Progetto Esplora

Progetto ESPLORA
Le innovazioni di ESPLORA nel settore
frutticolo ed arboricolo
Ignazio Verde Centro di Ricerca per la Frutticoltura
Roma 6 Novembre 2013
[email protected]
1
 Peculiarità specie arboree:
Ciclo lungo
Grandi dimensioni
 Strumenti disponibili:
Genoma di riferimento (Tutte, tranne olivo)
Tools genetici (microarray, chip SNP)
 Approcci utilizzati:
Popolazioni biparentali
Geni candidati
Mappatura per associazione
05/12/2013
2
Attività svolta dall'U.O. Centro di Ricerca per la Viticoltura
di Conegliano (CRA-VIT)
Ricerca di marcatori funzionali in vite
per i caratteri ‘apirenia’ e ‘tolleranza a
giallumi da fitoplasmi’.
Responsabile: Dr.ssa Manna Crespan
[email protected]
[email protected]
05/12/2013
3
Vite colpita da giallumi
05/12/2013
4
Allevamento ed infezione degli insetti vettori
05/12/2013
5
Strategia applicata
per l’apirenia
ricerca di SNP putativamente associati al carattere apirenia
 sequenziamento di 8 geni candidati MADS-box coinvolti
nello sviluppo del gametofito femminile, dell'endosperma e
dell'embrione e putativamente associati a QTL minori per
l’apirenia
per la flavescenza dorata (FD)
ricerca di geni candidati per la resistenza/tolleranza
a FD
 analisi di Next Generation Sequencing (RNA-Seq) di varietà di
vite sensibili (Chardonnay) vs tolleranti (Tocai friulano) in
esperimenti di infezione controllata in laboratorio
05/12/2013
6
Risultati ottenuti
Per l’apirenia
 Marcatori associati a uno dei geni MADS-box
(VvAGL11) sono utili ma non sufficienti alla MAS.
 Altri MADS-box sequenziati in 48 vitigni e 48
individui di una popolazione da incrocio (varietà
con semi x varietà apirena - F1_RVexSU); analisi dei
dati in corso.
 Produzione dati SSR e SNP per costruire una mappa
di associazione della F1_RVexSU in corso.
 Completata la fenotipizzazione della F1_RVexSU.
05/12/2013
7
Risultati ottenuti
Per la resistenza/tolleranza ai giallumi
 Il complesso esperimento di inoculo del patogeno
tramite vettore infetto in ambiente controllato è
riuscito (12 tesi x 3 repliche biologiche).
 Le prime analisi dei dati di RNA-Seq mostrano una
sovraespressione di geni legati ai meccanismi di difesa
nella varietà tollerante.
 Prodotte 3 popolazioni da incrocio (varietà sensibile
x tollerante a GY) per studiare le basi genetiche del
carattere.
 L’unione dei dati derivanti dai due approcci dovrebbe
fornire indicazioni sui geni candidati e marcatori
associati.
05/12/2013
8
Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale (CRA-PAV)
Unità Operativa: Centro di Ricerca per la Patologia
Vegetale – CRA-PAV – Roma
Responsabile scientifico: Graziella PASQUINI
Titolo della Ricerca:
Sviluppo di sistemi molecolari per
la caratterizzazione genomica del
fitoplasma Stolbur
Sintomi di Legno Nero sulla
varietà ‘Chardonnay’
[email protected]
OBIETTIVO: sviluppo di tools genetici per l’individuazione
di marcatori molecolari nel genoma di Stolbur
Strategia 1:
MLST
(Multilocus Sequence Typing)
(genoma patogeno)
Strategia 2:
Studio della interazione
vite/Stolbur
(genoma pianta ospite)
Prodotto atteso: markers molecolari
10
Strategia 1: MLST
203 campioni
da diversi areali
RISULTATI:
 I geni più interessanti per la
caratterizzazione del fitoplasma: tuf,
secY e stamp
 Definizione di una precisa
distribuzione geografica dei genotipi
 Sicilia: presenta monomorfismo
genetico su tutti e tre i geni
2 genotipi tuf:
tuf a
tuf b
PRODOTTO:
Genotipi definiti = markers genetici


per
tracciabilità delle infezioni
studio evoluzionistico del fitoplasma
11
Strategia 2: Studio della interazione vite/Stolbur
RISULTATI:
 Individuate vie metaboliche differenzialmente
espresse nei vari ‘status’ infettivi.

