ESERCIZIO 2 - e

ESERCIZIO 2.
Giochiamo un po’ con il cDNA della rcSHMT
Vogliamo clonare il gene della rcSHMT nel vettore pUC19 (vedi mappa in figura).
A) Possiamo farlo in vari modi, le metodologie del DNA ricombinante lasciano
spazio alla fantasia. Ipotizziamo un paio di modi, per i quali dovrete disegnare i
primer opportuni per la reazione di PCR che serve per la produzione del
frammento da inserire nel vettore:
1. Clonaggio utilizzando il sito di restrizione SmaI (che taglia con estremità
blunt end).
i. Nota1: possiamo usare il sito di restrizione per SmaI?
ii. Nota2: per la reazione di PCR utilizzeremo una polimerasi proofreading, ossia con attività 3’-5’ esonucleasica, che produce
frammenti blunt end).
iii. Nota 3: come facciamo poi a distinguere fra i due possibili
orientamenti con cui si inserisce il frammento nel sito SmaI del
vettore?
2. Clonaggio utilizzando SmaI (a monte) e EcoRI (a valle). Nota 4: con questo
tipo di clonaggio potremo avere problemi di orientamento del
frammento?
B) Ipotizzate gli stessi clonaggi, prendendo però in considerazione solo il
dominio dell’SHMT che lega il cofattore, il cosiddetto large domain, per vedere se
questo dominio è sufficiente per la funzionalità dell’enzima. Il dominio da
clonare va dalla tirosina in posizione 73 (Y73) all’aminoacido in posizione 310.
Aiutatevi con la sequenza del cDNA che codifica per l’SHMT (Allegato 1) e con il
codon usage (Allegato 2)
C) La lisina in posizione 257 è essenziale per il legame del cofattore piridossale5’-fosfato all’enzima. Per verificare se questo residuo è effettivamente
fondamentale per il funzionamento dell’SHMT vogliamo mutarlo in arginina e in
glutammina. Disegnate le due coppie di primer per generare le due forme
mutanti corrispondenti: K257R e K257Q.