gen 03 patov - Sezione di Microbiologia

In Natura si distingue:
Vita saprofita: nell’ambiente a spese di
(Maggioranza dei batteri)
materiale inanimato
Vita parassitaria:
a carico di organismi
superiori
(Minoranza)
Parassiti
Obbligati
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Facoltativi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Parassiti
Rapporti tra batteri e ospite:
Commensali (indifferenti)
Simbionti (utili)
Opportunisti (talvolta possono dare malattia)
Patogeni (nocivi) (moltiplicazione in vivo
e
tossigenicità)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Popolazione microbica normale
Esistono due gruppi di PMN: residente
transito
1) Competizione con nutrienti (interferenza)
2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo)
3) Produzione di batteriocine
4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti
(anaerobi)
5) Continua stimolazione del sistema immune
(macrofagi)
6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
POPOLAZIONE MICROBICA
NORMALE
Microrganismi acquisiti dalla nascita
subiscono modifiche in numero e specie lungo
tutto il decorso della vita
Dipendono da
•fattori genetici
•abitudini alimentari e igieniche
•situazioni di stress
•fenomeni psicosomatici
•età
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
POPOLAZIONE MICROBICA
NORMALE
Residenti, o popolazione microbica normale
È dominata dai batteri anaerobi o anaerobi
facoltativi, si calcola che il rapporto oscilli tra le
100 e le 1000 volte, circa 500-1000 specie diverse
non del tutto identificate o coltivate nel solo
apparato gastroenterico in circa 200 m2 vi sono
almeno 10 14 microrganismi
L‘unico sito anatomico privo di anaerobi è la faringe
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POPOLAZIONE MICROBICA
NORMALE
Residenti, o popolazione microbica normale
rappresentano circa l’1-3% del peso corporeo.
10 volte il numero totale delle cellule somatiche
Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di
batteri molte delle quali non coltivabili con le
metodiche tradizionali
Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia
costituito da batteri.
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PMN
Cute
Cavità orale e prime vie aeree
Tratto intestinale
Uretra
Vagina
Occhio
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PMN Cute
PM transitoria
Pieghe cutanee
Secrezioni sebacee
Sudorazione e lavaggi
Disinfezione
Medicazioni occlusive
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PMN cavità orale
Sterile alla nascita
4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti
(madre)
Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie,
moraxelle, difteroidi.
Eruzione dei denti: spirochete anaerobie,
prevotelle, fusobatteri, capnocytophaga
Actinomyces tonsille e gengive degli adulti
Miceti: Candida
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PMN vie respiratorie
Faringe e trachea
simili
alla cavità orale
Bronchi pochi
batteri
Bronchioli e
alveoli sterili
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PMN vie respiratorie
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POPOLAZIONE MICROBICA
NORMALE
La popolazione microbica dell’apparato
gastro-enterico è stata definita come
"un insieme di microrganismi presenti
nel lume intestinale i quali, se
convivono in un determinato equilibrio
contribuiscono allo stato di salute
dell'ospite"
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Nello stomaco vi è un alto grado di
acidità e il numero dei
microrganismi non supera le mille
unità, mentre nell'ileo la
concentrazione aumenta arrivando
nel colon a 1011-1012 batteri per g
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PMN intestinale
pH
acido
Duodeno: 103-106/gr
Digiuno-ileo: 105-108/gr
Cieco-colon trasverso: 108-1010/gr
Sigma-retto: 1011/gr
antibiotici
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basico
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POPOLAZIONE MICROBICA
NORMALE
Anche il numero e il tipo di
specie di microorganismi varia
con il variare del sito anatomico
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PMN intestinale
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini
Principi di Microbiologia medica, II ed.
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Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Portano milioni di geni (5), un numero di gran
lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma
umano.
Una gran varietà di composti che possono essere
metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)
Quando varia, si modifica anche l'assorbimento
dei nutrienti
Obesi e magri hanno profili batterici
radicalmente diversi nei loro intestini
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
La degradazione nell’intestino crasso,
in particolar modo della lignina e della
cellulosa, è incompleta portando a
particelle di fibre vegetali che
persistono fino all’intestino distale
dove possono esercitare un ruolo che
favorisce il processo di eliminazione
delle feci
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella
sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.
B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido
folico.
La vitamina K viene sintetizzata
dall'Eucobacterium lentum che modifica degli
steroidi a livello intestinale
I germi intestinali interagiscono con gli acidi
biliari.
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo
nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.
Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni,
estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale
attraverso varie reazioni chimiche
Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del
fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno
deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche
per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.
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POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE
A questo livello vi è una barriera protettiva
costituita da uno strato di muco denso che
contiene IgA secretorie, peptidi
antimicrobici e anche complessi
giunzionali che tengono unite le cellule
epiteliali adiacenti in modo da regolare la
permeabilità del tessuto intestinale e
impedire che i microrganismi lascino
questa sede
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli enterociti esprimono recettori PAMP
(pathogen-associated molecular pattern),
comprese le proteine denominate TLR e NOD.
Questi recettori captano la presenza di
componenti batterici presenti e conservati in
diverse specie microbiche e possono dare inizio
ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I
batteri possono presentare sulla superficie
esterna delle strutture che sono individuate dalle
cellule epiteliali e dalle cellule del sistema
immunitario
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The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial
cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information
about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs,
and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial
metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l
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PMN vagina
Alla nascita pH acido: lattobacilli
Dopo alcune settimane fino a pubertà pH
neutro: PMN mista cocchi e bacilli
Pubertà pH acido: lattobacilli
Dopo la menopausa pH neutro: PMN mista
cocchi e bacilli
IMPORTANTE IL LIVELLO
DEGLI ESTROGENI
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Batteri a circolazione interumana:
Infezioni esogene ed endogene
Portatore sano
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Canali naturali
Vie respiratorie
tratto gastro-enterico
genito-urinario
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Via
Esempi
Ingestione
Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae,
C. botulinum ecc..
Inalazione
Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella
Chlamydia ecc…
Penetrazione diretta
(aghi, ferite)
C. tetani, S. aureus ecc..
Punture
d’artropodi
Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc..
