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Gli organi sono formati
da diversi tessuti (quasi tutti
sono rappresentati e in
proporzioni diverse)
Le diverse modalità di prelievo di tessuti dal corpo umano
I principali metodi dell’Istologia
Il
mezzo più importante utilizzato per
osservare i tessuti al microscopio è
rappresentato dai vetrini istologici.
Sui vetrini si dispongono sezioni sottili di
tessuti o cellule intere isolate. Questi
preparati si devono colorare prima di
essere osservati al microscopio ottico.
I vetrini portaoggetto hanno dimensioni
26 x 76 mm
Ogni vetrino deve riportare tutte le
indicazioni scritte per identificare
il preparato
Le sezioni sono ricoperte da
un vetrino coprioggetto
sottile
Sezione di
ghiandola salivare
sottomandibolare,
tubuloacinosa
mista
La fibra muscolare
presenta striature
trasversali
NUCLEI
FIGURA 2-1
Diverse tecniche, diverse prospettive. (a) Microscopia ottica, (b) microscopia
elettronica a trasmissione, (c) microscopia
elettronica a scansione.
FISSAZIONE
E’ noto che tutte le cellule, dopo la morte dell’organismo o in
seguito al loro prelievo, vanno incontro con rapidità a
processi trasformativi/degenerativi (autolitici e\o putrefattivi).
La fissazione deve intervenire rapidamente per bloccare tali
processi.
La fissazione consiste nell’arrestare, in un tempo
determinato, l’attività vitale di un tessuto, fornendo
cosi un’immagine statica costantemente
riproducibile.
IL FISSATIVO:
PRESERVA LA STRUTTURA CELLULARE DALLE ALTERAZIONI
CONSEGUENTI ALLA MORTE DELLA CELLULA
I fissativi più comuni sono:
Formaldeide per la microscopia ottica
Glutaraldeide per la microscopia elettronica
Queste aldeidi formano legami crociati tra catene proteiche
adiacenti
Anche l’alcool etilico è comunemente impiegato come fissativo ma soltanto
nella microscopia ottica
Il tetrossido di osmio è usato per la microscopia elettronica,
si lega alle lipoproteine e a causa del suo elevato numero
atomico agisce anche come colorante elettronico. E’ molto utile
per evidenziare le membrane cellulari.
Formaldeide :
HCHO
I gruppi aldeidici
reagiscono
con gli aminoacidi basici
legando le proteine con
ponti metilenici CH2-
l’osmio reagisce con i gruppi NH2 e SH,
ossida i lipidi insaturi e li rende
insolubili.
Il frammento di tessuto fissato, per essere osservato al M.O.,
deve essere sezionato in fettine sottili (circa 10micron), per
consentire il passaggio della luce, e infine colorato.
Per poter preparare sezioni sottili, il tessuto deve assumere sufficiente durezza e
compattezza per cui và incluso in un mezzo solido, per esempio paraffina,
celloidina, resina ecc.
Il mezzo di inclusione più utilizzato è la
PARAFFINA
La paraffina si ottiene da residui della distillazione del petrolio, è
insolubile in acqua, mentre è solubile in diversi solventi come etere, cloroformio,
toluolo, xilolo.
La paraffina ha una consistenza plastica ed è chimicamente inattiva .
Il tessuto, una volta incluso, può conservarsi in essa per un periodo illimitato .
L’inclusione in paraffina viene effettuata in genere per gli esami di routine.
come si ottiene un
preparato istologico
Il fascio luminoso viene raccolto dal condensatore
che lo concentra focalizzando la luce e producendo
un cono che illumina il vetrino.
La sezione colorata modifica la luce
secondo la possibilità delle sue parti
di assorbire determinate lunghezze d’onda.
La microscopia ottica è definita dai seguenti parametri:
Potere di risoluzione:
dipende dalla lunghezza d’onda della luce, dall’ angolo di apertura
della lente obiettivo e dal mezzo interposto tra oggetto e lente.
Il potere di risoluzione massimo del microscopio ottico
è di circa 0.2 micron. In pratica non si possono distinguere come
separati due punti che distano tra loro meno di 0.2 micron.
