Lezione med. metodi Citologia 2016
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xxxxxxxxx Gli organi sono formati da diversi tessuti (quasi tutti sono rappresentati e in proporzioni diverse) Le diverse modalità di prelievo di tessuti dal corpo umano I principali metodi dell’Istologia Il mezzo più importante utilizzato per osservare i tessuti al microscopio è rappresentato dai vetrini istologici. Sui vetrini si dispongono sezioni sottili di tessuti o cellule intere isolate. Questi preparati si devono colorare prima di essere osservati al microscopio ottico. I vetrini portaoggetto hanno dimensioni 26 x 76 mm Ogni vetrino deve riportare tutte le indicazioni scritte per identificare il preparato Le sezioni sono ricoperte da un vetrino coprioggetto sottile Sezione di ghiandola salivare sottomandibolare, tubuloacinosa mista La fibra muscolare presenta striature trasversali NUCLEI FIGURA 2-1 Diverse tecniche, diverse prospettive. (a) Microscopia ottica, (b) microscopia elettronica a trasmissione, (c) microscopia elettronica a scansione. FISSAZIONE E’ noto che tutte le cellule, dopo la morte dell’organismo o in seguito al loro prelievo, vanno incontro con rapidità a processi trasformativi/degenerativi (autolitici e\o putrefattivi). La fissazione deve intervenire rapidamente per bloccare tali processi. La fissazione consiste nell’arrestare, in un tempo determinato, l’attività vitale di un tessuto, fornendo cosi un’immagine statica costantemente riproducibile. IL FISSATIVO: PRESERVA LA STRUTTURA CELLULARE DALLE ALTERAZIONI CONSEGUENTI ALLA MORTE DELLA CELLULA I fissativi più comuni sono: Formaldeide per la microscopia ottica Glutaraldeide per la microscopia elettronica Queste aldeidi formano legami crociati tra catene proteiche adiacenti Anche l’alcool etilico è comunemente impiegato come fissativo ma soltanto nella microscopia ottica Il tetrossido di osmio è usato per la microscopia elettronica, si lega alle lipoproteine e a causa del suo elevato numero atomico agisce anche come colorante elettronico. E’ molto utile per evidenziare le membrane cellulari. Formaldeide : HCHO I gruppi aldeidici reagiscono con gli aminoacidi basici legando le proteine con ponti metilenici CH2- l’osmio reagisce con i gruppi NH2 e SH, ossida i lipidi insaturi e li rende insolubili. Il frammento di tessuto fissato, per essere osservato al M.O., deve essere sezionato in fettine sottili (circa 10micron), per consentire il passaggio della luce, e infine colorato. Per poter preparare sezioni sottili, il tessuto deve assumere sufficiente durezza e compattezza per cui và incluso in un mezzo solido, per esempio paraffina, celloidina, resina ecc. Il mezzo di inclusione più utilizzato è la PARAFFINA La paraffina si ottiene da residui della distillazione del petrolio, è insolubile in acqua, mentre è solubile in diversi solventi come etere, cloroformio, toluolo, xilolo. La paraffina ha una consistenza plastica ed è chimicamente inattiva . Il tessuto, una volta incluso, può conservarsi in essa per un periodo illimitato . L’inclusione in paraffina viene effettuata in genere per gli esami di routine. come si ottiene un preparato istologico Il fascio luminoso viene raccolto dal condensatore che lo concentra focalizzando la luce e producendo un cono che illumina il vetrino. La sezione colorata modifica la luce secondo la possibilità delle sue parti di assorbire determinate lunghezze d’onda. La microscopia ottica è definita dai seguenti parametri: Potere di risoluzione: dipende dalla lunghezza d’onda della luce, dall’ angolo di apertura della lente obiettivo e dal mezzo interposto tra oggetto e lente. Il potere di risoluzione massimo del microscopio ottico è di circa 0.2 micron. In pratica non si possono distinguere come separati due punti che distano tra