Sessuale
N. gonorrhoeae, T. pallidum, C.
trachomatis
transplacentare
T. pallidum
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Canali occasionali
Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.)
tubi per ventilazione
sondini di drenaggio
Somministrazione di farmaci che deprimono la
risposta immunitaria o che alterano il
microambiente di alcuni distretti dell’organismo
(es. antiacidi)
interruzioni dell’integrità della superficie della
mucosa e della pelle
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Meccanismi di difesa naturale e
barriere
L’ambiente in vivo è molto sfavorevole
per i batteri: pH, T, O2, flusso dei
liquidi organici, cellule ciliate,
macrofagi,
integrità e composizione biochimica dei
tessuti, infiammazione, febbre
Strato corneo della pelle
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Colonizzazione della cute e delle mucose
Meccanismi di difesa naturale e
barriere
Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati,
movimento del contenuto del lume del
canale mucoso (intestino, uretra)…
PMN residente
Cellule di sfaldamento
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Meccanismi di difesa naturale
Fagocitosi
Funzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I
batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la
fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la
superficie batterica
a) l’anticorpo agisce da opsonina
b) l’anticorpo + antigene attiva il complemento
c) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili
che attivano il complemento
La fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai
granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è
stato osservato un aumento della produzione di acqua
ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma,
proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina,
perossidasi)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
Variazione antigenica (shift)
Inibizione della fusione lisosomiale
Elusione dei lisosomi e moltiplicazione nel
citoplasma
Produzione di catalasi che scinde lo ione
superossido
Resistenza agli enzimi lisosomiali
Produzione di IgA proteasi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
La resistenza ai macrofagi può aversi mediante:
1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi
2. capsula che impedisce la fagocitosi
3. produzione di superossidismutasi che sequestra
l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP
che è necessario per la fagocitosi
4. mimetismo antigenico
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Mimetismo antigene
È la presenza di componenti strutturali
che presentano notevoli analogie di
composizione con materiali presenti nei
tessuti dell’organismo ospite che vengono
quindi difficilmente individuati come nonself
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Strategie batteriche
Mimetismo antigene
Esempi:
la capsula di S. pyogenes è formata da
acido jaluronico, presente nel connettivo.
Alcuni enterobatteri possiedono nella
porzione polisaccaridica del LPS
determinanti antigeni simili a quelli presenti
nelle emazie della specie normalmente
parassitata.
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Strategie batteriche
Mimetismo antigene
S.pyogenes possiede diversi materiali
antigenici (proteina M, antigeni di
membrana, carboidrati di gruppo) che
presentano analogie molecolari ed
antigeniche con strutture molecolari
presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo
e nelle articolazioni e la risposta
autoimmune che si mette in opera durante
l’infezione da S. pyogenes, potrebbe
rappresentare un elemento di rilievo nella
patogenesi della febbre reumatica a della
cardiomiopatia reumatica.
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Strategie batteriche
Mimetismo antigene
Le Chlamydie presentano negli
involucri esterni alcune proteine
ricche in cisteina che hanno analogie
antigenetiche con la catena pesante
dell’alfa-miosina specifica del muscolo
cardiaco ed è stata quindi ipotizzata
una base autoimmune nella patologia
cardiaca correlata alla infezione di
Chlamydia (C. pneumoniae
soprattutto).
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Neisseria meningitidis
Gram-negative commensal of the human oropharynx, can cause
septicaemia by crossing the mucosal barrier and entering the
bloodstream or meningitis by crossing the blood–brain barrier
into the cerebrospinal fluid. In each case, N. meningitidis uses
molecular mimicry to survive exposure to the innate immune
system. The ability of the immune system to distinguish foreign
cells from self is mediated in part by sialic acid, which coats the
surface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidis
exploits this feature by decorating its outer surface with sialic
acid residues, thus masking itself from human defences.
Molecular
mimicry is a key component of N. meningitidis
pathogenesis and mutants that are unable to sialylate their outer
surface are highly attenuated. The in vivo nutritional
environment has an impact on N. meningitidis host cell mimicry.
N. meningitidis can use lactate and glucose as carbon and
energy sources, and lactate and glucose are present in
nasopharyngeal tissue, serum and cerebrospinal fluid at 1–2 mM
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and 6–10 mM levels, respectively.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Molecular mimicry by Neisseria
meningitidis.
a | Glucose catabolism in N. meningitidis
proceeds by the Entner–Doudoroff
pathway and lactate catabolism feeds
directly into the sialic acid pathway. Note
the relative number of metabolic steps
from glucose to phosphoenolpyruvate
compared with that from lactate to
phosphoenolpyruvate.
b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS)
on the N. meningitidis surface mimics the
surface of eukaryotic cells, preventing
deposition of the complement molecule
C3. Inactivation of the lactate permease
gene lctP results in C3-mediated cell
lysis.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Strategie batteriche
Neisseria meningitidis
Interestingly, although both of these carbon sources are present
in vivo, N. meningitidis catabolizes lactate at a faster rate than
it does glucose, and mutants that are deficient for lactate
transport are defective colonizers of nasopharyngeal tissue. Why
might a bacterium preferentially metabolize a more oxidized
substrate such as lactate over glucose? One likely explanation is
that intermediates of lactate consumption feed directly into the
sialylation pathway, thus enhancing sialic acid biosynthesis. This,
in turn, leads to increased sialylation of the N. meningitidis outer
membrane.