In particolare sono state evidenziate
alterazioni di espressione nelle piante
‘recovered’ potenzialmente utili nell’induzione
esterna del fenomeno (considerato un
importante metodologia di controllo delle
malattie da fitoplasmi)



PRODOTTO:
Geni di vie metaboliche differenzialmente espressi = markers genetici
per
diagnosi
Studio meccanismi patogenetici
Induzione status ‘recovery’
12
Partecipazioni a convegni e pubblicazioni
CONVEGNI:


F. Punelli, P. Uva, A. Ferrarini, L. Ferretti, G. Pasquini (2011) Validation of microarray expression profiles
with Real Time-PCR and GO classes study in Stolbur-affected grapevine plants. 2nd IPWG (International
Phytoplasmologist Working Group) Meeting. 12-16 settembre 2011, Neustadt an der Wienstraβe,
Germania).
F. Punelli, P. Uva, A. Ferrarini, L. Ferretti, G. Pasquini (2011) Real Time-PCR validation of microarray
expression profiles obtained in comparing healthy, recovered and Stolbur-affected grapevine plants. 2nd
European Bois Noir Workshop. 27 febbraio-1 marzo 2011, Castelbrando (TV).
PUBBLICAZIONI:



F. Punelli, F. Martinelli, P. Uva, L. Ferretti, G. Pasquini (2013) Elucidating transcriptomic responses to
Stolbur phytoplasma in Vitis vinifera in relation to ‘infected’ and ‘recovered’ status. Plant Science
(submitted).
F. Punelli., P. Uva, A. Ferrarini, F. Faggioli, M. Barba, G. Pasquini (2010) Differential Gene Ontology
Classes Expression in Grapevine Affected by Stolbur Phytoplasma. V Convegno Nazionale Fitoplasmi.
21-23 settembre 2010, Ancona - Petria 20(3): 762-764.
F. Punelli., F. Faggioli, P. Uva, A. Ferrarini, G. Pasquini (2010). Expression of gene clusters in grapevine
cultivars affected by bois noir and several viruses. [extended abstract] 13th Congress of the
Mediterranean Phytopathological Union. 20-25 giugno 2010, CRA-PAV - Centro di Ricerca per la
Patologia Vegetale, Roma, S5.116 - Petria 20(2): 428-429.
13
Mappaggio di QTL di interesse
agronomico e caratterizzazione del
germoplasma di Fragola
UO: CRA-FRF, Forlì
Responsabile:
Partecipanti:
Dr. Walther Faedi
Dr. Gianluca Baruzzi
Dr.ssa Federica Brandi
Dr.ssa Maria Luigia Maltoni
[email protected]
[email protected]
105 individui F1
Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca
Identificazione di associazioni tra marcatori molecolari e loci responsabili
di caratteri di interesse agronomico in fragola ottoploide
1) Costruzione di una mappa
di linkage su ottoploide
2) Fenotipizzazione per caratteri qualitativamente importanti
(dolcezza e colore del frutto)
3) Avvio della genotipizzazione di germoplasma diploide e
ottoploide utilizzando i marcatori già sviluppati e ampliamento
della collezione di marcatori
Risultati raggiunti (1/2)
Testati 89 SSR monodose, 58 sono risultati polimorfici e hanno
prodotto da 2 a 8 amplificati con 14 configurazioni alleliche
In generale F. chiloensis ha un profilo
allelico molto più semplice
F. chiloensis
F. x ananassa
Sono state caratterizzate numerose
accessioni del
germoplasma CRA-FRF
Tipo di
segregazione
Segregazione
attesa
N° di alleli per tipo
di segregazione
aaxab
1:1
4
aaxbn
1:1
1
abxaa
1:1
4
abxab
1:2:1
19
abxan
2:1:1
5
abxbn
1:1:2
5
anxab
2:1:1
5
anxbn
1:1:1:1
15
anxnn
1:1
