ProSpecT Adenovirus
Saggio su micropiastra
R240096 ....................
96
IT
1.
USO PREVISTO
Il saggio su micropiastra ProSpecTTM Adenovirus è un
immunodosaggio enzimatico qualitativo per la ricerca
dell’adenovirus nelle feci umane o in monostrati di colture
cellulari infettati.
2.
SOMMARIO
Gli adenovirus sono virus a DNA privi di involucro a simmetria
icosaedrica. La famiglia degli Adenoviridae comprende due
generi: gli adenovirus dei mammiferi (Mastadenovirus) e gli
adenovirus degli uccelli (Aviadenovirus)1. Sino ad ora sono stati
individuati almeno 51 sierotipi di adenovirus diversi. Essi sono
raggruppati in sei sottogruppi indicati dalle lettere A-F e sono stati
identificati e caratterizzati mediante emoagglutinazione, test di
neutralizzazione, test di ibridizzazione del DNA e analisi del DNA
adenovirale con endonucleasi di restrizione1,2,3,4,31.
Gli adenovirus umani, negli individui immunocompetenti e
immunocompromessi, sono associati a un’ampia gamma di
sindromi cliniche che includono infezioni del tratto respiratorio,
della congiuntiva e del tratto gastrointestinale3,5. Le infezioni
sono comuni nei bambini e possono manifestarsi sotto
forma di infezioni sporadiche o di epidemie. Circa il 5% delle
malattie respiratorie acute nei bambini e il 10% delle malattie
febbrili e delle polmoniti infantili sono associati a infezioni da
adenovirus3,6,7. Le infezioni oculari causate da adenovirus possono
provocare febbre faringocongiuntivale, congiuntivite follicolare o
cheratocongiuntivite epidemica3,8.
I sierotipi 40 e 41 dell’adenovirus sono comunemente associati
alla gastroenterite virale infantile e sono ritenuti responsabili del
4-15% delle infezioni nosocomiali nei reparti pediatrici3,9,10. Nei
pazienti con sistema immunitario compromesso (ad esempio
i pazienti trapiantati o i pazienti affetti da AIDS) possono
manifestarsi infezioni sistemiche gravi potenzialmente pericolose
per la vita3.
La diagnosi di laboratorio delle infezioni da adenovirus ha un ruolo
importante nella gestione dei pazienti e consente un’efficace
gestione e controllo delle epidemie. I metodi diagnostici
includono la ricerca diretta del virus o delle proteine virali in
campioni clinici, l’isolamento di virus vitali in monostrati di colture
cellulari inoculati con campioni respiratori, congiuntivali o fecali,
o mediante ricerca di immunoglobuline adenovirus specifiche3,5.
L’isolamento degli adenovirus da campioni clinici può essere
ottenuto in linee cellulari continue di origine essenzialmente
epiteliale, incluse le linee cellulari HeLa, Hep2, KB e 293, nelle
quali gli adenovirus possono produrre un effetto citopatico
caratteristico3,5. Per confermare l’identificazione di isolati
dell’adenovirus sono state utilizzate varie tecniche, tra cui test
di neutralizzazione, radioimmunodosaggio, ibridazione del
DNA, microscopia elettronica e elettroforesi del DNA11,12,13,14,15.
Queste tecniche possono essere complesse, laboriose, possono
richiedere tempo e risultano spesso inappropriate per l’uso di
routine.
Gli adenovirus associati a gastroenterite virale possono essere
ricercati direttamente in campioni fecali con la microscopia
elettronica11,16, una tecnica tuttavia disponibile solo in laboratori
specializzati.
Più recentemente è stato descritto l’uso dell’immunofluorescenza
diretta (ad esempio l’IMAGEN Adenovirus) o degli immunodosaggi
enzimatici con anticorpi monoclonali o policlonali specifici per la
ricerca diretta dell’adenovirus in campioni clinici o in monostrati
di colture cellulari15,17,18.
5.
CONTENUTO DEL KIT
96 - Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96
determinazioni. - La stabilità del kit è indicata sull’etichetta
all’esterno della confezione.
Conservare tutti i componenti a 2-8°C.
Prima dell’uso portare tutti i reagenti a temperatura ambiente
(20-25°C) e miscelare delicatamente. Conservare tutti i reagenti
non utilizzati a 2-8°C dopo l’uso.
