IL TRAFFICKING VESCICOLARE: DENTRO E FUORI LE CELLULE
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IL TRAFFICKING VESCICOLARE: DENTRO E FUORI LE CELLULE The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013: James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof "for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic, a major transport system in our cells" 13-01-14 La cellula La scoperta della cellula e la teoria cellulare La cellula è l’unità di base in biologia. Ogni organismo è costituito da cellule o è esso stesso un singola cellula 1665 Robert Hook 1668 Antoine van Leeuwenhoek animalcula e cellule del sangue cellulae … 1830 Robert Brown ogni cellula di pianta contiene un nucleo 1838 Matthias Schleider tutti i tessuti delle piante sono costituiti da cellule 1839 Theodor Schwann TEORIA CELLULARE fondamentale somiglianza tra cellule animali e vegetali TEORIA CELLULARE 1. tutti gli organismi consistono di una o più cellule; 2. la cellula è l’unità di base della struttura di tutti gli organismi; 3. tutte le cellule originano da cellule preesistenti (omnis cellula e cellula – 1980) qualsiasi forma di vita ha una base cellulare Gli organismi possono essere suddivisi in: • procarioti (batteri); • eucarioti. eu- autentico, karion nucleo pro- precedente, karion nucleo Cellule procariotiche Cellule eucariotiche Organismi tipici eubatteri ed archeobatteri protisti, funghi, piante e animali Dimensione ~ 1-10 µm ~ 10-100 µm Nucleo avvolto da membrana No Si Organuli No Si Strutture citoplasmatiche Poche Numerose strutture racchiuse da membrana e citoscheletro Endocitosi e endocitosi No Si Modalità di divisione cellulare Scissione Mitosi e meiosi Informazione gentica Molecole di DNA complessate con poche proteine DNA complessato con proteine (particolarmente istoni) a formare i cromosomi Organizzazione solitamente unicellulare Unicellulare, a colonie e in organismi pluricellulari (contenenti cellule specializzate) (adattata da “Il mondo della cellula”, W. M. Becker et al.) Principali caratteristiche di una cellula eucariotica: 1. membrana plasmatica; 2. un nucleo; 3. organuli circondati da membrane; 4. citosol disperso in un citoscheletro; 1) LE MEMBRANE 1972: Sanger e Nicolson - MODELLO A MOSAICO FLUIDO: mosaico di proteine incluse in modo discontinuo, o almeno attaccate, in un doppio strato lipidico fluido CARATTERISTICHE: • costituita da lipidi, proteine e steroli; • organizzata in due strati. 1) le membrane FUNZIONI: 1. delimitare i contorni della cellula e servire da barriera di permeabilità; 2. siti di specifiche funzioni; 3. assicurare e regolare i processi di trasporto; 4. ricevere informazioni dall’ambiente esterno; 5. mediare la comunicazione cellula-cellula. (adattata da “Il mondo della cellula”, W. M. Becker et al.) 1) le membrane La selettività delle membrane e il trasporto 1. delimitare i contorni della cellula e servire da barriera di permeabilità; • mantenere il contenuto separato dal materiale esterno; • avere una selettività di scambio; • non essere solubile in acqua, ma permettere il passaggio dell’acqua. H2O: • 75-85% del peso di una cellula; • molecola polare; • eccellente solvente. A seconda della solubilità delle molecole in acqua possono essere divise in: • idrofile (o polari); • idrofobiche (o apolari); • molecole anfipatiche testa idrofila code idrofobiche 1) LE MEMBRANE La selettività delle membrane e il trasporto molecole idrofile: • molte molecole organiche sono polari (come gli ioni – molecole inorganiche); • altre molecole organiche non hanno carica netta ma regioni di polarità; molecole idrofobiche: • molte molecole inorganiche non hanno regioni polari; • non interagiscono con le molecole d’acqua; • tendono ad interagire tra di loro. molecole anfipatiche: • ad esempio i fosfolipidi di membrana; • esposti ad un ambiente acquoso possono andare incontro ad interazioni idrofobiche. 1) LE MEMBRANE La selettività delle membrane e il trasporto Una membrana è: • molto permeabile alle molecole non polari; • piuttosto impermeabile alle molecole polari. Un soluto in un solvente migra secondo gradiente di concentrazione. Tre tipi di trasporto: 1. diffusione semplice; 2. diffusione facilitata; 3. trasporto attivo. Il trasporto di macromolecole e altre grosse sostanze attraverso la membrana avviene attraverso i fenomeni di endocitosi e esocitosi porzione idrofobica 2) IL NUCLEO • tipico di una cellula eucariotica • esempio della generale strategia della compartimentalizzazione. CARATTERISTICHE e FUNZIONI: • delimitato da una doppia membrana; • contiene e protegge l’informazione genica della cellula; • utilizza i pori nucleari per la comunicazione con il citoplasma. 3) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE 1. Reticolo Endoplasmatico; 2. Complesso di Golgi; 3. Endosomi, lisosomi e perossisomi. Reticolo endoplasmatico (RE) Sistema continuo di sacchetti appiattiti, tubuli e vescicole associate che si estende in tutto il citoplasma della cellula eucariotica RE Rugoso: • presenta i ribosomi attacati al lato citosolico (biosintesi e maturazione delle proteine); • membrane formano sacchetti appiattiti. RE Liscio: • assenza di ribosomi; • membrane formano strutture tubulari; • coinvolto nella detossificazione da farmaci, nel metabolismo dei carboidrati. 2) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE Complesso di Golgi 1898: Camillo Golgi descrive per la prima volta questa struttura • funzione di rielaborare, selezionare ed esportare i prodotti cellulari; • costituito da una serie di cisterne appiattite delimitate da membrana; • composto da due distinte facce. Faccia cis: orientata verso il RE, qui arrivano vescicole provenienti dal RER che trasportano lipidi e proteine di nuova sintesi Faccia trans (o di maturazione): costituito da una serie di tubuli circondati da membrana; da qui gemmano le vescicole di trasporto portando le proteine maturate dal complesso del Golgi ai granuli secretori, agli endosomi, ai lisosomi e alla membrana plasmatica. 2) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE IL TRAFFICKING VESCICOLARE endocitosi esocitosi SUM UP Cellula eucariotica: 1. membrana plasmatica; 2. un nucleo; 3. organuli circondati da membrane Compartimentalizzazione delle funzioni cellulari • migliora l’efficienza di molte funzioni cellulari; • previene la diffusione di molecole dannose. • necessità di scambio di specifiche molecole tra differenti compartimenti; • trasporto molecole da e fuori la cellula. STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Premio Nobel 1974 Claude, Palade, Duve le proteine sono prodotte dai ribosomi sul RER e trasportate al complesso del Golgi 1999 Blobel le proteine portano segnali intrinseci che governano trasporto e localizzazione come le specifiche molecole vengono trasportate verso la loro specifica destinazione? 2013 Schekman, Rothman, Südhof STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Randy W. Schekman – Identificazione dei geni coinvolti nel trafficking vescicolare Saccharomyces cerevisiae è un fungo (eucariote), usato per secoli dagli uomini per fare il pane, la birra e il vino. Primo genoma di organismo eucariotico ad essere sequenziato (1996). CARATTERISTICHE: • organismo unicellulare aploide; • si riproduce per gemmazione e velocemente nei terreni liquidi; • forma colonie clonali sulle piastre di agar; • può essere conservato congelato; • dotato di tutti gli organelli intracellulari. STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Randy W. Schekman Nel 1977 Linnemans et al., mostrano la presenza di un cluster di vescicole a livello della membrana di lievito Schekman ipotizza che queste vescicole servano per il trasporto delle proteine a livello della membrana plasmatica Analizza un serie di mutanti temperatura-sensibili (ts) In questi mutanti la secrezione delle proteine è bloccata alle alte temperature (non permissive) Es. sec 1 e sec 2 bloccano la secrezione e l’assemblaggio della membrana cellulare (Novick and Schekman, PNAS 1979) STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Randy W. Schekman Identificano altri 23 geni divisi in 3 classi, in base al blocco delle vescicole: 1. dal RE; 2. dal complesso di Golgi; 3. a livello della membrana plasmatica Adattata da “Molecular Cell Biology” STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Randy W. Schekman Il merito di Schekman è stato quello di fornire una base genetica ai processi di trasporto e fusione vescicolare, identificandone i geni fondamentali STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman – identificazione delle proteine coinvolte nel processo di fusione 1970: Sviluppa