As expected, a N. meningitidis strain that is unable to transport
lactate (DlctP) is highly deficient for sialic acid modification of the
outer membrane and is more susceptible to complementmediated killing. Thus, for N. meningitidis, catabolism of a
preferred carbon source in vivo is coupled to a unique immuneevasion strategy.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quando un microorganismo invade l’ospite
E’ in grado di superare le difese di un individuo sano
PATOGENO
Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospite
OPPORTUNISTA
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Attributi dei microorganismi che causano
malattia
Abilità di causare malattia o produrre lesioni
progressive (Patogenicità)
Grado di patogenicità, ovvero, malattia causata
anche da batteri in numero piuttosto limitato
(Virulenza).
Queste proprietà possono essere suddivise in
tossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche ed
invasività: abilità nel penetrare i tessuti e di
diffondere.
Molti di questi caratteri sono controllati da
plasmidi.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Isole di patogenicità (PAI)
I geni per i fattori di patogenicità, soprattutto
se localizzati a livello cromosomico, possono
essere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA:
PAI
I PAI probabilmente sono segmenti di DNA
acquisiti orizzontalmente che differenziano i
batteri che li posseggono dagli altri della
stessa specie
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Infezione
L’infezione è il processo attraverso il
quale un microorganismo entra in
relazione con l’ospite
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Infezioni
Monomicrobica: un singolo patogeno
Polimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobi
Mista: aerobi ed anaerobi insieme
Comunitaria:
acquisita
in
ambiente
non
ospedaliero
Nosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Fasi di una proliferazione batterica
1) Adesione
2) Invasione
3) Produzione di metaboliti (crescita)
4) Produzione di tossine: enzimi degradativi
tossine tipo A-B
5) Endotossine
6) Induzione di infiammazione
7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
8) Resistenza agli antibiotici
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Fattori che caratterizzano un microorganismo
patogeno
Adesività mediata da strutture specializzate
ac. lipoteicoici nei gram-positivi
proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.)
produzione di capsula (slime)
capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni
nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospite
capacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi
(invasività)
capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospite
produzione di esotossine
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Adesione
Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione.
Il processo è mediato da strutture poste sulla
superficie esterna dei batteri note come adesine,
per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia coli
enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici
(streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a
loro volta, come già detto, strutture che legano le
adesine ad esempio fibronectina disposta sulla
superficie dell’epitelio orale.
(Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
3: Fase di adesione
reversibile e irreversibile
Perchè i batteri aderiscono?
• I batteri non adesi verrebbero eliminati
• Adesione: prima tappa della colonizzazione
e della formazione del biofilm
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Evidenze sperimentali
del ruolo dell’adesione nella
colonizzazione
• I batteri legano recettori isolati o analoghi
dei recettori
• L’adesina purificata o un suo analogo lega il
recettore
• L’adesione è inibita da:
• Analoghi dei recettori e delle adesine
• Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore
• Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il
recettore
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Cosa utilizzano i batteri per aderire?
Adesine batteriche
• Proteine espresse sulla superficie
• Fimbrie
• Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi
teicoici (G+)
• Enzimi
• Enzimi batterici ancorano la cellula al
substrato
• Enzimi batterici possono esporre recettori
criptici
56
Morfologia delle adesine
Afimbrial adhesin
Type I fimbriae
Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)
Curli
57
ADESINE BATTERICHE
58
Adesività
Colonizzazione delle mucose
Adesione specifica e selettiva alle cellule epiteliali:
adesine-recettore
)
G-: proteine in fimbrie o pili
G+: glicolipidi (ac. Lipoteicoici, [LTA]) +
proteine (es. F di S.pyogenes) in fibrille
Recettore su cellule: porzione glicidica di
glicoproteine o glicolipidi o proteine di membrana
Materiale capsulare
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Colonizzazione delle mucose
Adesività
Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati
epiteli: Esiste uno spettro
S. mitis
tutta la mucosa buccale
S. salivarius
lingua e gengive
S. pyogenes
faringe e tonsille
N. gonorrhoeae
uretra
V. cholerae
intestino tenue
E. coli
ileo, colon,tratto urogenitale, ecc.
Tossine ciliostatiche
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Fibronectina
Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una
proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le
adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così
l’adesione dei gram-negativi.
La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli
epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi
organici, viene escreta nelle cavità naturali
dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle
mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un
reticolo fibrillare.
La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici
tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella
differenziazione cellulare.
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Acquisizione di patogeni potenziali:
malattia di base
Durante il decorso di varie affezioni si determinano
variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose)
con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e
riduzione della popolazione batterica gram-positiva
Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non
hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica
normale dell’orofaringe
Variazioni con la durata della degenza (stesso reparto)
62
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONE
BATTERICA RESIDENTE
La presenza di fibronectina in:
ferite accidentali o causate da strumenti, sulla
superficie di cateteri predispone all’invasività di cocchi
gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che
possiedono sulla loro superficie recettori per la
fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.
La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri grampositivi produttori di slime che li rende immuni da
qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei
macrofagi.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Fibronectina: un modulatore della
popolazione batterica residente
Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi
ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel
plasma
Conseguenze
Riduzione di fibronectina dalla superficie cellulare
scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi
colonizzazione da parte di bacilli gram-negativi
Produzione di proteasi batterica e dell’ospite?
Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di
colonizzazione.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Immunità naturale e Immunità acquisita:
Immunità naturale:
dovuta non dal contatto con l’antigene ma dal genotipo.
Es. malattie che colpiscono certe specie e non altre.
Nell’uomo certe razze, certi gruppi etnici ecc.
resistenza individuale diversa, nutrizione età, malattie
varie.
Immunità acquisita:
passiva dovuta alla somministrazione di anticorpi
specifici che danno una copertura temporanea, ma può
consentire una immediata ed elevata risposta
anticorpale. E’ passiva l’immunità acquisita dalla madre
attraverso il flusso sanguigno ed il colostro.