105
bbxab
1:1
2
bnxab
1:1:2
8
bnxan
1:1:2
11
nnxan
1:1
92
anxan
3:1
108
Tot. Alleli
384
Risultati raggiunti (2/2)
Alba 7,4 °Brix
<7°
7-8
Distribuzione in classi 8,1-9
9,1-10
di residuo secco
rifrattometrico °Brix 10,1-11
11,1-12
12,1-13
>13
F. chiloensis 11,1 °Brix
40
b* (blu-giallo)
35
30
Distribuzione della popolazione per
coordinate colorimetriche del
colore dei frutti
25
20 F. chiloensis
♂
15
10
Alba
♀
5
10
15
20
25
30
35
a* (verde-rosso)
40
45
50
Impatto dell’attività di ricerca
 Verrà resa disponibile una struttura di mappa ottoploide ottenuta con
la popolazione Alba x F. chiloensis (frutto bianco)
 La disponibilità della mappa di linkage favorirà l’individuazione di
marcatori molecolari per applicare la MAS per caratteri di grande
interesse commerciale come il colore e la dolcezza.
Prospettive future
 E’ presumibile che la costruzione della mappa di linkage richieda l’utilizzo di
ulteriori marcatori. A questo scopo sono stati presi contatti per l’utilizzo del
chip Affymetrix Axiom® su questa popolazione
 Ottenuto lo scheletro di mappa si vorrebbe proseguire con l’inclusione dei
caratteri semplici a ereditabilità mendeliana e, in seguito, con l’analisi di
caratteri ad ereditabilità quantitativa (QTL).
Centro di Ricerca per la Frutticoltura (CRA-FRU)
Analisi della biodiversità in pesco
tramite approcci di “Association
Mapping”
Ignazio Verde, Valeria Aramini, Sabrina Micali, Elisa
Vendramin, Maria Teresa Dettori
[email protected]
[email protected]
Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca
 Individuazione di un set di
circa 1000 SNP funzionali
uniformemente distribuiti nel
genoma
 Validazione di 80-100 SNP
tramite l’analisi di un panel di
10 accessioni.
 Utilizzo degli 80-100 SNP su un
subset della collezione di
pesco per l’analisi della
struttura della popolazione
RIMODULAZIONE
• Utilizzo del chip IPSC 9K SNP
array per valutare la struttura
della popolazione di un
subset di accessioni di pesco
(412) appartenenti alla
collezione (~1000) mantenuta
al CRA-FRU
Verde et al 2012 PLoS ONE 7(4): e35668.
Risultati ottenuti: Struttura della Popolazione
N accessioni
analizzate
412
SNP
N
SNP tot (chip 9K):
8144
SNP polimorfici
3893
Structure: K saggiati da 1 a 6
Evanno Method
3 sottopopolazioni
% tot
(8144 chip 9K)
47.8
Risultati ottenuti: Costruzione di una Core Collection
 Costruire una «Core Collection» (CC) significa
estrarre dalla collezione completa un numero
minimo di accessioni pur massimizzando il
numero di alleli rappresentati(cioè la
variabilità)
 412 accessioni analizzate con il 9K Peach IPSC
Array. Tramite il software Power Marker, 165
scelte a costituire la CC
Risultati ottenuti: fenotipizzazione della CC
(elaborazione dati in corso)
 Fenotipizzazione delle 165 accessioni della CC
• Caratteri: Data di fioritura e maturazione e 9
caratteristiche relative alla qualità del frutto
 L’analisi dei dati verrà effettuata con il
programma Tassel al fine di individuare le
regioni genomiche coinvolte nel controllo dei
caratteri studiati e i marcatori SNP associati
Centro di Ricerca per l’Agrumicoltura e le Colture
Mediterranee (CRA-ACM)
Fenotipizzazione e genotipizzazione di
accessioni di arancio pigmentato.
