Metodi di studio
UNITA’ DI MISURA
μm
20 μm
25 nm
1X5 μm
7 nm
2nm
Visualizzazione di cellule e tessuti
microscopia ottica
microscopia elettronica
Visualizzazione di cellule e tessuti
Il microscopio è uno strumento fondamentale
Gli studi su cellule, tessuti e organi
si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi
e sulle relative procedure
Esistono diversi metodi di microscopia:
- la microscopia ottica
- la microscopia elettronica
INGRANDIMENTO
capacità di fornire un’immagine ingrandita
dell’oggetto osservato.
L’ingrandimento dipende dall’obiettivo e
dall’oculare e corrisponde al prodotto degli
ingrandimenti delle singole lenti.
Microscopia ottica: fino a 1000 volte
Microscopia elettronica: oltre 106 volte
E’ limitato dal potere di risoluzione
Risoluzione:
la distanza minima a cui si distinguono
due oggetti
Risoluzione dell'occhio:
0.2 mm = 200 µm
Risoluzione del Microscopio ottico:
200 nm = 2,000 Angstroms
Risoluzione del Microscopio Elettronico a Trasmissione:
0,2 nm = 2 Angstroms
Risoluzione di un microscopio dipende da:
-
Caratteristiche della luce (lunghezza d’onda: λ)
-
Caratteristiche delle lenti (apertura angolare: α)
-
Caratteristiche del mezzo in cui si svolge
l’osservazione (indice di rifrazione: n)
R=
λ
2n x sen α
Lunghezza d’onda
R=
λ
2n x sen α
Apertura angolare
R=
λ
2n x sen α
Indice di rifrazione
R=
λ
2n x sen α
Microscopia Ottica
Microscopia Ottica in
Campo chiaro
Immagine si forma perché l’oggetto scherma
la luce trasmessa
Preparati in campo chiaro
Un batterio
Campo chiaro, 1000x
Cellule
Microscopia ottica a contrasto di fase
• Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto
• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi
differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare
rispetto al mezzo circostante
• I raggi di luce che attraversano le cellule subiscono un
leggero rallentamento che risulta una variazioni della fase
dell’onda luminosa
• Un anello di fase posto sopra l’obbiettivo trasforma questa
variazione di fase in cambiamenti della luminosità che
permettono di visualizzare l’oggetto
Citologia, Istologia e
Anatomia microscopica ©
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Microscopia ottica a contrasto di fase
Un batterio
400x
Un lievito
(S. cerevisiae)
400x
Cellule staminali
neuronali in
coltura
100x
Uso di colorazioni per migliorare
il contrasto dei preparati
Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile
migliorare il contrasto delle immagini al microscopio
Coloranti vitali
Le cellule possono essere colorate senza fissazione.
Coloranti che richiedono fissazione
Le cellule devono essere fissate e permeabilizzate.
Preparazione di un Campione
Biologico per la Microscopia Ottica
•
•
•
•
•
Prelievo del campione
Fissaggio (formaleide o alcol)
Preparazione delle sezioni
Taglio (microtomo)
Colorazione
(paraffina)
Taglio per mezzo di
un microtomo, che
produce sezioni dello
spessore di 1-10 µm
Montaggio delle
sezioni su vetrini per
microscopia
Sezione non colorata
Diversi tipi di Sezioni
Sagittali:
Separano
destra-sinistra
Coronali
o frontali:
Separano
davanti-dietro
Ematossilina/Eosina
•
Ematossilina
•
Ha affinità per le molecole cariche
negativamente (principalmente DNA
ed RNA)…maggiore concentrazione
nel nucleo
•
Eosina
•
Ha affinità per le molecole cariche
positivamente (ad esempio alcune
classi di proteine presenti nel citosol)
Cosa è colorato in questa sezione?
• Se una porzione di
tessuto o di una
cellula si colora di
violetto, viene detta
basofila
• È colorata
dall'ematossilina
• I Nuclei
generalmente sono
basofili
zoom
• Se una porzione si
colora in rosa, viene
detta acidofila o
eosinofila
• È colorata dall'eosina
• Colora il citosol
zoom
Impregnazione argentica
Tricromica o Hazan-Mallory
•Per i tessuti connettivi
•Le fibre di matrice
extracellulare si colorano in
blu
•Con E&E sono rosa
Giemsa
• Per le cellule del sangue
• Simile ad E&E
Cellule del sangue
Colorazioni di specifiche componenti: muco. Alcian Blu
E le aree "bianche"?
•
I fluidi presenti nei tessuti
o negli spazi interstiziali si
colorano debolmente con
Ematossilina & Eosina
•
•
•
Sangue, linfa etc.
Si riconoscono come ampi
spazi bianchi
Anche i lipidi ed il grasso
non si colorano con
Ematossilina & Eosina
Mesenchima
Immuno-marcatura:
Immunoistochimica
e Immunofluorescenza
Anticorpi sono coniugati con molecole «visibili»
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Anatomia microscopica ©
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Microscopia a Fluorescenza
•
Il campione viene colorato con
anticorpi (o altre molecole) coniugati a
fluorocromi
•
La luce utilizzata ha lunghezze d’onda
specifiche per eccitare i fluorocromi
•
I fluorocromi emettono radiazione blu,
rossa o verde
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Anatomia microscopica ©
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Citologia, Istologia e
Anatomia microscopica ©
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Utilizza raggio laser e diaframmi che permettono di bloccare
il segnale proveniente da altri piani focali
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Microscopia Elettronica a
Trasmissione
Microscopia Elettronica a
Trasmissione
• Utilizzano gli elettroni invece che
la luce
• Elettroni hanno una lunghezza
d'onda corta
– Alta risoluzione
• Gli elettroni passano attraverso il
campione
• Sezioni molto sottili colorate con
sostanze “coloranti” elettrondense
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm
Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene
proiettato su uno schermo fluorescente che trasforma
in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene
colpito.
Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti,
ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare
le traiettorie degli elettroni verso l'asse.
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Anatomia microscopica ©
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La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare
strutture non visibili con il microscopio ottico
Pinocitosi
Microscopia elettronica
- I campioni devono essere fissati e tagliati in sezioni
molto più sottili (50-100 nm) di quelli per il
microscopio ottico a luce trasmessa (ultramicrotomo)
- Non vengono usati coloranti ma sostanze dense
agli elettroni sia semplicemente per dare contrasto
(metalli pesanti come i sali di piombo) o anche per
marcare gli anticorpi (Immunogold)
Vari tipi di
Microscopia
Elettronica
• Transmissione (TEM)
• Scansione (SEM)
• Shadow-casting
• Freeze-fracture
• Freeze-etching
• CryoEM
• Negative Staining
Microscopia Elettronica a Scansione
SEM fa una
scansione della
superfice del
campione
Produce immagini
3-D
Microscopia Elettronica a Scansione
Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione,
bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto
del fascio di elettroni contro di esso
Immagini al SEM
Tridimensionalità
La caratteristica preminente delle immagini
ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità
- Ciglia e microvilli