65
Immunità attiva e Immunità umorale
Immunità attiva
dovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiede
tempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente
Immunità umorale
produzione attiva di anticorpi
neutralizzano tossine e prodotti cellulari
effetto battericida diretto o litico con il complemento
bloccano l’abilità infettiva dell’agente
agglutinano i batteri facilita la fagocitosi
opsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie che
possono limitare la fagocitosi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Sopravvivenza alla superficie delle
mucose
Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma
questo anche nei tessuti profondi) i batteri si
moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori
attraverso la produzione di sostanze variamente
tossiche. Queste proteine vengono secrete da
appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri
possono traslocare nel citosol della cellula
eucariotica le proteine effettrici che interferiscono
con il signalling eucariotico, compromettendo le
funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi
o alterano strutture particolari e causano necrosi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Invasione
Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri:
collagenasi: distrugge il collageno
coagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureus
ialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo)
streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina
dal plasminogeno, dissolve i coaguli
emolisine: lisano i globuli rossi
proteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine
dell’ospite.
La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un
fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici,
proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei
fagociti).
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Penetrazione nei tessuti profondi
Mucosa
Sottomucosa
Tessuti profondi
Via ematica/linfatica
Tutto l’organismo
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini
Principi di Microbiologia medica, II ed.
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Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Penetrazione nei tessuti profondi
Il danneggiamento dell’epitelio
mucoso è per molti batteri la strada
per raggiungere la sottomucosa, altri
quali Salmonelle e Shigelle utilizzano
peculiari meccanismi invasivi che
consentono di penetrare
direttamente nelle cellule dell’epitelio
mucoso.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Sopravvivenza nella sottomucosa e nei
tessuti profondi
Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o
resistenza al killing dei fagociti)
moltiplicazione
Tempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?)
(situazione simile a chemostato*, ma effetto del
s.i.)
Siderofori ecc.
Tropismo d’organo
* sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano
scorie
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Capsula
Colonizzazione delle
mucose
Contrasta gli effetti potenzialmente
nocivi dell’interazione adesine-recettore
fagocita
Maschera le adesine, varia la carica di
superficie batterica
Ostacola la deposizione di C3b e
l’ancoraggio di Ab
Strategia + comune nei G+
Nei G- mancata produzione di fimbrie
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Sopravvivenza nella sottomucosa e nei
tessuti profondi
Una volta all’interno di fagociti professionali,
alcuni batteri patogeni sono in grado di evadere
dal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi),
mentre altri sono in grado di moltiplicarsi
all’interno del fagosoma alterando la membrana
impedendo la fusione con il lisosoma, oppure
produzione di catalasi e SOD per contrastare i
meccanismi di killing ossigeno-dipendenti,
eliminado i derivati dell’ossigeno molecolare
provvisti di azione microbicida (perossido di
idrogeno, anione superossido etc).
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Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della
mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano
l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri
che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi
residenti nella sottomucosa.
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Produzione di metaboliti
Sono costituiti da prodotti originati dalla
crescita batterica in seguito alla demolizione
di composti complessi, molti di questi, come
l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o
comunque composti organici possono
esercitare un effetto tossico sulle cellule.
78
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Potere aggressivo dei batteri
Sostanze non tossiche:
capsula, coagulasi, catalasi (H2O2) SOD
(O2-), collagenasi, ialuronidasi ecc.
Sostanze tossiche:
Esotossine: esocitate, proteiche
Endotossine: legate al batterio LPS
Divisione non netta
i.e. endotossine
proteiche: V. cholerae
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Differenze tra esotossine ed endotossine
ESOTOSSINE
Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate
concentrazioni nei terreni
Polipeptidi PM 10.000-900.000
Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente
distrutta col calore>60°
Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti
titoli di antitossina che neutralizza la tossina
Convertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi,
calore ecc.
Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in
mg o meno
Non producono febbre nell’ospite
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Differenze tra esotossine ed endotossine
ENDOTOSSINE
Parte integrante della parete dei gram-negativi
Complesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la
porzione responsabile della tossicità
Stabile al calore>60° per ore senza perdere tossicità
Non stimola la formazione di antitossina
La parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la
produzione di anticorpi (Antigene somatico O)
Non è convertibile in anatossina
Debolmente tossico per animali anche a dosi di mg
Spesso causa febbre
81
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Classificazione delle esotossine
TOSSINE CITOLITICHE
Attive sulla membrana delle cellule
TOSSINE NEUROTROPE
Attive sulle cellule del sistema nervoso
TOSSINE ENTEROTOSSICHE
Attive sulle cellule della mucosa intestinale
TOSSINE PANTROPE
Attive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica
82
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Tossine emolitiche
Formazione di pori attraverso
la membrana
Attività fosfolipasica che
idrolizza la fosforilcolina
della membrana
Fig 7.3 LA placa
83
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Esotossine che agiscono a livello delle
strutture della superficie cellulare
Tossina esfoliativa →sindrome cute
ustionata
Tossine emolitiche (emolisine o citolisine)
84
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TOSSINE ENTEROTOSSICHE
Citotossiche che causano danni evidenti alle cellule
Citotoniche danni non evidenti
Colerica è il prototipo (80.000 daltons)
Subunità A 29.000 e 5-6 subunità B identiche 10.500
Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della
A
La A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva in
modo permanente l’adenilciclasi
questo provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti
(perdita di acqua attraverso il lume intestinale)
Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e
S. enteritidis
85
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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Tossina pertossica
87
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L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1.
Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con un
meccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degli
amminoacidi sulla catena peptidica nascente.
Tossina della pertosse. Proteina (100.000 D) composta da 5 subunità.
La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno della
membrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolge
attività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gs
mantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosse
interagisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente.
88
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
TOSSINE PANTROPE
Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di 62.000 D unita
da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti
A e B che restano uniti da S-S.
Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua
parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla
parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale
il frammento A penetra all’interno.
Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento
A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD
staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando
la traslocazione sul ribosoma.
Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il
GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP,
non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta.
89
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Esotossine che inibiscono la sintesi
proteica cellulare
90
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Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro
Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti
componenti A e B che sono secreti separatamente e si
riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio,
possiedono tutte un attività catalitica ADPribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio
l’actina.
