Ω-HIV1 -HIV GD 401 `USO
annuncio pubblicitario
ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE (2° step) 1) PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX IMPORTANTE: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio. Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella: SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test) H2O sterile tampone AMPLI-1 10X Ampli-Polymer DNTP’S* (10 mM) Primer 4RS-HIV A Primer 5RS-HIV S MgCl2 (25mM) *Taq. Polimerasi VOLUME TOTALE Sede Amministrativa e Produzione: Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672 Email: [email protected] 61 µl 10 µl 6 µl 2 µl 2 µl 2 µl 6 µl 1 µl 90 µl x (n. test) IL SISTEMA Ω-HIV1 PER LA * aggiungere alla Master Mix solo prima dell’uso. 2) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Distribuire 90 µl di Master Mix per tubo ed aggiungere 10 µl di amplificato 1° step (eliminare le aliquote di Master Mix non utilizzate), porre sul termociclatore preriscaldato a 94°C, ed eseguire il seguente ciclo di Temperature : 1 ciclo 5 cicli 30 cicli 1 ciclo STORAGE 94° C 95° C 94° C 72° C 4° C 4 min. 1 min 30 sec. 10 min. 55° C 55° C 96° C 1 min 1 min 10 min. 72° C 72° C Ricerca e Sviluppo: Traversa Michele Pietravalle, 11 80100 NAPOLI Tel. 081 5465026 Email: [email protected] RICERCA DELLA RESISTENZA A FARMACI ANTI-HIV GD 401 2 min 2 min Il prodotto della reazione è un frammento di DNA delle dimensioni di 1685 bp circa e può essere rivelato con un gel di agarosio 1%, colorato con Etidio Bromuro (GD212). Il prodotto di PCR ottenuto va controllato e purificato accuratamente, quindi sottoposto a reazione di sequenza con i primers contenuti nel kit GD 402. Identificazione del genotipo virale mediante sequenza del prodotto di PCR (Omega Typing Kit GD402) 96 sequenze/ 24 tipizzazioni. Contenuto del kit Primer Prot-FWD Primer RT-FWD Primer Prot-REV Primer RT-REV Kit Sequenza DTCS CEQ DNA Sequencing gel ISTRUZIONI D’USO P/N 608000 P/N 608010 I protocolli di sequenza vengono riportati nel file Microsoft Excel Seq. Score contenuto nel dischetto allegato. Edizione 2 Rev. 11 Giugno 2001 Prodotto e Distribuito da: GeneDia Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672 Web:www.genedia.it - Email [email protected] Rilevanza Clinica Studi recentissimi hanno dimostrato che la replicazione del virus HIV può essere drammaticamente ridotta, se non completamente arrestata, con combinazioni di farmaci antivirali ad elevata attività. I benefici della terapia combinata sono tuttavia enormemente ridotti in soggetti che erano già stati sottoposti a terapia antivirale precedente. Sebbene attualmente già 12 farmaci anti-HIV sono stati sottoposti a registrazione (5 farmaci come analoghi nucleosidici e tre non nucleosidici per l’inibizione della Retrotrascrittasi, e 4 inibitori di Proteasi), una notevole cross-resistenza è stata riscontrata a seguito dell’uso di questi farmaci. E’ prevista l’introduzione di numerosi nuovi prodotti nei prossimi due anni, ma i dati preliminari dei test condotti in vitro suggeriscono che molti isolati di HIV, già resistenti, possano risultare resistenti anche a questi ultimi. Allo scopo di ridurre e/o controllare questo problema in tutti i tryals clinici sono stati largamente utilizzati i test di tipizzazione del genoma di HIV mediante sequenza del l’RNA/DNA virale. La disponibilità attuale di test commerciali per la tipizzazione di HIV, consentirà una migliore correlazione tra le modifiche funzionali e le modifiche di sequenza dei geni della RT e della Proteasi di HIV. Variabilità della sequenza di HIV I