Lesson #2
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Applicazioni biotecnologiche in systems biology Lezione #2 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013 Contatti Dr. Marco Galardini Dip. Di Biologia Via Madonna del Piano 6, Polo Scientifico S. Fiorentino (c/o Incubatore delle idee) Email: [email protected] Tel: 0554574737 Systems biology Principali tecnologie di sequenziamento e controllo qualità Lezione #2 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013 Sequenziamento del genoma Genoma: intera sequenza nucleotidica di un organismo Sequenziamento: determinazione di una sequenza nucleotidica Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 – Sequenziamento chimico Generazione 1 – Dye-terminator Generazione 2 – NGS con pre-amplificazione Generazione 3 – NGS su singola molecola NGS: Next Generation Sequencing Sequenziamento del genoma Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 - Maxam & Gilbert Generazione 1 - Sanger Generazione 2 – Pyrosequencing (454), Solexa-Illumina, Solid, Ion Torrent Generazione 3 –PACBIO RS, Nanopore Evoluzione del sequenziamento 1977 Frederick Sanger Prima tecnica di sequenziamento 1987 Applyed Biosystems Prima macchina automatica per il sequenziamento del DNA 1986 Leeroy E.Hoods Prima macchina semiautomatica per il sequenziamento del DNA 1996 Pål Nyrén Nascita del pyrosequencing 1998 Phil Green and Brent Ewing Viene pubblicato il softwere “Phred” per l’analisi di sequenze di DNA 2000 Lynx Therapeutics Lancio sul mercato del “MPSS” e inizio del sequenziamento di nuova generazione (NGS) Evoluzione del sequenziamento 1977 Frederick Frederick Sanger Sanger Prima tecnica di sequenziamento 1987 Applyed Biosystems Prima macchina automatica per il sequenziamento del DNA Qualità e controllo dei dati ottenuti 1986 Leeroy E.Hoods Prima macchina semiautomatica per il sequenziamento del DNA Riduzione del costo Quantità di dati 1998 Green and Brent Ewing nell’unità di Phil tempo 1996 Pål Nyrén Nascita del pyrosequencing Viene pubblicato il softwere “Phred” per l’analisi di sequenze di DNA 2000 Lynx Therapeutics Lancio sul mercato del “MPSS” e inizio del sequenziamento di nuova generazione (NGS) Automatismi di sequenziamento ? Automatismi di sequenziamento Maggiore automazione, industrializzazione del sequenziamento Concentrazione di sequenziatori presso centri genomici (economia di scala) Riduzione del numero di singoli sequenziatori presso laboratori di ricerca Utilizzo della genomica per applicazioni cliniche, farmaceutiche, industriali Incremento della complessità Sanger sequencing Risorse per la lettura ed immagazzinamento delle sequenze Quantità di basi lette Nell’unità di tempo NGS Sequenziamento del genoma Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 - Maxam & Gilbert Generazione 1 - Sanger Generazione 2 – Pyrosequencing (454), Solexa-Illumina, Solid, Ion Torrent Generazione 3 –PACBIO RS, Nanopore Generazione 1 - Sanger ovvero l’idea geniale dei dideossi! Sanger sequencing: Cycle Sequencing Molecola segnale La bassa percentuale di ddNTP fa sì passi del tempo prima che la sintesi venga interrotta Animation @ dnalc Sequenziamento manuale • Di-deossi nucleotidi radioattivi • Una lane per ogni nucleotide • Esistono sequenziatori automatici che leggono automaticamente i gel di poliacrilamide Sequenziamento automatico • Di-deossi nucleotidi fluorescenti • Un colore per ogni nucleotide • Una singola lane per i 4 nucleotidi • Separazione attraverso elettroforesi capillare • Lettura nucleotidi tramite laser • Macchinari multi-capillari per letture in parallelo Cromatogramma Lunghezza dei frammenti raggiunta: fino a 1000 bp Cromatogramma – possibili errori Sovrapposizione fra i picchi Omonucleotidi Difficile separazione fra i picchi Sovrapposizione fra i picchi Necessario un