Array and NGS
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Macro, Micro …and Chips Cosa Sono gli Arrays Tipi di Arrays Utilizzi tipici degli Arrays Thousands of genes One gene I microarray possono misurare l’espressione di migliaia di geni noti in poche ore Arrays MacroArray Depositati su Nylon MicroArray Depositati su Nylon, su Vetro (silice) o Plastica Chip Sintesi di oligo direttamente su matrice di silice. (microarray) Arrays: una matrice ordinata composta da segmenti di DNA a localizzazione nota Evoluzione tecnologica Southern Blot Ricerca e selezione di sequenze “target” fra le moltissime prodotte per frammentazione da DNA Dot Blot Ricerca e selezione di sequenze “target” nel DNA proveniente da cloni (cDNA) “spottati” su filtro Macroarray Ricerca e selezione di sequenze “target” in cDNAteche di sequenze note e “spottate” ordinatamente su filtro a bassa densità Microarray su Filtro Ricerca e selezione di sequenze “target” in cDNAteche di sequenze note e “spottate” ordinatamente su filtro ad alta densità Microarray su Vetro Chip (microarray su vetro) Ricerca e selezione di sequenze “target” in cDNAteche di sequenze note adese ordinatamente su base solida non-porosa (vetro) ad alta densità Sintesi diretta su vetro di oligonucleotidi ancorati con legame covalente ad altissima densità spaziale Cosa distingue un Macro da un Micro-Array? La distinzione fra Macro e Micro Array viene effettuata sulla base della densità dei geni posti sul supporto: Numero di Geni = Densità Dimensioni del supporto Macro e Micro Array Dimensione supporto Densità Geni/cm2 Spaziatura Macro Array 8 x 12 cm 10-100/cm2 1–2 mm Micro Array (Nylon) 27 x 18 mm 5005000/cm2 Fino a 300 µm Micro Array (Vetro) 18 x 18 mm 10000/cm2 Meno di 300 µm Chips a Oligonucleotidi 12.8 x 12.8 mm 300.000 oligo 20-30 µm fino a 30-40 Angstrom Tecnologia degli arrays spottati Sfrutta la capacità di una data molecola di mRNA di associarsi con il DNA stampo da cui è stata generata PREPARAZIONE Libreria di cDNA o set di oligonucleotidi Spotting o sintesi diretta su vetro: con micro-capillari, ink jet o con robot dedicati Fissaggio al supporto Denaturazione (Alcali, Calore) Robot per MicroArray Un “Array” di “penne” per spottare un “Array” di DNA in una singola operazione di scrittura. Le penne funzionano per capillarità o pressione. Il Robot in azione… “Penne” per lo spotting del DNA MacroArray su nylon RNA Totale estratto da linee cellulari (microgrammi) DNA da cloni di cDNA noti Marcatura con 33P 8 cm 12 cm Ibridazione su nylon N° geni 12 x 8 = 96 cm2 x10 = 960 x 100 = 9600 Lettura dei Segnali Interpretazione e Quantificazione PhosphoImager MicroArray con Fosforo Radioattivo Confronto di campioni provenienti da due fonti (p.es. trattato e controllo) è necessario utilizzare 2 filtri in parallelo o ibridare, deibridare e reibridare lo stesso filtro MicroArray Research Genetics contenente 5760 spots di sequenze di DNA. Sono inclusi spots senza di DNA per la normalizzazione del Background e spots con DNA genomico totale per rilevare l’intensità del segnale aspecifico. Spot di controllo: tDNA vuoti Il segnale da Fosforo Radioattivo • Per la marcatura si preferisce il 33P al 32P perchè dà minore effetto “bleeding” nella rivelazione del segnale 32P 33P • L’espressione differenziale viene valutata ibridando sequenzialmente il filtro con il cDNA test ed il cDNA di riferimento. Radioattività o Fluorescenza? Il confronto fra i limiti di sensibilità per cDNA marcati con radioattivo e cDNA marcati con fluorocromi ha rivelato che la marcatura fluorescente è 100 volte meno sensibile. Radioattività o fluorescenza Quantità di RNA totale, poli(A) e cellule/tessuti di origine necessari per superare il limite minimo di sensibilità delle tecniche che impiegano isotopi radioattivi e fluorocromi. Radioattività e Fluorescenza La marcatura con isotopi radioattivi è efficiente per quantità di RNA totale estratto dal sistema biologico in esame a partire da 0.1 microgrammi