fattori che contribuiscono alla variabilità genetica includono: la perdita delle capacità di correzione della RT virale, l’elevato rate di replicazione dell’HIV in vivo, l’accumulo di varianti provirali durante il corso dell’infezione, il processo di ricombinazione virale. La probabilità di sviluppo della resistenza ai farmaci dipende: 1) dalle dimensioni e dall’eterogeneità della popolazione virale nell’ambito dello stesso individuo; 2) dalla facilità di acquisizione di una particolare mutazione o di un set di mutazioni; 3) dall’effetto delle mutazioni farmaco-resistenti sui cambi alla suscettibilità al farmaco stesso; 4) dalla robustezza del virus. Alcune mutazioni selezionate durante la terapia conferiscono una resistenza per se stessa misurabile, mentre altre mutazioni producono resistenza solo quando sono presenti in combinazione. L’analisi genetica di isolati di HIV ha rivelato almeno 10 diversi tipi M (maggioritari) ed i sottotipi da A a J, come diversi altri gruppi divergenti. Le differenze tra i sottotipi sono basate su divergenze nella regione env per il 30% per il 14% nella regione gag. La pandemia mondiale di HIV-1 è causata dal gruppo M. In Europa ed Australia la maggior parte degli isolati di HIV-1 appartengono al sottotipo B e gli attuali farmaci antivirali sono stati sviluppati avendo come riferimento isolati del tipo B. Tuttavia il tipo B viene riscontrato solo in una parte della popolazione mondiale e, soprattutto nei paesi industrializzati, isolati non-B vengono ritrovati con sempre maggiore frequenza. L’identificazione delle mutazioni di resistenza ai farmaci antivirali. Le mutazioni di resistenza ai farmaci antivirali vengono individuate durante la valutazione pre-clinica di un nuovo antivirale. Durante questa fase gli isolati di HIV-1 resistenti vengono identificati, sequenziati e testati per la loro suscettibilità al farmaco. Esperimenti di mutagenesi vengono eseguiti per confermare il ruolo di specifiche mutazioni introdotte in un virus wild-type. Le mutazioni farmacoresistenti identificate con questo metodo vengono generalmente acquisite e vengono riportate come Mutazioni Canoniche. Questo approccio sperimentale è comunque limitativo a causa delle diverse combinazioni di mutazioni associate alla resistenza e perché l’effetto di una mutazione spesso dipende dal contesto genetico in cui essa si sviluppa. In molti individui, specialmente coloro che ricevono combinazioni di farmaci diversi, pattern complessi di mutazioni non canoniche possono comunque Pag.1 SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test) H2O sterile q.b a 10 µl finali tampone AMPLI-1 10X 2 µl dNTP’s* (10 mM) 2 µl Ampli-Polymer 1 µl Rnase Inib. 0,5 µl (20 U.I.) Primer 3RS-HIV A 2 µl MgCl2 (100 mM) 1 µl Trascrittasi Inversa 0,25 µl (5 U.I.) VOLUME TOTALE 10 µl x (n. test) * I dNTP’s sono normalmente disponibili in soluzioni singole 100 mM (Pharmacia e Boehringher) o nel "Dna TAQ plus "(GD213). Poichè il processo di scongelamento e ricongelamento può provocarne la defosforilazione, è opportuno preparare una mix 10 mM da conservare a - 20°C in aliquote da 25 µl da utilizzare per ogni singolo set di campioni. Scongelare solo prima dell'uso ed eliminare eventuali residui. Preparazione dei campioni • Distribuire 10 µl di Master Mix in ciascun tubo da riporre in Termociclatore o Termostato. • Campioni: aggiungere 10 µl di campione in ciascun tubo predisposto. • Predisporre almeno un controllo Negativo. • Incubare come da seguente protocollo: 1 ciclo 42°C per 60 min. STORAGE 4°C Dopo l'incubazione i campioni trascritti in cDNA saranno pronti per essere sottoposti a reazione di Amplificazione. ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE (1° step) 1. PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX IMPORTANTE: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio. Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella: SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test) H2O sterile Tampone AMPLI-1 10X Ampli-Polymer Primer 2RS-HIV S MgCl2 (25mM) *Taq. Polimerasi VOLUME TOTALE 57 µl 8 µl 6 µl 2 µl 6 µl 1 µl 80 µl x (n. test) * aggiungere alla Master Mix solo prima dell’uso. 2. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Aggiungere 80 µl di Master Mix a ciascun tubo di cDNA (eliminare le aliquote di Master Mix non utilizzate), porre sul termociclatore preriscaldato a 94°C, ed eseguire il seguente ciclo di Temperature : 1 ciclo 5 cicli 30 cicli 1 ciclo STORAGE 94° C 95° C 94° C 72° C 4° C 4 min. 1 min 30 sec. 10 min. 55° C 55° C 96° C Pag.6 1 min 1 min 10 min. 72° C 72° C 2 min 2 min PROTOCOLLI di LAVORO Omega Prep-HIV1 (GD401) Estrazione Materiali contenuti nel Kit Soluzione. Lisante 4 tubi x 4,5 ml Carrier 1 tubo x 0,2 ml Acqua DEPC 1 tubo x 4,5 ml N.B. La procedura di estrazione può richiedere, per casi di bassa viremia in pazienti sottoposti a terapia, la procedura di arricchimento del campione mediante centrifugazione. Tale operazione prevede: 1. centrifugazione a 17.000rpm per 45 minuti a 4°C di 0,3 – 1 ml di campione oppure 2. centrifugazione a 60.000rpm per 20 minuti a 4°C 3. eliminare il sovranatante lasciando 0,1 ml di campione nel tubo e procedere con l’estrazione. Procedura di estrazione 0,1 ml di plasma e/o siero, o campione arricchito (viene preferito Plasma preparato con EDTA) 0,4 ml di MIX Lisante (0,4 ml lisante + 4µl RNA Carrier + 4 µl Beta-mercaptoetanolo) 0,5 ml di Isopropanolo puro • Agitare su Vortex (10 secondi circa) • Centrifugare 5 minuti a 14.000 rpm (meglio se refrigerata a 10°C) • Eliminare il Sovranatante • Lavare con 0,5 ml di Etanolo 70% • Centrifugare 5 minuti a 14.000 rpm (meglio se refrigerata a 10°C) • Eliminare il Sovranatante • Asciugare il pellet • Risospendere in 50 µl H2O-DEPC Retrotrascrizione 1° e 2° step di Amplificazione Materiali contenuti nel Kit • Acqua DEPC • DNTP’s mix 10mM each • Buffer 10X • Primer 2RS-HIV-S • Ampli Polymer • Primer 3RS-HIV-A • Primer 4RS-HIV-S • MgCl2 (100 mM) • Primer 5RS-HIV-A • MgCl2 (25 mM) • R.I. Rnasi-Inhibitor (40 U.I./µl) • Taq Polimerase (5 U.I./ µl) • Reverse Trascrittasi AMV-RT (10 U.I./µl) Retrotrascrizione Il campione da sottoporre a retrotrascrizione è costituito da RNA estratto. IMPORTANTE : tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio. Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella Pag.5 sviluppare resistenza. La possibilità di sequenziare isolati clinici di DNA virale può risultare, pertanto di grande importanza nella Valutazione dell’efficacia e nella Modulazione del trattamento farmacologico. La Metodologia proposta La variazione di un singolo codone nella regione della trascrittasi inversa si esprime in una singola mutazione puntiforme, mentre la variazione di un codone nel gene della proteasi si esprime in due sostituzioni aminoacidiche simmetriche, una per ciascun monomero dell’enzima. Le mutazioni sono per lo più raggruppate intorno al sito funzionale, sebbene ne siano descritte alcune lungo il decorso delle due catene antiparallele, che potrebbero avere una funzione compensatoria, ripristinando un certo grado di attività enzimatica altrimenti compromessa dalle mutazioni di resistenza. Il