Prevalenza dell'infezione da Transfusion Transmitted Virus (TTV) nei donatori di sangue dell'Alto Adige Sandro Rinaldi, Luigi Podda, Martin Pardatscher, Monika Ziller, Ivo Gentilini, Lorenza Vicentini, Cinzia Vecchiato, Federica Targa, Oswald Prinoth Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale – Ospedale Regionale di Bolzano (Responsabile: Dott. Oswald Prinoth) We conduced a study about the emerging pathogens related to the use of the blood components and derivatives to verify the presence, in the donors of the North Italian region of South Tyrol, of the Transfusion Transmitted Virus (TTV), recently identified and related to the onset of acute hepatitis. The presence of this virus in the plasma of 414 periodic volunteer donors was detected with a PCR-method. Thirty-seven donors were positive for TTV, with a prevalence of 8.94%, similar to that found in the other European studies and contrasting with the lack of report about acute hepatitis with unclear genesis. There was not correlation between the transaminase level and the presence of TTV in plasma donors. It is difficult to define the importance of this virus in the transfusion setting. The possibility that the virus could provoke the infection by transfusion is real, considering that the transaminase elevation doesn't correlate with the virus infection and that, at the moment, the detection of the TTV is not routinely. Nevertheless, the implications of the infection on the health of donors and transfusion recipients must be evaluated, considering that there is not agreement about the pathogenetic importance of TTV infection. Parole chiave: infezione da TTV, donatori di sangue. Key words: TTV infection, blood donors. Introduzione Il TTV è un virus riscontrato per la prima volta in malati giapponesi affetti da epatiti post trasfusionali non-A/non- Ricevuto: 30 dicembre 1999 - Accettato: 20 febbraio 2000 Corrispondenza: Dott. Sandro Rinaldi Via San Pietro 16 39018 Terlano (BZ) G1. Si tratta di un virus privo di envelope, costituito da una singola elica di DNA di circa 3.850 nucleotidi2. Vista la simile struttura genomica, era stato inizialmente ritenuto appartenente alla famiglia dei Parvovirus, anche se mancante della loro tipica sequenza terminale. Essendo, tuttavia, state dimostrate notevoli similitudini tra il TTV e i virus appartenenti alla famiglia dei Circoviridae, in particolare diversi suoi tratti di sequenza genica sarebbero uguali a quella del virus dell'anemia dei polli (chicken virus anaemia), si è ritenuto di poterlo indicare come primo Circovirus infettante gli umani3; ne è stato, successivamente, proposto l'inserimento in una nuova famiglia da denominare Circinovirus4. Il TTV è stato anche riscontrato nei primati (scimpanzé)5. L'analisi filogenetica ha permesso l'identificazione di sei genotipi diversi, individuabili attraverso un semplice genotyping assay basato sugli RFLP6. Con l'utilizzo della PCR è stato possibile risalire ad almeno 16 genotipi diversi, spesso contemporaneamente presenti nei soggetti studiati7. Il TTV è stato riscontrato in ogni parte nel mondo, con una prevalenza variabile, tra i donatori di sangue (e quindi, estensivamente, nella popolazione generale) dal 10 al 62% (Tabella I). Scopo del presente lavoro é quello di stimare la prevalenza dell'infezione da TTV in una coorte di donatori afferenti al nostro Servizio Trasfusionale e provenienti da tutto il territorio della provincia di Bolzano. La coorte dei donatori non è rappresentativa della popolazione generale dell'Alto Adige, in quanto altamente selezionata. Abbiamo, inoltre, verificato se ci fosse o meno un eventuale rialzo delle transaminasi ALT nei donatori TTV positivi e comparato la prevalenza da noi riscontrata dell'infezione con quella segnalata in letteratura da altri