un nuovo approccio in vitro per identificare gli eventi coinvolti nel trasporto vescicolare Come le vescicole gemmano dalle membrane portandosi via solo uno specifico set di proteine (“protein sorting”) e come ogni tipo di vescicola raggiunga una specifica membrana target (“vescicle sorting”). Studio dell’apparato di Golgi: • le cisterne possono essere isolate (Fleischer, 1974); • specializzato nel trasporto delle proteine (Farquhar and Palade, 1981; Rothman, 1981; Tartakoff, 1982); • il trasporto delle proteine può essere seguito grazie alla modificazione mediate da enzimi (glicosiltrasferasi) nei successivi compartimenti STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman Le principali modifiche che avvengono nell’apparato di Golgi sono: 1. aggiunta di acidi grassi nel cis-Golgi; 2. aggiunta di N-acetilglucosammine (GlcNAc) nelle cisterne intermedie; 3. aggiunta di un residuo di galattosio nel trans-Golgi; Saggio cell free: misurare il trasporto di proteine tra le cisterne dell’apparato di Golgi di mammifero (Bach, Rothman et al., Cell, 1984) STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman Con il saggio cell free: • ricostruisce il passaggio della proteina VSV-G all’interno dell’apparato di Golgi • studia la gemmazione e la fusione delle vescicole; • purifica proteine necessarie per il trasporto. STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman Prime proteine identificate NSF e SNAP (Adattata da Chen and Scheller, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001) NSF corrisponde al mutante sec18 SNAP corrisponde al mutante sec17 STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman A livello del sistema nervoso purifica le proteine SNARE (soluble NSF-attachment protein receptor Ipotesi SNARE v-SNARE t-SNARE (Adattata da Chen and Scheller, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001) STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE James E. Rothman Rothman con i suoi studi biochimici ha spiegato il meccanismo di trasporto e fusione delle vescicole, proponendo inoltre un modello per la specificità di questo sistema STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione Come viene controllata la fusione delle vescicole sinaptiche? NEURONI: • cellule del sistema nervoso; • formate da un soma, dendriti e assone; • cellule eccitabili; • trasmettono le informazioni tramite impulsi nervosi STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione Come viene controllata la fusione delle vescicole sinaptiche? L’impulso nervoso dal soma raggiunge il terminale assonale e genera una serie di eventi che portano al rilascio del neurotrasmettitore. La fusione delle vescicole deve essere finemente regolata. STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione 1995: Südhof studia come vengono trasmessi i segnali da una cellula nervosa ad un’altra e come il Ca2+ controlla questo processo Complexina e synaptotagmina sono importanti nella fusione Topi complexina deleti mostrano difetti nella efficienza di rilascio del neurotrasmettitore a causa della ridotta sensibilità al calcio La complexina previene la fusione costitutiva (Südhof, Cell, 2013) Südhof identica anche Munc13 come sec-1 La synaptotagmina-1 agisce come sensore del calcio permettendo il rapido rilascio del neurotrasmettitore STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione Le scoperte di Südhof hanno permesso di capire come la fusione delle vescicole viene controllata temporalmente e come i livelli di calcio controllino il rilascio del neurotrasmettitore L’IMPORTANZA DELLA FUSIONE DELLE VESCICOLE IN MEDICINA Il lavoro di Schekman, Rothman e Südhof hanno permesso di capire come la cellula organizza il trasporto di specifiche molecole in specifici compartimenti Difetti in uno qualunque degli step del trasporto e della fusione delle vescicole sono associati con diverse patologie Diabete mellito di tipo 2: caratterizzato sia da difetti nella secrezione di insulina da parte delle cellule del pancreas sia nella traslocazione insulino mediata del trasportatore del glucosio nei tessuti adiposi e muscolari Epilessia: alcune forme sono causate da mutazioni nei geni MUNC-18-1. Inoltre alcune tossine batteriche attaccano specificamente il macchinario di fusione vescicolare (Clostridium botulinum e Clostridium tetani).
