ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE (2° step)
1) PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX
IMPORTANTE: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio.
Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella:
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
H2O sterile
tampone AMPLI-1 10X
Ampli-Polymer
DNTP’S* (10 mM)
Primer 4RS-HIV A
Primer 5RS-HIV S
MgCl2 (25mM)
*Taq. Polimerasi
VOLUME TOTALE
Sede Amministrativa e Produzione: Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Email: [email protected]
61 µl
10 µl
6 µl
2 µl
2 µl
2 µl
6 µl
1 µl
90 µl x (n. test)
IL SISTEMA Ω-HIV1 PER LA
* aggiungere alla Master Mix solo prima dell’uso.
2) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Distribuire 90 µl di Master Mix per tubo ed aggiungere 10 µl di amplificato 1° step
(eliminare le aliquote di Master Mix non utilizzate), porre sul termociclatore preriscaldato
a 94°C, ed eseguire il seguente ciclo di Temperature :
1 ciclo
5 cicli
30 cicli
1 ciclo
STORAGE
94° C
95° C
94° C
72° C
4° C
4 min.
1 min
30 sec.
10 min.
55° C
55° C
96° C
1 min
1 min
10 min.
72° C
72° C
Ricerca e Sviluppo: Traversa Michele Pietravalle, 11 80100 NAPOLI Tel. 081 5465026
Email: [email protected]
RICERCA DELLA RESISTENZA
A FARMACI ANTI-HIV
GD 401
2 min
2 min
Il prodotto della reazione è un frammento di DNA delle dimensioni di 1685 bp circa e
può essere rivelato con un gel di agarosio 1%, colorato con Etidio Bromuro (GD212).
Il prodotto di PCR ottenuto va controllato e purificato accuratamente, quindi sottoposto
a reazione di sequenza con i primers contenuti nel kit GD 402.
Identificazione del genotipo virale mediante sequenza del prodotto di PCR
(Omega Typing Kit GD402) 96 sequenze/ 24 tipizzazioni.
Contenuto del kit
Primer Prot-FWD
Primer RT-FWD
Primer Prot-REV
Primer RT-REV
Kit Sequenza DTCS
CEQ DNA Sequencing gel
ISTRUZIONI D’USO
P/N 608000
P/N 608010
I protocolli di sequenza vengono riportati nel file Microsoft Excel Seq. Score contenuto
nel dischetto allegato.
Edizione 2 Rev. 11 Giugno 2001
Prodotto e Distribuito da:
GeneDia Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Web:www.genedia.it - Email [email protected]
Rilevanza Clinica
Studi recentissimi hanno dimostrato che la replicazione del virus HIV può essere drammaticamente
ridotta, se non completamente arrestata, con combinazioni di farmaci antivirali ad elevata attività. I
benefici della terapia combinata sono tuttavia enormemente ridotti in soggetti che erano già stati
sottoposti a terapia antivirale precedente. Sebbene attualmente già 12 farmaci anti-HIV sono stati
sottoposti a registrazione (5 farmaci come analoghi nucleosidici e tre non nucleosidici per l’inibizione
della Retrotrascrittasi, e 4 inibitori di Proteasi), una notevole cross-resistenza è stata riscontrata a
seguito dell’uso di questi farmaci. E’ prevista l’introduzione di numerosi nuovi prodotti nei prossimi due
anni, ma i dati preliminari dei test condotti in vitro suggeriscono che molti isolati di HIV, già resistenti,
possano risultare resistenti anche a questi ultimi.
Allo scopo di ridurre e/o controllare questo problema in tutti i tryals clinici sono stati largamente
utilizzati i test di tipizzazione del genoma di HIV mediante sequenza del l’RNA/DNA virale. La
disponibilità attuale di test commerciali per la tipizzazione di HIV, consentirà una migliore correlazione
tra le modifiche funzionali e le modifiche di sequenza dei geni della RT e della Proteasi di HIV.
