Markers enzimatici

Prof. Giorgio Sartor
Corso di Laurea Specialistica in Scienze per l’Ambiente e il Territorio
Misure con biomarcatori
V. Markers enzimatici
Copyright © 2001-2006 by Giorgio Sartor.
Versione 3.0 - gennaio 2006
All rights reserved.
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
Rottura
del DNA
Inattivazione
enzimi
Perossidazione
lipidica
Addotti
del DNA
Addotti
di proteine
Prodotti
di coniugazione
FASE I I
HO—
O2
Fe
H2O + O2
7
5
METABOLITI REATTIVI
1
FASE I
XENOBIOTICI
2
8
O -2
H2O2
COMPOSTI
REDOX
6
O2
4
GSH
GPX
9
GSSG
H2O
NADP+
GR
FADred
Enzimi a
flavina
Ciclo redox
O2
METABOLITI
RADICALICI
3
FADox
NADP+
NADPH + H+
NADPH + H+
Addotti
di proteine
Metabolismo
Addotti
del DNA
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Misure con biomarcatori V
2
1
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
1.
Inattivazione di
Il metabolismo
Rottura
I enzimi
(inclusoPerossidazione
delfase
DNA
lipidica
ossidazione
da
Citocromo P450) può
formare
metaboliti
O2
reattivi.HO—
Fe
H2O +
2.
Il O2 metabolismo
di
7
5
fase I può formare
8
specie
redox
che
H2O2 subire
possono
un O 2
6
ciclo redox.
3. Ciclo
redox O2 che
4
comprende
GSH
GPX
flavoproteine.
9
4. Per
completare
il NADP+
GSSG
GR
ciclo redox si forma
anione
superossido
NADPH + H+
H2O
(O
2 —) e si rigenera il
composto
di
Metabolismo
partenza.
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Addotti
di proteine
Addotti
del DNA
Prodotti
di coniugazione
FASE I I
METABOLITI REATTIVI
1
FASE I
XENOBIOTICI
2
COMPOSTI
REDOX
FADred
Enzimi a
flavina
Ciclo redox
O2
METABOLITI
RADICALICI
3
FADox
NADP+
NADPH + H+
Addotti
di proteine
Addotti
del DNA
Misure con biomarcatori V
3
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
Rottura
del DNA
Inattivazione
enzimi
HO—
O2
Fe
H2O + O2
8
Perossidazione
lipidica
7
5
O -2
H2O2
6
O2
4
GSH
GPX
9
GSSG
H2O
NADP+
GR
NADPH + H+
Addotti
5.
In
del DNA
Addotti
Prodotti
presenza
di ferro l’anione
di proteine
superossido forma di
il coniugazione
radicale
idrossido (Haber-Weiss).
FASE I I
6.METABOLITI
L’anioneREATTIVI
superossido
può
1
dismutare
a H2O
FASE
I 2 ad opera della
superossidodismutasi (SOD).
XENOBIOTICI
7.
In presenza di ferro l’ H2O2
2 forma il radicale idrossido e
ossigeno (Fenton).
COMPOSTI
8.REDOX
L’ H2O2 può essere degradata
+
ad acqua FAD
ad red opera NADP
della
Ciclo redox
Enzimi
a
catalasi (CAT)
o della
glutatione
flavina
perossidasi (GPX).
O2
NADPH + H+
FADox
9.
La glutatione
reduttasi
rigenera
METABOLITI
3
RADICALICI
il glutatione ridotto (GSH) da
quello ossidato (GSSG).
Addotti
di proteine
Metabolismo
Addotti
del DNA
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4
2
Citocromo P450 (CYP)
• Enzima microsomiale, il più versatile tra gli
enzimi di fase I.
• Inducibile.
• Anche conosciuto come ossidasi a funzioni miste
(MFO).
• Proteina che contiene un gruppo eme
– Il complesso formato dal Fe2+ e CO ha uno spettro di
assorbimento con massimo centrato a 450 nm (447452) nm.
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5
CYP
• Ossida gli xenobiotici usando il NADPH come
cofattore e O2
• La reazione procede come ciclo catalitico:
RH+O2+H++NADPH
ROH+H2O+NADP+
• Non è attivo contro tutti i contaminanti
(specialmente gli alogeni)
• In alcuni casi genera prodotti tossici (epossidi)
• L’induzione delle MFO è un sistema di
biomarcatura
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6
3
Struttura del CYP (1PO5)
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7
Struttura del CYP (1PO5)
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Misure con biomarcatori V
8
4
Struttura del CYP (1PO5)
AA basici
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Misure con biomarcatori V
9
Struttura del CYP (1PO5)
Cys436
AA basici
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Misure con biomarcatori V
10
5
Struttura del CYP (1PO5)
Cys436
AA basici
Cavità
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Misure con biomarcatori V
11
Struttura del CYP (1PO5)
Cavità
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Misure con biomarcatori V
12
6
Struttura del CYP (1PO5)
AA polari
AA neutri
Cavità
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Misure con biomarcatori V
13
Struttura del CYP
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Misure con biomarcatori V
14
7
Struttura del CYP
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Misure con biomarcatori V
15
Struttura del CYP
Canfora
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16
8
Struttura del CYP
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Ciclo del CYP
RH
(substrato)
(prodotto) ROH
Fe3+H2O
eFe3+RH
H2O
Fe3+ROH
H2O
Fe2+RH
FeO3+RH
NAD(P)H-citocromo
P450 reduttasi
O2
[Fe2+O2RH]-1
H2O
e-
H+
citocromo b5
H+
[Fe2+OOHRH]-1
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[Fe2+O2RH]-2
Misure con biomarcatori V
18
9
ROH
O
Meccanismo
ciclico del CYP
H
O
RH
H
Fe(III)
R
O
S
(1)
H
Fe(III)
1. P450 acquo Fe(III)
2. P450 canfora Fe (III)
3. P450 canfora CO
Fe(III)
4. P450 prodotto Fe(III)
5. P450 canfora Fe(II)
6. P450 canfora O2Fe(II)
7. P450 ossigeno
attivato Fe(IV)
H
O
OH
S
RH
H2O
H 2O
Fe(III)
(4)
(7)
-
HO
O
O
RH
O
Fe(III)
H+
Fe(II)
S
H+
S
H2O
RH
(2)
O RH
Fe(IV)
e-
S
H2O2
S
2-
O
O2
-
(5)
Fe(II)
O RH
S
O
eFe(II)
H+
RH
S
-
Fe(II)
2-
O
RH
(6)
O RH
Fe(II)
S
(3)
S
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Meccanismo
• L’ossigeno è legato non ad angolo retto.