C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante
prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo
e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.
Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending
toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella.
induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e
il blocco del ciclo cellulare
Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi.
91
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TOSSINE NEUROTROPE
Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNC
Botulinica attiva sulle cellule del sistema periferico
La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella
giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida
(meccanismo non noto)
La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi
contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e
giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido
gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui
recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a
livello presinaptico (paralisi spastica)
92
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GABA
93
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95
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Tossina botulinica
Sulla base del valore di LD50 di circa 1
ng/kg, poche centinaia di grammi di
questa tossina potrebbero teoricamente
uccidere ogni essere umano presente
sulla Terra (a scopo comparativo, la
stricnina richiederebbe 400 tonnellate per
uccidere ogni essere umano).
Generalmente le dosi letali orali risultano
comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento
ingerito.
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97
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Endotossina
Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie
Contribuisce alla tossicità del Lipide A
influenzandone l’idrosolubilità e la struttura
Glucosamina fosforilata
ed esterificata con acidi
grassi saturi
98
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Endotossina
LPS si lega a proteina di memb. CD14
(recettore) dei macrofagi
Le LBP prodotte dal fegato e presenti in circolo
si combinano con LPS e catalizzano il suo
trasferimento sul macrofago e il legame con
CD14
Recettori Tlr presenti sui macrofagi in contatto
con LPS legato a CD14, trasducono il segnale di
membrana → rilascio citochine
99
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Endotossina
In passato si riteneva che LPS agisse
direttamente sulle membrane
biologiche
Oggi si sa che:
stimola i macrofagi al rilascio di
sostanze che sono le reali effettrici
dell’attività tossica
Attiva la cascata del complemento
Attiva la cascata della coagulazione
100
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101
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Effetti dell'endotossina
- febbre (attivazione di IL-l)
- neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi
- ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi
- ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di
liquidi
- anormale perfusione di organi essenziali
- attivazione del complemento
- disseminata coagulazione intravascolare
- reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata)
102
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Superantigene
Alcune tossine particolari liberate da alcuni
patogeni attivano le cellule T senza richiesta di
antigene, si legano al recettore di queste cellule sia
a
quello
del
complesso
maggiore
di
istocompatibilità che può scatenare una risposta
immune nei confronti delle stesse cellule, quindi
molto rischioso. Esempi di queste tossine sono
quelle dello shock tossico di S.aureus e quelle
eritrogeniche di S.pyogenes.
103
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
superantigeni
Enterotossine stafilococciche
TSST (Tossina dello Shock Tossico)
T. pirogeniche streptococciche
Devono parte della loro tossicità a:
Specifica attività enzimatica (es. attivazione
interleuchina
Sono fortemente pirogene
Interagiscono con i LT, attivazione e moltiplicazione
in % amplificata (2-20% vs 0.0001-0.01% normale
Ag)
104
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A. L’antigene
convenzionale,
internalizzato ed elaborato
dalla cellula viene esposto
nel contesto del MHC II al
riconoscimento del TCR con
specifica
capacità
combinatoria
A. Il
superantigene
lega
direttamente,
senza
precedente internaliz. ed
elaboraz., le proteine del
MHC II e il TCR
105
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Infiammazione
Si ha in risposta di infezione batterica, ma in
particolare per i virus, si ha un eccesso di
risposta immune in proporzione al processo
infettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, ma
anche streptococchi (febbre reumatica)
106
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
107
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108
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
IgA
Le IgA o immunoglobuline secretorie si trovano in
tutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Si
formano, attraverso la cattura, da parte delle
cellule M (microfold) che sono localizzate nei
pressi delle placche del Peyer, di corpi estranei,
virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule non
hanno attività fagocitaria, presentano quindi
l’antigene ai macrofagi sottostanti che lo
digeriscono e lo presentano alle cellule T che
elaborano le IgA specifiche, in questo modo
l’organismo ha immunoglobuline per contrastare
l’invasione dei microorganismi più frequentemente
presenti.
109
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
110
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IgA
La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare
IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60
mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle
placche del Peyer vengono prodotte anche IgM.
Le IgA sono considerate l’elemento primario per
la risposta immunitaria verso gli antigeni
microbici. Le IgG fanno parte della risposta
immunitaria innata della mucosa.
111
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Infezioni polimicrobiche
Possono essere più gravi di quelle
causate da un singolo patogeno
quando le interazioni tra le singole
specie
trasformano un’infezione mista in
una
INFEZIONE SINERGICA
112
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
E’ un fenomeno comune e
importante nella produzione di
infezioni miste di
aerobi ed anaerobi
specie in tessuti a lento ricambio o
drenaggio o dove l’eliminazione
dei patogeni è rallentato
113
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentato
nelle infezioni sperimentali
intraddominali
tessuti molli
setticemie
dentali
ginecologiche
114
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INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentato
nelle infezioni sperimentali
Da peritoniti sono stati isolati i vari
microorganismi in coltura pura:
Rinoculati in animali
Singola specie: innocua
Coltura mista: palese infezione
115
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico (ipotesi)
Favorevoli modifiche dell’ambiente
Provvedere a nutrienti essenziali
Provvedere a fattori di virulenza
Modulare la risposta immunitaria
Protezione reciproca nei confronti degli
agenti antibatterici
116
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Il consumo di O2 da parte dei batteri aerobi
nella popolazione mista produce condizioni
favorevoli alla proliferazione degli anaerobi,
i quali a loro volta proteggono i batteri
aerobi dalla fagocitosi
Il basso pH dovuto al metabolismo di molti
aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli
per lo sviluppo di anaerobi e acidofili
117
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Molte specie aerobie che producono capsula
(E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae)
raramente producono ascessi se
agiscono come unico patogeno
mentre il Bacteroides fragilis (anaerobio)
produce una capsula che è in grado di
promuovere la formazione di ascessi
118
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INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTO
La formazione sinergistica di un ascesso provvede:
una barriera alla diffusione degli agenti antibatterici
una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite
allo sviluppo di più specie batteriche che:
>elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi,
cinasi anti aminoglicosidi ecc.)