Sequenziamento di geni coinvolti nella
biosintesi delle antocianine
UO: CRA-ACM
Responsabile: Giuseppe Reforgiato Recupero
Partecipanti: Concetta Licciardello, Maria
Patrizia Russo, Giuseppe Russo, Santo Recupero
[email protected]
Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca
1)Individuazione delle accessioni con caratteristiche fenotipiche
differenziali nella collezione CRA-ACM, ricerca di polimorfismi SNP e
loro verifica;
2)Individuazione di marcatori ed estensione dei risultati più significativi
ottenuti a tutta la collezione di arance pigmentata del CRA-ACM;
3)Risequenziamento di alcuni mutanti somatici ed allineamento della
sequenza con la sequenza del clementine dell’International Citrus
Genome Consortium (ICGC);
4)Genotipizzazione di alcuni mutanti indotti per irraggiamento con raggi g.
Risultati raggiunti (1/4)
•
•
•
•
1 Obiettivo:
Individuazione delle accessioni con
caratteristiche fenotipiche differenziali nella
collezione CRA-ACM, ricerca di polimorfismi
SNP e loro verifica
Individuati bioinformaticamente tramite analisi EST migliaia di SNP teoricamente discriminanti tra
arancio e clementine.
163 SNP validati con il metodo di genotipizzazione Kaspar su 50 diverse accessioni di arancio e
clementine.
Di questi, 37 sono stati validati anche mediante sequenziamento Sanger.
L’analisi di genotipizzazione ha individuato 78 siti polimorfici, di cui 36 eterozigoti. Le variazioni in
termini di SNP sono state trovate soprattutto tra le specie, dimostrando una bassa diversità genetica
in arancio e clementine e confermando una più elevata eterozigosità in arancio rispetto a clementine.
Gli SNP derivanti dalle EST oggetto di studio, anche se non verranno
utilizzati come marcatori molecolari (considerata la mancanza di
associazione con caratteristiche agronomiche evidenti) potranno
servire negli studi di filogenesi e come marcatori delle singole
accessioni.
Risultati raggiunti (2/4)
•
•
•
•
2 Obiettivo
Individuazione di marcatori ed estensione dei
risultati più significativi ottenuti a tutta la
collezione di arance pigmentate del CRA-ACM
La regione 3’LTR che regola l’espressione del gene Ruby (Myb Transcripion Factor
coinvolto nella sintesi delle antocianine - Butelli et al., 2012) è stata utilizzata come
marcatore della pigmentazione antocianica in frutti di arancio e suoi ibridi
Genotipizzata una collezione di circa 100 accessioni di arancio pigmentato, arancio
biondo e diversi ibridi.
L’amplificazione della 3’LTR ha confermato la presenza dell’inserto nelle accessioni
caratterizzate dalle antocianine nella polpa ed è quindi marcatore diagnostico del
carattere
L’amplificazione della regione di Tcs1 (parte integrante del promotore/retrotrasposone)
ha mostrato una presenza non costante dell’inserto nei vari cloni di arancio Tarocco,
Premio SIGA 2013
Risultati raggiunti (3/4)
3 Obiettivo:
Risequenziamento di alcuni mutanti somatici
ed allineamento della sequenza con quella del
clementine (International Citrus Genome
Consortium - ICGC)
• Risequenziate (in collaborazione con il prof. Morgante) 3 varietà di
clementine (Caffin, precoce e apireno; Rubino, tardivo e apireno;
Monreal, medio e con semi) su piattaforma Illumina.
• La disponibilità on-line del genoma del clementine aploide
(http://www.phytozome.net/clementine.php) ha consentito le
operazioni di allineamento dei genomi delle tre clementine con il
riferimento. I primi dati hanno prodotto una copertura molto bassa,
variabile tra 2.8x (Rubino) e 12x (Monreal).
E’ stato avviato un nuovo risequenziamento, i cui dati di copertura sono
decisamente migliori dei precedenti. Questo è presupposto per un’analisi
più approfondita da avviare in termini di individuazione di elementi
trasponibili, delezioni, «depth of coverage» e «loss of heterozigosity”.