• Il legame dell’ossigeno allontana il ligando
(RH) solo dopo che I due atomi diossigeno si
sono ridotti il ligando si riavvicina. Ciò
previene la formazione di ROS.
• Gli elettroni per la riduzione dell’ossigeno so
forniti da una proteina Fe-S (P450 batterica o
mitcondriale) o da una NADPH-citocromo P450
ossidoreduttasi
FAD/FMN
dipendente
(microsomi).
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20
10
Meccanismo generale del CYP
H2O
NADP+
CYTP450
Reduttasi
FMNH2/FADH2
NADPH
+ H+
ROH
CYP Fe3+
CYTP450
Reduttasi
FMN/FAD
CYP Fe2+
RH
2H+ + O2
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Meccanismo
• Nel complesso
con la NADPHcitocromo P450
ossidoreduttasi
l’elettrone si
muove
attraverso lo
scheletro della
proteina
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22
11
Struttura del CYP
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23
Colesterolo monoossigenasi
(CYTP450scc - EC 1.14.15.6 - CYP11A)
H2O
H OH
NADP+
NADPH
+ H+
CYTP450
Reduttasi
FMNH2
CYTP450
Reduttasi
FMN
H
Colesterolo
monoossigenasi
Fe3+
H
H
HO
22β-idrossi
colesterolo
Colesterolo
monoossigenasi
Fe2+
H
H
H
H
HO
colesterolo
2H+ + O2
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12
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Idrossilazione di aromatici
Epossidazione di aromatici
Idrossilazione di alifatici
Epossidazione di alcheni
N-dealchilazione
O-dealchilazione
S-sealchilazione
N-ossidazione
N-idrossilazione
S-ossidazione
Ossidazione di aldeidi
Aromatizzazione di
androgeni
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ossidazione dell’alotano
Riduzione dell’alotano
Ossidazione dell’arginina
Taglio della catena laterale
del colesterolo
Deidrogenazione
Dealogenazione
Azoriduzione
Deaminazione
Desolforazione
Idrolisi di ammidi
Idrolisi di esteri
Perossidazione
Denitrazione
Più almeno altre 20
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Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Idrossilazione di atomi di carbonio
alifatici o aromatici
H
N
O
– Da (S)-mefentoina a 4’-idrossi-(S)mefentoina (CYP2C19)
N
O CH3
H3C
H
– Da testosterone a 6α-idrossitestosterone
(CYP3A4)
OH
H
H
H
H
O
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26
13
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Epossidazione di doppi legami
– Da 5-colestene a 5,6β-epossi-5β-colestano
NADPH
NADP+
H
H
H
H
H
+ O 2 + H+
O
H
+ H2O
H
• Ossigenazione di eteroatomi, N-idrossilazione
– Da amine a idrossilamine
– Da omeprazolo to solfone (CYP3A4)
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Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Dealchilazione di eteroatomi
– O-dealchilazione (da destrometorfano a destrorfano)
– N-demetilazione della caffeina
CH3
destrometorfano
H N
O
H3C
N
caffeina
H
N
H3C O
H3C
CH3
destrorfano
H N
H
N
O
N
CYP2E1
CYP1A2
O
N
CH3
CH3
CYP2E1
CYP2D6
N
N
N
H
O
H
O
N
H3C
N
N
CH3
teobromina
N
N
O
N
CH3
N
N
CH3
O
CH3
O
teofillina
H
HO
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paraxantina
Misure con biomarcatori V
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14
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Trasferimento di
gruppo per via
ossidativa
– N, S, X
rimpiazzato con O
O
H 3C
O
P
N
+O
O
O
H3C
P
CH3
F
O
OO
CH3
F
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O
S O
• Da parathion a
paroxon (da S a O)
• Attivazione
dell’alotano a
trifluoroacetilcloruro
+O
N
F
O
Br
F
F
Cl
F
CH3
Cl
Misure con biomarcatori V
29
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Scissione di esteri
– Scissione del gruppo funzionale con O nel gruppo
uscente
• Da loratadina a lorantadina desacetilata (CYP3A4, 2D6)
• Deidrogenazione
– Astrazione di due H con formazione di C=C
• Attivazione di acetaminofene al metabolita epatotossico Nacetilbenzochinoneimina
OH
O
H3C
O
O
N
H3C
N
H
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Misure con biomarcatori V
30
15
La famiglia del
Citocromo P450
• Ha molti membri:
– 450 nel riso, 57
nell’uomo, 84 nel
topo, 10 nella
Chlamodymonas
• Filogenesi
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Misure con biomarcatori V
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Induzione
• Meccanismo attraverso il quale uno stimolo
esterno alla cellula provoca come risposta la
produzione di una o più proteine o, comunque,
una attivazione della sintesi proteica:
– CYP
– HSP
– Stress
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16
Un gene
+ (senso)
filamento
PROMOTORE
GENE
introne 1
5’
esone 1
introne 2
esone
2
3’
3’
esone
3
5’
U (RNA)
C T pirimidine
|||
||
G A purine
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Misure con biomarcatori V
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Il DNA fa RNA che fa PROTEINA
+ (senso)
filamento
PROMOTORE
GENE
introne 1 introne 2
5’
3’
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esone 1
RNApol
esone 2
esone 3
3’
5’
Misure con biomarcatori V
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17
Trascrizione
+ filamento
introne 1 introne 2
5’
esone 1
esone 2
3’
esone 3
3’
RNApol
Pre-mRNA
5’
3’
5’
Il filamento complementare dà una COPIA del GENE.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
35
Splicing
3’
RNApol
5’
3’
5’
Pre-mRNA
splicing
3’
5’
mRNA
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
36
18
Traduzione
3’
5’
mRNA
proteina
NH2
M
S
TRADUZIONE
t RNA
G
3’
5’
mRNA
RNA Ribosomiale
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
37
MAPK
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
38
19
MAPK
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
39
Il paradigma
Xenobiotico
Attivazione del gene
per CYP
Metabolismo
dello xenobiotico
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
Espressione di CYP…
40
20
CYP1A1 e recettori per idrocarburi
aromatici
• CYP1A1 non è espressa costitutivamente nel
fegato di ratto.