L’ingrandimento:
è il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio
e la dimensione dell’oggetto. Di solito si dice che l’ingrandimento utile
è di circa 1000 volte.
Il contrasto:
Dipende dalle differenze di assorbimento della luce
La maggioranza dei costituenti cellulari sono trasparenti alla regione
visibile dello spettro a causa dell’alto contenuto d’acqua.
Questa difficoltà viene superata dall’uso dei coloranti.
La colorazione è un procedimento che
aumenta il contrasto presente tra
diverse strutture cellulari, tale da
permetterne il loro riconoscimento
nelle sezioni istologiche.
Il termine “colorazione” è usato, sebbene in modo improprio,
anche in campo ultrastrutturale per indicare i procedimenti
con cui si rendono elettronopache determinate strutture
microscopiche utilizzando sali di metalli pesanti.
Nel campo della microscopia a fluorescenza si usa per
indicare i procedimenti con cui le molecole fluorescenti si
legano a quelle del preparato.
Acidofilia e basofilia
Acidofilia: affinità delle molecole biologiche basiche
(gruppi basici come NH3+) per i coloranti acidi.
Basofilia: affinità delle molecole biologiche acide
(gruppi acidi come COO- ) per i coloranti basici.
Alcuni coloranti più usati
ACIDI /gruppo cromoforo acido
Eosina
Blu di Anilina
Orange G Verde luce
Colorano i componenti acidofili delle cellule come mitocondri, emoglobina,
fibre collagene
BASICI /gruppo cromoforo basico
Fucsina basica
Blu di metilene
Blu di toluidina Ematossilina
Colorano i componenti basofili delle cellule come il nucleo ed il reticolo
endoplasmatico rugoso
Per colorante si intende una molecola
solubile, fornita di colore proprio,
capace di legarsi stabilmente a
substrati cellulari e tessutali.
La maggior parte dei coloranti sono
soluzioni di molecole organicche
aromatiche che formano legami
elettrostatici di tipo salino con i radicali
ionizzabili delle macromolecole.
EMATOSSILINA-EOSINA è la colorazione più utilizzata
Ematossilina colorante basico si lega con legame
non ben precisato a strutture con radicali liberi acidi.
Colora perciò in viola i nuclei (presenza di DNA), il nucleolo (presenza di
RNA ribosomiale), aree basofile nel citoplasma (presenza eventuale di
ribosomi), la sostanza fondamentale della cartilagine (presenza di
glicosaminoglicani e proteoglicani contenenti radicali liberi carbossilici e
solforici).
Eosina:
(colorante acido) colora le strutture basiche in rosa.
Evidenzia il citoplasma delle cellule legandosi alle proteine basiche, le
fibre collagene nel connettivo, ecc.
Solo ematossilina
Solo eosina
Ematossilina-eosina
AZAN-MALLORY: Colorazione elettiva
per evidenziare le fibre collagene del
connettivo.
MAY-GRÜNWALD-GIEMSA: utilizzata
normalmente per colorare
strisci di sangue.
IMPREGNAZIONE ARGENTICA per il tessuto reticolare.
ematossilina eosina
Uno stesso tessuto assume
aspetti diversi in funzione
dei coloranti utilizzati
tricromica
di Masson
azan
Istochimica
Consente di identificare e di localizzare
le sostanze chimiche all’interno
delle cellule e nei costituenti intercellulari dei tessuti
Due colorazioni istochimiche per i glucidi
PAS (Periodic Acid Schiff) per le glicoproteine (glicocalice, membrana
basale, mucina ) ed per il glicogeno:
L'ossidazione con acido periodico opera la rottura di un legame tra due
atomi di carbonio adiacenti della molecola del carboidrato con formazione
di un gruppo aldeidico che viene rivelato dal reattivo di Schiff, in presenza
di anidride solforosa. Il colore è rosso magenta.
ALCIAN BLU (ftalocianina rameica) è un colorante carico
positivamente che forma legami con i polianioni tissutali.
Colora i glicosaminoglicani (GAG) acidi o solforati e le mucine acide
Si lega, in quanto colorante carico positivamente, a tutti i composti aventi
radicali acidi liberi (carbossilici, solforici, fosforici).
