathic behavior in peripheral nerve injury models of CCI and SNI NGF BB14: 37.5 µg/µl/hr= 3.6 mg/Kg body weight Bibliography Colangelo et al (2008). J Neurosci 28(11):2698-709 Cirillo et al. (2010). Cell Mol Neurobiol 30(1):51-62. Epub 2009 Cirillo et al (2011). Neurobiol Dis 41(3):630-9. Epub 2010 Nov 25 Cirillo et al. (2012). Biotechnol Advances Colangelo et al. (2012). Biotechnol Advances • Azione NGF-like • Attività anti-gliosi 28 The tripartite synapse Neuroprotection by NGF and BB14 also involves modulation of glial activation BB14 BB14 Other effects of NGF Glial changes: reduces microglial activation DRG structure: neuronal size size and N° of satellite cells Myelin tickness of sciatic nerve stump fibers Dorsal horns: expression of NGF and receptors (TrkA and p75) 29 Increasing endogenous NGF or BB14 restore vesicular neurotransmitter transporters Tripartite synapse: functional role of NGF in modulating glial function in synaptic homeostasis and neuroprotection pre (18aa) pro (103aa) mature NGF (118aa) Glial activation determines: MMPs activation Decrease of NGF Increase of proNGF Increase of p75 NGF and BB14 reduce glial activation and restore: • glial and neuronal Glutamate transporters • GABAergic markers • GSH levels Normalization of synaptic homeostasis, glial neuroprotection, and reduction of Neuropathic behavior 30 Systems Biology for the Biology of a System • Complex system: structural organization and function ~ 100 billion (1011) neurons (different types) 10× more glial cells (different types) 1016 synapses each protoplasmic astrocyte can enwrap ~ 2x106 synapses huge number of functional neuro-glial networks NGF IGF-1 IGF-R Wnt TrkA proNGF p75 P ras PI3K Aβ FasL TRAF6 FADD NRIF RIP2 P PLC-γ Fas Plasma membrane sphingomyelinase Shc P P ceramide NADE ROS Ca2+ NRAGE Calpain Survivin IAP ERK1/2 JNK p53 Akt ROS Bax Caspase-12 P Bad 14-3-3 FKH P Procaspase-8 Bid Bcl-xl p10 GSK-3β p25 cdk5 Cki Survivin Cyclins IAP cdk Apaf-1 Procaspase-9 CytochromeC Bad Bcl-xl Bax Bak Gene Transcription Caspase-3 AIF EndoG IAP/Survivin/Cki Procaspase-7 Caspase-7 Survivin IAP Cytochrome c Cell cycle Procaspase-3 Caspase-9 Bax Bax NF-kB MnSOD p23 p15 Anti-apoptotic Bcl-xl Bcl-2 Procaspase-2 tBid Bax Akt p27Kip Caspase-2 p35 Caspase-8 Bim Aβ NFT Procaspase-12 Smac/DIABLO Mitochondrial dysfunction Procaspase-6 Caspase-6 Caspases cascade Apoptotic Degradation of DNA, proteins, etc. 31 Models of Neurodegeneration • In-vitro: neuronal PC12 (expressing TrkA and p75) Primary cortical neurons Primary astrocytes and microglia β-III tubulin-TrkA β-III tubulin • GFAP Iba-1 In vivo: perypheral nerve injury: chronic constriction injury (CCI) SNI (spared nerve injury) CTR LPS 24h Morphology and mitochondrial membrane potential (∆Ψm) in NGF-differentiated PC12 cells: effect of NGF deprivation A B C D E F Mitochondrial mass and potential (∆Ψm) by double-staining with MitoTracker Green and Red. (A, B and C) mass, potential and merge of PC12 cells in DMEM (low serum) plus mNGF (10ng/ml), (D, E and F) NGF-differentiated PC12 cells after NGF withdrawal for 24 hr. 32 Autophagy and longevity: neuroprotection in neurological disorders Wiring neuron survival: Crosstalk between autophagy and apoptosis Glial activation Pro-NGF NGF Trk Glu sphingomyelinase DD ceramide NGF P CycD1 IkB CREB NF-kB Bad Bad P Bcl-2 Bcl-XL RXR p38MAPKi 14-3-3 Bcl-XL BAX BAX Mitochondrial dysfunction Caspase-9 Caspase-3 apoptosis IP3 No NGF Ca2+ ER degradation of GLT-1, GLYT1, EAAC H2O2 150 µM CTR RSV ROS LA NAC CRC ALCAR QRC Flav 1µM Sel 50 nM ∆Ψm cytochrome c Transcription Survival genes (Mn-SOD APOE) NGF Selenium/ selenoproteins Bcl-XL ↑BAX MEF PPARγ Ca2+ calpain JNKi GSK3β AP-1 Pro-NGF ROS JNK/p38MAPK PI3K/Akt metabotropic GluR Ca2+ ras/MAPK survival AMPA GluR MMP-9 p75 P P P Glu NMDA GluR apoptosome Pro-caspase-9 TUNEL NGF Necrosis P-AMPK Nutrient deprivation Annexin V In: Colangelo & Alberghina (2010). Apoptotic Mechanisms Involved in Neurological Disorders +++ Mitochondrial dysfunction Adaptation Neuron death Stress events Apoptosis Autophagy Misfolded proteins Reciprocal interplay 33