• CYP1A1 è indotta da idrocarburi policiclici
– Benzo(α)pirene, TCDD (diossine).
– Farmaci (omeprazolo, inibitore delle pompe
protoniche).
• Meccanismo – up-regulation trascrizionale.
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Misure con biomarcatori V
41
Induzione CYP1
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Misure con biomarcatori V
42
21
Induzione CYP2-4 (e 7)
Regolata da recettori nucleari
Regione
cardine
A/B
C
Sito di legame del
DNA
(Zn2+ fingers)
D
E
F
Sito di
legame del
ligando
I recettori nucleari sono una superfamiglia
di proteine
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Misure con biomarcatori V
43
Dominio zinc-fingers
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
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22
Dominio zinc-fingers
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
45
Dominio zinc-fingers
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
46
23
Recettori nucleari
I recettori nucleari sono fattori di trascrizioni attivati dai ligandi
Ligando
NR1
NR2
espressione
+/
-
Ligando
NR
NR
Elemento
di risposta
DNA
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GENI
Misure con biomarcatori V
47
Recettori nucleari
•
Recettori per gli steroidi
•
Recettori per altri ligandi
– GR: recettore per i glucocorticoidi
– RXR: recettore per X retinoide
– MR: recettore per i
mineralocorticoidi
– RAR: recettore per acido retinoico
– AR: recettore per glia androgeni
– ER: recettore per gli estrogeni
•
gs © 2001-2006 ver 3.1
– TR: recettore per l’ormone tiroideo
– VDR: recettore per la vitamina D
?
•
PXR: recettore per X pregnano
•
CAR: recettore constitutivo attivato
Misure con biomarcatori V
48
24
Recettori nucleari
• I recettori nucleari si legano
ad uno specifico elemento di
risposta
• Generalmente 2 mezzi siti di
legame correlati con AGGTCA
• Sono i recettori per gli ormoni
steroidei (GR, MR ecc...)
AGGACANNNTGTACC
TCCTGTNNNACATGG
• Si lega come omodimero
• Sequenza palindromica
imperfetta
• Separati da 3bp
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Misure con biomarcatori V
49
Heat Shock Proteins
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
50
25
Classificazione delle HSP
Famiglia
Nome
hsp 100
hsp 110
hsp 104
grp 100
hsp 90
grp 94
hsp 70
hsc 70
grp 78
mtp 70
hsp60
hsp 58
hsp 40
hsp 90
hsp 70
hsp 60
hsp 40
hsp 30
Piccole hsp
Ubiquitina
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hsp 32
hsp 35
hsp 27
hsp42p
hsp 10
Ubiquitina
Altri nomi
Localizzazione
subcellulare
Livello di espressione
Normale
Stress
hsp 82, HtpG
Erp90
hsp 72, DnaK
hsp 73
BIP, Kar2p
Ssc1p, grp 75
GroEL, cpn60
HuCHa 60
DnaJ, hdj-1
Nucleo/nucleolo
citosol
ER/Golgi
Citosol/nucleo
ER
Citosol/nucleo
Citosol/nucleo
ER
Mitocondrio
Citosol
Mitocondrio
Citosol/nucleo
+
+
+
++
+
++
++
+
+
+
+
eme-ossigenasi
G3PDH
α-cristallino
Citosol
Citosol
Citosol/nucleo
GroES, cpn-10
Mitocondrio
Citosol
+
+
+
+
+
+
++
+++
++
+++
++
+++
?
+++
++
+
+
++
++
++
++
?
++
++
++
Misure con biomarcatori V
51
Ruolo costitutivo delle HSP
• Le HSP presenti costitutivamente nelle
cellule hanno un ruolo fondamentale nei
processi fisiologici di ripiegamento
trasferimento e degradazione delle
proteine.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
52
26
Ruolo citoprotettivo delle HSP
• Il ruolo delle HSP indotte in cellule
sottoposte ad insulto è quello di
minimizzare i danni arrecati ai processi
di:
– sintesi,
– traslocazione
– ripiegamento
• di proteine cellulari.
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Misure con biomarcatori V
53
Risposta heat shock
• La risposta heat shock è un evento comune a
tutti gli organismi, caratterizzato
dall’aumentata sintesi di HSP in risposta ad
un numero molto elevato di stimoli:
– aumento di temperatura,
– ipossia,
– shock osmotico,
– metalli pesanti, ischemia,
– invecchiamento
–…
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
54
27
Turn-over delle proteine
• Le proteine cellulari vengono regolarmente degradate e
risintetizzate.
• Il tempo di semi-vita di un enzima nel fegato di ratto
varia da 10 minuti a una settimana.