Risultati raggiunti (4/4)
4 Obiettivo:
Genotipizzazione di alcuni mutanti indotti per
irraggiamento con raggi g
• Tre cicli di irraggiamento con raggi γ (2008, 2009 e 2010) del Tarocco Scirè D2062 hanno
prodotto fenotipi mutanti. Sono state già osservate interessanti mutazioni a carico della
forma del frutto e del contenuto di antocianine.
Forma del frutto
Pigmentazione
Peduncolo e consistenza buccia
• La possibilità di un risequenziamento dei mutanti ottenuti, aggiunti ai dati di
risequenziamento di 10 mutanti somatici naturali di arancio già a disposizione del CRAACM, potrebbe aiutare a comprendere meglio la base genetica dei caratteri fenotipici in
questione.
SOI 2013
Centro di Ricerca per l’Olivicoltura
di Rende (CRA-OLI)
Sviluppo di nuovi tool genetici e molecolari
a supporto del breeding in olivo
 Responsabile UO: Samanta Zelasco
[email protected]
Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca
1) Riordino del germoplasma olivicolo
Attività
Sviluppo di un metodo efficiente per l’identificazione genetica in olivo
2) Individuazione e selezione di materiale genetico interessante a supporto del breeding
Attività
Selezione materiale genetico di interesse per la tolleranza al freddo
Saggi di radicazione e valutazione di potenziali portinnesti nanizzanti
Ottenimento di tool molecolari
Riordino del germoplasma olivicolo
Sviluppo di un metodo efficiente per l’identificazione genetica in olivo
300
Loci SSR
N alleli
individuati
DCA 3
13
DCA 8
17
DCA 11
17
DCA 13
11
DCA 16
24
DCA 18
15
EMO 090
11
GAPU71B
9
Tot alleli
Sinonimie riscontrate altamente correlate con i dati morfologici
Mission = Picholine Marocaine Ascolana dura = Ascolana semitenera
Dolce d’Andria = Termite di Bitetto Carpinetana = Bosana
Moraiolo=Paesana Nera
Leccino=Palmarola
Tondina = Provenzale
Giarfara=Tonda Dolce di Partanna Grossale = Santomauro
117
Struttura del database molecolare con i dati standardizzati (esempio)
Loci SSR
Autore
collezione
Sarri et al.,
2006
Baldoni
al., 2009
et
Koehmstedt
et al., 2011
Posizione
WOGB
Arbequina
WOGB
NCGR,Davis
varietà
Arbequina
Dole 39
Arbequina
Beghe' et al.,
2011
CRA-OLI
Arbequina
Bandelj
al., 2002
Slovenia
Arbequina
WOGB
Arbequina
et
Doveri2008
Zelasco et
al.,2013
NCGR
Dole 39
Arbequina
sinonimie
nessuna
nessuna
nessuna
nessuna
nessuna
nessuna
nessuna
DCA3
DCA3
DCA 8
DCA8
232
243
141
141
232
243
141
141
232
243
141
141
232
243
232
243
139
141
232
243
141
141
232
243
141
141
Individuazione e selezione di materiale genetico interessante
breeding
Selezione materiale genetico per la tolleranza al freddo
Culitvar
Radicazione %
Istituzione
a supporto del
Provenienza
Degli
23.8
UNI-PR
Montericco
26.3
UNI-PR
Montelocco
33
UNI-PR
Orbetana
24.1
Privato
Leccino clone 18 Bartolini
57.5
UNI-PR
Leccio del Corno
nessuna
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Frantoio ? ecotipo 1
62.5
Privato
Campo sperimentale Aviano (PN)
Frantoio ? ecotipo 2
37
Privato
Campo sperimentale Aviano (PN)
genotipo non noto
19.3
Dolce Agogia (Par.Incr)
15
Ascolana tenera
11.5
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Bianchera
11.8
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Nostrana di brisighella
43.3
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Nostrale di Rigali
6.8
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Carolea
CRA-OLI
Campo Collezione Rende (CS)
Coratina
CRA-OLI
Campo Collezione Rende (CS)
Ghiacciolo
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
CRA-OLI
Campo Collezione Mirto (CS)
Ortice
1.9
Privato
CNR-IGV-PG
5 campi collezione Emilia Romagna
5 campi collezione Emilia Romagna
5 campi collezione Emilia Romagna
Campo sperimentale Aviano (PN)
5 campi collezione Emilia Romagna
Campo sperimentale Aviano (PN)
CNR-IGV-PG
Saggi di radicazione e valutazione di potenziali portinnesti nanizzanti
Testate per la radicazione 49 varietà e 3 ecotipi spontanei
Variazione nella % di radicazione
Trattate con miscela
di Ormoni
Non trattate
Radicazione
da 0 a 78%
da 0 a 60%
Varietà /ecotipi potenzialmente interessanti
Capena: 78 % trattata; 60% non trattata
Ecotipo 110: 65% trattata 36 % non trattata
Capena
Presunto Oleastro
Valutazione del
germoplasma di Populus
nigra e ricerca di
determinanti di resistenza
all’afide lanigero
(Phloeomyzus passerinii).
