Retrovirus
HIV
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HIV: la storia
1978: casi isolati di sindrome da
immunodeficienza negli Usa, Haiti,
Africa.
1981: Soggetti omosessuali con
sarcoma di Kaposi e rare infezioni, età
inferiore ai 60 anni
1982: CDC stabilisce la definizione di
AIDS.
1983: AIDS: è legata alle trasfusioni di
sangue, droghe per via IV, infezioni
transplacentari.
1983-84: HIV, identificato negli USA e
Francia.
1984: Primi casi di AIDS in Africa.
1984: Test anti-HIV.
1986: WHO strategia globale per il
controllo dell’AIDS.
1997: inizio della terapiaHAART(Highly
Active Anti-Retroviral Therapy)
HIV prevalence in adults
2011
I retrovirus:
Retrovirus
ücodificano per una DNA polimerasi RNA-dipendente o
trascrittasi Inversa (reverse transcriptase, RT)
üsi replicano attraverso un intermedio a DNA (provirus)
1970
D. Baltimore e H. Temin: scoperta della trascrittasi inversa
1975
Baltimore, Temin, Dulbecco: premio Nobel
Classificazione dei Retrovirus
3 sottofamiglie:
1. Oncovirinae B (MMTV), C (HTLV-1, -2 -5)
eD
(HTLV-1, leucemia acuta a cellule T
nell’adulto, mielopatia associata all’HTLV-1)
HTLV-2 (leucemia a cellule capellute)
2. Lentivirinae (HIV-1diffuso in tutto il
mondo, HIV-2 in Africa )
3. Spumavirinae (Human foamy virus)
HIV - Caratteri generali
- Forma sferica
- 2 copie di RNA a polarità +
- Presenza di mantello
- Diametro di 80-120nm
Presenza di:
ü una RT (trascrittasi inversa)
ü una integrasi
ü due RNA di trasferimento
cellulari (tRNA)
I tRNA si associano a ciascuna
copia del genoma mediante
appaiamento di basi e vengono
utilizzati come primer dalla
trascrittasi inversa.
Genoma HIV - 1
Due filamenti singoli di RNA, polarità positiva, 9.7
kb.
Tre geni strutturali: gag, pol, env
gag → proteine del capside (p 24), nucleocapside
(p 7), matrice (p17)
pol → enzimi virali (trascrittasi inversa, RNAsi,
integrasi, proteasi) p11, p66, p33
env → proteine dell’envelope (gp 120, gp41)
Organizzazione genoma virale
3 geni principali
gag “ group – antigen ”
pol “ polymerase”
env “ envelope”
LTR “long terminal repeat” non codificante , si lega a DNA
ospite
promotore della trascrizione
Organizzazione genoma virale
6 geni accessori , codificanti per proteine omologhe
vif, vpu,
vpr, tat,
rev,
nef
Proteine codificate dal genoma di HIV-1
Proteine strutturali:
• gag (p24, p17, p9, p7)
• pol (p10, p51, p32)
• env (gp120, gp41)
Proteine regolatorie:
• tat p14-15
• rev p19, p28
• nef p27
Proteine accessorie:
• vif, p23
• vpr
• vpu, p15,16
Prodotti dei geni accessori:
proteine regolatorie
tat (transactivating protein): transattivatore della traduzione di
geni virali e cellulari
rev (regulator of viral protein synthesis): regola il trasporto di
mRNA virale nel citoplasma
nef (negative factor): riduce l’espressione di CD4 e MHC I
sulle cellule, è richiesto per mantenere elevati livelli virali in
circolo
proteine accessorie
vif (virion infectivity factor): promuove assemblaggio e
maturazione
vpu (viral protein U): riduce l’espressione di CD4 e facilita il
rilascio del virus
vpr (viral protein R, vpx in HIV-2): trasporta il cDNA nel nucleo
HIV Genome and Gene Products
Ciclo di replica del virus HIV
FUSIONE
ATTACCO
al recettore CD4
= è la VAP
Ingresso e penetrazione
NB:
• Oltre ai linfociti T CD4 + sono cellule bersaglio
di HIV:
monociti
(sangue)
cellule follicolari dendritiche (linfonodi)
macrofagi alveolari
(polmoni)
cellule della microglia
(SNC)
• Monociti / macrofagi :
“serbatoio virale”,
“veicolo del virus”
•
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•
•
•
Replica di HIV
Legame di gp120 a CD4;
è richiesto un secondo recettore
Fusione del mantello con la
membrana cellulare
Rilascio del genoma nel
citoplasma
La RT utilizza il tRNA del virione
come primer e sintetizza un
filamento di DNA a polarità
negativa
La RT agisce anche da
ribonucleasi H degradando l’RNA
• La RT sintetizza poi la molecola di DNA a
polarità positiva complementare (cDNA)
• Durante la sintesi del DNA (retrotrascrizione)
le estremità del provirus comprendono le
sequenze uguali LTR (U3-R-U5)
• Questo processo crea sequenze necessarie
per l’integrazione e sequenze enhancer e
promoter per la regolazione della trascrizione
.