• In media il tempo di semi-vita di una proteina è
correlato con il residue N-terminale:
– Proteine con N-terminale come Met, Ser, Ala, Thr,
Val, o Gly hanno un tempo di semi-vita maggiore di
20 ore.
– Proteine con N-terminale Phe, Leu, Asp, Lys, o0 Arg
hanno un tempo di semi-vita di 3 minuti o meno.
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Misure con biomarcatori V
55
Turn-over delle proteine
• È stato dimostrato che le proteine ricche in Pro
(P), Glu (E), Ser (S) and Thr (T), chiamate
proteine PEST, sono degradate più
rapidamente che le altre proteine.
• La degradazione di specifiche proteine può
essere regolata:
– Negli eucarioti il ciclo cellulare è controllato, alcuni
enzimi regolatori del ciclo sono degradati in fasi
particolari del ciclo cellulare in risposta a segnali
intra o extra-cellulari.
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Misure con biomarcatori V
56
28
Proteolisi: meccanismo generale
n
n+1
n
n+1
R''
O
R''
O
H
H
NHR
H
N
NHR
Nu+
CR''
R'
H
N
H
R' R
CR''
H
H
Nu:
H
R
n
n+1
n
R''
O
H
OH
R''
H
H
NHR
n+1
O
N
H
H
NHR
Nu
CR''
R'
R'
H
R
H
H2O
R
gs © 2001-2006 ver 3.1
H
CR''
H
Nu:
N
Misure con biomarcatori V
57
Enzimi proteolici
• Classi di enzimi proteolitici:
– Proteasi a serina: enzimi digestivi come tripsina,
chimotripsina, elastasi...
– Differiscono nella specificità del substrato:
• Chimotripsina: privilegia il taglio del legame peptidico nel
quale l’AA che impegna il C=O ha una catena laterale.
• Tripsina: preferisce un AA carico positivamente (Lys o
Arg) nella stessa posizione.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
58
29
Enzimi proteolici: proteasi a serina
• Il sito attivo (tripsina bovina
3BTK) è fatto da un residuo di
serina (Ser195), uno di istidina
(His57) e uno di aspartato
(Asp102).
• Durante la catalisi vi è un
attacco nucleofilo del OH della
serina sul carbonio del
carbonile del legame peptidico
che deve essere tagliato.
• Durante la reazione un H+ è
trasferito dalla serina all’anello
imidazolico dell’istidina,
l’aspartato forma un legame H
con l’istidina.
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Misure con biomarcatori V
59
Enzimi proteolici: proteasi a aspartato
• Le
–
–
–
–
proteasi ad aspartato comprendono:
La pepsina (enzima digestivo).
Alcune proteasi lisosomiali.
L’enzima renale renina.
Le proteasi dell’HIV.
• Due residui di aspartato sembra partecipino alla catalisi
acido/base nel sito attivo.
• Un aspartato accetta H+ da una molecola di H2O nel sito
attivo che attacca il carbonio carbonilico del legame
peptidico.
• Simultaneamente l’atro aspartato cede l’H+ all’ossigeno
del carbonile del legame peptidico.
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Misure con biomarcatori V
60
30
Enzimi proteolici: metallo proteasi
• Appartengono alla classe delle proteasi a Zinco
(metalloproteasi):
– La carbossipeptidasi (enzima digestivo).
– Le metalloproteasi della matrice (collagenasi),
coinvolte nella degradazione della matrice extra
cellulare durante la crescita dei tessuti.
– Una proteasi lisosomiale.
• Nel sito attivo è presente uno zinc binding motif, con
due residui di istidina il cui imidazolo complessa lo ione
Zn++.
• Nella catalisi lo Zn++ interagisce con l’ossigeno del C=O
promuovendo l’attacco nucleofilo dell’ossigeno di una
molecola di acqua nel sito attivo al carbonio del C=O.
• Nella carbossipeptidasi un residuo di glutamato facilita
la reazione estraendo un H+ dall’acqua.
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Misure con biomarcatori V
61
Enzimi proteolici: proteasi a cisteina
• Appartengono alla classe delle proteasi a Cisteine:
– La papaina (della Carica Papaya).
– Alcune protesi lisosomiali (catepsine).
– Le caspasi che si occupano della degradazione delle
proteine dell’apoptosi (morte cellulare
programmata).
• Le proteasi lisosomiali a cisteina sono omologhe alla
papaina. Sono una famiglia molto grande con svariata
specificità di substrato.
• Le caspasi tagliano il lato carbossilico di un aspartato.
• Il meccanismo delle proteasi a cisteina si pensa che
coinvolga la deprotonazione del SH di una cisteina da
parte di un residuo vicino di istidina seguito da un
attacco nucleofilo dello zolfo al carbonio carbonilico.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
62
31
Attivazione delle proteasi
• Attivazione delle proteasi:
• La maggior parte delle protesi sono sintetizzate come
proenzimi di maggiori dimensioni.
• L’attivazione consiste nella rimozione di un segmento
inibitorio nel proenzima.
• L’attivazione può avvenire dopo che la proteasi è stata
secreta nell’apposito compartimento cellulare o nella
matrice extracellulare.
• In alcuni casi (attivazione dell’apoptosi) l’attivazione
può essere a cascata e portare all’attivazione di proteasi
specifiche.
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Misure con biomarcatori V
63
Degradazione delle proteine
• Ci sono tre principali sistemi di degradazione delle
proteine (nel muscolo):
– Ubiquitina-proteosoma
• Le proteine sono marcate per la degradazione da unità di
ubiquitina.
• I proteosoma 20S inattivo viene attivato da una proteina
regolatrice diventando proteosoma 26S
• Il proteosoma 26S rompe la proteina in peptidi
– I peptidi sono scissi in aminoacidi liberi da altri processi nella
cellula
– Lisosomi
• Le proteine entrano nei lisosomi via endocitosi
– La catepsina e le proteinasi degradano i legamo peptidici.
