GuestEditorial_La Biologia Molecolare del Glaucoma ruolo dello

Anno diciottesimo settembre 2013
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Guest Editorial
Biologia Molecolare del Glaucoma:
Ruolo dello Stress ossidativo nel segmento
anteriore nel Glaucoma cronico ad angolo
aperto - TERZA PARTE
Sergio C. SACCÀ1, Aldo VAGGE2, Alberto Izzotti3
Diparitmento Testa/Collo, Ospedale San Martino, Unità Oftalmologica, Genova
Dipartmento di Neuroscienze, Oftalmologia & Genetica, Università di Genova, Clinica Oculistica,
Università di Genova
3
Dipartmento di Scienza della Salute, Facoltà di Medicina, Università di Genova
1
2
4.0 La proteomica dell’umor acqueo riflette la
patogenesi del glaucoma
L’endotelio della CA (ACE) è non solo un gruppo di cellule che agiscono
come una barriera tra l’UA e i tessuti circostanti, ma come nei vasi, è un
organo reale con la funzione di modulare il tono oculare e la quantità
del flusso in risposta a stimoli umorali, nervosi e meccanici. In condizioni
fisiologiche l’ACE gioca un ruolo attivo di interscambio cellulare, essendo
in grado di adattarsi funzionalmente e strutturalmente alle variazioni
dell’ambiente (Verma et al 2003). La normale funzione endoteliale
dipende sia dalla continuità anatomica del monostrato cellulare sia
dalla sua integrità funzionale (Furchgott e Zawadzki 1980). Nei vasi, la
disfunzione endoteliale è caratterizzata da vasocostrizione, aggregazione
piastrinica, proliferazione delle cellule muscolari lisce, ed è correlato ad
una ridotta biodisponibilità di ossido nitrico (NO), un carico ossidativo
eccessivo e ad un aumento degli effetti dell’endotelina 1 (Monnink et al
2002; Landmesser et al 2002) (Fig. 6).
L’NO è una delle sostanze più importanti prodotte dall’endotelio; esso
è un potente vasodilatatore, un inibitore della crescita delle cellule
endoteliali e dell’infiammazione. L’ossido nitrico è il maggior fattore
intercellulare ed extracellulare contro lo stress ossidativo, ed ha un
benefico effetto antiossidante contro i ROS, come l’H2O2 il cui effetto
deprimente sul deflusso dell’UA è stato accertato (Lutjen-Drecoll
2000). Un ruolo prominente nella disfunzione endoteliale deve essere
assegnato all’attivazione dell’NO da parte dei ROS. La reazione dei ROS
con NO produce perossido nitriti i quali sono agenti citotossici quindi
decrementano la biodisponibilità di NO o lo inattivano direttamente
(Aslan et al 2008).
L’endotelina 1 (ET1), un peptide vasocostrittore potente di produzione
endoteliale che agisce su specifici recettori presenti solo su cellule
muscolari lisce e che causa vascocostrizione e crescita cellulare. L’ET1
opera mediante la stimolazione della produzione di NO il quale
agisce come feedback negativo inibendo la produzione di ulteriore
ET1 (Heitzer et al 2001). In caso di riduzione di biodisponibilità di
NO questo meccanismo di feedback negativo è compromesso e
conseguentemente l’effetto vascocostrittivo dell’ET1 è incrementato
(Haynes e Webb 1998).
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fig. 6
156
Fig. 6
Come nella
disfunzione
endoteliale classica
quella che colpisce il
Trabecolato produce
alterazioni a carico
della biodisponibilità
dell’Ossido Nitrico
e della endotelina 1.
Il TNF-α regola
l’espressione e
l'attività NOS, che
esercita effetti diretti
sulla produzione del
NO. TNF-α aumenta
l’espressione iNOS
attivando la via
NF-κB. Aumentando
l’espressione del
TNF-α aumenta
la produzione di
ROS. TNF-α attiva
anche la trascrizione
della NF-κB che
regola l’expression
dei geni coinvolti
nell'infiammazione e
nello stress ossidativo.
Un equilibrio tra vasocostrittori e vasodilatatori è necessario per mantenere
la struttura fisiologica e la funzione endoteliale (Gibbons 1997). Ogni
qualvolta l’equilibro tra vasocostrittori e vasodilatatori è alterato, come nel
glaucoma, il risultato è la disfunzione endoteliale ed il danno che hanno
come conseguenza è la perdita di proteine dalle cellule nell’UA.
