Universit`a degli Studi di Pisa Facolt`a di Scienze

Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Magistrale in
Biologia Molecolare Cellulare
Noggin induce un destino neurale corticale nelle
cellule staminali embrionali murine
antagonizzando Bone Morphogenetic Proteins
(BMPs) secrete in maniera autocrina.
Tesi di Laurea di
Luca Pandolfini
Relatore:
Prof. Federico Cremisi
Correlatori:
Prof. Robert Vignali
Dr.ssa Michela Ori
Anno Accademico 2010/2011
Indice
Introduzione
1
1.1
Neurodegenerazione e rigenerazione . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2
Le cellule staminali embrionali . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.3
L’induzione neurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.4
La corticogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.5
Patterning della corteccia nei mammiferi . . . . . . . . . . . . .
8
1.6
ESC e differenziamento neurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.7
Via di segnale di BMP e induzione neurale . . . . . . . . . . . . 11
1.8
Noggin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.9
Scopo della tesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Materiali e metodi
17
2.1
Colture cellulari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2
Induzione neurale in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3
Estrazione dell’RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4
Retrotrascrizione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5
Progettazione dei primers di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.6
RT-PCR semiquantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.7
Immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.8
Microscopia e analisi delle immagini . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Indice
2.9
ii
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.10 Ibridazione dei Microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.11 Analisi dei dati di Microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Risultati
37
3.1
Neurogenesi in vitro a partire dalle ESC . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2
L’identità di default dei neuroni differenziati dalle ESC è di tipo
pro-mesencefalico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3
Le cellule ES secernono Bone Morphogenetic Proteins in maniera
autocrina e sono sensibili alla loro attività . . . . . . . . . . . . . 45
3.4
Noggin induce l’anteriorizzazione dei neuroni ottenuti dalle ESC . 49
3.5
I neuroni ottenuti da trattamento con Noggin hanno identità
molecolare corticale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Discussione
58
4.1
Dissezione del processo di neurogenesi . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.2
Induzione neurale nei mammiferi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.3
Differenziamento di neuroni nel sistema
sperimentale in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.4
Noggin come morfogeno del patterning A/P . . . . . . . . . . . 61
4.5
Conferme e novità dei dati sperimentali . . . . . . . . . . . . . . 61
4.6
Le BMP agiscono sulle ESC come morfogeni posteriorizzanti . . . 62
4.7
Conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Ringraziamenti
65
Materiali aggiuntivi
67
Bibliografia
75
Elenco delle figure
1.1
Segmentazione nei mammiferi . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.2
Sviluppo del tubo neurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.3
Le mitosi nel neuroepitelio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.4
Meccanismo della corticogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.5
Determinanti molecolari del patterning corticale
9
1.6
Via di segnale di BMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.7
Struttura del dimero Noggin-BMP . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1
Struttura dei composti chimici utilizzati . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2
Controllo di qualità dell’RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3
Elettroferogramma del Bioanalyzer . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.4
Retta di taratura della quantificazione ELISA . . . . . . . . . . . 31
2.5
Analisi del layout di un miroarray . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.6
Controllo di riproducibilità dei Microarray . . . . . . . . . . . . . 34
3.1
Protocollo di differenziamento neuronale . . . . . . . . . . . . . 38
3.2
Effetto del siero sul differenziamento delle ESC . . . . . . . . . . 39
3.3
ESC differenziate in CDMM alla fine dello Step 3 . . . . . . . . . 41
3.4
Identità regionale delle ESC differenziate in CDMM . . . . . . . . 43
3.5
Le ESC producono BMPs e loro recettori . . . . . . . . . . . . . 46
3.6
Effetti di Noggin sul differenziamento . . . . . . . . . . . . . . . 47
. . . . . . . . .
Elenco delle figure
iv
3.7
Attivazione della via di segnalazione di BMP nelle ESC . . . . . . 48
3.8
Effetto di Noggin sui geni del patterning A/P . . . . . . . . . . . 50
3.9
Specificità del segnale di BMP nel patterning . . . . . . . . . . . 51
3.10 Attivazione di FoxG1 e Tbr1 in differenti condizioni di crescita . . 53
3.11 GSEA ed analisi genome-wide dei marcatori antero-posteriori . . . 54
3.12 Analisi delle componenti principali e clustering . . . . . . . . . . 56
Elenco delle tabelle
2.1
Composizione del mezzo di crescita per ESC (ES medium) . . . . 18
2.2
Composizione del mezzo di crescita per cellule RAW/MSC . . . . 18
2.3
Composizione del CDMM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4
Composizione della mix di retrotrascrizione . . . . . . . . . . . . 24
2.5
Sequenze dei primers di amplificazione . . . . . . . . . . . . . . 25
2.6
Composizione della mix di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.7
Ciclo termico di PCR
2.8
Anticorpi primari per immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . 28
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
†
In ricordo di Nonno Carlo
e del Prof. Arturo Falaschi
Sommario
Le cellule staminali embrionali (ESC) rappresentano uno strumento utile per lo
studio in coltura del potenziale differenziativo di cellule pluripotenti. Il differenziamento di ESC in mezzi di coltura chimicamente definiti permette di individuare
i fattori necessari e sufficienti all’induzione di specifici destini cellulari. Abbiamo
studiato il differenziamento di ESC murine, coltivate come monostrato aderente,
in un mezzo minimo privo di fattori di crescita. La coltura di ESC in queste condizioni porta al differenziamento di neuroni caratterizzati da un profilo
di espressione genica tipico delle regioni prosencefalo-mesencefaliche. Il lavoro
dimostra che le ESC durante il loro differenziamento secernono BMPs (Bone
Morphogenetic Proteins) e che l’inibizione di questa via di segnale per mezzo di
Noggin rafforza l’abilità delle ESC di generare neuroni con un repertorio genico
corticale. Tali neuroni sono stati caratterizzati mediante l’analisi di espressione
di marcatori antero-posteriori e dorso-ventrali dello sviluppo del sistema nervoso.
Inoltre abbiamo comparato mediante microarray l’espressione genica globale delle
cellule ottenute dal differenziamento di ESC con quella del prosencefalo, mesencefalo e romboencefalo embrionale murino. Nell’insieme i dati suggeriscono, per
le ESC murine, la presenza di un programma differenziativo di default in senso
neurale corticale.
Abstract
Embryonic stem cells (ESCs) are a powerful tool to investigate the differentiation
potential of pluripotent cells in a culture dish. ESCs differentiating in factor-free
chemically defined media allow to investigate factors necessary and sufficient
to induce distinct differentiation fates. We studied the intrinsic differentiation
fate of mouse ESCs cultured as adherent cells in a minimal culture medium
devoid of growth factors, which allowed cell survival. ESCs cultured in this
minimal medium generated neurons with a gene expression profile consistent with
a mixed forebrain-midbrain identity. We found that ESCs secrete BMP during
their differentiation and that inhibiting BMP signaling with Noggin increases their
ability to generate neurons and to express a repertoire of cortical genes. ESCsgenerated neurons were characterized by their expression of pan-neuronal markers
and of anterior-posterior or dorsal-ventral markers of developing CNS. Moreover,
global gene expression profiles of differentiated ESCs cells were compared to the
profiles of mouse embryonic forebrain, midbrain and hindbrain. Our data indicate
that ESCs hold an intrinsic program of neuronal, cortical differentiation that is
normally inhibited by endogenous BMP.