Variabilità della sequenza di HIV
I fattori che contribuiscono alla variabilità genetica includono: la perdita delle capacità di correzione
della RT virale, l’elevato rate di replicazione dell’HIV in vivo, l’accumulo di varianti provirali durante il
corso dell’infezione, il processo di ricombinazione virale.
La probabilità di sviluppo della resistenza ai farmaci dipende:
1) dalle dimensioni e dall’eterogeneità della popolazione virale nell’ambito dello stesso individuo;
2) dalla facilità di acquisizione di una particolare mutazione o di un set di mutazioni;
3) dall’effetto delle mutazioni farmaco-resistenti sui cambi alla suscettibilità al farmaco stesso;
4) dalla robustezza del virus.
Alcune mutazioni selezionate durante la terapia conferiscono una resistenza per se stessa misurabile,
mentre altre mutazioni producono resistenza solo quando sono presenti in combinazione.
L’analisi genetica di isolati di HIV ha rivelato almeno 10 diversi tipi M (maggioritari) ed i sottotipi da A
a J, come diversi altri gruppi divergenti. Le differenze tra i sottotipi sono basate su divergenze nella
regione env per il 30% per il 14% nella regione gag. La pandemia mondiale di HIV-1 è causata dal
gruppo M. In Europa ed Australia la maggior parte degli isolati di HIV-1 appartengono al sottotipo B e
gli attuali farmaci antivirali sono stati sviluppati avendo come riferimento isolati del tipo B. Tuttavia il
tipo B viene riscontrato solo in una parte della popolazione mondiale e, soprattutto nei paesi
industrializzati, isolati non-B vengono ritrovati con sempre maggiore frequenza.
L’identificazione delle mutazioni di resistenza ai farmaci antivirali.
Le mutazioni di resistenza ai farmaci antivirali vengono individuate durante la valutazione pre-clinica
di un nuovo antivirale. Durante questa fase gli isolati di HIV-1 resistenti vengono identificati,
sequenziati e testati per la loro suscettibilità al farmaco. Esperimenti di mutagenesi vengono eseguiti
per confermare il ruolo di specifiche mutazioni introdotte in un virus wild-type. Le mutazioni farmacoresistenti identificate con questo metodo vengono generalmente acquisite e vengono riportate come
Mutazioni Canoniche. Questo approccio sperimentale è comunque limitativo a causa delle diverse
combinazioni di mutazioni associate alla resistenza e perché l’effetto di una mutazione spesso dipende
dal contesto genetico in cui essa si sviluppa. In molti individui, specialmente coloro che ricevono
combinazioni di farmaci diversi, pattern complessi di mutazioni non canoniche possono comunque
Pag.1
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
H2O sterile
q.b a 10 µl finali
tampone AMPLI-1 10X
2 µl
dNTP’s* (10 mM)
2 µl
Ampli-Polymer
1 µl
Rnase Inib.
0,5 µl (20 U.I.)
Primer 3RS-HIV A
2 µl
MgCl2 (100 mM)
1 µl
Trascrittasi Inversa
0,25 µl (5 U.I.)
VOLUME TOTALE
10 µl x (n. test)
* I dNTP’s sono normalmente disponibili in soluzioni singole 100 mM (Pharmacia e Boehringher) o nel
"Dna TAQ plus "(GD213). Poichè il processo di scongelamento e ricongelamento può provocarne la
defosforilazione, è opportuno preparare una mix 10 mM da conservare a - 20°C in aliquote da 25 µl da
utilizzare per ogni singolo set di campioni. Scongelare solo prima dell'uso ed eliminare eventuali residui.
Preparazione dei campioni
• Distribuire 10 µl di Master Mix in ciascun tubo da riporre in Termociclatore o Termostato.
• Campioni: aggiungere 10 µl di campione in ciascun tubo predisposto.
• Predisporre almeno un controllo Negativo.
• Incubare come da seguente protocollo:
1 ciclo 42°C per 60 min. STORAGE
4°C
Dopo l'incubazione i campioni trascritti in cDNA saranno pronti per essere sottoposti a
reazione di Amplificazione.
ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE (1° step)
1. PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX
IMPORTANTE: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio.
Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella:
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
H2O sterile
Tampone AMPLI-1 10X
Ampli-Polymer
Primer 2RS-HIV S
MgCl2 (25mM)
*Taq. Polimerasi
VOLUME TOTALE
57 µl
8 µl
6 µl
2 µl
6 µl
1 µl
80 µl x (n. test)
* aggiungere alla Master Mix solo prima dell’uso.
2. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Aggiungere 80 µl di Master Mix a ciascun tubo di cDNA (eliminare le aliquote di Master Mix non
utilizzate), porre sul termociclatore preriscaldato a 94°C, ed eseguire il seguente ciclo di Temperature :
1 ciclo
5 cicli
30 cicli
1 ciclo
STORAGE
94° C
95° C
94° C
72° C
4° C
4 min.
1 min
30 sec.
10 min.
55° C
55° C
96° C
Pag.6
1 min
1 min
10 min.
72° C
72° C
2 min
2 min
PROTOCOLLI di LAVORO
Omega Prep-HIV1 (GD401)
Estrazione
Materiali contenuti nel Kit
Soluzione. Lisante 4 tubi x 4,5 ml
Carrier
1 tubo x 0,2 ml
Acqua DEPC
1 tubo x 4,5 ml
N.B. La procedura di estrazione può richiedere, per casi di bassa viremia in pazienti sottoposti a
terapia, la procedura di arricchimento del campione mediante centrifugazione.
Tale operazione prevede:
1. centrifugazione a 17.000rpm per 45 minuti a 4°C di 0,3 – 1 ml di campione
oppure
2. centrifugazione a 60.000rpm per 20 minuti a 4°C
3. eliminare il sovranatante lasciando 0,1 ml di campione nel tubo e procedere con l’estrazione.
Procedura di estrazione
0,1 ml di plasma e/o siero, o campione arricchito (viene preferito Plasma preparato con EDTA)
0,4 ml di MIX Lisante (0,4 ml lisante + 4µl RNA Carrier + 4 µl Beta-mercaptoetanolo)
0,5 ml di Isopropanolo puro
• Agitare su Vortex (10 secondi circa)
• Centrifugare 5 minuti a 14.000 rpm (meglio se refrigerata a 10°C)
• Eliminare il Sovranatante
• Lavare con 0,5 ml di Etanolo 70%
• Centrifugare 5 minuti a 14.000 rpm (meglio se refrigerata a 10°C)
• Eliminare il Sovranatante
• Asciugare il pellet
• Risospendere in 50 µl H2O-DEPC
Retrotrascrizione 1° e 2° step di Amplificazione
Materiali contenuti nel Kit
• Acqua DEPC
• DNTP’s mix 10mM each
• Buffer 10X
• Primer 2RS-HIV-S
• Ampli Polymer
• Primer 3RS-HIV-A
• Primer 4RS-HIV-S
• MgCl2 (100 mM)
• Primer 5RS-HIV-A
• MgCl2 (25 mM)
• R.I. Rnasi-Inhibitor (40 U.I./µl)
• Taq Polimerase (5 U.I./ µl)
• Reverse Trascrittasi AMV-RT (10 U.I./µl)
Retrotrascrizione
Il campione da sottoporre a retrotrascrizione è costituito da RNA estratto.
IMPORTANTE : tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio.
Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella
Pag.5
sviluppare resistenza. La possibilità di sequenziare isolati clinici di DNA virale può risultare, pertanto di
grande importanza nella Valutazione dell’efficacia e nella Modulazione del trattamento farmacologico.