L’immunodosaggio enzimatico è un metodo rapido, sensibile e
specifico per la ricerca e la conferma degli isolati di adenovirus in
monostrati di colture cellulari o in campioni fecali.
Tutti i reagenti tranne il tampone di lavaggio sono forniti pronti per
l’uso. Se i reagenti sono versati per l’uso con pipette multicanale,
non versare nuovamente nel flacone il reagente in eccesso.
Il saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus è un
immunodosaggio per la rilevazione di tutti i sierotipi di adenovirus
umani in campioni fecali o in monostrati di colture cellulari. Il test
utilizza un anticorpo monoclonale genere-specifico per ricercare
un epitopo dell’antigene hexon dell’adenovirus che è presente in
tutti i sierotipi umani19.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
Il saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus utilizza un
anticorpo monoclonale in un immunodosaggio enzimatico tipo
sandwich in fase solida per ricercare un epitopo dell’antigene
hexon genere-specifico dell’adenovirus. Micropozzetti separabili
sono ricoperti con un anticorpo monoclonale specifico per
l’adenovirus. Nel micropozzetto si aggiunge una sospensione
fecale o un fluido di coltura cellulare non diluito da incubare
contemporaneamente a un anticorpo monoclonale specifico
per adenovirus coniugato con perossidasi di rafano. L’antigene
di adenovirus presente nel campione è catturato fra l’anticorpo
sulla fase solida e l’anticorpo coniugato con l’enzima. Dopo 60
minuti di incubazione a temperatura ambiente, i micropozzetti
sono lavati con tampone di lavaggio alla concentrazione di lavoro
per eliminare il campione in eccesso e l’anticorpo marcato con
l’enzima non legato. Un cromogeno è aggiunto ai micropozzetti
e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente. La presenza
di un anticorpo marcato con enzima specificamente legato nei
micropozzetti è evidenziata da uno sviluppo di colorazione che
viene bloccato mediante l’aggiunta di un acido. Un’intensità di
colorazione significativamente al di sopra dei livelli di riferimento
è indicativa della presenza dell’antigene di adenovirus nel
campione o nel controllo.
4.
DEFINIZIONI DEI SIMBOLI
Nelle informazioni del prodotto sono utilizzati i simboli seguenti.
Codice del prodotto e numero di catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
N
Contiene materiale sufficiente per ‘N’ test
Fabbricato da
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Utilizzare entro
Codice del lotto
Limiti di temperatura di conservazione
Istruzioni per l’uso
Pipette di trasferimento
Coperchio per micropiastra
Certificato del contenuto
Scheda della procedura
Una piastra per microtitolazione da
96 pozzetti in 12 strisce separabili di 8
micropozzetti ricoperti con un anticorpo
monoclonale specifico per adenovirus. Una
confezione di alluminio sigillabile contenente
essiccante per la conservazione dei
micropozzetti non utilizzati. I micropozzetti
possono essere utilizzati entro 16 settimane
dalla prima apertura se sono conservati
correttamente nella confezione.
Un flacone di ciascuno dei seguenti salvo diversa indicazione:
120 ml di diluente per campione: soluzione
salina di tampone tris contenente un agente
antimicrobico e un colorante rosso
4 ml di controllo positivo: adenovirus tipo 7
inattivato in tampone contenente un agente
antimicrobico
4 ml di controllo negativo: soluzione salina
di tampone tris contenente un agente
antimicrobico e un colorante rosso
12 ml di coniugato: anticorpo monoclonale
specifico per adenovirus coniugato con
perossidasi di rafano in una soluzione
proteica tamponata contenente un agente
antimicrobico e un colorante blu
120 ml di tampone di lavaggio concentrato
(x10): soluzione di tampone fosfato con
agente antimicrobico e detergente
Diluire soluzione di lavaggio 10x concentrata
aggiungendo 1 parte di concentrato a 9 parti
di acqua distillata o deionizzata. Il tampone
di lavaggio diluito è stabile sino a 30 giorni se
conservato a 2-8°C.
12 ml di substrato: 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina
in un tampone leggermente acido
12 ml di soluzione bloccante: acido solforico
0,46 mol/L
6.
PRECAUZIONI
- Per uso diagnostico in vitro. Il personale che esegue un
saggio utilizzando questo prodotto deve essere specializzato
nell’uso del test ed esperto in procedure di laboratorio.