approccio algoritmico per determinare la qualità dei cromatogrammi ed individuare la giusta sequenza Generazione 2 – NGS con pre-amplificazione Pyrosequencing (454) Solexa-Illumina Solid (Anche la tecnica Sanger prevede un’amplificazione del dna prima del sequenziamento, con successiva ligazione di un primer) NGS, seconda generazione NGS, seconda generazione Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator) NGS, seconda generazione 454 pyrosequencing Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator) Illumina (Solexa) SOLiD Ion semiconductor DNA nanoball Helioscope SMRT/RNAP NGS, seconda generazione 454 pyrosequencing Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator) Illumina (Solexa) SOLiD Ion semiconductor DNA nanoball Helioscope SMRT/RNAP Il Pyrosequencing (o 454) La tecnologia 454 • Da 400 a 700 basi per read • Circa la metà rispetto al Sanger • 400-600 megabasi ogni 10 ore • Più veloce del Sanger • Costi medio alti • Impossibilità di sequenziare correttamente più di 8 basi identiche consecutive (omonucleotidi) Il Pyrosequencing (o 454) • Amplificazione tramite emulsion PCR (emPCR) • Multiple reazioni di PCR nella stessa provetta • Sospensioni acquose in “olio” • Frantumazione DNA • Primer di PCR legati a microsfere • Intrappolamento microsfere in micropiastra • Una microsfera per pozzetto La tecnologia 454 Il Pyrosequencing (o 454) Pirosequenziamento • Inserimento di un nucleotide per volta • Incorporazione di un nucleotide da parte della DNA polimerasi comporta lo sviluppo di luce • Rilevazione da parte di una videocamera La tecnologia 454 Importante: Cosa succede quando aggiungo ATP? Importante: Cosa succede quando aggiungo ATP? Al posto dell’ATP si usa d-alpha-thio triphosphate (non utilizzata dalla luciferasi) Il Solexa-Illumina La tecnologia Solexa, cioè sequencing on-a-chip • • • • Circa 100 basi per read 10 milioni di reads per spot Ridotti costi di sequenziamento Profondità di sequenziamento elevata Video Overview • Frammentazione + ligazione adattatori • Annealing sul chip • Amplificazione tramite bridge PCR • Amplificazione tramite bridge PCR • Formazione di cluster densi e separati • Ogni cluster contiene una singola sequenza • Aggiunta di nucleotidi fluorescenti • Terminatori reversibili (il fluoroforo può essere clivato) • Lettura di una base per volta, ma in parallelo su molti cluster Lunghezza dei frammenti raggiunta: 100 basi (in pair-end) Il SOliD – Sequencing by ligation • No DNA polimerasi • Utilizzo dell’enzima ligasi • • • • • Reads di 150 bp massimo (generalmente 35 bp) Massima accuratezza Vengono utilizzati sonde con due basi Ogni base della sequenza viene «letta» due volte Costi bassi • Pre-amplificazione con emPCR su microsfere • Ligazione delle microsfere su un vetrino Sequencing by Ligation 1. Primers hybridize to the P1 adapter sequence on the templated beads. 2. A set of four fluorescently labeled di-base probes compete for ligation to the sequencing primer. Specificity of the di-base probe is achieved by interrogating every 1st and 2nd base in each ligation reaction. 3. Multiple cycles of ligation, detection and cleavage are performed with the number of cycles determining the eventual read length. 4. Following a series of ligation cycles, the extension product is removed and the template is reset with a primer complementary to the n-1 position for a second round of ligation cycles. Lunghezza dei frammenti raggiunta: 35-75 basi Video Ion Torrent • • • • • Amplificazione tramite emPCR su microsfere (intrappolate in micropozzetti) Utilizzo di normali dNTP L’incorporazione di un dNTP rilascia un protone (H+) Rilevazione della differenza di voltaggio (ΔV) ΔV proporzionale al numero di nucleotidi incorporati Lunghezza dei frammenti raggiunta: oltre 100 basi Previsto nuovo CMOS chip da 400 basi