Virus dell’immunodeficienza umana (HIV) è un organismo altamente polimorfico. Infatti è quasi impossibile che due soggetti infetti abbiano la stessa sequenza virale in circolo. Pertanto non è possibile prevedere la sequenza virale riscontrabile in ciascun paziente. I metodi indiretti di genotipizzazione come l’uso di DNA probes, o DNA chips, richiedono l’esatta conoscenza della sequenza di DNA di riferimento e, pertanto non sono applicabili nella identificazione delle quasi-specie significative di HIV1. La strategia ottimale per l’identificazione della maggior parte dei genotipi sconosciuti è la sequenza diretta del DNA, che comunque risulta oltre che di riferimento anche competitiva in termini di costi ed operatività. L’AIDs è causato dalla distruzione del sistema immunitario causata dal Retrovirus HIV. Il retrovirus infetta le cellule con RNA che viene poi convertito in DNA ad opera di una retrotrascrittasi (RT) virale. Il cDNA virale può essere integrato nel genoma ospite nella forma di provirus. La retrotrascrittasi virale ha una elevata frequenza di errore e pertanto producecopie di DNA provirale caratterizzate dalla presenza di un gran numero di mutazioni. Questi errori vengono trasmessi poi alla progenie virale quando il DNA integrato viene nuovamente trascritto in RNA. Le sequenze dell’RNA virale isolato da pazienti diversi affetti da infezione da HIV-1, infatti, differiscono per un gran numero di basi. Così come per la maggior parte dei virus, il genoma dell’HIV è molto compatto e la maggior parte delle mutazioni sono dannose e pertanto conducono a Virus difettivi. Tuttavia alcune mutazioni risultano silenti (ovvero non sono seguite da cambi aminoacidici), altre conservative (un cambio di aminoacido non seguito da effetti funzionali) oppure alcune mutazioni selezionate che possono provocare modifiche funzionali, che determinano un aumento dell’abilità virale a replicarsi in particolari condizioni ambientali, ad esempio in presenza di farmaci antivirali. Quando vengono introdotti farmaci che sono efficaci per inibire il ciclo vitale del Virus, la carica virale che viene misurata sul siero si abbassa drammaticamente. Nel tempo la maggior parte dei pazienti mostra una ripresa della viremia sviluppando virus che risultano resistenti a questi farmaci. Una grande mole di lavoro è stata fatta per stabilire la correlazione tra il cambio di efficacia di alcuni farmaci e le modificazioni dell’RNA virale. Un esempio di ciò è dato dai cambi nella sequenza del gene della RT su alcuni specifici codoni correlabili con lo sviluppo di resistenza agli analoghi nucleosidici (ddN), AZT, ed agli inibitori della retrotrascrittasi non nucleosidici (NNRTIs), e resistenza multipla ai farmaci (MDR). Inizialmente si riteneva che con un semplice sistema basato sull’uso di probes specifici, fosse possibile monitorare i pazienti in terapia. Sfortunatamente, a causa dell’elevato rate di mutazione del Virus e della tolleranza del gene della RT alle sostituzioni aminoacidiche, le innumerevoli mutazioni del DNA attorno ai codoni implicati nelle resistenze virali, rende impossibile disegnare probes che possano discriminare le mutazioni silenti da quelle conservative, correlate allo sviluppo di resistenza ai farmaci. Pertanto l’unico approccio possibile per lo stato del genoma di HIV è Pag.2 rappresentato dalla sequenza dell’intera regione genica subordinata alla RT ed alla Proteasi del Virus. IL SISTEMA Ω-HIV1 PER LA RICERCA DELLA RESISTENZA A FARMACI ANTI-HIV Al fine di definire l’efficacia di un trattamento è indispensabile valutare