Fare riferimento alla scheda di sicurezza (SDS) e all’etichetta
del prodotto per informazioni su componenti potenzialmente
pericolosi.
INFORMAZIONI SU SALUTE E SICUREZZA
6.1. Il controllo positivo contiene adenovirus tipo 7 inattivato
che è stato dimostrato non infettare la coltura cellulare.
Il controllo deve tuttavia essere maneggiato e smaltito
come potenzialmente infetto.
6.2.
La soluzione bloccante contiene acido solforico (0,46
mol/L).
6.3.
Il tampone di lavaggio contiene un potenziale
sensibilizzante della cute (<1% v/v (percentuale in
volume)). Evitare il contatto con la pelle. Utilizzare guanti
in vinile o nitrile monouso.
6.4.
Non mangiare, bere, fumare, conservare né preparare cibi
o applicare cosmetici nell’area di lavoro designata.
6.5.
Non pipettare i materiali con la bocca.
6.6.
Durante la manipolazione dei campioni clinici e dei
reagenti si raccomanda l’utilizzo di guanti monouso.
Lavare sempre le mani dopo aver lavorato con materiale
infetto.
6.7.
Smaltire tutti i campioni clinici in conformità alle
normative locali.
6.8.
I reagenti ProSpecT Adenovirus contengono un agente
antimicrobico brevettato che non presenta rischi per
l’utilizzatore qualora siano seguite le normali precauzioni
di sicurezza di laboratorio.
6.9.
A causa dell’affinità di alcuni adenovirus per la zona
oculare, va accuratamente evitato il contatto tra mano e
occhio in tutte le fasi dell’analisi dei campioni.
PRECAUZIONI ANALITICHE
6.10. I componenti non devono essere usati dopo la data di
scadenza indicata sull’etichetta. Per non compromettere
i risultati, non mischiare o scambiare tra loro i seguenti
reagenti: piastra, coniugato e controlli.
6.11. In tutta la gamma di prodotti ProSpecT possono essere
usati i comuni reagenti indicati di seguito: tampone di
lavaggio, substrato TMB e soluzione bloccante.
6.12. Evitare la contaminazione dei reagenti.
6.13. Quando si utilizza il metodo della boccetta contagocce,
verificare che tutti i controlli e i reagenti siano aggiunti allo
stesso modo (il rendimento del kit può essere influenzato
negativamente se si utilizza una combinazione dei metodi
con pipetta e contagocce).
6.14. Utilizzare pipette monouso o puntali differenti per
ogni campione, controllo o reagente (se non si
utilizzano boccette contagocce) per evitare una crosscontaminazione dei campioni, dei controlli o dei reagenti,
che potrebbe determinare risultati incorretti.
6.15. Conservare l’acqua deionizzata o distillata per la diluizione
dei reagenti concentrati in contenitori puliti per evitare il
rischio di contaminazione microbica.
6.16. Evitare la contaminazione con ioni metallici e agenti
ossidanti.
6.17. Non utilizzare il substrato se presenta una colorazione blu
prima dell’aggiunta nei micropozzetti.
6.18. Proteggere il substrato dalla luce.
6.19. I micropozzetti non possono essere riutilizzati.
6.20. La quantità inutilizzata di tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro può essere conservata sino a 30
giorni a 2-8°C per il successivo utilizzo. I contenitori per
il tampone di lavaggio, al termine dell’utilizzo, devono
essere sciacquati con acqua deionizzata o distillata e
lasciati asciugare all’aria.
6.21. L’attrezzatura per il lavaggio, manuale o automatico,
deve essere priva di contaminazione microbica, calibrata
correttamente e conservata conformemente alle istruzioni
del fabbricante.
6.22. Quando si utilizzano boccette contagocce di reagente,
tenerle verticalmente con il beccuccio circa 5 mm
sopra il micropozzetto. Schiacciare delicatamente il
flacone e verificare che le gocce cadano liberamente
nei micropozzetti senza toccare lateralmente il pozzetto.
Evitare la contaminazione di tutti i beccucci dei contagocce.
7.
RACCOLTA DI CAMPIONI FECALI E DI COLTURE
CELLULARI
RACCOLTA DI CAMPIONI FECALI
I campioni fecali devono essere raccolti il più presto possibile
dopo la comparsa dei sintomi.