gruppi. LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45 - num. 3 maggio-giugno 2000 (137-142) 137 S. Rinaldi et al. Tabella I: prevalenza del TTV nei donatori: confronto delle varie casistiche Autore 8 Nazione n° dei donatori studiati n° e % dei donatori TTV positivi Berg Germania 284 20 (7,04%) Viazov9 Germania 122 16 (13,11%) Gimenez-Barcons10 Spagna 168 23 (13,69%) Gallian11 Francia non disponibile non disponibile (5,3%) Giappone non disponibile non disponibile (12%) Kanda12 Tangkijvanich 13 Thailandia 200 14 (7%) Tanaka14 Thailandia 105 38 (36,19%) Irving15 Inghilterra non disponibile non disponibile (7,7%) Simmonds16 Scozia 1.000 19 (1,9%) Niel17 Brasile 72 45 (62,5%) Nakano18 Corea 220 27 (12,27%) Desai19 USA non disponibile non disponibile (10%) Charlton20 USA 100 1 (1%) Matsumoto21 USA 402 30 (7,46%) Prati22 Italia 100 22 (22%) Nostra casistica Italia 414 37 (8,94%) 3.187 292 (9,16%) Totale Materiali e metodi Lo studio, approvato dal comitato etico dell'Ospedale, prevedeva la raccolta di almeno 400 campioni di sangue (in provette non etichettate e quindi anonime), prelevati in concomitanza con le donazioni di sangue, randomizzati nell'arco di un mese di attività (dall'8/2/99 al 4/3/99), eseguita nei diversi centri di prelievo dell'Alto Adige (Bolzano, Merano, Bressanone, Brunico, Vipiteno, San Candido e Silandro). I 414 donatori (294 maschi e 120 femmine), di età compresa tra i 18 e i 65 anni di età, analizzati per TTV–DNA e per ALT, corrispondono a circa il 2,85% del totale dei donatori altoatesini (13.952 alla data del 28 febbraio 1999). Il dosaggio delle ALT è stato eseguito utilizzando un semplice metodo enzimatico. Per quanto riguarda l'identificazione dei campioni positivi per il TTV, è stata utilizzata la tecnologia PCR. È stato estratto, in primo luogo, il DNA da 150 µL di plasma di ogni singolo donatore, utilizzando il kit "Helix Speed Virus" fornito dalla ditta Diatech S.r.l., Jesi (AN). Si procedeva, quindi, ad una prima amplificazione su termociclatore, utilizzando il primer "TTV 1" (facente parte del kit "Direct TTV DNA" fornito dalla stessa ditta Diatech). Tale amplificazione consta di 30 cicli (con 94 °C/15 secondi, 56 °C/15 secondi e 72 °C/45 secondi) Successivamente, i campioni di DNA erano sottoposti ad un'ulteriore amplificazione, utilizzando il primer "TTV 2" (facente parte anch'esso del kit "Direct TTV DNA" fornito sempre dalla ditta Diatech: 25 cicli con 94 °C/15 secondi, 56 °C/15 secondi e 72 °C/45 secondi). I primers del kit amplificano nella regione 138 ORF1 del genoma del TTV. Come controllo è stato utilizzato un campione di siero proveniente da un paziente TTV positivo. La rilevazione degli eventuali amplificati era effettuata, previa elettroforesi su gel d'agarosio all'1%, evidenziando, in caso di positività, la presenza di bande fluorescenti della lunghezza di 268 paia di basi. Risultati Abbiamo riscontrato la presenza del virus in 37 campioni (34 maschi e 3 femmine) con una prevalenza dell'infezione da TTV di 8,94% sul totale dei 414 donatori analizzati (Tabella II). Da tenere presente che i donatori, in linea con quanto previsto dalla vigente Legge Trasfusionale, non avevano né ricevuto trasfusioni di emocomponenti ed emoderivati negli ultimi cinque anni né sofferto, in passato, di epatite; non erano stati né a stretto contatto con soggetti affetti da epatite, né sottoposti, nei sei mesi precedenti la donazione, ad alcun tipo di intervento chirurgico o a Tabella II: risultati Maschi n° donatori non disponibile in Alto Adige n° donatori analizzati n° donatori TTV positivi 294 34 (11,56%) Femmine Totale non disponibile 13.952 120 414 3 (2,5%) 37 (8,94%) Infezione da TTV nei donatori dell'Alto Adige Tabella III: aree di provenienza e numero donatori analizzati Area di provenienza N° donatori analizzati N° donatori TTV-positivi % Bolzano 49 4 8,16 Bressanone 88 5 5,68 Brunico 50 9 18,00 Merano 118 8 6,78 11,42 San Candido 35 4 Silandro 33 1 3,03 Vipiteno 41 6 14,63 Totale 414 37 8,94 tatuaggi, foratura delle orecchie e agopuntura; non erano dediti all'alcool. In ambito provinciale la percentuale di positività ottenuta variava dal 3,03% di Silandro al 18% di Brunico (tabella III). Nel nostro Servizio, provvediamo all'eliminazione di quelle unità di sangue che abbiano un valore di transaminasi ALT superiore alle 55 UI/mL. Poiché solamente due delle 37 unità TTV positive hanno seguito questa sorte, non abbiamo potuto riscontrare alcuna correlazione tra l'elevazione dei livelli sierici delle ALT e la presenza del TTV nel plasma dei donatori (Figura 1). Discussione La prevalenza del virus nel nostro campione di donatori di sangue è confrontabile con quella riscontrata in altre regioni europee ma risulta, generalmente, più bassa rispetto a quella dei paesi extraeuropei. È, invece, macroscopica la differenza rispetto alle statistiche orientali (Tailandia14 e Corea18) e sudamericane (Brasile17 e Colombia23). Segnalata anche in Africa un'alta prevalenza dell'infezione da TTV24. Sono stati dimostrati due possibili meccanismi in grado di spiegare il contagio interumano per opera del TTV: il primo di tipo parenterale (prevalente in Europa, Stati Uniti e Giappone, dovuto all'utilizzo di emocomponenti ed emoderivati), il secondo di tipo enterale (importante in quelle aree aventi un livello sociosanitario più basso). Per quanto riguarda il contagio parenterale, esso é stato sospettato fin dalla scoperta del virus25 e confermato da molte segnalazioni8,9,16,20; oltretutto nei politrasfusi sono spesso evidenziabili più genotipi virali, una situazione che indicherebbe la possibilità di infezioni multiple sovrapposte26. Il contagio enterale é stato documentato da diverse osservazioni. In uno studio, condotto su bambini nati in un'area rurale della Repubblica Democratica del Congo, si é notato che i bambini si infettavano spesso dopo il terzo mese dal parto, che le madri di bambini TTV positivi risultavano negative e che, nei casi con madre positiva, le sequenze dei virus presenti nei bimbi differivano spesso da quelle dei virus riscontrati nelle loro madri. Queste tre osservazioni contrastano con la trasmissione materno-fetale del virus, suggerendo, invece, un contagio enterale simile a quello dell'epatite A24. Analoghe conclusioni sono state tratte da uno studio condotto a Taiwan27. La presenza del TTV é stata, inoltre, dimostrata nella bile di soggetti infettati, giustificando ulteriormente il contagio per via oro-fecale28. Figura 1: andamento delle ALT dei donatori TTV positivi 139 S. Rinaldi et al. Un recente studio prospettico italiano22, della durata di tre anni, eseguito su pazienti talassemici politrasfusi, ha evidenziato che il 93,5% dei malati era già TTV positivo al momento della prima osservazione e che il 96,5% di questi restava viremico durante i tre anni d'osservazione, in assenza di particolari alterazioni degli enzimi epatici. Il fatto che il TTV rimanga in circolo per cosi lungo periodo aggrava la possibilità di contagio interumano. Oltretutto, la ricerca del TTV nel plasma dei donatori non é routinaria e tantomeno lo é l'eliminazione delle unita di sangue che risultassero positive, sebbene esista la possibilità di introdurre un semplice test di screening in grado di determinare in immunofluorescenza la presenza degli Ab anti-TTV29. Da rimarcare inoltre che le ALT non correlano assolutamente con la presenza del TTV: questo significa che esse non ci sono di alcun aiuto nell'eliminazione delle unità TTV positive. Giacché non é attualmente possibile, al fine di evitare il contagio interumano, l'eliminazione del TTV dagli emocomponenti ed emoderivati e vista anche l'importanza