– Calpaina
• Proteasi attivate da calcio nel citosol della cellula
– I differenti isomeri sono attivati da differenti concentrazioni di
calcio.
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Misure con biomarcatori V
64
32
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Ubiquitina:
– Le proteine sono marcate per la proteolisi
selettiva dall’ubiquitina, una proteina ubiquitaria
altamente conservata.
– Si forma un legame isopeptidico tra il
carbossiterminale dell’ubiquitina e un gruppo NH2
di una lisina della proteina da degradare.
• Il processo è ATP dipendente.
• Sono coinvolti tre enzimi (E1, E2 e E3).
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
65
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Inizialmente il carbossiteminale dell’ubiquitina è legato con un
legame tioestere al Ubiquitin-Activating Enzyme (E1)
attraverso una reazione ATP dipendente
• L’ubiquitina vien quindi trasferita ad un gruppo sulfidrilico del
Ubiquitin-Conjugating Enzyme (E2).
• Una Ubiquitin-Protein Ligase (E3) trasferisce l’ubiquitina
attivata al gruppo ε-amino dui una lisina formando un legame
isopeptidico.
• Ci sono diverse ligasi dell’ubiquitina che differiscono per la
specificità.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
66
33
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Più ubiquitine sono
legate per formare una
catena.
• Il carbossiterminale
forma un legame con il
gruppo ε-amino della
Lys48 di una catena
adiacente di ubiquitina.
H2N
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COOH
Misure con biomarcatori V
67
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella
regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza
chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del
corrispondente E3.
• L’interazione dell’ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è
regolata , in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina
bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici.
H2N
gs © 2001-2006 ver 3.1
COOH
Misure con biomarcatori V
68
34
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• La degradazione selettiva di una proteina avviene nel proteosoma.
Un complesso proteico presente nella cellula.
• Il core complex del proteosoma, ha un coefficiente di
sedimentazione di 20S ed è costituito di 14 subunità di due tipi
(α7β7).
– Le sette subunità α formano un anello a struttura cilindrica.
– Le sette subunità β formano l’anello centrale.
α
α7β7
{β
1JD2
β
α7β7
{α
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Misure con biomarcatori V
69
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Il core complex del proteosoma racchiude una cavità fatta di
tre compartimenti collegati da uno stretto passaggio.
• L’attività proteasica è associata a tre delle subunità β ognuna
con differente specificità per il substrato.
α
β
β
α
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Misure con biomarcatori V
70
35
Sistema Ubiquitina-proteosoma
1. Una subunità β ha una attività simile alla chimotripsina
con preferenza per Tyr o Phe come AA al carbonile del
legame peptidico.
2. Una subunità β ha una attività simile alla tripsina con
preferenza per Arg o Lys al carbonile del legame
peptidico.
3. Una subunità β ha una attività post-glutamil con
preferenza per glutamato o altro residuo acido.
•
•
Non sono coinvolti residui di cisteina o serina.
L’attività idrolasica del proteosoma costituisce una
famiglia di proteasi a treonina.
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Misure con biomarcatori V
71
Sistema Ubiquitina-proteosoma
•
•
•
•
Nella struttura del core
complex del proteosoma non ci
sono apparenti aperture verso
l’esterno.
Si è postulata l’interazione con
un cap complex che apra il
passaggio verso l’esterno.
È stato cristallizzato il core
complex 20S del proteosoma
con il cap complex 11S.
L’interazione del cap complex
11S altera la conformazione
del dominio N-terminale delle
subunità α del core complex
permettendo l’accesso
dall’esterno.
1FNT
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Misure con biomarcatori V
72
36
Determinazione
• Western blotting:
– anticorpo specifico
– sviluppo di chemioluminescenza
Ab2°
ECL
Ab1°
Proteina
LUCE
Nitrocellulosa
Lastra
fotografica
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Misure con biomarcatori V
73
Acetilcolinesterasi
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
74
37
Aceticolina
O
H3C
O
CH3
+ CH3
N
CH3
• È stato il primo neurotrasmettitore ad esser identificato
– da Otto Loewi nel 1921, attraverso la stimolazione del
nervo vago nelle rane che, era noto, causa il rallentamento
del battito cardiaco.
– Raccolse il fluido circostante il cuore stimolato e lo applicò
ad un cuore non stimolato osservandone il rallentamento.
– Attribuì l’effetto ad un prodotto chimico che in seguito
identificò come acetilcolina.
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Misure con biomarcatori V
75
Recettori per l’acetilcolina
• Due tipi:
• Recettori Nicotinici
– Canali ionici,
– Rispondono rapidamente ed hanno effetto
eccitatorio
– Bloccati dal curaro
• Recettori Muscarinici
–
–
–
–
Accoppiati alla proteina G
Rispondono lentamente
Possono essere sia eccitatori che inibitori
Bloccati da atropina e scopolamina.
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Misure con biomarcatori V
76
38
Il recettore nicotinico per l’acetilcolina
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
77
Recettori muscarinici
O
H3C
• Acetilcolina
H3C
N
+
O
H3C
CH3
4.44 A
• Muscarina
H3C
H3C
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
OH
CH3
N
+
O
CH3
78
39
Recettori nicotinici
O
H3C
H3C
• Acetilcolina
N
+
O
H3C
CH3
5.59 A
• Nicotina
N
N
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
79
Aceticolinesterasi (AChE) EC 3.1.1.7
• È l’enzima che si occupa di degradare l’acetilcolina per
evitare una sovrastimolazione.