Secondo quanto riportato, l’escrezione massima di adenovirus
nelle feci di pazienti con gastroenterite si manifesta nel giro di
3-13 giorni dopo la comparsa dei sintomi3.
I campioni fecali per l’analisi diretta devono essere raccolti in
contenitori privi di mezzi, preservanti, sieri di origine animale, ioni
metallici, agenti ossidanti o detergenti, poiché sono tutti additivi
che possono interferire con il test ProSpecT Adenovirus.
I tamponi rettali raccolti devono contenere materiale fecale
sufficiente per ottenere una sospensione di feci al 10% (vedere
sezione 8 A).
I campioni possono essere conservati per 8 giorni a 2-8°C prima
dell’analisi. In caso di conservazione a lungo termine, conservare
i campioni fecali a -20°C.
RACCOLTA DI CAMPIONI DI COLTURE CELLULARI
La raccolta dei campioni è di importanza fondamentale nella
diagnosi di adenovirus da coltura cellulare. I campioni devono
essere raccolti dal sito di infezione nel momento di escrezione
virale massima in modo che contengano più materiale infettato
possibile. I tamponi congiuntivali, nasali e/o faringei o gli altri
tipi di tamponi raccolti devono essere posti in un mezzo di
trasporto virale utilizzato di routine per l’isolamento del virus e
inviati immediatamente al laboratorio. Il momento ottimale per
la raccolta dei campioni è il prima possibile dopo l’insorgenza
dei sintomi. Le secrezioni o gli aspirati nasofaringei devono
essere raccolti in un estrattore di muco mediante una sonda di
alimentazione di misura 8. L’estrattore di muco e la sonda devono
essere inviati immediatamente in laboratorio per il trattamento.
8.
PROCEDIMENTO
MATERIALI NECESSARI FORNITI
Vedere Contenuto del kit, sezione 5
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
Contenitori per la raccolta dei campioni fecali
Contenitori monouso con tappo a vite puliti (capacità minima 3
ml) per la preparazione del campione fecale
Carta assorbente pulita (per asciugare i micropozzetti)
Micropipette di precisione e puntali monouso per la dispensazione
di 50 µl, 100 µl e 1000 µl
Contenitore per i rifiuti di scarto con disinfettante fresco idoneo
Timer
Spruzzetta per il tampone di lavaggio
Acqua distillata o deionizzata
MATERIALI OPZIONALI NON FORNITI
Lettore per micropiastre in grado di leggere a 450nm (con
riferimento 620-650 nm opzionale)
Vortex con adattatore piastra o agitatore/incubatore
Lavapiastre automatico o altra attrezzatura idonea per il lavaggio
di strisce da 8 micropozzetti
PROCEDIMENTO
8.1. Aprire la confezione di alluminio, togliere il numero
di strisce di micropiastra richiesto e posizionarle in un
portastrisce. Usare un pozzetto per il controllo negativo
e un pozzetto per quello positivo. Se si usano meno di 8
pozzetti, staccare il numero richiesto di pozzetti da una
striscia e riporre i pozzetti inutilizzati nella confezione
di alluminio con l’essiccante. RISIGILLARE BENE LA
CONFEZIONE PER ESCLUDERE LA PRESENZA DI UMIDITÀ E
CONSERVARLA DI NUOVO A 2-8°C.
A. DILUIZIONE DI CAMPIONI FECALI
Aggiungere 1 ml di diluente per campione in un contenitore
idoneo opportunamente contrassegnato per la preparazione di
una sospensione al 10% o per la diluizione del campione fecale
con circa 0,1g di feci formate (pari alle dimensioni di un pisello
piccolo) o circa 100 µl di feci liquide utilizzando le apposite
pipette di trasferimento. Mescolare bene e lasciare la pipetta di
trasferimento nel contenitore per un uso successivo.
B.
Le raccolte di colture cellulari devono essere conservate a 2-8°C
e devono essere analizzate entro 72 ore dalla raccolta. In caso di
conservazione a lungo termine delle raccolte di colture cellulari,
conservare a -20°C o a una temperatura inferiore.
8.2.
Aggiungere 2 gocce (o 100 µl) di ciascun campione diluito,
fluido di coltura cellulare, controllo negativo o controllo
positivo in micropozzetti differenti. Includere almeno un
controllo negativo e un controllo positivo in ciascun lotto
di test.
8.3.