del contagio per via enterale, andiamo, allora, ad analizzare la pericolosità del virus, considerando le manifestazioni cliniche che esso può o potrebbe provocare. Sulla patogenicità del virus esistono due pareri apparentemente contrastanti: quello di chi certifica l'innocuità dell'infezione da TTV, tanto isolata che in associazione ad altri agenti infettivi epatotropi8-11,13,15,18,21,30-32 e quello di chi segnala il coinvolgimento, ma solamente in maniera sporadica, del TTV nel determinismo delle epatopatie acute e croniche33, specie se l'infezione persiste nel tempo34. A tal proposito segnaliamo che, nell'ambito della nostra attività trasfusionale, che spesso ci vede chiamati a compiti di look-back nei confronti di forme epatitiche ritenute posttrasfusionali, non abbiamo mai ricevuto segnalazioni di epatopatie o di importanti aumenti delle ALT ascrivibili al TTV. Tutto ciò potrebbe dipendere, tuttavia, da una scarsa attenzione da parte dei clinici, più portati ad attribuire questi eventi alla tossicità dei farmaci, piuttosto che al rischio infettivo trasfusionale. Le segnalazioni di epatopatie acute, provenienti dal Giappone e senza riscontro in Europa e nell'America del Nord, potrebbero essere spiegate sia dalla diversa patogenicità dei vari ceppi di virus, postulando, pertanto, una diversità tra il genotipo virale europeo e quello giapponese, che da una diversa sensibilità immunologica, HLA-dipendente. Ammettendo, tuttavia, che il TTV sia innocuo, non dobbiamo ignorare la possibilità di vedere aumentata la sua patogenicità a causa di una qualche mutazione 140 genomica. A tal proposito, possiamo citare uno studio inglese15, nell'ambito del quale tali mutazioni sono state osservate, e uno studio francese, il quale asserisce che le sequenze del TTV, riscontrate in tre pazienti emodializzati che sono stati seguiti per un periodo variabile dai 15 ai 31 mesi, non sono cambiate35. Considerando, tuttavia, la presenza di genotipi virali diversi, generati presumibilmente da precedenti mutazioni genomiche, riteniamo più probabile la possibilità che tali mutazioni possano verificarsi ulteriormente. Visto quanto sopra, non riteniamo utile, al momento, testare ogni singolo emocomponente per verificarvi la presenza di questo virus; sarebbe, tuttavia, auspicabile uno studio nazionale sulla reale prevalenza di questo virus, tanto sui donatori di sangue che sulla popolazione generale, al fine di stabilire eventuali strategie d'azione qualora si determinasse un eventuale aumento di patogenicità, correlato alle possibili mutazioni virali. La possibilità che si verifichino mutazioni genomiche del TTV, tali da aumentarne la patogenicità (la quale appare, al momento, scarsa) é un evento che dovrebbe preoccupare seriamente, viste le segnalazioni sull'inefficacia dell'Interferone nei confronti di questo virus36,37. É stato recentemente segnalato che il TTV ha la capacità di infettare, oltre agli epatociti, anche le cellule mononucleate del sangue periferico, integrando il suo DNA con quello delle cellule umane38. Uno studio precedente, condotto solo sugli epatociti, aveva invece escluso questa possibilità32. Riteniamo, pertanto, che l'importanza a lungo termine dell'infezione da TTV nel sano o nel paziente immunocompromesso sia tutta da appurare, rendendo necessari ulteriori studi. Ci sembra prematuro, in conclusione, ritenere il TTV un innocuo ospite dell'organismo umano, vista la possibilità di un aumento della sua patogenicità in conseguenza di mutazioni genetiche e considerato che i presidi terapeutici efficaci nei confronti di altri virus epatotropi non lo sono su di esso36, 37. Riassunto Nell'ambito dei controlli sui patogeni emergenti correlati all'uso di emocomponenti ed emoderivati, il Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale dell'Ospedale