L'AC è un lume di un vaso costituito dalla cornea e dall’iride congiunti
insieme mediante il TM. La CA contiene l’UA. Il volume della CA è
approssimativamente di 0,25 ml mentre il volume della camera posteriore
è 0,26 ml. L’UA ha la funzione di garantire la trasparenza ottica, l’integrità
delle strutture, la nutrizione in assenza di vasi sanguigni (Izzotti et al
2009). Inoltre, questo liquido ha il compito di proteggere e fornire i
nutrienti alla cornea, al cristallino ed al TM (Izzotti et al 2006; Fuchshofer
e Tamm 2009). Altre funzioni ascrivibili all’afflusso d’UA sono state meno
chiaramente definite (Krupin e Civan 1996) ed includono la distribuzione
di antiossidanti, come l’ascorbato e la partecipazione alla risposta immune
locale. L’epitelio ciliare concentra ascorbato nell’UArendendolo concentrato
40 volte di più nell’UA che nel plasma sanguigno (Krupin e Civan 1996).
È possibile che l’ascorbato non sia solo uno scavenger di ROS, ma possa
essere anche un regolatore dell’attività dei canali ionici funzionando
come un modulatore endogeno dell’eccitabilità neuronale (Nelson et al
2007). In ogni caso le cellule nella via di deflusso sono soggette a stress
ossidativo cronico e vanno incontro ad un'attività ridotta dell’attività del
proteasoma nel trabecolato (Govindarajan et al 2008). Pertanto, qualsiasi
alterazione della funzione del proteasoma dovuta allo stress ossidativo
od all’invecchiamento dovrebbe inoltre aumentare il tasso di accumulo di
miocillina mutante nel reticolo endoplasmatico e contribuire agli effetti
patogenici di questa proteina mutata nelle attività mitocrondriali nelle
cellule trabecolari umane (He et al 2009). L’UA rappresente un contenitore
proteico biologico fluido fondamentale per la fisiopatologia dell’occhio
(Civan 2008). Tuttavia la relazione tra TM e proteine dell’UA in relazione
alla patogenesi del POAG non è stata ancora valutata. Molte proteine
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fig. 7
fig. 7
Il profilo proteico del
paziente glaucomatoso
da un punto di
vista quantitativo è
simile a quello del
paziente non affetto.
Tuttavia da un punto
di vista qualitativo
le proteine espresse
nell’UA dei due gruppi
sono assolutamente
differenti.
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espresse ad alti livelli in pazienti sani sono ridotte in pazienti con POAG,
mentre altre proteine presenti a bassi livelli in soggetti normali sono
incrementate in pazienti con POAG (Fig. 7). Recentemente abbiamo
scoperto sei classi di proteine specificatamente presenti nell’UA in pazienti
glaucomatosi avanzati (Izzotti et al 2010a).
5.0 Proteine nell’umor acqueo nei pazienti glaucomatosi
La prima classe di proteine sono proteine mitocondriali implicate nella
catena di trasporto degli elettroni, nel trasporto trans-membrana, nella
riparazione proteica e nel mantenimento dell’integrità mitocondriale.
La seconda classe sono proteine implicate nell’induzione dell’apoptosi,
attraverso la via intrinseca mitocondrio dipendente.
La terza classe sono proteine cellulari che connettono le cellule, queste
includono le catenine, le placche proteiche giunzionali, le dineine e le
caderine.
La quarta classe è composta da proteine neuronali come l’optineurina
o fattori di crescita e implicati nella differenziazione e la sopravvivenza
neuronale e nella neurogenesi.
La quinta classe include le proteine chinasi implicate nell’apoptosi,
nell’attivazione e trasduzione del segnale.
Infine, la sesta classe è concernente lo stress ossidativo ed include: ossido
nitrico sintetasi, superossido dismutasi e la glutatione S-transferasi 1
microsomiale.
Tutte queste proteine attestano che la composizione dell’UA è correlata
e riflette il meccanismo della patogenesi del glaucoma. La presenza di
proteine mitocondriali, normalmente segregate all’interno di mitocondri
intatti, riflette il fatto che le cellule endoteliali del TM sono affette da
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perdita mitocondriale e da disfunzione come si verifica specificatamente
solo nel TM e non in altri tessuti della CA durante il glaucoma.
La presenza di proteine endoteliali nell’UA indica che il trabecolato subisce
alterazioni strutturali e che in particolare le sue cellule endoteliali perdono
proteine mitocondriali come una conseguenza di una delezione del
DNA mitocondriale che determina un malfunzionamento dei mitocondri
e una destrutturazione trabecolare che porta all’apoptosi. La perdita
cellulare è determinata non solo da proteine pro-apoptotiche ma anche
da altri meccanismi implicati e rivelati dalla presenza di altre proteine:
infiammazione, disregolazione vascolare ed ipossia (Choi e Benveniste
2004; Li et al 2006). Infatti proteine di questi gruppi funzionali sono
espresse nell’UA di pazienti glaucomatosi. Troviamo ad esempio la proteina
BIK, normalmente localizzata all’interno del mitocondrio, che attiva il
processo apoptotico attraverso la via intrinseca, e la proteina FAS che
è responsabile dell’attivazione dell’apoptosi attraverso la via estrinseca
in risposta all’infiammazione e/o allo stress ossidativo. La FAS inoltre,
provoca l’apoptosi incrementando il rilascio di miocilina dal mitocondrio nel
compartimento citosolico delle cellule trabecolari (Sakai et al 2007).
