IL TRAFFICKING VESCICOLARE:
DENTRO E FUORI LE CELLULE
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013:
James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof "for their
discoveries of machinery regulating vesicle traffic, a major transport system
in our cells"
13-01-14
La cellula
La scoperta della cellula e la teoria cellulare
La cellula è l’unità di base in biologia. Ogni organismo è costituito da cellule o è esso stesso
un singola cellula
1665
Robert Hook
1668
Antoine van
Leeuwenhoek
animalcula
e cellule del
sangue
cellulae
…
1830
Robert
Brown
ogni cellula di
pianta contiene
un nucleo
1838
Matthias
Schleider
tutti i tessuti
delle piante
sono costituiti
da cellule
1839
Theodor
Schwann
TEORIA
CELLULARE
fondamentale
somiglianza tra
cellule animali
e vegetali
TEORIA CELLULARE
1. tutti gli organismi consistono di una o più cellule;
2. la cellula è l’unità di base della struttura di tutti gli organismi;
3. tutte le cellule originano da cellule preesistenti (omnis cellula e cellula – 1980)
qualsiasi forma di vita ha una base cellulare
Gli organismi possono essere suddivisi in:
• procarioti (batteri);
• eucarioti.
eu- autentico, karion nucleo
pro- precedente, karion nucleo
Cellule procariotiche
Cellule eucariotiche
Organismi tipici
eubatteri ed archeobatteri
protisti, funghi, piante e animali
Dimensione
~ 1-10 µm
~ 10-100 µm
Nucleo avvolto da membrana
No
Si
Organuli
No
Si
Strutture citoplasmatiche
Poche
Numerose strutture racchiuse da
membrana e citoscheletro
Endocitosi e endocitosi
No
Si
Modalità di divisione cellulare
Scissione
Mitosi e meiosi
Informazione gentica
Molecole di DNA complessate con
poche proteine
DNA complessato con proteine
(particolarmente istoni) a
formare i cromosomi
Organizzazione
solitamente unicellulare
Unicellulare, a colonie e in
organismi pluricellulari
(contenenti cellule specializzate)
(adattata da “Il mondo della cellula”, W. M. Becker et al.)
Principali caratteristiche di una cellula eucariotica:
1. membrana plasmatica;
2. un nucleo;
3. organuli circondati da
membrane;
4. citosol disperso in un
citoscheletro;
1) LE MEMBRANE
1972: Sanger e Nicolson - MODELLO A MOSAICO FLUIDO: mosaico di
proteine incluse in modo discontinuo, o almeno attaccate, in un doppio strato
lipidico fluido
CARATTERISTICHE:
• costituita da lipidi, proteine e steroli;
• organizzata in due strati.
1) le membrane
FUNZIONI:
1. delimitare i contorni della
cellula e servire da barriera
di permeabilità;
2. siti di specifiche funzioni;
3. assicurare e regolare i
processi di trasporto;
4. ricevere informazioni
dall’ambiente esterno;
5. mediare la comunicazione
cellula-cellula.
(adattata da “Il mondo della cellula”, W. M. Becker et al.)
1) le membrane
La selettività delle membrane e il trasporto
1. delimitare i contorni della cellula e servire da barriera di permeabilità;
• mantenere il contenuto separato dal materiale esterno;
• avere una selettività di scambio;
• non essere solubile in acqua, ma permettere il passaggio dell’acqua.
H2O:
• 75-85% del peso di una cellula;
• molecola polare;
• eccellente solvente.
A seconda della solubilità delle
molecole in acqua possono
essere divise in:
• idrofile (o polari);
• idrofobiche (o apolari);
• molecole anfipatiche
testa idrofila
code idrofobiche
1) LE MEMBRANE
La selettività delle membrane e il trasporto
molecole idrofile:
• molte molecole organiche sono polari
(come gli ioni – molecole inorganiche);
• altre molecole organiche non hanno
carica netta ma regioni di polarità;
molecole idrofobiche:
• molte molecole inorganiche non hanno
regioni polari;
• non interagiscono con le molecole
d’acqua;
• tendono ad interagire tra di loro.
molecole anfipatiche:
• ad esempio i fosfolipidi di membrana;
• esposti ad un ambiente acquoso
possono andare incontro ad
interazioni idrofobiche.
1) LE MEMBRANE
La selettività delle membrane e il trasporto
Una membrana è:
• molto permeabile
alle molecole non
polari;
• piuttosto
impermeabile alle
molecole polari.