di Bolzano ha condotto un'indagine per verificare la presenza, nei donatori di sangue ad esso afferenti, del TTV (Trasfusion Transmitted Virus), agente recentemente identificato e correlato all'insorgenza di epatopatie acute. La presenza di tale virus é stata ricercata, con metodica PCR, nel plasma di 414 donatori Infezione da TTV nei donatori dell'Alto Adige periodici. In 37 di essi è stata riscontrata la presenza del virus, con una prevalenza dell'8,94%, confrontabile con quella riscontrata in studi condotti in altri paesi europei e contrastante con la mancata segnalazione di epatiti ad insorgenza acuta non altrimenti spiegabili. Non vi era correlazione tra il livello delle transaminasi (ALT) e la presenza del TTV nel plasma dei donatori. Ci risulta difficile definire l'importanza di questo virus in ambito trasfusionale. La possibilità che si verifichi l'infezione attraverso la trasfusione di sangue esiste, vista l'impossibilità di escluderla o di ridurla utilizzando le ALT elevate e considerato che la ricerca del TTV non è, allo stato attuale, routinaria. Sono, tuttavia, da valutare le implicazioni dell'infezione da TTV, sia sullo stato di salute del donatore che su quello dei riceventi la trasfusione, dal momento che non esiste accordo sul significato patogenetico dell'infezione da TTV. Bibliografia 1) Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K et al.: A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown aetiology. Biochem Biophys Res Commun, 241, 92, 1997. 2) Okamoto H, Nishizawa T, Ukita M et al.: The entire nucleotide sequence of a TT virus isolate from the United States (TUS01): comparison with reported isolates and phylogenetic analysis. Virology, 259, 437, 1999. 3) Miyata H, Tsunoda H, Kazi A et al.: Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TTV, the first human circovirus. J Virol, 73, 3582, 1999. 4) Mushahwar IK, Erker JC, Muerhoff AS et al.: Molecular and biophysical characterisation of TT virus: evidence for a new virus family infecting humans. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 3177, 1999. 5) Prescott L, Simmonds P: Global distribution of TransfusionTransmitted Virus (Correspondence). NEJM, 339, 776, 1998. 6) Tanaka Y, Mizokami M Orito E et al.: New genotypes of TT virus (TTV) and a genotyping assay based on restriction fragment length polymorphism. FEBS Lett, 437, 201, 1998. 7) Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T et al.: Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TTV demonstrated by PCR with primers from coding and noncoding regions. Virology, 259, 428, 1999. 11) Gallian P, Berland Y, Olmer M et al.: TT virus infection in French hemodialysis patients: study of prevalence and risk factors. J Clin Microbiol, 37, 2538, 1999. 12) Kanda Y, Tanaka Y, Kami M et al.: TTV in bone marrow transplant recipient. Blood, 93, 2485, 1999. 13) Tangkijvanich P, Theamboonlers A, Hirsch P et al.: TT virus infection in chronic liver disease. Hepatogastroenterology, 46, 1053, 1999. 14) Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakul P et al.: Infection with an unenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis patients and healthy blood donors in Thailand. J Med Virol, 56, 234, 1998. 15) Irving WL, Ball JK, Berridge S et al.: TTV infection in patients with hepatitis C: frequency, persistence and sequence heterogeneity. J Infect Dis, 180, 27, 1999. 16) Simmonds P, Davidson F, Lycett C et al.: Detection of a novel DNA virus (TT virus) in blood donors and blood products. Lancet, 352, 191, 1998. 17) Niel C, De Oliveira JM, Ross RS et al.: High prevalence of TTV infection in Brazilian blood donors. J Med Virol, 57, 259, 1999. 18) Nakano T, Park YM, Mizokami M et al.: TT virus infection among blood donors and patients with non-B, non-C liver diseases in Korea. J Hepatol, 30, 389, 1999. 