• The ends of the LTRs subsequently participate in
integration of the provirus into the host genome.
•Once provirus has been integrated, the LTR on the 5’
end serves as the promoter for entire retroviral
genome.
.
Il cDNA a doppio filamento migra
nel nucleo e si integra nel
genoma della cellula ospite
mediante l’integrasi.
La RT commette facilmente
degli errori che rendono
instabile geneticamente
il virus.
Una volta integrato, il DNA virale viene
trascritto come un gene cellulare ad
opera dell’RNApol II della cellula ospite.
La trascrizione del genoma permette di
produrre diversi mRNA contenenti le
sequenze dei geni gag, pol, env.
La replica dell’HIV è regolata dai prodotti
dei 6 geni accessori (tat, rev, nef,
vif, vpu, vpr)
Sembra che l’attivazione virale sia associata ad una attivazione cellulare
La trascrizione del provirus viene effettuata da una polimerasi cellulare
Il genoma di HIV codifica per tre classi di mRNA di diversa lunghezza:
1.mRNA che hanno subito eventi di splicing e codificano per proteine
regolatrici
2.mRNA non subiscono eventi di splicing e codificano per il genoma della
nuova progenie e proteine gag
3.mRNA che codificano per proteine di env che che subiscono eventi
singoli di splicing (introni rimossi e esoni uniti)
Tat rev e nef sono proteine precoci
vpu,vpr, vif gag pol env sono proteine tardive
• Le proteine tradotte dagli
mRNA vengono sintetizzate
sottoforma di poliproteine e
poi processate nelle proteine
funzionali. .
Gemmazione della particella virale.
Rilascio del virus dalla cellula: la proteasi virale
determina il taglio delle poliproteine gag-pol, env.
L’azione delle proteasi determina il rilascio e la
formazione del virione maturo, fino alla produzione
di virioni infettanti. La proteasi è un bersaglio dei
farmaci antivirali.
CDC/ C. Goldsmith, P. Feorino, E. L. Palmer, W. R. McManus
In sintesi
Meccanismo di replica di HIV ( I )
è retrotrascrizione (sintesi DNA per trascrittasi inversa
da RNA)
è degradazione dell’RNA da parte della RNAsi H
è sintesi del secondo filamento di DNA da primo
filamento
è migrazione del cDNA nel nucleo (diretta da vpr)
è integrazione (scissione del DNA ospite e DNA virale
in un punto preciso, inserimento nel genoma del
DNA complementare)
è latenza (1/1000 linfociti CD4 esprime RNA virale;
1/ 100 linfociti CD4 esprime DNA virale)
In sintesi
Meccanismo di replica di HIV ( II )
è slatentizzazione del virus (replica virale)
è trascrizione (regolata da tat) da parte della RNA
polimerasi II cellulare
è sintesi proteica:
tat, rev, nef sono definite proteine precoci
gag, pol, env e vif, vpu, vpr sono definite
proteine tardive
è taglio (proteasi) e glicosilazione delle proteine
è assemblaggio del virus
è rilascio del virus
è maturazione
HIV Life Cycle
Patogenesi e immunità
Il legame del virus alla cellula inizia con il legame della
gp 120 e della gp 41 al recettore cellulare CD4.