Unità di ricerca per le
produzioni legnose fuori
foresta (CRA-PLF).
Carletti Giorgia, Carra Andrea, Gianni
Allegro, Vietto Lorenzo, Calligari Paolo,
Rossino Renzo, Nervo Giuseppe
[email protected]
Afide lanigero: Phloeomyzus passerinii
Secrezione bianca dovuta alla
presenza di colonie di afide
lanigero del pioppo
Piante di pioppo con evidente
infestazione di afide lanigero
39
Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca
 Identificazione e localizzazione del/dei Quantitative Trait Loci (QTL)
associati alla resistenza all’afide lanigero attuabile attraverso:
 Fenotipizzazione della progenie F1 derivante da incrocio interspecifico tra
un parentale femminile di P. deltoides (resistente) ed un parentale
maschile di P. nigra (suscettibile) ed analisi di segregazione per la
resistenza all’afide lanigero (Phloeomyzus passerinii).
 Sviluppo di una mappa genetica in pioppo utilizzando marcatori SSR
(individuati tramite ricerca bioinformatica) e marcatori SNP (ottenuti
attraverso tecniche NGS high-throughput)
Risultati raggiunti (1/3)
Valutazioni fenotipiche per la resistenza all’afide lanigero in un vivaio di
due anni
120
110
100
90
N. Individui
80
1 = suscettibile
5 = resistente
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Classi Fenotipiche
5
Risultati raggiunti (2/3)
 Validazione di marcatori SSRs e sviluppo di una mappa preliminare
partendo da 113 microsatelliti polimorfici e segreganti.
P. nigra
Pochissimi marcatori sono stati ancorati, sono
quindi necessarie tecniche high-throughput
per poter sviluppare una mappa di linkage in
pioppo
P. deltoides
Risultati raggiunti (3/3)
• Sono in corso le analisi genetiche di 8653 marcatori SNP polimorfici e
segreganti nella popolazione ottenuti attraverso la tecnica RAPiD-Seq,
basata su piattaforma Illumina, Genotyping by Sequencing (GBS).
•Da una prima analisi genetica i marcatori hanno una segregazione 3:1,
1:2:1, 1:1, come atteso.
Prospettive
A breve una mappa genetica di Populus nigra e Populus deltoides sarà
disponibile. Correlando i dati di mappa e i rilievi fenotipici sarà possibile
identificare i/il QTL responsabili/e della resistenza genetica all’afide lanigero
Impatto dell’attività di ricerca
Considerando l’importanza economica del genere Populus e gli ingenti
danni colturali che l’afide lanigero può provocare, lo sviluppo di una
mappa genetica e la localizzazione dei QTL legati alla resistenza a tale
patogeno risultano strategici per un’ efficiente conduzione dei
programmi di breeding per il pioppo.
Fino ad ora nessuna regione cromosomica portante la resistenza
all’afide lanigero è stata identificata ed è per questo che la ricerca
svolta dal CRA-PLF è di notevole interesse scientifico ed economico