in su, paragonabile all’efficienza di marcatura con fluorescenza indiretta. La marcatura diretta dell’RNA con fluorocromi diventa efficienta a partire da 10 microgrammi di RNA totale. Il grafico precedente evidenzia la quantità di materiale tipicamente disponibile per studi sullo sviluppo, campioni istologici, biopsie cliniche, culture cellulari. La quantità di materiale richiesto per le tecniche con radioattivo è molto inferiore. MicroArray con Fluorocromi MicroArray con Fluorocromi Paragonare campioni provenienti da due fonti (p.es. trattato e controllo, normale tumorale, differenziato e non) è più semplice con i fluorocromi, in quanto è possibile utilizzare contemporaneamente 2 fluorocromi diversi (Cy3 e Cy5) per marcare il campione test e quello di riferimento. Osservando e quantificando le due differenti emissioni si ottiene il risultato. Fluorophore DyLight 405 Aminomethylcoumarin, AMCA Cyanine, Cy2 Alexa Fluor® 488 Fluorescein, FITC/DTAF Indocarbocyanine, Cy3 Tetramethyl Rhodamine, TRITC Rhodamine Red-X, RRX Alexa Fluor® 594 Texas Red, TR Alexa Fluor® 647 Indodicarbocyanine, Cy5 Alexa Fluor® 680 Excitation Peak (nm) 400 Emission Peak (nm) 421 350 450 492 493 492 550 510 519 520 570 550 570 570 591 596 651 650 684 590 616 620 667 670 702 Alexa Fluor® 790 792 803 Campione 1 Campione 2 Qualità dell’RNA RNA Elettroforesi su gel ND-1000 NanoDrop Bioanalyzer Ratio 260/280=1.8-2.0 1.0 OD di Assorbanza a (260)=40mg/ml di RNA Marcatura con fluorocromi Campione 1 Campione 2 RNA Cy5 cDNA Cy3 Cy5 conjugates are excited maximally at 650 nm and fluoresce maximally at 670 nm krypton/argon laser (647 nm) Cy3 conjugates are excited maximally at 550 nm and fluoresce maximally at 570 nm Campione 1 Campione 2 RNA Cy5 cDNA Cy3 + REPLICHE SPERIMENTALI Stesso RNA testato su due vetrini distinti REPLICHE BIOLOGICHE RNA proveniente da campioni simili ma distinti Tipico esperimento Microarray Acquisizione dell’immagine mediante scanner Cy3 Cy5 MicroArray con Fluorocromi Cy5 Cy3 MicroArray con 550 spot di cDNA di topo; le sequenze target sono stae marcate con Cy3dUTP –verde (wild type) e Cy5-dUTP –rosso (mutante). La sovrapposizione dell’emissione di Cy3 e Cy5 in uno stesso spot genera una colorazione gialla. L’intensità della fluorescenza è legata al numero di fluorofori legati. Interpretazione dei dati Cy5 X sperim. Cy5 Cy3 X sper =0 X rif = 0 Cy3 verde X riferim. spot nero X sper = X rif Xs – Xr = 0 spot giallo X sper > X rif Xs – Xr > 0 spot rosso X sper < X rif Xs – Xr > 0 spot verde La sovrapposizione di uno spot verde ed uno rosso di eguale intensità dà fluorescenza gialla = azzeramento del segnale differenziale L’intensità del segnale di fluorescenza (legata al CHIP) verde o rosso è proporzionale alla quantità di molecole targets nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantità di RNA espresso dalla cellula. Analisi di Espressione Rosso: aumento di abbondanza di mRNA Verde: diminuzione Espressione genica differenziale studiata durante il ciclo cellulare di Lievito. 800 geni coinvolti rappresentati dalle righe del diagramma. Sono messi a confronto 4 ceppi sincronizzati con procedure diverse. Le barre colorate in alto rappresentano le fasi del ciclo cellulare; la barra colorata verticale a destra rappresenta il momento del ciclo cellulare in cui ciascun gruppo di geni raggiunge il massimo di espressione. Microarray ad oligonucleotidi Tecnologia Affimetrix Human Whole Genome Fotolitografia Alla superficie del Chip viene legata una prima serie di “blocchi da costruzione” rappresentato da deossiribo nucleosidi con il gruppo idrossilico funzionale 3’OH protetto. Alcuni di questi blocchi vengono “de-protetti” per azione di un fascio di luce che illumina aree specifiche del chip. Segue una reazione chimica che lega uno specifico nucleoside (a sua volta “protetto”). Questa sequenza viene ripetuta ciclicamente producendo una serie di oligonucleotidi specifici, diversi fra loro, legati in posizioni note sulla