>causano strette condizioni di anaerobiosi che
compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni
così come la fagocitosi
119
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INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Provvedere a nutrienti essenziali
(commensalismo)
Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone)
che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per
esprimere la virulenza
S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis
I treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico)
liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi)
Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla
popolazione microbica normale (PMN)
Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato
dagli altri commensali
120
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Provvedere a fattori di virulenza
Fusobacterium necrophorum elabora una
leucocidina che protegge
Corynebacterium pyogenes dall’attività
battericida dei leucociti. (C. pyogenes produce un
fattore di crescita per F. necrophorum)
S. aureus produce ialuronidasi che esalta
l’attività necrotica degli streptococchi
anaerobi e conduce alla distruzione dei
tessuti
121
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Modulazione della risposta immunitaria
Nelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi
degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività
di:
opsonizzazione
chemiotassi dei neutrofili
produzione di ossigeno
batteriocidia
Attraverso il meccanismo di:
diminuzione delle opsonine del siero
produzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico)
tossici per la fagocitosi
produzione di leucocidine
122
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Protezione reciproca nei confronti degli agenti
antimicrobici
B. fragilis e altre specie anaerobie producono βlattamasi
Nelle infezioni miste questi enzimi proteggono le
specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi
antibiotici (patogenicità indiretta)
B. fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il
cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante
popolazione batterica mista
123
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
INTERAZIONI TRA BATTERI
Sinergismo batterico
Strategie terapeutiche
L’eliminazione selettiva di un componente
della popolazione mista fa fallire il sinergismo
batterico
Farmaci a spettro ristretto
Eliminazione di tutti i patogeni in causa
Antibiotici ad ampio spettro
usualmente β-lattamici
in caso di allergie: macrolidi o altri agenti
124
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese
dell’ospite
Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola la
fagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae)
Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersi
dalle difese in generale S.aureus
Fibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggere
l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti
opportunisti)
Compromettere la funzionalità dei fagociti e delle
cellule ciliate: Bordetelle
Produzione
di
enzimi
citotossici:
S.aureus,
S.pyogenes, Pseudomonas spp.
A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi
(Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma e
lisozima (Gonococchi, Micobatteri)
125
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese
dell’ospite
Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrina
Sfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula
(pneumococchi)
Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella
meningite infantile
Cattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficie
esterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum)
Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig che
provoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus)
126
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese
dell’ospite
Fase aerobia (aerobi, >>>ATP)
Fase anaerobia (aerobi, <<<ATP)
Fase planctonica
Fase sessile
Ridotta tossicità di LPS P.aeruginosa,
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Morte cellulare programmata (PCD)
128
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese
dell’ospite
Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione
lenta
Fase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig
e a molti antibiotici, tasso di crescita
Induzione di forme filamentose
Quorum sensing, attivazione di alcune funzioni
cellulari mediate da ferormoni (in funzione del
numero)
Attivazione di uno stato vitale ma non
coltivabile
129
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
S. pneumoniae
S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state of
genetic competence under conditions of high cell
density in response to a secreted signaling peptide (QS).
Only a fraction of the S. pneumoniae cells become
competent in response to the peptide autoinducer and
elaborate a bacteriocin that causes the lysis of
noncompetent cells.
The lysed cells release not only transforming DNA and
nutrients but also pneumolysin and other factors
important for virulence.
S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose
which facilitates invasion of its host.
130
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La vita dei microorganismi è
prevalentemente sessile e solo una
frazione minima (<0,1 %) mantiene
uno stato planctonico
131
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La semplice adesione ad una superficie,
attiva nel microorganismo
l’espressione di molti geni che
codificano sia per tutti i prodotti
deputati alla vita sessile sia quelli che
sono coinvolti nei meccanismi di
patogenicità e virulenza
132
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Una volta che i batteri sono adesi, essi si
organizzano in microcolonie. Questo
fenomeno implica la presenza di un
biofilm, ove i microorganismi sono
immersi, costituito da polisaccaridi e
prodotti metabolici che, come già detto,
mediano adesività tra i microorganismi e
gli epiteli e tra i batteri stessi.
133
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Biofilm : una resistenza fenotipica
Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166
134
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Biofilm : una strategia batterica
Fasi del biofilm
adesione
organizzazione
rilascio
Salvatorelli G. et al.Biofilms: stato dell’arte l’INTERNISTA, 10 (4), 2002
Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166
135
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Biofilm : i riflessi negativi !..
• Protezione vs anticorpi
• Ridotta attività PMN
nessuna fagocitosi
• Rilascio di enzimi
inattivanti gli ATB
Solo gli elementi planctonici sono distrutti :
• normali processi di difesa
• antibiotici
Lewis K et al : Antimicrob Agents Chemother 2001;45:999-1007136
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Il biofilm rappresenta un nido di
microorganismi anche quando tutte le
forme planctoniche sono state uccise.
Questo spiega perché i cateteri
colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni
con scarse possibilità di successo
terapeutico.
137
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Biofilm in patologia umana
Impianto su superfici mucose
Center for Disease Control and Prevention
stima che
la formazione di biofilm
sia implicata almeno nel 65
65--80%
di tutte le infezioni
croniche e/o recidivanti.
Potera C. Forging a link between biofilms and disease.
Science 283: 1837-1939, 1999
Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents.