i cambiamenti di viremia nel tempo del paziente sottoposto a terapia. La sequenza di particolari codoni nei geni della Proteasi e della Retrotrascrittasi può dare indicazioni di una potenziale resistenza a determinati farmaci. Il sistema ΩHIV1 può essere utilizzato da solo o in combinazione con un dosaggio di viremia, al fine di definire il genotipo della maggiore specie di HIV infettante un individuo, prima dell’inizio della terapia. L’aumento della carica virale durante la terapia è indicativo di un cambio nel genotipo virale, che rende inefficace il trattamento. Ω-HIV1 è un kit basato sulla sequenza del DNA che ha come target due regioni specifiche del genoma di HIV, appartenenti al gene Pol. Due geni appartenenti al genoma di HIV sono suscettibili di mutazioni in codoni specifici che possono conferire resistenza ai farmaci antivirali: 1) il gene della Retrotrascrittasi 2) 2) il gene della Proteasi. Il gene della Proteasi è un frammento di circa 297 paia di basi, che codifica per 99 aminoacidi; il gene della RT ha dimensioni di circa 1680 basi e codifica per 560 aminoacidi. Nei pazienti infetti il virus è presente in due forme , ovvero particelle virali a RNA circolanti nel siero e DNA provirale integrato nel genoma delle cellule infette. Ambedue le forme hanno rilevanza clinica e diagnostica. Ω-HIV1 è stato disegnato per ottenere la sequenza della regione del genoma virale dal nucleotide 2190 al nucleotide 3300 circa, che sottende alle 41 mutazioni attualmente descritte relative al gene della Proteasi virale ed a 60 delle 62 mutazioni descritte per il gene della Trascrittasi Inversa. La procedura prevede l’estrazione di RNA circolante e/o DNA provirale integrato, una reazione di RT-PCR nested per la produzione di un frammento di 1,5 Kbasi e successiva sequenza di questo frammento con due primer reverse e due primer forward diretti verso la regione genomica della proteasi virale e della RT virale. Di seguito viene riportato la schema della sequenza di HIV-1 preso a modello per lo sviluppo del metodo, con la distribuzione delle mutazioni attualmente note. Applicabilita' : Su RNA estratto e purificato (2-10 µl) Numero di Test : 40 (24 Tipizzazioni) Conservazione: -20°C Stabilita': superiore a 12 mesi se correttamente conservato Materiali Richiesti: • Portaprovette refrigerato • Puntali sterili con barriera antiaereosol • Tubi NO-OIL, Thin-Walled 0,5 ml oppure 0,2 ml. Strumenti richiesti: • TERMOCICLATORE programmabile • Set di pipette "pre-PCR" 1. 0,5 - 10 µl 2. 5 - 50 µl 3. 50 - 200 µl Tutti i materiali necessari all'esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter disporre di un set di micropipette dedicato. Si suggerisce di eseguire tutte le operazioni in cappa biologica ed in ghiaccio. E' tassativo l'uso di guanti durante la manipolazione di campioni e reagenti. Pag.3 LOCUS DEFINITION BASE COUNT HIVHXB2CG 9719 bp ss-RNA VRL 25-MAR-1997 Human immunodeficiency virus type 1 (HXB2), complete genome; 3411 a 1772 c 2373 g 2163 t 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 agctgcatcc ctggggactt cctgcatata gcctgggagc tgagtgcttc agaccctttt cgaaagggaa caagaggcga aggagagaga aaaattcggt agcagggagc agacaaatac ttatataata aaggaagctt gcagcagctg atccaggggc gtagtagaag ggagccaccc atgcaaatgt gtgcatgcag ggaactacta gtaggagaaa agccctacca gaccggttct acagaaacct ggaccagcgg cataaggcaa atgcagagag gaagggcaca aaggaaggac tggccttcct ccaccagaag ccgatagaca tcgtcacaat atacagtatt ttggaggttt aagctatagg tgactcagat aattaaagcc taaaagcatt ggcctgaaaa ggagaaaatt aattaggaat tgggtgatgc ccatacctag agggatggaa ttagaaaaca ctgacttaga