La Metodologia proposta
La variazione di un singolo codone nella regione della trascrittasi inversa si esprime in una singola
mutazione puntiforme, mentre la variazione di un codone nel gene della proteasi si esprime in due
sostituzioni aminoacidiche simmetriche, una per ciascun monomero dell’enzima. Le mutazioni sono
per lo più raggruppate intorno al sito funzionale, sebbene ne siano descritte alcune lungo il decorso
delle due catene antiparallele, che potrebbero avere una funzione compensatoria, ripristinando un
certo grado di attività enzimatica altrimenti compromessa dalle mutazioni di resistenza. Il Virus
dell’immunodeficienza umana (HIV) è un organismo altamente polimorfico. Infatti è quasi impossibile
che due soggetti infetti abbiano la stessa sequenza virale in circolo. Pertanto non è possibile
prevedere la sequenza virale riscontrabile in ciascun paziente. I metodi indiretti di genotipizzazione
come l’uso di DNA probes, o DNA chips, richiedono l’esatta conoscenza della sequenza di DNA di
riferimento e, pertanto non sono applicabili nella identificazione delle quasi-specie significative di HIV1. La strategia ottimale per l’identificazione della maggior parte dei genotipi sconosciuti è la sequenza
diretta del DNA, che comunque risulta oltre che di riferimento anche competitiva in termini di costi ed
operatività.
L’AIDs è causato dalla distruzione del sistema immunitario causata dal Retrovirus HIV. Il retrovirus
infetta le cellule con RNA che viene poi convertito in DNA ad opera di una retrotrascrittasi (RT) virale.
Il cDNA virale può essere integrato nel genoma ospite nella forma di provirus. La retrotrascrittasi
virale ha una elevata frequenza di errore e pertanto producecopie di DNA provirale caratterizzate
dalla presenza di un gran numero di mutazioni. Questi errori vengono trasmessi poi alla progenie
virale quando il DNA integrato viene nuovamente trascritto in RNA.
Le sequenze dell’RNA virale isolato da pazienti diversi affetti da infezione da HIV-1, infatti, differiscono
per un gran numero di basi. Così come per la maggior parte dei virus, il genoma dell’HIV è molto
compatto e la maggior parte delle mutazioni sono dannose e pertanto conducono a Virus difettivi.
Tuttavia alcune mutazioni risultano silenti (ovvero non sono seguite da cambi aminoacidici), altre
conservative (un cambio di aminoacido non seguito da effetti funzionali) oppure alcune mutazioni
selezionate che possono provocare modifiche funzionali, che determinano un aumento dell’abilità
virale a replicarsi in particolari condizioni ambientali, ad esempio in presenza di farmaci antivirali.
Quando vengono introdotti farmaci che sono efficaci per inibire il ciclo vitale del Virus, la carica virale
che viene misurata sul siero si abbassa drammaticamente. Nel tempo la maggior parte dei pazienti
mostra una ripresa della viremia sviluppando virus che risultano resistenti a questi farmaci. Una
grande mole di lavoro è stata fatta per stabilire la correlazione tra il cambio di efficacia di alcuni
farmaci e le modificazioni dell’RNA virale. Un esempio di ciò è dato dai cambi nella sequenza del gene
della RT su alcuni specifici codoni correlabili con lo sviluppo di resistenza agli analoghi nucleosidici
(ddN), AZT, ed agli inibitori della retrotrascrittasi non nucleosidici (NNRTIs), e resistenza multipla ai
farmaci (MDR). Inizialmente si riteneva che con un semplice sistema basato sull’uso di probes
specifici, fosse possibile monitorare i pazienti in terapia. Sfortunatamente, a causa dell’elevato rate di
mutazione del Virus e della tolleranza del gene della RT alle sostituzioni aminoacidiche, le
innumerevoli mutazioni del DNA attorno ai codoni implicati nelle resistenze virali, rende impossibile
disegnare probes che possano discriminare le mutazioni silenti da quelle conservative, correlate allo
sviluppo di resistenza ai farmaci. Pertanto l’unico approccio possibile per lo stato del genoma di HIV è
Pag.2
rappresentato dalla sequenza dell’intera regione genica subordinata alla RT ed alla Proteasi
del Virus.