È richiesto un secondo recettore
inizialmente la gp 120 si lega
a CD4 sulle cellule della linea
monocito-macrofagica (MØ, DC)
virus M-tropico
+ secondo recettore: CCR5
(NSI: non-syncytium inducing
o virus R5)
in seguito la gp 120 si lega a CD4 su linfociti T naïve o helper
virus T-tropico
+ secondo recettore: CXCR4
(SI: syncytium inducing o virus X4)
I ceppi di HIV con entrambi i tropismi sono detti dual/mixed
n.b.: la deficienza genetica dei recettori per le chemochine
determina resistenza all’infezione (es. mutazione D32 di CCR5)
http://www.prn.org/index.php/management/article/hiv_tropism_1002
TROPISMO CELLULARE: USO DEL CORECETTORE DA PARTE DI HIV
Virus M-tropico
R5
Presente al momento
della trasmissione e nelle
fasi di latenza clinica
Macrofagi
CD4+
CCR5
Virus T-tropico
X4
Virus Dual-tropico
R5X4
Celule T
primarie
CD4+
CCR5
CXCR4
Presente nelle
fasi tardive della malattia
altamente citotossico
Linea
cellulare T
CD4+
CXCR4
Progressione clinica ad AIDS: R5 (
) vs dual/mixed tropic virus (
Daar et al, Clin Infect Dis. 2007;45:643-649
)
Il virus causa
• infezione litica nei linfociti T CD4+
Il virus induce la formazione di
sincizi dove le cellule, esprimendo
un n° elevato di CD4 vanno incontro
ad apoptosi
• infezione persistente, con
produzione di bassi livelli virali,
nelle cellule della linea
macrofagica e nelle cellule
dendritiche.
• L’infezione altera le funzioni dei
linfociti T e dei macrofagi.
Come HIV sfugge al sistema immune:
• infezione di linfociti e macrofagi= inattivazione
di elementi chiave
• In particolare, la inattivazione delle cellule
T helper CD4+ blocca la DTH
• variabilità antigenica di gp120: evasione delle
risposte anticorpali
• glicosilazione di gp120: evasione delle
risposte anticorpali
La diminuzione del numero di cellule T CD4+ può derivare da:
- citolisi indotta da HIV per danno alla membrana citoplasmatica
o per accumulo di macromolecole virali
- induzione di apoptosi
- distruzione di cellule con proteine dell'envelope virale espresse
o adese sulla membrana, ad opera di linfociti CD8+;
EPIDEMIOLOGIA
A)
Il virus può arrivare nel sangue
esclusivamente attraverso:
• rapporti sessuali con persone infette
• trasfusione di sangue infetto o plasma
o fattori della coagulazione infetti
• siringhe o aghi contaminati con sangue
infetto
• la madre infetta il figlio durante la
gravidanza, al momento del parto o
durante l’allattamento
B)
Il pericolo d’infezione aumenta con
la frequenza di comportamenti a rischio:
• cambiamento di partner sessuali
• rapporto anale
• scambio di siringhe tra tossicodipendenti
C)
Non è stato mai dimostrato che vi siano
rischi nei contatti sociali
• ambiente familiare
• ambiente di lavoro
• scuola
• locali pubblici
• mezzi di trasporto
Non è dimostrata la trasmissione
attraverso acqua, stoviglie, servizi
igienici, piscine, spogliatoi.
Non è dimostrata la trasmissione
• per via aerea (goccioline di saliva, colpi
di tosse),
• per contatti casuali (stretta di mano)
• tramite alcuni liquidi biologici
(urina, saliva, lacrime)
• per contatti con animali, punture
d’insetto, zanzare.
HIV
evoluzone dell’infezione da HIV
Infezione
acuta
Sieroconversione
dopo circa 3 mesi
Infezione
asintomatica
PGL
LAS
Sieropositivià
Da 1 a 10 (20?) anni
ARC
AIDS
50%: AIDS
dopo 10 anni
Decorso e stadi della infezione da HIV
Infezione acuta
• durata 3-6 mesi
• conta T CD4+ : circa 1000 / mm3
Latenza clinica:
• 1 ≥10 anni
LAS (linfoadenopatia sistemica)
o PGL (persistent generalized limphoadenopathy)
• conta T CD4+ : 600 /mm3
ARC (AIDS-related complex, complesso AIDS-correlato))
• conta T CD4+ : 400 /mm3
AIDS conclamato
• conta T CD4+ : <150-200 /mm3
stadi della infezione da HIV
CD4+ T cell count (cells per µL)
HIV RNA copies per mL of plasma
Con il tempo, la diversità virale aumenta: infezione cronica
Stadi della infezione da HIV
Infezione primaria
• sintomi simil-mononucleosici
(linfoadenopatia)
• sintomi gastrointestinali (diarrea)
• artromialgie
• febbre
A volte:
• esantema maculo-papulare
• meningite
Durata: 2-3 settimane
Stadi della infezione da HIV
LAS o PGL
linfoadenopatia della durata
di 3 mesi implicante 2 stazioni
linfonodali extra-inguinali
Inoltre,
per un tempo superiore ai 3 mesi:
• sudorazione notturna
• linfoadenopatia
• calo ponderale superiore al 10%
• febbre, diarrea, affaticamento,
astenia.