CH3
+ CH3
O
CH3
+ CH3
N
H3C
O
gs © 2001-2006 ver 3.1
CH3
N
HO
Misure con biomarcatori V
CH3
O
+H C
3
O
80
40
Siti di azione degli insetticidi neurotossici
Canali del Ca++, Calmodulina
ATPase Na+
Ca++
K+
Corpo cellulare del neurone
(organoclorurati, piretrine)
gs © 2001-2006 ver 3.1
Cl- (GABA)
Sinapsi (anticolinesterasici)
Misure con biomarcatori V
81
Trasmissione del segnale nervoso
+
+ Na+
— —
+
—
—
—
+
—
+
Colinesterasi
+
+ +
—
+— +
—
—
K+ +
—
+ —
+ +
—
+ —
—
—
+ +
+ —
+
—
+—
— +
—
+
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
82
41
Trasmissione del segnale nervoso
+
—
+ Na+
—
+
—
+ — —
Colinesterasi
+ — + —+ +
+— +
—
—
+
—
K+
+ —
+ +
—
+ —
—
—
—
+ +
+ —
+
—
+—
— +
—
+
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
83
Trasmissione del segnale nervoso
+
+ Na+
— —
+
—
—
—
+
No Colinesterasi
—
+
+
+
+
+— + —
—
—
—
K+ +
+ —
+ +
—
+ —
—
—
+ +
+ —
+
—
+—
— +
—
+
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
84
42
Aceticolinesterasi
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
85
Acetilcolina e acetilcolinestrasi
Glu327
-
His440 Ser200
+
HO
H3C
H3C
+
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
CH3
O
N
O
Misure con biomarcatori V
86
43
Acetilcolina e acetilcolinestrasi
Glu327
-
His440 Ser200
+
O HO
O
H3C
H3C
CH3
+
N
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
87
Colina e acetilcolinestrasi acetilata
Glu327
-
His440 Ser200
+
O
O
H3C
H3C
N
+
CH3
OH
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
88
44
Colina e acetilcolinestrasi acetilata
Glu327
-
His440 Ser200
+
HO
H3C
H3C
N
O
OH
+
O
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
CH3
Misure con biomarcatori V
89
Acetilcolinestrasi fosforilata
Glu327
-
His440 Ser200
+
O
H3 C
H3C
P
O
RO
RO
+
N
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
CH3
O
Complesso stabile che
può essere scisso da
ossime
O
Misure con biomarcatori V
90
45
Acetilcolinestrasi fosforilata
Glu327
-
His440 Ser200
+
O
O
P
P
O
RO
RO
RO
RO
OH
OH
N
R
Complesso stabile che
può essere scisso da
ossime
N
R
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
91
Acetilcolinestrasi fosforilata
Glu327
-
His440 Ser200
+
O
P
O
RO
HO
HO
OH
N
R
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
R
La dealchilazione porta
alla stabilizzazione del
complesso
92
46
Agenti anticolinestrasici
• Inizialmente sviluppati come arma chimica
• Gas nervini
CH
CH
O
3
– Tabun, Sarin
N
H3C
O
O
H3C
3
O
P
CN
H3C
H
O
H3C
P
F
• Insetticidi organofosfati
O
N
– Malathion, parathion
+
O
CH3
O
H3C
P
S
O
S
H3C
O
O
H3C
O
CH3
O
O
O
P
S
O
CH3
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
93
Acetilcolinesterasi e Sarin
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
94
47
Tossicità selettiva
CH3
O
Malathion
P
H3C
S
O
S
O
O
H3C
CH3
O
O
VELOCE (mammiferi)
LENTO (insetti)
VELOCE
(insetti e mammiferi)
CH3
Malaoxon
O
P
H3C
O
O
S
H3C
METABOLITI
INATTIVI
O
VELOCE (mammiferi)
LENTO (insetti)
O
O
CH3
O
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
95
Inibitori dell’aceticolineterasi
R
R
H3C
Y
P
Y
z
Struttura generale
• R = catena idrocarburica
• Z = gruppo organico
• Y=SoO
H3C
S
O
O
NO2
P
O
Parathion
• Organofosfati
– Poco costosi e poco tossici verso le specie non bersaglio.
– Più solubili in acqua del DDT, più degradabili e meno
persistenti.
– Veleno del SN.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
96
48
Degradazione del parathion®
O
+
N
O
O
N
+
O
H3C
OH
O
P
O
O
H3C
P
S
O
parathion
H3C
O
P
O
O
CH3
O
O
paraoxon CH
3
CH3
O
dietilfosfato
O
+
O
N
OH
4-nitrofenolo
NH2
H3C
O
S
H 3C
O
P
O
OH
P
O
dietiltiofosfato CH3
SO
idrochinone
OH
CH3
NH2
aminoparathion
HO
4-aminofenolo
gs © 2001-2006 ver 3.1
OH
Misure con biomarcatori V
97
Determinazione
• L’enzima idrolizza l’acetilcolina in colina e
acido acetico rimuovendola così dalle fessure
sinaptiche
H3C
N
+
CH3
O
H3C CH
3
H3C
N
+
OH
+
H3C CH
3
O
CH3
O
O
• Viene valutata l’idrolisi dell’acetiltiocolina
(metodo di ELLMAN)
H3C
N
+
H3C CH
3
gs © 2001-2006 ver 3.1
CH3
S
O
H3C
N
+
H3C CH
3
Misure con biomarcatori V
SH
+
CH3
O
O
98
49
Reazione di ELLMAN
H3 C
H3 C
+
SH
H3C CH
3
S
+
O
S
N
H3C CH
3
O
N
N
N
S
+
O
O
S
O
N
+
O
O
O
O
O
ditiobisnitrobenzoato, DTNB
N
SH
O
O
Assorbimento a 412 nm
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
99
GSH
• Il glutatione è un tripeptide formato da
glicina, cisteina, acido glutamico.
SH
O
O
N
H
O
NH2
GLU
gs © 2001-2006 ver 3.1
H
N
O
O
O
CYS
Misure con biomarcatori V
GLY
100
50
Coniugazione con il GSH
• Due tipi di reazione con il GSH
– Spiazzamento di alogeni, solfati, solfonati, fosfati,
nitrogruppi
– Il glutatione viene addizionato a doppi legami attivati
(epossidi) come nella sintesi delle prostaglandine.