superficie del chip. MicroArray ad Oligo Sintesi automatica diretta di oligonucleotidi con sequenza predeterminata in specifiche posizioni su di una superficie (Affymetrix) Microarray ad oligonucleotidi Agilent Human Whole Genome 41015 60mers sintetizzati sul vetrino mediante ink-jetting (più un numero di spot vuoti, più gli spot di allineamento negli angoli) >33.000 geni noti e nuovi; 41.015 tra geni e trascritti Troubleshootings Fonti di confusione in un esperimento microarray • • • • • • • • Qualità dell’RNA estratto Retrotrascrizione Marcatura Deposizione delle sequenze sul vetrino Disomogeneità della superficie del vetrino Ibridazione Lavaggi Acquisizione dell’immagine MicroArray a Oligo Target di grosse dimensioni hanno la tendenza a ripiegarsi su se stessi a causa dell’accoppiamento di basi all’interno della sequenza. Questo porta ad una parziale “mascheratura” delle sequenze bersaglio degli oligo legati alla superficie che può abbassare l’efficienza di ibridazione di alcuni targets rispetto ad altri. La figura mostra targets di tRNAphe in soluzione di ibridazione contro oligo decanucleotidici legati al substrato MicroArray a Oligo Piccoli target interagiscono meglio con gli oligonucleotidi legati al substrato: hanno minori probabilità di ripiegarsi su se stessi formando legami intramolecolari che possano nascondere basi necessarie al riconoscimento da parte degli oligo. Inoltre la massa minore consente a queste molecole di penetrare meglio fra gli oligo. Idealmente, target e probe (cioè gli oligonucleotidi fissati al supporto) dovrebbero avere la stessa lunghezza. MicroArrays a oligo: spaziatori e linkers Oligo Linkers Spaziatori Superficie (vetro o chip) La densità degli oligo sia su vetro che su chip è altissima: si può arrivare a 1 molecola / 39 angstrom2. In questa situazione impedimenti sterici fra oligo vicini e fra oligo e superficie possono interferire nel processo di ibridazione. Questi problemi vengono parzialmente superati con l’inserzione di elementi “spaziatori” fra gli oligo e di catene (linkers) per allontanare l’oligo dalla superficie (qui sono rappresentate catene di glicole oligoetilenico) Validazione del risultato mediante Real-Time PCR Applicazioni degli Arrays Analisi di Espressione Macro e MicroArray Genotipizzazione MicroArray Screening di Mutazioni Chip Misurazione dei livelli di RNA entro un set completo dei trascritti di un organismo. Analisi dei livelli differenziali di espressione genica fra linee cellulari diverse o diversamente trattate o in tempi diversi di un trattamento sperimentale. Determinazione contemporanea degli alleli presenti in centinaia o migliaia di loci differenti. Analisi di mutazioni. Studi sull’associazione genica. Ricerca e caratterizzazioni di mutazioni legate a specifiche malattie. Screening popolazioni. genico su individui o intere http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/microarray/ Genotipizzazione Alleli SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Singolo Array con 120.000 Oligo per la determinazione del genotipo di un campione in più di 3.000 loci biallelici caratterizzati da un SNP Le due metà superiore ed inferiore di ciascun blocco si riferiscono ai 2 alleli; Per ciascun allele c’è una coppia di probe centrati sulla posizione dell’SNP e dei probe centrati in posizione –1 e –4 dell’SNP per ciascun lato. La coppia di probe, inoltre, è formata dalla sequenza perfetta e da una sequenza di controllo mutata in una base. MicroArray a Oligonucleotidi • • L’identificazione della corretta ibridazione è data dalla presenza, per ogni oligo, di un oligo di controllo mutagenizzato in una singola posizione. Più oligo di regioni diverse di un certo gene sono poste sul chip allo scopo di ridurre i falsi positivi. Tre diversi approcci per l’analisi mutazionale in un singolo nucleotide Analisi mutazionale a) Analisi per Aumento di Segnale il target in esame si va a legare alla sequenza contenente il nucleotide mutato