3A-Preparazione dei campioni

Microscopi e tecniche
microscopiche
Possiamo dividere i microscopi a seconda del tipo di
onda utilizzata per visualizzare le immagini
Microscopi Ottici
Microscopi Elettronici
Permettono di osservare strutture troppo
piccole per essere osservate ad occhio nudo
L’ISTOLOGIA ED I SUOI METODI DI STUDIO
Per un appropriata comprensione di qualsiasi ramo
delle scienze è indispensabile una certa familiarità
con gli strumenti e i metodi ad esso propri.
La comprensione della morfologia e cioè
dell’organizzazione strutturale delle cellule e dei
tessuti è un requisito essenziale per comprendere
come essi funzionano.
Le piccole dimensioni delle cellule e dei
componenti della matrice rendono l’istologia
dipendente dall’impiego e dal progredire dei
microscopi.
visualizzazione di cellule
e tessuti
Il microscopio è uno strumento fondamentale
Storicamente gli studi su cellule, tessuti e organi
si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi
e sulle relative procedure
Esistono diversi metodi di microscopia, e la microscopia
ottica è stata ed è tuttora la piu’ ultilizzata anche a
scopo didattico
DIMENSIONI BIOLOGICHE E DIVERSITA’ DELLE
CELLULE
UNITA’ DI MISURA
μm
20 μm
25 nm
1X5 μm
7 nm
2nm
microscopia ottica
Negli ultimi anni la microscopia ottica è diventata ancora
più importante, soprattutto a causa dello sviluppo di metodi
per la marcatura specifica per la visualizzazione di singoli
costituenti cellulari e la ricostruzione della loro architettura
Tridimensionale.
Un vantaggio importante della microscopia ottica è che
la luce è relativamente poco distruttiva
Marcando componenti cellulari specifici con marcatori
fluorescenti, possiamo cosi’ osservare i loro movimenti e
le loro interazioni in cellule e organismi viventi
microscopia in campo chiaro
Il tipi piu’ diffuso di microscopio è quello illuminato
a campo chiaro (BFM-bright-field Microscope)
perché è poco costoso, facilmente trasportabile ed è in
grado di fornire molte informazioni sulla struttura
di cellule,tessuti ed organi.
Con il BFM si possono studiare cellule viventi, (in vivo) e
piccole parti di tessuti o di organi.
Limiti: dimensioni del preparato, la risoluzione,
l’ingrandimento ed il contrasto.
Immagini al M.O.
Microscopia ottica
• Una funzione cellulare è correlata
alla sua morfologia
• 2 micron-1 metro in lunghezza
• rotonde,discoidali,con estensioni
• filiformi, cubiche,
• piramidali
Immagini al Microscopio a fluorescenza
L’ingrandimento è il rapporto tra la dimensione
dell’immagine e quella dell’oggetto osservato.
Il limite superiore effettivo dell’ingrandimento è da
1000 a 1200 diametri (diametro dell’oggetto)
Con l’aumentare dell’ingrandimento, il diametro di campo
Si restringe e diminuisce la possibilità di dedurre la forma
Generale degli oggetti di maggiori dimensioni
La risoluzione del microscopio in campo chiaro
è di circa 0,25 m
La microscopia ottica è limitata nella finezza dei dettagli
che può rivelare, i microscopi che utilizzano altri tipi di
radiazioni, -in particolare il microscopi elettronicipossono risolvere strutture molto piu’ piccole di quelle che
è possibile risolvere con la luce visibile
Gli svantaggi della microscopia elettronica sono che la
preparazione dei campioni è molto piu’ complessa ed è piu’
difficile essere sicuri che cio’ che vediamo nell’immagine
corrisponda precisamente alla struttura reale che viene
esaminata.
L’analisi computerizzata dell’immagine utile per ricostruire
oggetti tridimensionali a partire da visioni oblique multiple.
Tutti questi approcci stanno estendendo la risoluzione e il
campo d’indagine della microscopia al punto che possiamo
iniziare ad immaginare le strutture di singole
macromolecole.
Preparazione Dei
Campioni per l'Analisi
Istologica
Come si preparano sezioni
istologiche per la microscopia
ottica ed elettronica.
Preparazione di un Campione
Biologico per la Microscopia
Ottica
•
Acquisizione del
campione e taglio in pezzi
(1cm3)
– Biopsia, intervento chirurgico,
autospia postmortem.
– Prelevato rapidamente
utilizzando strumenti adatti
(bisturi).
• Fissaggio del campione (immobilizzare,
"uccidere" e preservare)
– generalmente per mezzo di aldeidi reattive
(formaldeide);
– cross-link delle macromolecole, in particolare le
proteine;
– si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli";
– deve essere fatto rapidamente per evitare che gli
enzimi presenti degradino il tessuto.
• Disidratazione del campione
attraverso passaggi in soluzioni a
concentrazione crescente di etanolo
– Paraffina (materiale usato per l'inclusione)
non è solubile in H2O.
• Eliminazione dell'etanolo e
passaggi in xilene
– Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo
• Inclusione del campione in
in mezzo appropriato
paraffina o resina
– Tessuti sono "molli" e fragili
– Diversi passaggi in paraffina calda
– La paraffina occupa lo spazio
precedentemente occupato
dall'H2O
– La paraffina fredda si indurisce e
permette di sezionare il campione