entro dicembre 2011 Generazione 3 Oxford Nanopore PacBio – Single Molecule Real Time sequencing (SMRT) • Sequenziamento a singola molecola di DNA • Amplificazione iniziale tramite PCR non necessaria • Riduzione di bias dovuti all’amplificazione (amplificazione differenziale di alcune parti della sequenza) Oxford Nanopore • Tecnologia ancora molto sperimentale • Vari metodi per determinare i singoli nucleotidi PacBio RS - SMRT Technology Filmato SMRT • Pozzetti con volume 10-21 litri (zeptolitri) • Aggiunta sequenziale di dNTP marcati con fluorofori • Determinazione incorporazione tramite ZMW (zero-mode waveguide) Lunghezza dei frammenti raggiunta: 860-1100bp (esperimenti con circa 2.5 kb) Qualità dei sequenziamenti Dalla reazione alla sequenza Qualità dei sequenziamenti Sequence: ?????????????????????????????????? Qualità dei sequenziamenti Come è possibile risalire alla sequenza di DNA sequenziata? • Necessità di trovare un modo univoco per l’interpretazione dei cromatogrammi. E’ possibile ripetere il processo per milioni di volte? • Necessità di sviluppare algoritmi in grado di assegnare ad ogni picco una determinata base in modo automatico. Qualità dei sequenziamenti Qualità dei sequenziamenti G Qualità dei sequenziamenti G C Qualità dei sequenziamenti G C A Qualità dei sequenziamenti G C A G Qualità dei sequenziamenti ………… G C A G C G A • Durante l’elettroforesi capillare frammenti di lunghezza diversa possono non essere ben separati • Lettura simultanea di basi diverse • Man mano che il sequenziamento procede verso la fine del segmento di DNA, la qualità andrà a diminuire (anche all’inizio) • Una bassa qualità può significare una sequenza diversa da quella reale Base-calling algorithm Algoritmo che, data una serie di picchi cromatografici, sia in grado di risalire alla corretta sequenza di DNA che li ha generati ed assegnare ad ogni base una certa «qualità» Phred E’ l’algoritmo più utilizzato. Ad oggi la qualità delle sequenze di DNA viene espressa utilizzando il suo score Base-calling algorithm Vengono presi in considerazione i principali parametri relativi alla forma ed all’ampiezza dei picchi; in base a questi viene calcolato un certo valore di qualità relativo ad ogni base. Base-calling algorithm Vengono presi in considerazione i principali parametri relativi alla forma ed all’ampiezza dei picchi; in base a questi viene calcolato un certo valore di qualità relativo ad ogni base. La qualità così ottenuta è strettamente legata alla probabilità di ottenere quella determinata base in quel punto del cromatogramma Base A C Quality 40 30 Qualità e Probabilità Q = Qualità (Phred Score) P = Probabilità di errore Q = -10log10(P) P = 10-Q/10 BASES A ERROR QUALITY 20 C T G 30 40 50 Qualità e Probabilità Q = Qualità (Phred Score) P = Probabilità di errore Q = -10log10(P) P = 10-Q/10 BASES A ERROR 1% QUALITY 20 Ad esempio: una qualità pari a 20 si traduce in una probabilità di errore dell’1%, mentre una qualità pari a 30 si traduce in una probabilità dello 0.1% C 0.1% 30 T 0.01% 40 G 0.001% 50 Qualità e Probabilità BASES A ERROR 1% QUALITY 20 Base scartata C 0.1% 30 T 0.01% 40 G 0.001% 50 Qualità generalmente accettata Importante: Una probabilità d’errore dell’1% può sembrare bassa Bisogna tenere conto che vengono sequenziate milioni di basi 1% = 10’000 basi errate ogni Mb Queste basi errate possono essere confuse per mutazioni -> implicazioni cliniche gravi! Dal sequenziamento al genoma Dalle reads alle sequenze (più o meno) complete • Tutte le tecniche di sequenziamento portano alla produzione di molte sequenze corte (35-2000 bp) • Il genoma batterico più corto è circa 1Mb (500 volte la reads più lunga) • Un gene batterico è lungo in media 300 bp • Necessario unire insieme le varie reads per ottenere un genoma Trimming, Assembling, Scaffolding
