Progetti di ricerca in corso nell’ U.O. di Virologia
Direttore: Prof. Ceccherini-Nelli Luca
INTRODUZIONE
Il virus erpetico ottavo umano (HHV-8), noto anche come virus erpetico associato al
sarcoma di Kaposi (KSHV) è stato isolato per la prima volta nel 1994 da una biopsia di un
sarcoma di Kaposi (SK) associato ad AIDS. E’ un virus a DNA a doppio filamento dotato di
pericapside e con simmetria icosaedrica appartenente alla famiglia dei γ-herpesvirus.
L’infezione primaria avviene generalmente durante l’infanzia e permane come infezione
latente nei linfociti B19 a lungo termine spesso asintomatica. HHV-8 infetta molti tipi
cellulari dove inizialmente favorisce l’istaurarsi di un ciclo latente e solo alcuni tipi cellulari
latentemente infetti permettono l’istaurarsi di un ciclo virale litico. HHV-8 è associato a
tutte le forme clinico-epidemiologiche di SK nonché ad alcuni rari tipi di linfomi: la malattia
di Castelman multicentrica (MCD) e il linfoma ad effusione primaria (PEL). Il DNA di HHV8 mostra una notevole eterogeneità, grazie alla quale è stato possibile suddividere i vari
isolati in sei sottotipi (A, B, C, D, E e Z) prevalenti in maniera diversa a seconda delle aree
geografiche. I meccanismi di trasmissione e la dinamica nei vari distretti cellulari di HHV-8
sono ancora poco chiari.
Le metodiche di quantificazione molecolare di HIV hanno dato un grosso impulso al
monitoraggio delle terapie antiretrovirali nei pazienti infetti. Inoltre, gli studi epidemiologicovirali basati su analisi molecolari sono in continuo crescendo. L’effettuazione di analisi
molecolari nei Paesi in via di sviluppo sono problematiche per una serie di motivi dovuti
alla povertà presente in queste regioni. Anche la spedizione di materiali biologici
conservati in maniera adeguata risulta difficoltosa. Per questi motivi sono state sviluppate
speciali cartine bibule sulle quali i camponi biologci possono essere posti ed essiccati. In
questo modo i campioni possono giungere senza problemi in un laboratorio attrezzato ed
essere qui processati per l’esecuzione di analisi molecolari.
PROGETTI DI RICERCA
1) Analisi quantitativa e determinazione dei ceppi del virus erpetico 8 in pazienti con
Sarcoma di Kaposi
1.1
Da un gruppo di pazienti affetti da Sarcoma di Kaposi provenienti dalla Sardegna
sono stati prelevati campioni di sangue, siero e saliva. Dai suddetti campioni è stato
estratto il DNA ed è stata eseguita la quantificazione del virus mediante real-time PCR.
Per ogni paziente è stato anche determinato il ceppo virale mediante PCR di una regione
ipervariabile e successiva analisi di sequenza. Da una prima analisi sembra esserci una
correlazioni tra il ceppo virale e la sua carica nei vari distretti dove il virus è presente. Il
numero dei campioni da analizzare deve essere aumentato.
Competenze da acquisire: estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, PCR, realtime PCR, elettroforesi su gel di agarosio, analisi di sequenza con metodi bioinformatici
1.2
Per avere una conferma in vitro di questa osservazione preliminare si stanno
allestendo delle colture cellulari di BCBL1 e BC3 per riattivare HHV8 dei due ceppi
prevalenti nell’area Mediterranea. Il virus riattivato da queste linee cellulari sarà usato per
infettare successivamente cellule epiteliali ed analizzare l’andamento dell’infezione
misurando l’antigene mediante immunofluorescenza diretta ed il carico virale per real-time
PCR.
Competenze da acquisire: crescita e mantenimento di colture cellulari,
immunofluorescenza, estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, real-time PCR
2) Estrazione e quantificazione di acidi nucleici virali provenienti da materiali
biologici essiccati su carta bibula
Di recente nel nostro laboratorio è stata messa a punto la metodica per l’estrazione e la
quantificazione di acidi nucleici da campioni biologici provenienti dall’Africa ed essicati su
carta bibula. Un primo studio in corso prevede la determinazione della presenza di DNA di
HHV-8 in campioni di saliva, posti ed essiccati su cartine, di madri del Camerun per
ottenere dati epidemiologico-molecolari sulla saliva come veicolo di trasmissione del virus.
Un secondo studio prevede la quantificazione molecolare di HIV da campioni di sangue,
posti ed essiccati su cartine, provenienti da un nuovo ospedale situato in Repubblica
Centrafricana. E’ in corso anche la messa a punto della tipizzazione virale sia di HIV che
di HHV-8 dei campioni procvenienti dallAfrica.