• Substrati:
– Idrofobici che contengono un elettrofilo
– Possono reagire non enzimaticamente
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
101
Coniugazione
SH
O
O
RX +
N
H
O
NH2
O
H
N
O
O
glutatione S-transferasi
EC 2.5.1.18
NH2
HX +
O
O
H
N
O
O
N
H
O
O
S
R
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
102
51
Glutatione S-transferasi – EC 2.5.1.18
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
103
Glutatione S-transferasi
EC 2.5.1.18 (1A0F)
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
104
52
Glutatione S-transferasi
• Glutatione-S-transferasi microsomiale e
citosolica
• Almeno quattro classi di glutatione-Stransferasi (α, β, γ, δ), diversi isoenzimi
inducibili.
CH3
– Induttori (3-metilcolantrene, fenobarbital,
corticosteroidi, anti-ossidanti)
– La sovraespressione porta a resistenza (insetti
DDT resistenti, piante resistenti all’atrazina,
cellule tumorali resistenti alla chemioterapia)
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
105
Eliminazione dei composti coniugati con il
GSH
• Escrezione dei glutatione-coniugati:
– Intatti nella bile
– Convertiti in acido mercapturico nei reni ed escreti
nelle urine
• γ-glutamiltransferasi, aminopeptidasi M
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
106
53
γ-glutamiltransferasi
SR
O
O
O
H
N
+
O
N
H
O
H2O
O
NH2
γ -glutamiltransferasi
EC 2.3.2.2
O
O
SR
NH2
+
N
H
O
O
O
NH2
Glutamato
R-S-alanilglicina
gs © 2001-2006 ver 3.1
O
O
Misure con biomarcatori V
107
Metallotioneine
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
108
54
Metallotioneine
• Le metallotioneine (MT) sono peptidi e
proteine ubiquitarie a basso peso molecolare
ad alto contenuto in aminoacidi solforati e
metalli.
• Si ipotizza che giochino un ruolo:
– nella fissazione dei metalli in tracce (Zn++, Cu++),
– nel controllare la concentrazione di questi ioni,
– nella regolazione dei flussi degli ioni ai distretti
cellulari,
– nella neutralizzazione dei metalli tossici (Cd++, Hg++)
e nella protezione dallo stress indotto dai metalli.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
109
Distribuzione
• Le metallotioneine sono presenti in tutti gli organismi:
animali, vegetali e microrganismi.
• Negli animali queste proteine posseggono polimorfismo
genetico e sono abbondanti nei tessuti parenchimali
(fegato, rene, pancreas e intestino).
• La loro concentrazione dipende da specie, tessuto, età,
sesso ed altri fattori non ancora completamente
identificati
• Nonostante che le metallotioneine siano proteine
citoplasmatiche si sono trovate accumulate nei lisosomi
e nel nucleo.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
110
55
Trasporto di metallotioneine
• Schema ipotetico del
trasporto di metalli pesanti
attraverso l’epitelio
branchiale di molluschi
bivalvi.
– M: metalli in traccia;
– MT: metallotioneine.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
111
Turnover delle metallotioneine
• Schema del turnover
di MT in cellule di
molluschi bivalvi (Isani
et al., 2000).
– M: Metalli;
– MTF: Fattori di
Trascrizione;
– MTI: Inibitori di
Trascrizione.
gs © 2001-2006 ver 3.1
Misure con biomarcatori V
112
56
Classificazione
• Il nome deriva dal fatto che hanno
un alto contenuto di zolfo e metalli.
Tale contenuto varia a secondo del
metallo (fino ad oltre il 20% in peso)
• Nei mammiferi sono caratterizzate
da un peso molecolare di 6000-7000
Da, contengono da 60 ad 68 amino
acidi di cui 20 Cys che legano 7
equivalenti
di
ione
metallico
bivalente. Mancano di aminoacidi
aromatici. Tutte le Cys sono in
forma ridotta e sono coordinate con
ioni metallici.
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Classificazione – Le metallotioneine
• La superfamiglia delle the metallotioneine è definita
come quella che comprende i peptidi che assomigliano
alla metallotioneina renale equina che ha le seguenti
caratteristiche:
– Basso peso molecolare
– Composizione:
• Alto contenuto in Cys, basso contenuto in aromatici.
• Sequenza caratteristica.
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Classificazione – Le famiglie
• Una famiglia di metallotioneine è caratterizzata da una
particolare sequenza ed è legata ad una o più specie.
– I membri di una determinata famiglia appartengono solo a
quella e si pensa siano correlati da un punto di vista
evoluzionistico
– Ogni famiglia è identificata da un numero e dalla specie.
– Per esempio: Famiglia 1: vertebrati.
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Classificazione
• Le sottofamiglie
– Si definiscono sottofamiglie di metallotioneine quegli
insiemi di proteine che oltre i caratteri propri delle famiglie
condividono un insieme di caratteri più stringenti.
– Per esempio: m1, m2…
• I sottogruppi
– Un sottogruppo rappresenta un insieme di sequenza
correlate filogeneticamente. In un albero filogenetico
rappresentano un ramo.
– Per esempio: m2U2 = MT-2 di ungulati, sottogruppo della
sottofamiglia m2.
• Le isoforme
– Sono i membri di sottogruppi, sottofamiglie e famiglie.
– Per esempio MT-1E umana.