loro meno di 0.2 micron. L’ingrandimento: è il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e la dimensione dell’oggetto. Di solito si dice che l’ingrandimento utile è di circa 1000 volte. Il contrasto: Dipende dalle differenze di assorbimento della luce La maggioranza dei costituenti cellulari sono trasparenti alla regione visibile dello spettro a causa dell’alto contenuto d’acqua. Questa difficoltà viene superata dall’uso dei coloranti. La colorazione è un procedimento che aumenta il contrasto presente tra diverse strutture cellulari, tale da permetterne il loro riconoscimento nelle sezioni istologiche. Il termine “colorazione” è usato, sebbene in modo improprio, anche in campo ultrastrutturale per indicare i procedimenti con cui si rendono elettronopache determinate strutture microscopiche utilizzando sali di metalli pesanti. Nel campo della microscopia a fluorescenza si usa per indicare i procedimenti con cui le molecole fluorescenti si legano a quelle del preparato. Acidofilia e basofilia Acidofilia: affinità delle molecole biologiche basiche (gruppi basici come NH3+) per i coloranti acidi. Basofilia: affinità delle molecole biologiche acide (gruppi acidi come COO- ) per i coloranti basici. Alcuni coloranti più usati ACIDI /gruppo cromoforo acido Eosina Blu di Anilina Orange G Verde luce Colorano i componenti acidofili delle cellule come mitocondri, emoglobina, fibre collagene BASICI /gruppo cromoforo basico Fucsina basica Blu di metilene Blu di toluidina Ematossilina Colorano i componenti basofili delle cellule come il nucleo ed il reticolo endoplasmatico rugoso Per colorante si intende una molecola solubile, fornita di colore proprio, capace di legarsi stabilmente a substrati cellulari e tessutali. La maggior parte dei coloranti sono soluzioni di molecole organicche aromatiche che formano legami elettrostatici di tipo salino con i radicali ionizzabili delle macromolecole. EMATOSSILINA-EOSINA è la colorazione più utilizzata Ematossilina colorante basico si lega con legame non ben precisato a strutture con radicali liberi acidi. Colora perciò in viola i nuclei (presenza di DNA), il nucleolo (presenza di RNA ribosomiale), aree basofile nel citoplasma (presenza eventuale di ribosomi), la sostanza fondamentale della cartilagine (presenza di glicosaminoglicani e proteoglicani contenenti radicali liberi carbossilici e solforici). Eosina: (colorante acido) colora le strutture basiche in rosa. Evidenzia il citoplasma delle cellule legandosi alle proteine basiche, le fibre collagene nel connettivo, ecc. Solo ematossilina Solo eosina Ematossilina-eosina AZAN-MALLORY: Colorazione elettiva per evidenziare le fibre collagene del connettivo. MAY-GRÜNWALD-GIEMSA: utilizzata normalmente per colorare strisci di sangue. IMPREGNAZIONE ARGENTICA per il tessuto reticolare. ematossilina eosina Uno stesso tessuto assume aspetti diversi in funzione dei coloranti utilizzati tricromica di Masson azan Istochimica Consente di identificare e di localizzare le sostanze chimiche all’interno delle cellule e nei costituenti intercellulari dei tessuti Due colorazioni istochimiche per i glucidi PAS (Periodic Acid Schiff) per le glicoproteine (glicocalice, membrana basale, mucina ) ed per il glicogeno: L'ossidazione con acido periodico opera la rottura di un legame tra due atomi di carbonio adiacenti della molecola del carboidrato con formazione di un gruppo aldeidico che viene rivelato dal reattivo di Schiff, in presenza di anidride solforosa. Il colore è rosso magenta. ALCIAN BLU (ftalocianina rameica) è un colorante carico positivamente che forma legami con i polianioni tissutali. Colora i glicosaminoglicani (GAG) acidi o solforati e le mucine acide Si lega, in quanto colorante carico positivamente, a tutti i composti aventi radicali