138
Nature Rev. Drug Discov. 2: 114-122, 2003
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Biofilm batterici e Infezioni recidivanti
• Endocarditi: valvole naturali o artificiali
• Quadri legati a inserzione di
cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali
• Otiti,sinusiti
• Prostatiti, uretriti ,cistiti
• infezioni vie biliari
•Fibrosi cistica
Riacutizzazioni di BPCO
Costerton JW e al :Science 1999;284 :1318-22
139
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
“ Biofilm “ su superfici inerti
140
Attacco al Biofilm
• Prevenire
la formazione di biofilm
• Disgregare
biofilm, già esistenti
• Eradicare
i microrganismi
negli strati più profondi del biofilm
Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: 465-471
141
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Attacco al Biofilm
La strategia terapeutica deve tener conto
che gli antibiotici attualmente in uso
sono stati sviluppati e studiati
per agire contro batteri planctonici
e non organizzati in biofilm
Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003
142
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Attacco al Biofilm
Eradicare le cellule planctoniche !
responsabili dell’episodio acuto,
per ritardare :
colonizzazione,
potenziale produzione di biofilm
recidivare dell’infezione
Kobayashi H. Int J Antimicrob Agents 2001 ; 17:351-56
143
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Nel loro insieme queste osservazioni
indicano che la fase planctonica è quella
che favorisce la disseminazione della vita
microbica, mentre la fase sessile
all’interno del biofilm è favorevole alla
sopravvivenza.
144
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche
Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla
presenza nell’ambiente di un fattore
prodotto dagli stessi microorganismi
autoinducente che a sua volta dipende dal
numero dei batteri, il fenomeno è noto
come quorum sensing
145
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quorum Sensing
146
Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
E’ stato identificato nel 1970 su un batterio
luminescente il Vibrio fischeri che colonizza
un cefalopodo. Il microorganismo è presente
in mare ad una concentrazione di circa 100
cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del
pesce raggiunge 1010 cell/ml e diviene
luminescente.
147
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
I batteri elaborano un prodotto specie specifico
(omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove
permane e si accumula.
Quando la concentrazione raggiunge un limite
condizionato dal numero dei batteri presenti si ha
induzione del gene bersaglio.
148
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quorum sensing
Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in
molte specie ed è tutto da valorizzare.
E’ un sistema molto economico per rivelare la
propria presenza solo quando il numero è
sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi
(nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di
patogenicità e virulenza, ecc.)
149
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quorum sensing
Applicazioni
E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si
inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi
caratteri di patogenicità.
Si possono rendere innocui i patogeni eliminando
il loro sistema quorum sensing?
150
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quorum sensing
Applicazioni
Trovare composti che funzionano come gli
autoinduttori ma bloccano il gene
Furanone è stato trovato in un’alga
ha dimostrato di interferire con il quorum
sensing di Serratia liquefaciens.
151
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
152
I Gram-positivi causano effetti simili ma usanohttp://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
mediatori diversi
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
La scoperta dei sistemi quorum sensing nei
batteri
gram-negativi
ha
non
solo
approfondito le nostre conoscenze sulla
patogenesi delle infezioni causate da questi
organismi ma potrebbe anche provvedere ai
mezzi per il trattamento di queste comuni ed
importanti infezioni
Hartman and Wise 2001
153
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm
Dinamica delle Popolazioni Batteriche
E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratteristiche
molto diverse da quelle che mostrano in coltura in laboratorio
L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e alla
sopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati a
moltiplicarsi nell’uomo o negli animali
Questi microorganismi hanno sviluppato risposte sofisticate
alle variazioni ambientali
154
Quando le condizioni ambientali non sono idonee alla
crescita, i batteri entrano in una fase programmata di
sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno
attivo e rende il batterio più resistente.
•Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici
•Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle
capacità adesive
•Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana,
degli aa della parete
•Cambiamento di forma
•Topologia del cromosoma
155
156
I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI
AMBIENTALI MEDIANTE
•Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei
nutrienti presenti in concentrazioni ridotte
•Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo scopo
di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in
concentrazioni ridotte
•Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrienti
presenti in eccesso
•Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo
scopo di evitare possibili blocchi
Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la
crescita bilanciata
157
VBNC
viable but non culturable
(Xu et al. 1982)
I batteri in stato VBNC sono
metabolicamente attivi ma non sono in
grado di attuare i processi divisionali che
portano alla formazione di colonia sui
terreni di coltura normalmente utilizzati
per il loro rilevamento
158
FATTORI CHE INFLUENZANO
L’ATTIVAZIONE DELLO STATO
VBNC
Scarsità di nutrienti
Temperatura
Luce
Salinità
Pressione idrostatica
Ossigeno
159
ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE
POSSONO ATTIVARE LO STATO
VBNC
Aeromonas
Enterococcus
Pseudomonas
Agrobacterium
Escherichia
Rhizobium
Alcaligenes
Helicobacter
Salmonella
Campylobacter
Klebsiella
Shigella
Enterobacter
Legionella
Vibrio
Micrococcus
Yersinia
160
SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA
VITALITA’ BATTERICA
•Conta Vitale Diretta (DVC)
•Immunofluorescenza - Conta
Vitale Diretta (DFA-DVC)
•Colorazione con cloruro di
tetrazolio (CTC)
•Colorazione con “Live/Dead
bacLight Viability kit”
•Ricerca di RNA
messaggero (RT-PCR)
•Ricerca di antigeni
specifici dello stato
VBNC
161
Le cellule non coltivabili
(VBNC, stressate) possono
rappresentare un problema
per la salute pubblica se
non rilevate con saggi
adeguati
162
163
164
165
166
167
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladder
epithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immune
effectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in the
exposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant to
neutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cells
to begin the process again.
168
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species,
including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulates
filamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists.
Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in the
environment and the depletion of non-Flectobacillus species
169
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number of
similar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteria
respond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although a
mechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that this
morphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from the
host immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell division
is restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue.
170
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β-lactam antibiotics in
vitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive.
The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example,
Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics of
similar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The
mechanisms and consequences of this response have not yet been explored.
171
172
INVASIONE CELLULARE da parte di
batteri enteropatogeni
173
Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo?
• I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in
cellule che non sono fagociti professionisti.