19) Desai SM, Muerhoff AS, Leary TP et al.: Prevalence of TTV infection in US blood donors and populations at risk for acquiring parenterally transmitted viruses. J Infect Dis, 179, 1242, 1999. 20) Charlton M, Adjei P, Poterucha J et al.: TT-virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure and cryptogenic cirrhosis. Hepatology, 28, 839, 1998. 21) Matsumoto A, Yeo AE, Shih JW et al.: Transfusion-associated TTV infection and its relationship to liver disease. Hepatology, 30, 283, 1999. 22) Prati D, Lin YH, De Mattei C et al.: A prospective study on TT virus infection in transfusion-dependent patients with betathalassemia. Blood, 93, 1502, 1999. 23) Tanaka Y, Mizokami M, Orito E et al.: A new genotype of TTV infection among Colombian native Indians. J Med Virol, 57, 264, 1999. 24) Davidson F, MacDonald D, Mokili JL et al.: Early acquisition of TTV in an area endemic for TTV infection. J Infect Dis, 179, 1070, 1999. 25) Okamoto H, Akahane Y, Ukita M et al.: Faecal excretion of a non-enveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A-G hepatitis. J Med Virol, 56, 128, 1998. 26) Takayama S, Yamazuki S, Matsuo S et al.: Multiple infection of TTV with different genotypes in Japanese haemophiliacs. Biochem Biophys Res Commun, 256, 208, 1999. 8) Berg T, Schreier E, Heuft HG et al.: Occurrence of a novel DNA virus (TTV) infection in patients with liver diseases and its frequency in blood donors. J Med Virol, 59, 117, 1999. 27) Hsieh SY, Wu YH, Ho YP et al.: High prevalence of TTV infection in healthy children and adults and in patients with liver disease in Taiwan. J Clin Microbiol, 37, 1829, 1999. 9) Viazov S, Ross RS Varenholz C et al.: Lack of evidence for an association between TTV infection and severe liver disease. J Clin virol, 11, 183, 1998. 28) Ukita M, Okamoto H, Kato N et al.: Excretion into bile of a novel unenveloped DNA virus (TTV) associated with acute and chronic non-A-G hepatitis. J Infect Dis, 179, 1245, 1999. 10) Gimenez-Barcons M, Forns X, Ampurdanes S et al.: Infection with a novel human DNA virus (TTV) has no pathogenic significance in patients with liver diseases. J Hepatol, 30, 1028, 1999. 29) Tsuda F, Okamoto H, Ukita M et al.: Determination of antibodies to TTV and application to blood donors and patients with post-transfusion non-A to G hepatitis in Japan. J Virol Methods, 77, 199, 1999. 141 30) Kanda T, Yokosuka O, Ikeuchi T et al.: The role of TTV infection in acute viral hepatitis. Hepatology, 29, 1905, 1999. 31) Fukuda Y, Nakano I, Katano Y et al.: TTV is not associated with acute sporadic hepatitis. Infection, 27, 125, 1999 32) YamamotoT, Kajino K, Ogawa M et al.: Hepatocellular carcinomas infected with the novel TT DNA virus lack viral integration. Biochem Biophys Res Commun, 251, 339, 1998. 33) Ikeda H, Takasu M, Inoue K et al.: Infection with an unenveloped DNA virus (TTV) in patients with acute or chronic liver disease of unknown aetiology and in those positive for hepatitis C virus RNA. J Hepatol, 30, 205, 1999. 142 34) Takayama S, Miura T, Matsuo S et al.: Prevalence and persistence of a novel DNA TT virus (TTV) infection in Japanese haemophiliacs. Br J Haematol, 104, 626, 1999. 35) Biagini P, Gallian P, Attoui H et al.: Determination and phylogenetic analysis of partial sequences from TTV isolates. J Gen Virol, 80, 419, 1999. 36) Maggi F, Fornai C, Morrica A et al.: High prevalence of TTV viremia in Italian patients, regardless of age, clinical diagnosis and previous Interferon treatment. J Infect Dis, 180, 838, 1999. 37) Chayama K, Kobayashi M, Tsubota A et al.: Susceptibility of TTV to interferon therapy. J Gen Virol, 80, 631, 1999. 38) Okamura A, Yoshioka M, Kubota M et al.: Detection of a novel DNA virus (TTV) sequence in peripheral blood mononuclear cells. J Med Virol, 58, 174, 1999.