acidi liberi (carbossilici, solforici, fosforici). REAZIONE DI FEULGEN Si utilizza l'acido cloridrico e il reattivo di Schiff per colorare il DNA in rosso magenta, Il pezzo appena prelevato viene fissato per immersione in azoto liquido o con un getto di CO2 compressa che lo raffredda molto rapidamente senza farlo cristallizzare, quindi viene tagliato al criostato. Le sezioni cosi ottenute sono pronte per le colorazioni sia istologiche che istochimiche. La microscopia a CONTRASTO DI FASE si impiega per osservare cellule e tessuti viventi. Questa tecnica si basa sul fatto che le strutture biologiche presentano piccole differenze nell’indice di rifrazione che determinano cambiamenti di fase delle radiazioni che le attraversano. Nel microscopio a contrasto di fase queste differenze di fase vengono trasformate in differenze di ampiezza. Microscopia elettronica Il limite di risoluzione del microscopio elettronico a trasmissione è di 0.30.5nm,quello del M E a scansione è di 5 nm. La sorgente di luce è costituita da un fascio di elettroni emessi da un filamento di tungsteno (catodo) TRASMISSIONE Le lenti sono costituite da campi elettromagnetici capaci di deflettere gli elettroni che passano attraverso il campione e infine proiettati su uno schermo fluorescente SCANSIONE L'immagine della superficie viene ottenuta grazie agli elettroni secondari emessi dalla superficie colpita dal fascio elettronico Questi elettroni secondari, provenienti da tutte le direzioni dal campione, vengono raccolti da un sensore convertiti in impulsi elettrici ed integrati in un monitor a formare l’immagine tridimensionale della struttura esterna del campione. Filtro dicroico Localizzazione dell’actina ACTINA e microtubuli Recettori dell’insulina Figura 1-4. Esempio di immunoistochimica indiretta. Neuroni di ganglio cervicale superiore di ratto immunocolorati con anticorpi fluorescenti diretti contro i recettori dell’insulina. Le aree colorate corrispondono ai siti dove l’anticorpo si è legato al recettore dell’insulina. La distribuzione della colorazione indica che i recettori sono localizzati in tutta la regione del soma e dei prolungamenti, mentre manca a livello del nucleo. (Da James, S., Patel, N., Thomas, P. e Burnstock, G.: Immunohistochemical localization of insulin receptors on rat superior cervical ganglion neurons in dissociated cell culture. J. Anat. 182: 95-100, 1993). Collagene IV Figura 1-5. Immunoistochimica indiretta. Gli anticorpi fluorescenti sono stati preparati contro gli anticorpi primari anti collagene IV, per dimostrare la presenza di una lamina basale continua all’interfaccia tra gruppi di cellule maligne ed il connettivo circostante. (Da Kopf-Maier, P. e Schroter-Kermani, C.: Distribution of type IV collagen in xenografted human carcinomas. Cell Tissue Res. 272: 395-405, 1993. Copyright Springer-Verlag). CARDIOMIOCITO: desmina MICROSCOPIA OTTICA CONFOCALE l’autoradiografia L’impiego di composti marcati con radioisotopi consente di studiare attività metaboliche delle cellule Il principio generale consiste nel seguire il destino, nei tessuti o in una cellula, di un isotopo o di composti che contengono nella molecola un isotopo radioattivo L’autoradiografia può essere applicata sia a frazioni cellulari che a sezioni istologiche Figura 1-6. Autoradiografia. Osservazione al microscopio ottico della incorporazione della prolina tritiata nella membrana basale in funzione del tempo, a partire dalla somministrazione del precursore. Nelle microfotografie 1a, 1b e 1c si può osservare come i granuli d’argento (macchie scure) sono localizzati prevalentemente nelle cellule endodermiche, ma dopo 8 ore (1d), i granuli d’argento sono osservabili nella membrana basale. La presenza dei granuli indica la localizzazione della prolina tritiata.