REAZIONE DI FEULGEN
Si utilizza l'acido cloridrico e
il reattivo di Schiff per colorare il DNA in rosso magenta,
Il pezzo appena prelevato viene
fissato per immersione in azoto liquido o con un getto di CO2
compressa che lo raffredda molto rapidamente senza farlo
cristallizzare, quindi viene tagliato al criostato.
Le sezioni cosi ottenute sono pronte per le colorazioni sia istologiche
che istochimiche.
La microscopia a CONTRASTO DI FASE
si impiega per osservare
cellule e tessuti viventi.
Questa tecnica si basa sul fatto che le strutture
biologiche presentano piccole differenze nell’indice di
rifrazione che determinano cambiamenti di fase delle
radiazioni che le attraversano.
Nel microscopio a contrasto di fase queste differenze
di fase vengono trasformate in differenze di ampiezza.
Microscopia elettronica
Il limite di risoluzione del
microscopio elettronico a
trasmissione è di 0.30.5nm,quello del M E a
scansione è di 5 nm.
La sorgente di luce è costituita da un fascio di
elettroni emessi da un filamento di tungsteno
(catodo)
TRASMISSIONE
Le lenti sono costituite da campi elettromagnetici capaci
di deflettere gli elettroni che passano attraverso il
campione e infine proiettati su uno schermo fluorescente
SCANSIONE
L'immagine della
superficie viene ottenuta
grazie agli elettroni
secondari emessi dalla
superficie colpita dal
fascio elettronico
Questi elettroni
secondari, provenienti
da tutte le direzioni dal
campione, vengono
raccolti da un sensore
convertiti in impulsi
elettrici ed integrati in un
monitor a formare
l’immagine
tridimensionale della
struttura esterna del
campione.
Filtro dicroico
Localizzazione dell’actina
ACTINA e microtubuli
Recettori dell’insulina
Figura 1-4. Esempio di immunoistochimica indiretta.
Neuroni di ganglio cervicale superiore di ratto immunocolorati
con anticorpi fluorescenti diretti contro i recettori dell’insulina.
Le aree colorate corrispondono ai siti dove l’anticorpo
si è legato al recettore dell’insulina. La distribuzione
della colorazione indica che i recettori sono localizzati in
tutta la regione del soma e dei prolungamenti, mentre
manca a livello del nucleo. (Da James, S., Patel, N.,
Thomas, P. e Burnstock, G.: Immunohistochemical
localization
of insulin receptors on rat superior cervical ganglion
neurons in dissociated cell culture. J. Anat. 182: 95-100,
1993).
Collagene IV
Figura 1-5. Immunoistochimica indiretta. Gli anticorpi
fluorescenti sono stati preparati contro gli anticorpi primari
anti collagene IV, per dimostrare la presenza di una
lamina basale continua all’interfaccia tra gruppi di cellule
maligne ed il connettivo circostante. (Da Kopf-Maier,
P. e Schroter-Kermani, C.: Distribution of type IV collagen
in xenografted human carcinomas. Cell Tissue Res. 272:
395-405, 1993. Copyright Springer-Verlag).
CARDIOMIOCITO:
desmina
MICROSCOPIA OTTICA CONFOCALE
l’autoradiografia
L’impiego di composti marcati con radioisotopi consente di studiare
attività metaboliche delle cellule
Il principio generale consiste nel seguire il destino, nei tessuti o
in una cellula, di un isotopo o di composti che contengono
nella molecola un isotopo radioattivo
L’autoradiografia può essere applicata sia a frazioni
cellulari che a sezioni istologiche
Figura 1-6. Autoradiografia. Osservazione al
microscopio
ottico della incorporazione della prolina
tritiata nella
membrana basale in funzione del tempo, a
partire dalla
somministrazione del precursore. Nelle
microfotografie
1a, 1b e 1c si può osservare come i granuli
d’argento
(macchie scure) sono localizzati
prevalentemente nelle cellule
endodermiche, ma dopo 8 ore (1d), i granuli
d’argento
sono osservabili nella membrana basale. La
presenza
dei granuli indica la localizzazione della
prolina tritiata.