Un soluto in un solvente migra
secondo gradiente di
concentrazione.
Tre tipi di trasporto:
1. diffusione semplice;
2. diffusione facilitata;
3. trasporto attivo.
Il trasporto di macromolecole e altre
grosse sostanze attraverso la
membrana avviene attraverso i
fenomeni di endocitosi e esocitosi
porzione
idrofobica
2) IL NUCLEO
• tipico di una cellula eucariotica
• esempio della generale strategia della compartimentalizzazione.
CARATTERISTICHE e FUNZIONI:
• delimitato da una doppia membrana;
• contiene e protegge l’informazione genica della cellula;
• utilizza i pori nucleari per la comunicazione con il citoplasma.
3) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE
1. Reticolo Endoplasmatico;
2. Complesso di Golgi;
3. Endosomi, lisosomi e perossisomi.
Reticolo endoplasmatico (RE)
Sistema continuo di sacchetti
appiattiti, tubuli e vescicole
associate che si estende in tutto il
citoplasma della cellula
eucariotica
RE Rugoso:
• presenta i ribosomi attacati al lato
citosolico (biosintesi e maturazione
delle proteine);
• membrane formano sacchetti appiattiti.
RE Liscio:
• assenza di ribosomi;
• membrane formano strutture tubulari;
• coinvolto nella detossificazione da farmaci, nel metabolismo dei carboidrati.
2) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE
Complesso di Golgi
1898: Camillo Golgi descrive per la prima
volta questa struttura
• funzione di rielaborare, selezionare
ed esportare i prodotti cellulari;
• costituito da una serie di cisterne
appiattite delimitate da membrana;
• composto da due distinte facce.
Faccia cis: orientata verso il RE,
qui arrivano vescicole provenienti
dal RER che trasportano lipidi e
proteine di nuova sintesi
Faccia trans (o di maturazione): costituito da una serie di tubuli circondati
da membrana; da qui gemmano le vescicole di trasporto portando le
proteine maturate dal complesso del Golgi ai granuli secretori, agli
endosomi, ai lisosomi e alla membrana plasmatica.
2) ORGANULI CIRCONDATI DA MEMBRANE
IL TRAFFICKING VESCICOLARE
endocitosi
esocitosi
SUM UP
Cellula eucariotica:
1. membrana plasmatica;
2. un nucleo;
3. organuli circondati da
membrane
Compartimentalizzazione delle
funzioni cellulari
• migliora l’efficienza di molte funzioni cellulari;
• previene la diffusione di molecole dannose.
• necessità di scambio di specifiche molecole tra differenti compartimenti;
• trasporto molecole da e fuori la cellula.
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Premio Nobel
1974
Claude, Palade,
Duve
le proteine sono prodotte
dai ribosomi sul RER e
trasportate al complesso
del Golgi
1999
Blobel
le proteine portano
segnali intrinseci che
governano trasporto e
localizzazione
come le specifiche molecole
vengono trasportate verso la loro
specifica destinazione?
2013
Schekman,
Rothman,
Südhof
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Randy W. Schekman – Identificazione dei geni coinvolti nel trafficking vescicolare
Saccharomyces cerevisiae è un fungo
(eucariote), usato per secoli dagli
uomini per fare il pane, la birra e il vino.
Primo genoma di organismo eucariotico
ad essere sequenziato (1996).
CARATTERISTICHE:
• organismo unicellulare aploide;
• si riproduce per gemmazione e velocemente nei terreni liquidi;
• forma colonie clonali sulle piastre di agar;
• può essere conservato congelato;
• dotato di tutti gli organelli intracellulari.
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Randy W. Schekman
Nel 1977 Linnemans et al., mostrano la presenza di un cluster di vescicole a
livello della membrana di lievito
Schekman ipotizza che queste vescicole servano per il trasporto delle
proteine a livello della membrana plasmatica
Analizza un serie di mutanti temperatura-sensibili (ts)
In questi mutanti la secrezione
delle proteine è bloccata alle alte
temperature (non permissive)
Es. sec 1 e sec 2 bloccano la
secrezione e l’assemblaggio della
membrana cellulare
(Novick and Schekman, PNAS 1979)
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Randy W. Schekman
Identificano altri 23 geni divisi in 3 classi, in base al blocco delle vescicole:
1. dal RE;
2. dal complesso di Golgi;
3. a livello della membrana plasmatica
Adattata da “Molecular Cell Biology”
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Randy W. Schekman
Il merito di Schekman è stato quello di fornire una base genetica ai processi di
trasporto e fusione vescicolare, identificandone i geni fondamentali
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman – identificazione delle proteine coinvolte nel processo di fusione
1970: Sviluppa un nuovo approccio in vitro per identificare gli eventi coinvolti nel
trasporto vescicolare
Come le vescicole gemmano dalle membrane portandosi via solo uno
specifico set di proteine (“protein sorting”) e come ogni tipo di vescicola
raggiunga una specifica membrana target (“vescicle sorting”).