Dopo aver introdotto tutti i campioni e i controlli,
aggiungere 2 gocce (o 100 µl) di coniugato al contenuto
di ciascun micropozzetto e miscelare delicatamente per
20-30 secondi.
8.4.
Coprire la piastra e incubare a 20-30°C per 60 +/- 5 minuti.
8.5.
Aspirare il contenuto o svuotare i pozzetti capovolgendoli.
Lavare riempiendo completamente ogni pozzetto
con tampone di lavaggio diluito (~350-400 µl per
pozzetto). Aspirare o svuotare tutto il fluido dai pozzetti
capovolgendoli, dopo ogni lavaggio. In totale, lavare 5
volte. Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere il contenuto e
picchiettare la piastra su panni di carta puliti o aspirare.
Se si usa un lavapiastre automatico, questo deve essere
programmato per completare 5 cicli di lavaggio. I
lavapiastre devono essere calibrati correttamente per
assicurare che i micropozzetti siano riempiti e svuotati
completamente dopo ogni lavaggio. Dopo il lavaggio
finale, la piastra deve essere capovolta e picchiettata
su carta assorbente per rimuovere le tracce residue di
tampone di lavaggio.
Ruotare il tampone rettale in 1 ml di diluente per campione
premendolo contro la parete del contenitore per liberare il
materiale fecale. Miscelare bene.
Le sospensioni fecali precedentemente conservate nella
formalina devono essere ulteriormente diluite nel diluente
per campione ProSpecT Adenovirus in modo da preparare una
sospensione fecale al 10% prima dell’esecuzione dell’analisi.
I campioni sospesi/diluiti nel diluente per campione ProSpecT
Adenovirus possono essere conservati a 2-8°C fino a 8 giorni
prima dell’analisi.
NOTA: Sono idonei all’analisi con il test ProSpecT Adenovirus
anche i campioni fecali preparati con il diluente per campione
dei test ProSpecT Astrovirus, ProSpecT Rotavirus e ProSpecT
Norovirus. Non sono stati validati per l’uso diluenti per
campione di altra provenienza.
DILUIZIONE DI CAMPIONI DI COLTURE CELLULARI
I campioni di colture cellulari possono essere analizzati
direttamente nel test ProSpecT Adenovirus. I campioni raccolti
per la coltura cellulare devono essere inoculati nelle linee
cellulari utilizzate di routine in laboratorio per l’isolamento di
adenovirus, ad esempio le linee cellulari Hep2 o HeLa. Le colture
cellulari devono essere esaminate regolarmente per ricercare
la comparsa dell’effetto citopatico (CPE) caratteristico degli
adenovirus. L’effetto citopatico dell’adenovirus può svilupparsi
entro 2-7 giorni dall’inoculazione di linee cellulari, ma in alcuni
casi tale sviluppo può richiedere sino a 28 giorni. Il fluido di
coltura dei monostrati cellulari che evidenzia la presenza di
un CPE può essere raccolto e analizzato direttamente per la
presenza di adenovirus utilizzando il test ProSpecT Adenovirus.
9.
CONTROLLO DI QUALITÀ
Includere almeno un controllo positivo e un controllo negativo
ogni volta che si esegue l’analisi.
DETERMINAZIONE VISIVA
Tutti i micropozzetti del controllo negativo non devono presentare
alcuna colorazione. In caso contrario, i risultati del test non
possono essere determinati visivamente.
Il micropozzetto del controllo positivo deve evidenziare una
caratteristica colorazione blu distinguibile da quella del controllo
negativo.
DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMETRICA
Il valore del controllo negativo, o una media dei valori del controllo
negativo, deve essere inferiore a 0,150 unità di assorbanza.
Il valore del controllo positivo deve essere superiore a 0,500 unità
di assorbanza.
10.
RISULTATI
DETERMINAZIONE VISIVA
I campioni che evidenziano una colorazione blu più intensa
di quella del controllo negativo sono positivi. I campioni che
evidenziano una colorazione uguale o meno intensa di quella
del controllo negativo sono negativi. I micropozzetti nei quali
l’intensità di colorazione è di difficile interpretazione rispetto al
controllo negativo devono essere letti fotometricamente dopo
l’aggiunta della soluzione bloccante o rianalizzati.
DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMETRICA
10.1. I micropozzetti devono essere letti fotometricamente
entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante.