complementare; b) Analisi per Diminuzione di Segnale il DNA di riferimento selvatico è marcato con il fluoroforo Cy5 (red) . Il DNA da analizzare è marcato con Cy3 (green). Dove un allele mutato trova l’oligo con la mutazione corrispondente vi si lega causando una diminuzione del segnale rosso. c) Analisi per mini sequenziamento gli oligonucleotidi sono uniti all’array per l’estremità 5’ ed hanno un gruppo 3’-OH esposto. Le sequenze target non marcate dopo l’ibridazione fanno da stampo per una reazione enzimatica di Primer extension usando i 4 ddNTP, un singolo ddNTP per volta marcato con fluorocromo. La sua presenza blocca la sequenza e viene rilevata con una analisi della fluorescenza con microscopio laser. Analisi computazionale dei dati Acquisizione Dati Lettore asservito a Computer Banca Dati Posizione Spot o Oligo Filtro/Vetrino/Chip Emissione e Cattura del Segnale Digitalizzazione del Segnale Salvataggio Dati Numerici 00100010010010010 010010011110110100 101101001010111111 10010100101000100 010101010111111100 000000101010101101 10101010 ….. Normalizzazione Dati Lettura Valore Sperimentale Lettura Valore Sperimentale Geni di Riferimento: HouseKeeping o Total DNA, o altro… Lettura Background Locale Divisione per il Background Lettura Background Locale Divisione per il Background Normalizzazione Ricalcolo Valori Sperimentali rispetto ai valori di riferimento Dato Sperimentale Normalizzato Calcolo Media e Deviazione Standard Elaborazione dei Dati Wet Biology In Silico Biology Preparazione target Elaborazione dati: •Normalizzazione •Confronto Ibridazione Lettura Array Image Analysis Data Mining Clustering Rappresentazione Dati Collegamento a Banche Dati Strumenti basati su WEB Servers Gene Bank Entrez BLAST Data Base Locali o Specializzati 1.602123918 0.337338397 1.844665188 0.323511778 1.768371159 0.353063436 1.713861779 0.267738357 1.303581653 0.254316183 1.547421159 0.317877837 0.836073045 0.881123347 1.087850536 0.33549304 0.305381289 0.283247613 0.853842716 0.542276827 0.757941912 0.440914237 0.328088028 0.304303553 1.643209944 0.324313594 1.877650509 0.294381073 1.655292613 Rappresentazione Dati 1.940693947 0.425630257 2.096773288 0.586138673 2.340281295 0.536911137 2.192482278 0.418784684 2.179213283 0.370275224 2.21861074 0.435055016 0.832259526 1.110397913 1.255508348 0.390475344 0.42840439 0.34408926 1.044141295 0.70624124 0.817729689 0.628867053 0.521591696 0.529410599 2.323978705 0.471268812 2.357837714 0.482821154 2.714877603 2.302936699 0.30506372 2.744427633 0.390622914 2.963051643 0.481762233 2.731550961 0.30659347 2.380973934 0.321728961 2.57892107 0.326781951 1.263089068 0.589378951 0.865317535 0.302573619 0.282743216 0.374218306 0.762380469 0.649139013 1.375079017 0.399835463 0.33594167 0.339880513 2.552775603 0.412139213 3.003807813 0.39106552 2.943123795 Tabella Numerica Raw Data (Dati “Crudi”) Dati Normalizzati Raw Data (Dati “Crudi”) 1.866142311 0.389038225 2.316925173 0.347776799 2.276261836 0.491311494 2.106607882 0.426630292 2.085540052 0.378401935 1.967187072 0.340941878 0.708350554 0.637161764 0.688994822 0.397882942 0.368334098 0.375125914 0.708389619 0.520128891 1.289974878 0.465834776 0.446383404 0.565695482 2.134509286 0.459601985 2.34030319 0.495577595 2.289567976 Dati Normalizzati Istogramma Esperimento “A” 3.5 3 2.5 Serie1 2 Esperimento “B” Serie2 Serie3 1.5 Serie4 1 0.5 0 1 Trasformazione Logaritmica Scatter Plot 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Clustering Esperimento “A” Esperimento “B” Clustering Geni con Comportamento Simile Esperimento “C” Esperimento “D” Esperimenti: a tempi diversi o con trattamenti diversi Data Mining Il Data Mining è il processo di “estrazione” di informazioni funzionali dai dati sperimentali. È un processo che, per la enorme mole di dati prodotti dalla tecnica in esame, dovrà essere sempre più affidato alle macchine. Come per ogni altro approccio sperimentale, lo scopo del Data Mining è cercare relazioni significative fra