ESERCIZIO 2. Giochiamo un po’ con il cDNA della rcSHMT Vogliamo clonare il gene della rcSHMT nel vettore pUC19 (vedi mappa in figura). A) Possiamo farlo in vari modi, le metodologie del DNA ricombinante lasciano spazio alla fantasia. Ipotizziamo un paio di modi, per i quali dovrete disegnare i primer opportuni per la reazione di PCR che serve per la produzione del frammento da inserire nel vettore: 1. Clonaggio utilizzando il sito di restrizione SmaI (che taglia con estremità blunt end). i. Nota1: possiamo usare il sito di restrizione per SmaI? ii. Nota2: per la reazione di PCR utilizzeremo una polimerasi proofreading, ossia con attività 3’-5’ esonucleasica, che produce frammenti blunt end). iii. Nota 3: come facciamo poi a distinguere fra i due possibili orientamenti con cui si inserisce il frammento nel sito SmaI del vettore? 2. Clonaggio utilizzando SmaI (a monte) e EcoRI (a valle). Nota 4: con questo tipo di clonaggio potremo avere problemi di orientamento del frammento? B) Ipotizzate gli stessi clonaggi, prendendo però in considerazione solo il dominio dell’SHMT che lega il cofattore, il cosiddetto large domain, per vedere se questo dominio è sufficiente per la funzionalità dell’enzima. Il dominio da clonare va dalla tirosina in posizione 73 (Y73) all’aminoacido in posizione 310. Aiutatevi con la sequenza del cDNA che codifica per l’SHMT (Allegato 1) e con il codon usage (Allegato 2) C) La lisina in posizione 257 è essenziale per il legame del cofattore piridossale5’-fosfato all’enzima. Per verificare se questo residuo è effettivamente fondamentale per il funzionamento dell’SHMT vogliamo mutarlo in arginina e in glutammina. Disegnate le due coppie di primer per generare le due forme mutanti corrispondenti: K257R e K257Q.