10.2. Miscelare il contenuto dei micropozzetti e leggere
l’assorbanza di ciascun micropozzetto su uno
spettrofotometro impostato a 450 nm. Prima della lettura,
pulire il fondo dei micropozzetti. Il lettore deve essere
azzerato contro aria prima di procedere alla scansione
della piastra.
10.3. Se lo spettrofotometro consente l’utilizzo di una lunghezza
d’onda di riferimento (da 620 e 650 nm), si raccomanda la
lettura a doppia lunghezza d’onda.
10.4. Calcolare il valore cut-off aggiungendo 0,100 unità di
assorbanza al valore del controllo negativo oppure
al valore medio quando è incluso più di un controllo
negativo.
10.5. Interpretare i risultati del test:
8.6.
Aggiungere 2 gocce (o 100 µl) di substrato a ogni
micropozzetto.
Positivo:
8.7.
Coprire la piastra e incubare a 20-30°C per 10 minuti.
Negativo:
8.8.
I micropozzetti possono essere letti visivamente subito
dopo la seconda incubazione (vedere sezione 9 e 10).
Equivoco:
8.9.
In alternativa, bloccare la reazione del substrato
aggiungendo 2 gocce (o 100 µl) di soluzione bloccante in
ciascun micropozzetto. Miscelare bene il contenuto dei
micropozzetti prima della lettura dei risultati. Il prodotto
colorato è stabile sino a 30 minuti dopo l’aggiunta della
soluzione bloccante.
8.10. Leggere spettrofotometricamente a 450 nm (vedere
sezione 9 e 10).
valore di assorbanza del campione clinico >
del valore cut-off
valore di assorbanza del campione clinico <
del valore cut-off
valore di assorbanza del campione clinico
entro 0,010 unità di assorbanza del valore
cut-off. È necessario rianalizzare campioni
o raccogliere un altro campione del
paziente
11.
LIMITAZIONI DI PERFORMANCE
11.1. La validità dei risultati con il dosaggio su micropiastra
ProSpecT Adenovirus dipende dall’efficacia delle reazioni
di controllo rispetto alle prestazioni attese. Vedere la
sezione Controllo di qualità 9.
11.2. Un risultato negativo non esclude la possibilità di
un’infezione da adenovirus nel paziente. La mancata
rilevazione dell’adenovirus può essere causata da diversi
fattori quali la raccolta del campione in un momento
inappropriato della malattia, quando i virioni sono
presenti in quantità troppo scarsa, il campionamento e/o
la manipolazione incorretti del campione o l’insufficienza
della coltura cellulare.
11.3. Il test ProSpecT Adenovirus rileva un antigene hexon
specifico del genere presente in tutti i sierotipi umani. Il
test non può essere usato per distinguere i diversi sierotipi.
11.4. I reagenti sono forniti a concentrazioni di lavoro fisse.
Qualsiasi alterazione dei reagenti o la conservazione non
conforme a quanto indicato nella sezione 5 può influire
negativamente sul risultato del test.
11.5. Un risultato negativo per una campione fecale può non
precludere la presenza di un’infezione con adenovirus non
enterici in altre sedi corporee. Se si sospetta un’infezione
respiratoria od oftalmica, i campioni prelevati dalla sede
dell’infezione devono essere messi in coltura.
11.6. Tutti i risultati positivi devono essere interpretati nel
contesto delle informazioni cliniche correlate al paziente
poiché l’adenovirus può avere una fase di latenza e
recrudescenza. L’escrezione asintomatica di un virus può
verificarsi fino a 18 mesi dopo l’infezione20. Adenovirus
enterici possono essere riscontrati in campioni fecali di
bambini asintomatici21.
11.7. L’uso del saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus
per l’analisi diretta di campioni diversi da quelli fecali
non è raccomandato poiché la presenza di un antigene
insufficiente o una raccolta dei campioni inadeguata
possono dare risultati negativi fuorvianti. Un risultato
positivo dei campioni fecali, associato a diarrea, è
fortemente indicativo di gastroenterite adenovirale10. I
sierotipi 40 e 41 dell’adenovirus, e occasionalmente il 31,
sono comunemente associati alla gastroenterite virale.
11.8. Un risultato positivo non preclude la presenza di altri
patogeni enterici. Dal momento che la relazione esistente
tra l’azione dell’adenovirus e il manifestarsi della
gastroenterite è ben definita, è possibile un’infezione
concomitante con altri patogeni microbici.