Studio dell’apparato di Golgi:
• le cisterne possono essere isolate (Fleischer, 1974);
• specializzato nel trasporto delle proteine (Farquhar and Palade, 1981;
Rothman, 1981; Tartakoff, 1982);
• il trasporto delle proteine può essere seguito grazie alla modificazione mediate
da enzimi (glicosiltrasferasi) nei successivi compartimenti
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman
Le principali modifiche che avvengono nell’apparato di Golgi sono:
1. aggiunta di acidi grassi nel cis-Golgi;
2. aggiunta di N-acetilglucosammine (GlcNAc) nelle cisterne intermedie;
3. aggiunta di un residuo di galattosio nel trans-Golgi;
Saggio cell free: misurare il trasporto di proteine tra le cisterne dell’apparato di
Golgi di mammifero
(Bach, Rothman et al., Cell, 1984)
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman
Con il saggio cell free:
• ricostruisce il passaggio della proteina VSV-G all’interno dell’apparato di Golgi
• studia la gemmazione e la fusione delle vescicole;
• purifica proteine necessarie per il trasporto.
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman
Prime proteine identificate NSF e SNAP
(Adattata da Chen and Scheller, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001)
NSF corrisponde al mutante sec18
SNAP corrisponde al mutante sec17
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman
A livello del sistema nervoso purifica le proteine SNARE (soluble NSF-attachment
protein receptor
Ipotesi SNARE
v-SNARE
t-SNARE
(Adattata da Chen and Scheller, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001)
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
James E. Rothman
Rothman con i suoi studi biochimici ha spiegato il meccanismo di trasporto e
fusione delle vescicole, proponendo inoltre un modello per la specificità di questo
sistema
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione
Come viene controllata la fusione delle vescicole sinaptiche?
NEURONI:
• cellule del sistema nervoso;
• formate da un soma, dendriti e assone;
• cellule eccitabili;
• trasmettono le informazioni tramite impulsi nervosi
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione
Come viene controllata la fusione delle vescicole sinaptiche?
L’impulso nervoso dal soma raggiunge il terminale assonale e genera una serie di
eventi che portano al rilascio del neurotrasmettitore.
La fusione delle vescicole deve essere
finemente regolata.
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione
1995: Südhof studia come vengono trasmessi i segnali da una cellula nervosa ad
un’altra e come il Ca2+ controlla questo processo
Complexina e synaptotagmina
sono importanti nella fusione
Topi complexina deleti
mostrano difetti nella efficienza
di rilascio del neurotrasmettitore
a causa della ridotta sensibilità
al calcio
La complexina previene la
fusione costitutiva
(Südhof, Cell, 2013)
Südhof identica anche Munc13 come sec-1
La synaptotagmina-1 agisce
come sensore del calcio
permettendo il rapido rilascio
del neurotrasmettitore
STUDIO DELLA COMPARTIMENTALIZZAZIONE CELLULARE
Thomas C. Südhof – Identificazione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione
Le scoperte di Südhof hanno permesso di capire come la fusione delle vescicole
viene controllata temporalmente e come i livelli di calcio controllino il rilascio del
neurotrasmettitore
L’IMPORTANZA DELLA FUSIONE DELLE VESCICOLE IN MEDICINA
Il lavoro di Schekman, Rothman e Südhof hanno permesso di capire come la
cellula organizza il trasporto di specifiche molecole in specifici compartimenti
Difetti in uno qualunque degli step del trasporto e della fusione delle vescicole
sono associati con diverse patologie
Diabete mellito di tipo 2: caratterizzato sia da difetti nella secrezione di insulina
da parte delle cellule del pancreas sia nella traslocazione insulino mediata del
trasportatore del glucosio nei tessuti adiposi e muscolari
Epilessia: alcune forme sono causate da mutazioni nei geni MUNC-18-1.
Inoltre alcune tossine batteriche attaccano specificamente il macchinario di
fusione vescicolare (Clostridium botulinum e Clostridium tetani).