• diminuzione delle T helper
• aumento delle globuline sieriche
• anergia, leucopenia, anemia.
LAS
stadi della infezione da HIV
ARC (complesso AIDS-correlato)
Clinica:
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•
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•
incubazione 3-6 settimane
febbre
astenia ingravescente
calo ponderale
diarrea intermittente
sudorazione notturna
linfoadenopatia
disordini immunologici
disappetenza
piastrinopenia
stadi della infezione da HIV
ARC: le principali infezioni opportunistiche
- linfoadenite ascellare suppurativa
da Mycobacterium Avium Complex
- candidosi orale
- oral hairy leukoplakia: virus Epstein-Barr sulla mucosa linguale
- ulcere orali da virus herpes 1 e 2
AIDS
Criteri clinici:
- Presenza di 1 o più
infezioni opportunistiche,
segno di immunodeficienza
- Encefalopatie: la TAC di
pazienti con HIV mostra encefalopatie
(emisferi cerebrali raggrinziti)
Sindrome di indebolimento
Sudorazione notturna
Linfonodi cervicali ingrossati
Caratteristiche cliniche di AIDS
Linfoadenopatia e febbre:
• Inizio insidioso
• Perdita di peso e malessere
Infezioni opportunistiche:
• Polmonite da Pneumocystis jirovecii
• Toxoplasmosi cerebrale
• Meningite criptococcica
• Candidosi
• Infezioni da Herpesvirus
• Malattie diarroiche
Tumori
• Sarcoma di Kaposi ( tumore vasi)
• Linfoma non-Hodgkin
Demenza correlata all’AIDS
• Diminuzione delle funzioni motorie e
cognitive
AIDS: infezioni opportunistiche
Protozoarie
• toxoplasmosi cerebrale
• criptosporidiosi con diarrea
• isosporiasi con diarrea
Fungine
• esofagite da Candida
• criptococcosi
• histoplasmosi
• coccioidomicosi
Virali
• CMV
• HSV
• PML: leucoencefalopatia multifocale
progressiva (poliomavirus JC)
• leucoplakia orale capelluta
(Epstein-Barr Virus)
Batteriche
• MAC (micobatteri atipici)
• setticemia da salmonella
• infezioni piogeniche
Stadi dell’infezione da HIV (CDC 1993)
Gruppo I:
• malattia con sieroconversione
Gruppo II
• asintomatca
Gruppo III
• linfoadenopatia persistente generalizzata
Gruppo IV
a) malattia costituzionale
b) malattia neurologica
c) malattie infettive secondarie
d) cancro secondario
e) altre condizioni
Lo sviluppo dell’ AIDS
Viral Load = Velocità del treno
CD4+ = Distanza dal baratro
Modificata da Coffin J 1996
Diagnosi di laboratorio
I test per la diagnosi di infezione da HIV vengono eseguiti
per:
a) per identificare gli individui infettati in modo tale da poter
iniziare una terapia antivirale
b) per identificare i portatori che possono trasmettere
l’infezione ad altri individui (donatori di sangue ed
organi, donne in gravidanza e i partner sessuali).