ggtggggact gttatgaact gctggactgt acccagggat aagtaatacc aagaaccagt agcaggggca caggaaaata cagtgcaaaa tgcccataca ttcctgagtg aagaacccat ggagtacttc tccagggagg agcagctgct tctctggcta aagtagtgtg agtcagtgtg accagaggag ggggcggcga tgggtgcgag taaggccagg tagaacgatt tgggacagct cagtagcaac tagacaagat acacaggaca aaatggtaca agaaggcttt cacaagattt taaaagagac ggcctattgc gtacccttca tttataaaag gcattctgga ataaaactct tgttggtcca ctacactaga gagttttggc gcaattttag cagccagaaa accaaatgaa acaagggaag agagcttcag aggaactgta aaagataggg agaagaaatg tatcaaagta tacagtatta tggttgcact aggaatggat agtagaaatt tccatacaat agtagatttc accacatccc atatttttca tataaacaat aggatcacca aaatccagac aatagggcag taccacacca ccatcctgat caatgacata taaagtaagg actaacagaa acatggagtg aggccaatgg tgcaagaatg aataaccaca aaaggaaaca ggagtttgtt agtaggagca aagaactgct cgtggcctgg ttttgcctgt actagggaac tgcccgtctg gaaaatctct ctctctcgac ctggtgagta agcgtcagta gggaaagaaa cgcagttaat acaaccatcc cctctattgt agaggaagag cagcaatcag tcaggccata cagcccagaa aaacaccatg catcaatgag accaggccag ggaacaaata atggataatc cataagacaa aagagccgag aaatgcgaac agaaatgatg tgaagcaatg gaaccaaaga ttgcagggcc agattgtact gccagggaat gtctggggta tcctttaact gggcaactaa agtttgccag agacagtatg gtaggaccta ttaaattttc ggcccaaaag tgtacagaga actccagtat agagaactta gcagggttaa gttcccttag gagacaccag gcaatattcc atagttatct catagaacaa gacaaaaaac aaatggacag cagaagttag caattatgta gaagcagagc tattatgacc acatatcaaa aggggtgccc gaaagcatag tgggaaacat aatacccctc gaaaccttct gacatcgagc gcgggactgg actgggtctc ccactgctta ttgtgtgact agcagtggcg gcaggactcg cgccaaaaat ttaagcgggg aaatataaat cctggcctgt cttcagacag gtgcatcaaa caaaacaaaa gtcagccaaa tcacctagaa gtgataccca ctaaacacag gaagctgcag atgagagaac ggatggatga ctgggattaa ggaccaaagg caagcttcac ccagattgta acagcatgtc agccaagtaa aagattgtta cctaggaaaa gagagacagg tttcttcaga gagacaacaa tccctcaggt aggaagctct gaagatggaa atcagatact cacctgtcaa ccattagccc ttaaacaatg tggaaaagga ttgccataaa ataagagaac aaaagaaaaa atgaagactt ggattagata aaagtagcat atcaatacat aaatagagga atcagaaaga tacagcctat tggggaaatt aactccttag tagaactggc catcaaaaga tttatcaaga acactaatga taatatgggg ggtggacaga ccttagtgaa atgtagatgg ttgctacaag ggagtggcga tctggttaga agcctcaata ctggtaacta cccgaacagg gcttgctgaa tttgactagc gagaattaga taaaacatat tagaaacatc gatcagaaga ggatagagat gtaagaaaaa attaccctat ctttaaatgc tgttttcagc tggggggaca aatgggatag caaggggaag caaataatcc ataaaatagt aaccctttag aggaggtaaa agactatttt agggagtagg caaattcagc agtgtttcaa agggctgttg ctaatttttt gcagaccaga ctccccctca cactctttgg attagataca accaaaaatg catagaaatc cataattgga tattgagact gccattgaca agggaaaatt gaaaaaagac tcaagacttc atcagtaaca caggaagtat tcagtacaat gacaaaaatc ggatgatttg gctgagacaa acctccattc agtgctgcca gaattgggca aggaaccaaa agaaaacaga cttaatagca gccatttaaa tgtaaaacaa aaagactcct gtattggcaa attatggtac ggcagctaac ggactttccg gccctcagat ccagatctga aagcttgcct gagatccctc gacctgaaag gcgcgcacgg ggaggctaga tcgatgggaa agtatgggca agaaggctgt acttagatca aaaagacacc agcacagcaa agtgcagaac atgggtaaaa attatcagaa tcaagcagcc agtgcatcca tgacatagca acctatccca aagaatgtat agactatgta aaattggatg aaaagcattg aggacccggc taccataatg ttgtggcaaa gaaatgtgga agggaagatc gccaacagcc gaagcaggag caacgacccc ggagcagatg atagggggaa tgtggacata agaaatctgt gtaccagtaa gaagaaaaaa tcaaaaattg agtactaaat tgggaagttc gtactggatg actgcattta gtgcttccac ttagagcctt tatgtaggat catctgttga ctttggatgg gaaaaagaca agtcagattt gcactaacag gagattctaa gaaatacaga aatctgaaaa ttaacagagg aaatttaaac gccacctgga cagttagaga agggagacta _ Primers Forward e Reverse 1 e 2 step _ Protease gene start/end _ Protese resistance Mutations _ RT resistance Mutations _ RT gene start/end Pag.4