Competenze da acquisire: estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, PCR, realtime PCR, elettroforesi su gel di agarosio, analisi di sequenza con metodi bioinformatici
3) Sviluppo di microarray per l’individuazione di agenti infettanti
Vari fattori sono stati proposti per spiegare i dati epidemiologici sia sierologici che
molecolari che indicano questa diversa distribuzione geografica dell'infezione da HHV8 e
dell’insorgenza del KS, fra loro potenzialmente interagenti, quali: genotipi virali HHV8 a
diversa patogenicità; fattori genetici e fisiologici dell’ospite (il grado di immunosorveglianza
generale e/o locale cutanea); comportamenti e/o esposizione a fattori biologici di natura
infettiva, non solo umani, ma anche animali, nell'ambito di specifiche aree geografiche.
Ci proponiamo di ricercare cofattori biologici di natura infettiva che possano essere
coinvolti nella patogenesi del KS quali: coinfezioni con altri herpesvirus non solo a
tropismo esclusivamente umano, ma anche animale che promuoverebbero l’insorgenza
della neoplasia modulando non solo l’espressione di geni di HHV8 fondamentali nella
trasformazione, ma anche una disregolazione del sistema immunitario.
Abbiamo deciso di utilizzare a tale proposito la tecnica dei DNA microarray. Lo scopo è di
amplificare e marcatre tutto il DNA presente in campione da ibridare su vetrini spottati con
sonde 70-mer specifiche per ogni agente da ricercare. Sono state validate ad oggi 34
sonde (4 per ogni virus erpetico, 2 per il gene della BetaGlobina), è stato messo a punto il
sistema di spottaggio, di marcatura random e di ibridazione. E’ in corso l’acquisizione di
nuove sonde e di isolati di virus erpetici animali da utilizzare come controllo positivo.
Competenze da acquisire: allestimento di colture cellulari, isolamento e propagazione di
isolati virali, estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, PCR, elettroforesi su gel di
agarosio, ricerca e validazione di oligo di varia con metodi bioinformatici.
4) Trasmissione di HHV-8
Studi sieroepidemiologici hanno dimostrato che vi sono almeno due vie di trasmissione di
HHV8: sessuale, più comune in paesi a bassa sieropositività dove l’infezione è rara
(Europa del Nord, Asia e America), e non sessuale, predominante nelle regioni
endemiche dell’Africa dove i tassi di infezione sono alti; non è ancora chiaro quale delle
due modalità di trasmissione sia prevalente nei paesi del Mediterraneo. Una via di
trasmissione accertata risulterebbe il trapianto di organo solido. I meccanismi di
trasmissione interumana che portano a queste differenze non sono noti, né per l’infezione
primaria né per la riattivazione.
Ci proponiamo di valutare la possibilità di una trasmissione intrafamiliare attraverso
l’analisi delle sequenze di familiari di pazienti KS.
Ad oggi sono stati analizzati 13 pazienti KS e 22 dei loro familiari; l’analisi delle sequenze
dei ceppi infettanti ha rilevato una maggiore omologia nei ceppi dei soggetti imparentati
rispetto a quelli appartenenti allo stesso genotipo infettanti soggetti non imparentati.
E’ in corso l’ampliamento del numero dei campioni in analisi.
Allo scopo di valutare la trasmissione intrafamiliare è in corso anche l’analisi dei genotipi
infettanti madri e figli residenti in Cameroon, paese ad alta endemia di KS e in Italia,
paese a bassa endemia.
Competenze da acquisire: estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, PCR, rel-time
PCR, elettroforesi su gel di agarosio, analisi di sequenza con metodi bioinformatici.
4) Farmaci antivirali
I farmaci antivirali antierpetici oggi disponibili sono analoghi nucleosidici della guanosina,
la cui attività dipende dalla attivazione del profarmaco da parte della timidino-kinasi virale
(ACICLOVIR, PENCICLOVIR, FAMCICLOVIR) oppure molecole fosforilate derivate della
citidina che agiscono sull’attività della DNA polimerasi virale e quindi indipendentemente
dal funzionamento della timidino-kinasi virale (FOSCARNET, CIDOFOVIR). Mutazioni
genomiche virali nei geni TK e POL possono conferire resistenza a queste classi di
farmaci, pertanto è utile saggiare composti con meccanismi di azione diversa che possano
potenzialmente incrementare l’armamentario terapeutico contro le infezioni erpetiche che
sono in continua espansine legata all’aumento di pazienti immunocompromessi per
senilità, trapianti d’organo, AIDS. A questo scopo viene saggiata nel nostro laboratorio
l’attività antivirale di farmaci antivirale di nuova e vecchia generazione con metodi sia
cellulari che molecolari.
A tale proposito vengono allestiste colture cellulari sia per l’isolamento, spesso a scopo
diagnostico, che la propagazione di agenti virali. Ad oggi HSV, VZV, CMV e HHV-8 sono i
virus di cui stiamo valutando la sensibilità a vari farmaci.
Competenze da acquisire: allestimento di colture cellulari, isolamento e propagazione di
isolati virali, saggio di placca, estrazione di acidi nucleici da campioni biologici, realtimePCR, utilizzo di software per l’analisi dei dati.