c) per seguire il decorso della malattia e confermare la
diagnosi dell’AIDS
d) valutare l’efficacia della terapia
Diagnosi di laboratorio
Definizione di sieropositività per HIV
Test di screening (classico)
1) Ricerca dell’antigene p24, marker
precoce d’infezione
(2-4 settimane dopo il contagio)
(test ELISA)
2) Se positivo, dopo 2 mesi,
ricerca di anticorpi anti-p24
(test ELISA)
Test di conferma
3) Se positivo:
test di conferma con Western
blotting o RIBA
Diagnosi di laboratorio
Test di conferma:
HIV-RIBA (Recombinant ImmunoBlotting Assay)
o Test INNO-LIA (Line Immuno-Assay)
Il test RIBA può essere considerato come un Western-blot
“ottimizzato”, con antigeni viali ricombinanti
RIBA
positivo
se nel siero sono presenti
anticorpi verso gli antigeni
virali, si legheranno
e sarà possibile vedere
una banda nera in
corrispondenza
RIBA
negativo
Criteri di interpretazione dei saggi di conferma
(CDC)
• POSITIVO = presenza di reattività per
almeno 2 delle seguenti bande: p24, gp41, gp
120/160
• NEGATIVO = assenza di ogni banda
• INDETERMINATO = test con una o più
bande reattive che non rientra nel criterio di
positività sopra indicato
Valutazione del
• numero di linfociti T CD4+
e del
• rapporto CD4/CD8 (nei soggetti normali: tra 1 e 2;
nei soggetti infetti: <<1)
Recentemente: valutazione della % di CD8+CD38+
come marker di progressione in AIDS
Non è un test diagnostico ma, insieme alla
valutazione dell’HIV-RNA viene impiegato:
a) per il follow-up (ogni 3-6 mesi) dei sieropositivi
b) per il monitoraggio della terapia HAART
Esistono anche test rapidi per HIV-1 e HIV-2
A
B
(scarsa sensibilità/specificità)
Test “OraQuick®”( Ab test )
Prelievo di fluido orale
ruotando un apposito
tampone in gomma.
L’impiego di guanti non
è fondamentale: il
materiale di scarto non è
infettante
Inserire il tampone; il risultato è
visibile dopo 20 minuti
Positive
HIV-1/2
Reactive
Control
Positive
Negative
Controllo e prevenzione
•
•
•
•
Educazione sanitaria
Screening
Informazione
Sviluppo di un vaccino
Terapia HAART
(Highly Active Anti-Retroviral Therapy:
terapia antiretrovirale altamente attiva)
Fino a qualche anno fa, la terapia HAART
era iniziata quando i linfociti CD4+ scendevano
al di sotto di 350/mmc
e/o quando la concentrazione plasmatica
di HIV-RNA era > 100.000 copie/ml
Dr. David Ho
Secondo le ultime linee guida, si tende ad iniziare molto
presto la terapia, tenendo conto dello stato complessivo
del paziente, in modo da instaurare una terapia
individualizzata anche sulla base di segni clinici di malattia
riconducibili all’infezione da HIV, della
“compliance/adherence”, della tossicità, delle resistenze etc.
1996-97:
Terapia HAART
di solito comprende
• un analogo nucleosidico (DNA chain terminator)
• un analogo non-nucleosidico inibitore della RT (NNRTI)
• un inibitore della proteasi (PI)
Esempi
Indinavir + AZT + 3TC
Ritonavir + AZT+ 3TC
Nelfinavir + AZT + 3TC
Nevirapina+ AZT +ddI
Nevirapina + Indinavir + 3TC
Efavirenz + lamivudina + zidovudina
• I farmaci antivirali limitano la progressione della
malattia.
• I vaccini per prevenire ed il trattamento sono in
fase di trials clinici.
• Sicurezza: sesso monogamo aiuta a limitare la
diffusione.
• Uso di aghi sterili monouso.
• Screening del sangue per trasfusioni, organi per
trapianti, fattori della coagulazione usati per
Questo maledetto
emofiliaci.
AIDS ti preoccupa
molto, non è vero?
Procedimenti di disinfezione per materiali contaminati con
virus:
Autoclave: 121°C, 15’, 1atm
Ebollizione: 10’ in acqua bollente
Pastorizzazione. T° di 65°C (20’)
Incenerimento
Ossido di etilene (una notte)
Irradiazione con UV: 2400 Å (1’)
Ipocloriti: Cloro attivo 10.000 ppm (1’)
Cloro attivo 1000 ppm (amuchina) (30’)
Fenolici (10’)
Formalina (1 ora)
Glutaraldeide: soluzione al 2% in acqua (30’)
Beta propiolattone: soluzione in 35% di acqua.