• I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale,
aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la barriera naturale,
estremamente impermeabile, rappresentata dalle cellule epiteliali
Esempi:
Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis
Shigella spp.
Salmonella spp.
Listeria monocytogenes
174
Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-intestinale
175
La barriera dell‘epitelio intestinale
176
Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille
Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di linfociti B circondato da
linfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino tenue. L’epitelio sovrastante le
placche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passaggio
di particelle nel tessuto linfoide sottostante.
La superficie basolaterale invaginata forma una superficie dove migrano linfociti e
macrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nella tasca.
177
Fattori che determinano se il batterio
sarà internalizzato o no:
• Natura del recettore sulla cellula ospite
• Forza dell’interazione
• Capacità del batterio di inviare segnali che
stimolano o antagonizzano
l’internalizzazione
178
STUDI IN VITRO E IN VIVO
Colture cellulari
Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’invasione
batterica: sistema eccellente, riproducibile e non complicato, ma
con diverse limitazioni
Modelli animali
Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vitro,
possono essere poi verificati in modelli animali
179
Meccanismi di invasione cellulare
Zipper
Yersinia, Listeria
Trigger
Salmonella, Shigella
180
Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non
professionisti in vitro
Sono coinvolte almeno due proteine di superficie:
• Internalina (InlA): proteina di superficie che è ancorata
covalentemente alla parete
• InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete
181
in vivo
• I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os con
Listeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino
•Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA
• Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contrario di cellule che
esprimono E-cadherina umana, non permettono ingresso di Listeria via inlA
•la specie specificità è dovuta a differenze in un singolo aa
Listeria wt causa una malattia sistemica in topi
transgenici che esprimono caderina E umana negli
enterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci di
attraversare la barriera intestinale efficientemente
182
Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria
183
184
Motilità dipendente
dalla polimerizzazione
di actina
• Polimerizzazione dell’actina con
formazione di code
• Si muove nel citoplasma
• Invade le cellule adiacenti
• ActA: proteina di 90 kDa,
determina il reclutamento e
l’assemblaggio dei filamenti
Localizzata ad una estremità del
batterio
Velocità: 1um/sec
185
Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal
vacuolo secondario
•
I batteri a contatto con la membrana plasmatica
continuano a muoversi
• Producono protusioni che si estendono nella
cellula adiacente: listeriopodi
• Si forma una vescicola con due membrane e la
cellula si libera nel citoplasma
Per la fuoriuscita dai vacuoli:
•
•
•
•
Listeriolisina
PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi
a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC)
Metallo proteasi: trasforma il precursore di PCPLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa)
Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le
membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli
diversi nei due compartimenti che formano il
vacuolo
Pseudopodi: 40 um
186
inlA/B
hlyA plcA
plcB
hlyA
actA
inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi);
actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi)
187
188
The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion
system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virulence plasmid
VIRF: quando il batterio cresce
a 37°C, la proteina plasmidica
virF si lega al promotore di virB
inducendo l’espressione della
proteina virB, anch’essa
plasmidica
VirB: attiva i promotori ipa, mxi,
e spa.
IpaA iniettata nel citoplasma
dell’ospite favorisce la
depolimerizzazione dell’actina
accumulata intorno al sito d’ingresso
del batterio.
Le proteine IpaA servono anche per
la lisi del vacuolo
IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana
esterna della cellula batterica, in posizione polare
IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica
diverse proteine actino-associate, provocando la
polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo
spostamento della cellula batterica.
Ipa B e C, si integrano nella
membrana dell’ospite e
promuovono la formazione
degli pseudopodi
IcsB lisa le membrane dei
vacuoli; esposta sulla superficie
o secreta
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes
spa surface presentation of invasion plasmid antigens
spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del
complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il
contatto con la cellula
189
FATTORI DI VIRULENZA
plasmidici
IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)ABCD
IpaA (30 kDa) IpaB (62
kDa), IpaC (42 kDa), e
IpaD (35 kDa) in
condizioni non
secretorie sono
accumulate nel
citoplasma legate ad
una proteina di 18 kDa
(IpgC) che ne
impedisce
l’aggregazione e la
digestione
VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la
proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB
inducendo l’espressione della proteina virB,
anch’essa plasmidica
VirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.
Ipa B e C, si integrano
nella membrana
dell’ospite e promuovono
la formazione degli
pseudopodi
IpaA iniettata nel
citoplasma dell’ospite
favorisce la
depolimerizzazione
dell’actina accumulata
intorno al sito
d’ingresso del
batterio.
Le proteine IpaA
servono anche per la
lisi del vacuolo
190
FATTORI DI VIRULENZA
spa surface presentation of invasion plasmid antigens
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes.
spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di
traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula
IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula
batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula
batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione
dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.
IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta
191
invasion plasmid
antigens ipa,
surface presentation of
invasion plasmid
antigens spa,
membrane excretion of
Ipa mxi,
virulence vir genes.
A 37°C, VIRF e
VIRB attivano
operon spa, mxi e
ipa
Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa:
invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa
192
proteins and surface presentation of antigens
Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa:
invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of
antigens
193
194
195
Cytoskeletal rearrangements
induced during Shigella
invasion of epithelial cells.
Shigella secretes the effector
proteins, such as IpaB, IpaC,
IpaA and VirA, into host cells.
IpaB and IpaC are integrated
into the host membrane, and
IpaC modulates Cdc42dependent filopodial formation
which, in turn, may cause
activation of Rac1 and
lamellipodial formation. IpaA
binds vinculin, and the
resulting IpaA−vinculin
complex promotes
depolymerization of actin
filaments, which is thought to
be required for modulation of
lamellipodial formation. VirA
binds / -tubulin heterodimers
and induces MT destabilization.
VirA-induced MT destabilization
would in turn lead to MT
growth and stimulation of the
Rac1 activity, and thus evoke
the local membrane ruffling.
196