IL SISTEMA Ω-HIV1 PER LA RICERCA DELLA RESISTENZA A FARMACI ANTI-HIV
Al fine di definire l’efficacia di un trattamento è indispensabile valutare i cambiamenti di viremia nel
tempo del paziente sottoposto a terapia. La sequenza di particolari codoni nei geni della Proteasi e della
Retrotrascrittasi può dare indicazioni di una potenziale resistenza a determinati farmaci. Il sistema ΩHIV1 può essere utilizzato da solo o in combinazione con un dosaggio di viremia, al fine di definire il
genotipo della maggiore specie di HIV infettante un individuo, prima dell’inizio della terapia. L’aumento
della carica virale durante la terapia è indicativo di un cambio nel genotipo virale, che rende inefficace il
trattamento.
Ω-HIV1 è un kit basato sulla sequenza del DNA che ha come target due regioni specifiche del genoma
di HIV, appartenenti al gene Pol. Due geni appartenenti al genoma di HIV sono suscettibili di mutazioni
in codoni specifici che possono conferire resistenza ai farmaci antivirali:
1) il gene della Retrotrascrittasi
2) 2) il gene della Proteasi.
Il gene della Proteasi è un frammento di circa 297 paia di basi, che codifica per 99 aminoacidi; il gene
della RT ha dimensioni di circa 1680 basi e codifica per 560 aminoacidi. Nei pazienti infetti il virus è
presente in due forme , ovvero particelle virali a RNA circolanti nel siero e DNA provirale integrato nel
genoma delle cellule infette. Ambedue le forme hanno rilevanza clinica e diagnostica.
Ω-HIV1 è stato disegnato per ottenere la sequenza della regione del genoma virale dal nucleotide 2190
al nucleotide 3300 circa, che sottende alle 41 mutazioni attualmente descritte relative al gene della
Proteasi virale ed a 60 delle 62 mutazioni descritte per il gene della Trascrittasi Inversa. La procedura
prevede l’estrazione di RNA circolante e/o DNA provirale integrato, una reazione di RT-PCR nested
per la produzione di un frammento di 1,5 Kbasi e successiva sequenza di questo frammento con due
primer reverse e due primer forward diretti verso la regione genomica della proteasi virale e della RT
virale. Di seguito viene riportato la schema della sequenza di HIV-1 preso a modello per lo sviluppo del
metodo, con la distribuzione delle mutazioni attualmente note.
Applicabilita' : Su RNA estratto e purificato (2-10 µl)
Numero di Test : 40 (24 Tipizzazioni)
Conservazione: -20°C
Stabilita': superiore a 12 mesi se correttamente conservato
Materiali Richiesti:
• Portaprovette refrigerato
• Puntali sterili con barriera antiaereosol
• Tubi NO-OIL, Thin-Walled 0,5 ml oppure 0,2 ml.
Strumenti richiesti: • TERMOCICLATORE programmabile
• Set di pipette "pre-PCR"
1. 0,5 - 10 µl
2. 5 - 50 µl
3. 50 - 200 µl
Tutti i materiali necessari all'esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter
disporre di un set di micropipette dedicato. Si suggerisce di eseguire tutte le operazioni in cappa
biologica ed in ghiaccio. E' tassativo l'uso di guanti durante la manipolazione di campioni e reagenti.
Pag.3
LOCUS
DEFINITION
BASE COUNT
HIVHXB2CG
9719 bp ss-RNA
VRL
25-MAR-1997
Human immunodeficiency virus type 1 (HXB2), complete genome;
3411 a
1772 c
2373 g
2163 t
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
3181
3241
3301
3361
3421
3481
3541
3601
3661
3721
3781
3841
agctgcatcc
ctggggactt
cctgcatata
gcctgggagc
tgagtgcttc
agaccctttt
cgaaagggaa
caagaggcga
aggagagaga
aaaattcggt
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agaaggctgt
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agcacagcaa
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tgacatagca
acctatccca
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ttagagcctt
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agtcagattt
gcactaacag
gagattctaa
gaaatacaga
aatctgaaaa
ttaacagagg
aaatttaaac
gccacctgga
cagttagaga
agggagacta
_ Primers Forward e Reverse 1 e 2 step
_ Protease gene start/end
_ Protese resistance Mutations
_ RT resistance Mutations
_ RT gene start/end
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