11.9. I campioni di meconio non sono stati validati per l’uso con
il saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus.
11.10. I risultati del test devono essere interpretati
congiuntamente con altre informazioni disponibili
ottenute da studi epidemiologici, con la valutazione
clinica del paziente e con altre procedure diagnostiche20.
12.
VALORI ATTESI
I tassi di positività possono variare in funzione della prevalenza
di adenovirus in diverse popolazioni, dell’ubicazione geografica,
del metodo di raccolta dei campioni, della manipolazione, della
conservazione e del trasporto dei campioni, del sistema di
coltura cellulare utilizzato e dello stato di salute generale della
popolazione di pazienti oggetto di studio.
La frequenza di insorgenza di infezioni dovute ad adenovirus
varierà in rapporto alla sindrome clinica e all’età dell’individuo. Nei
bambini sotto i 5 anni, circa il 5% dei casi di malattia respiratoria
acuta è dovuto all’adenovirus22.
Circa il 10% delle polmoniti infantili può essere causato da
adenovirus6. La cistite emorragica acuta nei bambini può essere
indotta da adenovirus nel 20-70% del casi23,24. Gli adenovirus
enterici (tipo 40 e 41) sono implicati in circa il 10% dei casi come
organismo causativo della gastroenterite pediatrica e compaiono
più frequentemente nei bambini di età inferiore ai 2 anni10.
Negli adulti, gli adenovirus sono a volte implicati nella cervicite
e nella malattia respiratoria acuta, specialmente tra le reclute
militari26. Infezioni oculari causate da adenovirus come la
cheratocongiuntivite epidemica e la cosiddetta “congiuntivite
delle piscine”, possono manifestarsi in tutti i gruppi di età27,28. Tutti
i gruppi di pazienti immunosoppressi possono essere infettati da
adenovirus29,30.
25
13.
CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Il saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus è stato valutato
in studi clinici eseguiti presso quattro centri. Gli studi sono stati
condotti su campioni fecali prelevati da pazienti con gastroenterite
e su monostrati di colture cellulari inoculati con campioni clinici
prelevati da pazienti con sospetta infezione da adenovirus. I
risultati del saggio su micropiastra ProSpecT Adenovirus sono
stati confrontati con il test al microscopio elettronico (ME) per
campioni fecali e con la neutralizzazione virale per campioni di
colture cellulari.
Tabella 13.2
Confronto fra il ProSpecT Adenovirus e i test
di neutralizzazione virale su isolati di colture cellulari
METODO
+
ProSpecT Adenovirus
Sensibilità
Specificità
Correlazione
Tabella 13.1
Confronto fra il test ProSpecT Adenovirus e il
microscopio elettronico per l’analisi di campioni fecali
METODO
ME
+
+
64
-
7**
1*
ProSpecT Adenovirus
Sensibilità
Specificità
Correlazione
*
**
104
90,1 %
99,0 %
95,5 %
Campione insufficiente per ripetere l’analisi.
È stato accertato mediante ME che tutti i campioni hanno
particelle del virus occasionali e da 5 campioni sono stati
isolati ceppi di adenovirus non fastidiosi (tipi 2, 4 e 5).
13.2. Campioni di colture cellulari
Quando sono stati analizzati i campioni delle colture cellulari, il
test ProSpecT Adenovirus ha mostrato una correlazione del 98%
(150/153)) con la neutralizzazione virale nella coltura cellulare.
La sensibilità e la specificità totale del test ProSpecT Adenovirus,
quando paragonate alla neutralizzazione virale, sono risultate pari
rispettivamente al 97,6% (82/84) e al 98,6% (68/69).
2
68
97,6%
98,6%
98,0%
LIMITE DI RICERCA
Un campione fecale positivo per adenovirus con conteggi delle
particelle virali stimate per ml determinati mediante ME è stato
diluito serialmente e analizzato con il test ProSpecT Adenovirus
per stabilire il limite di ricerca (vedere tabella 13.3). I risultati
indicano che possono essere rilevati conteggi delle particelle di
adenovirus dell’ordine di 3,0 x 105 per ml con il test ProSpecT
Adenovirus.