i dati sperimentali, quelli già acquisiti e la letteratura scientifica che li discute. La possibilità di riarrangiare, secondo nuove prospettive, e confrontare i risultati sperimentali fra loro consente di favorire la “scoperta” di modi nuovi di esaminare i dati stessi, offrendo – a volte – risposte a problemi non ancora chiaramente posti. Sonda gene-specifica La FISH può essere eseguita su: Nuclei isolati Cromosomi metafasici Cromatina interfasica Fibre di DNA allungate meccanicamente La FISH usa la tecnica della ibridazione molecolare Le sonde possono essere: Locus-specifiche Cromosoma-specifiche Centromero/Telomero specifiche nuclei isolati: per diagnosi di o ed anomalie numeriche Y 21 X TRISOMIA 21 Su nuclei isolati (2 ml di liquido amniotico): per diagnosi di sesso ed anomalie numeriche Y Su villi coriali: per diagnosi di riarrangiamenti cromosomici 21 Su cromosomi metafasici (15 ml di liquido amniotico): per diagnosi di alterazioni cromosomiche strutturali Su fibre (Fiber-FISH): per diagnosi di micro-alterazioni e gene mapping X TRISOMIA 21 Sonde del 7q 3 7 SKY and Multicolor-FISH are molecular cytogenetic techniques that permit the simultaneous visualization of all human (or mouse) chromosomes in different colors, considerably facilitating karyotype analysis. Chromosome-specific probe pools (chromosome painting probes) are generated from flow-sorted chromosomes, and then amplified and fluorescently labeled by degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction. Both SKY and M-FISH use a combinatorial labeling scheme with spectrally distinguishable fluorochromes, but employ different methods for detecting and discriminating the different combinations of fluorescence after in situ hybridization. CGH utilizes the hybridization of differentially labeled tumor and reference DNA to generate a map of DNA copy number changes in tumor genomes. Mutazioni sporadiche con fenotipo severo Microdelezioni con fenotipo severo G6PD sostituzione nucleotidica 5’-CGTG-204 nt 202 G -> A 5’-GAATG-379 nt 376 A -> G G6PD A Sito di restrizione 5’-CATG-204 + NLA III 5’-GGATG-379 + FOK I Omozigote normale NLAIII Omozigote variante Eterozigote Omozigoti var Eterozigote Omozigoti normali Q F-PCR Quantitative Fluorescent-PCR Polimorfismo del Singolo Filamento Esoni 11-13 Esone 6 Genetic Heterogeneity of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency Revealed by Single-Strand Conformation and Sequence Analysis V. Calabro et al. Am. J. Hum. Genet. 52:527-536, 1993 Oligonucleotide Ligation AssayPCR OLA Oligonucleotide-Ligation Assay C G MUTATO * C 5’ P modificato T DNA LIGASI C G T G ELETTROFORESI CAPILLARE ECCITAZIONE LASER RIVELATORE CCD Dispositivo a carica accoppiata A S O La sostituzione nucleotidica A>T responsabile della genesi di un allele “malattia” non genera o abolisce alcun sito di restrizione Gli ASO permettono di determinare il genotipo di qualsiasi locus SNP La diagnosi clinica di una mutazione si ottiene ibridando o sequenziando con oligonucleotidi allele-specifici su microarray Le mutazioni dinamiche Le mutazioni nel locus del morbo di Huntington sono causate dall’espansione di un microsatellite a tripletta ripetuta all’inteno di una regione codificante Distrofia muscolare Facio-Scapolo-Omerale (FSHD) 1:10000 Cromosoma 4 D G G E o TGGE GGGGGGGG Anche la D G G E è una tecnica basata sulla PCR I domini di “melting” sono regioni di una sequenza di DNA caratterizzate da una diversa Tm che dipende dai legami idrogeno ed ancor più dalle interazioni idrofobiche fra le basi impilate del DNA I domini di “melting” sono regioni di una sequenza di DNA caratterizzate da una diversa Tm che può variare dai 65 agli 80°C Il GC-clamp assicura che i due filamenti di DNA rimangano legati anche alla massima temperatura o alla massima concentrazione di denaturante raggiunta. DDGE gel preparation DDGE electrophoretic analysis NGS Next Generation Sequencing 454 genome Sequencer Metodo Solexa “Illumina” THE END