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58
Classificazione – I clan
• Un clan è un insieme di proteine che dividono delle
caratteristiche non già definite:
–
–
–
–
–
Struttura,
Proprietà termodinamiche,
Affinità per i metalli
Proprietà funzionali
…
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Sequenza
Misure con biomarcatori V
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Famiglia
Caratteristiche
Sottofamiglie
K-x(1,2)-C-C-x-C-C-P-x(2)-C
1
vertebrati
Da 60 a 68 AA; 20 Cys (21 in un caso), 19 totalmente
conservate; due domini strutturali, contenenti 9 e 11 Cys
che legano 3 e 4 ioni bivalenti rispettivamente. Il gene è
composto di 3 esoni, 2 introni
m1, m2, m3, m4, m, a,
a1, a2, b, ba, t
C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-Cx(3)-C-x-C-K
2
molluschi
Da 64 a 75 AA; da 18 a 23 Cys, minimo 13 totalmente
conservate; due domini
mo1, mo2, mog, mo
P-[GD]-P-C-C-x(3,4)-C-x-C
3
crostacei
da 58 a 60 AA; esistono varianti con e senza Met Nterminale; 18 Cys totalmente conservate; due domini,
ognuno con 9 Cys che legano 3 ioni bivalenti
c1, c2, c
4
echinodermi
Da 64 a 67 AA; 20 Cys ; due domini strutturali,
contenenti 9 e 11 Cys che legano 3 e 4 ioni bivalenti
rispettivamente
e1, e2
Da 40 a 43 AA; 10 Cys conservate
d1, d2
62 e 74 AAs; 18 Cys, contiene una Tyr
n1, n2
P-D-x-K-C-[V,F]-C-C-x(5)-C-x-Cx(4)-C-C-x(4)-C-C-x(4,6)-C-C
C-G-x(2)-C-x-C-x(2)-Q-x(5)-Cx-C-x(2)D-C-x-C
5
ditteri
K-C-C-x(3)-C-C
6
nematodi
una sequenza
7
ciliati
C-G-C-S-x(4)-C-x-C-x(3,4)-C-xC-S-x-C
8
funghi I
C-X-K-C-x-C-x(2)-C-K-C
105 AA, 31 Cys, multiplo pattern CCC, una Tyr
ci
Da 25 a 33 AA; 7 Cys
f1
11
funghi IV
Da 55 a 56 AA; 9 Cys; un pattern CCC; contiene His e
Phe
f4
K-C-A-C-x(2)-C-L-C
14
procarioti
Da 53 a 56 AAs; 9 Cys; una Tyr, una His; contine residui
non comuni
p
[YFH]-x(5,25)-C-[SKD]-C-[GA][SDPAT]-x(0,1)-C-x-[CYF]
15
piante
Da 45 a 84 AAs; due regioni ric he di Cys (dominio 1 e
dominio 3) separate da una regione con poche Cys
(dominio 2)
p1, p2, p2v, p3, pec,
p21
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59
Struttura
• Nonostante che le sequenze aminoacidiche
siano diverse hanno caratteristiche strutturali
simili:
–
–
–
–
Forma a manubrio,
Due domini,
Diverse unità tetraedriche Me(II)-Cys,
Tutte le Cys coinvolte nel legame con lo ione
metallico
– Pressoché assente la struttura secondaria.
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Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)
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60
Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)
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Misure con biomarcatori V
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mare
Subunità α (1QJH)
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Misure con biomarcatori V
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61
Cd-Metallotioneina da Riccio di mare
Subunità α (1QJH)
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Misure con biomarcatori V
123
Cd-Metallotioneina da Riccio di mare
Subunità β (1QJL)
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Misure con biomarcatori V
124
62
Cd-Metallotioneina da Riccio di mare
Subunità β (1QJL)
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Misure con biomarcatori V
125
Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Misure con biomarcatori V
126
63
Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Misure con biomarcatori V
127
Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Misure con biomarcatori V
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Struttura genica
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Aspetti funzionali
• La
più
importante
delle
funzionalità
delle
metallotioneine è la loro inducibilità da una serie di
agenti e condizioni:
–
–
–
–
–
–
Ioni metallici d10 (Cu++, Zn++, Cd++, Tl+, Pb++…)
Ormoni
Citochine
Fattori di crescita
Promotori tumorali
Stress
• È dimostrato il loro aumento fisiologico durante la
proliferazione cellulare:
MT-Zn++ + Apo-Zinc-fingers → MT + Zn++- Zinc-fingers
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Determinazione
• Le MT sono proteine ricche in cisteina
con affinità elevata per i metalli pesanti
• La concentrazione di MT è quantificata
valutando il contenuto in Cys
• Reazione di ELLMAN (standard GSH)
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GSH
• Il glutatione è un tripeptide formato da
glicina, cisteina, acido glutamico.
SH
O
O
N
H
O
NH2
GLU
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H
N
O
O
O
CYS
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GLY
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67
Reazione di ELLMAN
R S
O
S
N
O
N
RS +
S
O
O
S
O
N
+
O
O
O
O
O
ditiobisnitrobenzoato, DTNB
N
SH
O
O
Assorbimento a 412 nm
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Misure con biomarcatori V
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Grazie a…
• … Bruna Gravina, Irene Tamburin, Christian Asirelli,
Federico Caselli, Francesco Ferretti, Giuseppe
Giammanco che, nell’ambito delle loro tesi di laurea in
Scienze Ambientali, hanno prodotto testi, immagini,
figure e diapositive, utilizzate in questa presentazione.
Giorgio Sartor
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68
Referenze sul WEB …
•
•
•
•
•
•
•
Vie metaboliche
– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/
• Degradazione degli xenobiotici:
http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
Struttura delle proteine:
– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/
– Hexpasy
• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/
• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/
• Enzyme (Enzyme nomenclature database):
http://www.expasy.org/enzyme/
– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
Enzimi:
– Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/
– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/
Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/
Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html
Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry
http://www.atsdr.cdc.gov
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…e naturalmente
• Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il
sito: http://www1.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per
didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione,
purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
• Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna a Ravenna
Corso di Laurea in Scienze Ambientali
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