Tabella 13.3
Valori di assorbanza (A450) ottenuti con
titolazioni di un campione fecale contenente adenovirus
Particelle del
virus/ml (ME)
1,9x107
4,8x106
1,2x106
5,9x105
3,0x105*
7,4x104
Sono stati analizzati in totale 176 campioni fecali e 153 campioni
di colture cellulari. I risultati di questi studi sono riportati nelle
tabelle 13.1 e 13.2.
13.1. Campioni fecali
Quando sono stati analizzati i campioni fecali, il test ProSpecT
Adenovirus ha mostrato una correlazione del 95,5% (168/176)
con il microscopio elettronico. La sensibilità e la specificità totale
del test ProSpecT Adenovirus, quando paragonate al ME, sono
risultate pari rispettivamente al 90,1% (64/71) e al 99% (104/105).
NEUTRALIZZAZIONE VIRALE
+
82
1
Lettura dell’assorbanza media effettuata
utilizzando il test ProSpecT Adenovirus
1,85
1,75
0,84
0,45
0,21
0,10
*
Concentrazione di endpoint dell’adenovirus rilevata con il
test ProSpecT Adenovirus.
PRECISIONE
Precisione intra saggio
La precisione intra-saggio è stata valutata con tre campioni fecali e
tre campioni di colture cellulari. Ogni campione è stato analizzato
eseguendo un saggio singolo 32 volte e sono stati determinati il
valore medio e il coefficiente di variazione (n=32).
Tabella 13.4
Adenovirus
Stato del
campione
Negativo
Positivo
Positivo
Precisione intra-saggio del test ProSpecT
Campioni di colture cellulari
Au media
%CV
0,05
5,5
0,36
5,6
2,89
4,2
Campioni fecali
Au media
%CV
0,05
10,8
0,42
10,5
2,34
8,4
Inter saggio
La precisione inter-saggio è stata valutata con tre campioni fecali e
tre campioni di colture cellulari. Ogni campione è stato analizzato
in 12 diversi saggi e sono stati determinati i valori dell’assorbanza
media e il coefficiente di variazione (n=24).
Tabella 13.5
Adenovirus
Stato del
campione
Negativo
Positivo
Positivo
Precisione inter-saggio del test ProSpecT
Campioni di colture cellulari
Au media
%CV
0,05
7,3
0,24
8,6
2,02
5,3
Campioni fecali
Au media
%CV
0,05
7,6
0,33
5,4
1,75
7,9
REATTIVITÀ CROCIATA
Sono stati analizzati con il test ProSpecT Adenovirus e confermati
negativi i microrganismi indicati di seguito. I test di crossreattività sono stati eseguiti su campioni clinici di stato microbico
ben determinato o su colture di laboratorio di organismi noti
contenenti circa 107-108 organismi vitali/ml.
Virus
Astrovirus
Coronavirus
Cytomegalovirus
Echovirus 9, 11, 22, 32
Enterovirus
Foamy virus
Influenzavirus A e B
Parainfluenza 1, 2, 3, 4a, 4b
Piccolo virus strutturato rotondo
Poliovirus tipi 1, 2 e 3
Rhinovirus
Rotavirus
Virus Coxsackie A16, B2, B3, B4, B5
Virus del morbillo
Virus del vaiolo bovino
Virus della parotite
Virus di Epstein-Barr
Virus Herpes simplex tipi 1 e 2
Virus respiratorio sinciziale
Virus Sendai
Batteri
Acholeplasma laidlawii
Aeromonas spp
Bacillus spp
Bordetella pertussis
Branhamella catarrhalis
Campylobacter spp
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Clostridium difficile (tossina)
Clostridium perfringens (tossina)
Clostridium spp
Corynebacterium sp
E. coli enteropatogeno
E. coli enterotossigeno
Escherichia coli
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus spp
14.
Legionella spp
Listeria monocytogenes
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria flavascens
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C e D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Plesiomonas shigelloides
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella agona
Salmonella enteritidis
Salmonella typhimurium
Salmonella virchow
Shigella dysenteriae
Shigella sonnei
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp
Vibrio alginolyticus
Vibrio cholerae
Vibrio haemolyticus
Protozoi
Cryptosporidium sp
Giardia lamblia
Altri microorganismi
Candida spp
Microsporum spp
Pneumocystis carinii
Trichuris trichiura
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ProSpecT Adenovirus
IFU X7597B Revisione Marzo 2013