La presenza di “proteine che connettono le cellule” nell’UA del paziente
glaucomatoso riflette il danneggiamento di organizzazioni citoscheletriche,
adesioni cellula-cellula e capacità di migrazione (Lee e Tomarev 2007).
La caldessina presente nell’UA può essere associata con la presenza di
miocilina mutata. La miocilina, la prima proteina geneticamente associata
con lo sviluppo del glaucoma, è un costituente dell’UA umano ed è
espressa in molti tessuti oculari con un’alta espressione osservata nelle
cellule del trabecolato (Adam et al1997).
La calnexina è una proteina legante il calcio che gioca un ruolo importante
nel dispositivo di controllo della qualità del reticolo endoplasmatico
mantenendo il ruolo controllo sulle strutture delle proteine ripiegate in
modo non corretto. Essa è normalmente localizzata nei melanosomi, la
sua presenza nell’UA è probabile che sia causata dalla morte di cellule
pigmentate del TM indotta dalla miocilina mutante e wild-type a seconda
della presenza di proteine malripiegate nell’ER (Liu and Vollrath 2004).
La miocilina è una proteina secretoria che fa da segnale (Hebert e Molinari
2007). Questa ha sia una funzione intracellulare che intercellulare (Ueda
et al 2002) che può essere trovata in vari organelli come il reticolo
endoplasmatico (Liu and Vollrath 2004), apparato di Golgi (O’Brien et al
2000) ed inoltre nei mitocondri (Wentz-Hunter et al 2002). La miocilina
incrementa la concentrazione di calcio nel citoplasma e nei mitocondri,
probabilmente attraverso la disregolazione dei canali del calcio (He et
al 2009). Un eccessivo calcio citoplasmatico determina un sovraccarico
di calcio mitocondriale a cui consegue una iper-produzione di ROS,
depolarizzazione delle membrane mitocondriali ed inibizione della
produzione di ATP, tutti eventi segnali di una disfunzione mitocondriale ed
eventuale apoptosi (Jackson and Thayer 2006; Dahlem et al 2006). Perciò
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la mutazione di miocilina altera la funzione mitocondriale nelle cellule
trabecolari umane (He et al 2009) e può conferire una sensibilità differente
allo stress ossidativo dipendente dalla mutazione di questa proteina (Joe
and Tomarev 2010) come indurre le basi genetiche nel glaucoma giovanile
o nel POAG ROS-mediato.
La presenza di proteine neuronali nell’UA non è sorprendente, perché le
cellule trabecolari hanno un’origine neuro-ectodermica, esprimendo, almeno
in parte, un fenotipo simil-neuronale (Steely et al 2000) delle cellule
trabecolari derivando dalle cellule mesenchimali della cresta neurale (Cvekl
e Tamm 2004). L’optineurina gioca un ruolo neuroprotettivo nell’occhio e
nel nervo ottico, protegge le cellule dal danno ossidativo e blocca il rilascio
di citocromo C dai mitocondri (De Marco et al 2006). La sua presenza
nell’UA nei soggetti glaucomatosi suggerisce un tentativo anti-apoptotico
da parte delle cellule trabecolari attraverso la regolazione della via NFk-B
(Ray e Mookherjee 2009). Viceversa la presenta di anchirina testimonia il
processo degenerativo delle cellule trabecolari (Scotland et al 1998).
Di grande interesse sembra essere la presenza di proteina chinasi C
(PKC) nell’umor acqueo. Effettivamente, questa potrebbe influenzare
il deflusso dell’UA essendo implicata sia nella contrazione che nel
rilassamento cellulare, nelle variazioni morfologiche del trebecolato e
nelle cellule sclero-corneali (Khurana et al 2003) e nella secrezione delle
metallo-proteinasi della matrice (Husain et al 2007). Una sollecitazione
meccanica induce variazioni di un grande numero di geni che sono
noti per influenzare facilità di deflusso alterando la composizione della
matrice cellulare, del citoscheletro e dell’adesione delle cellule (Luna
et al 2009). La constatazione che le alterazioni proteomiche nell’UA
riflettano la patogenesi del glaucoma confermano l’importanza della
motilità trabecolare. Un malfunzionamento trabecolare è multifattoriale
essendo correlato non solo ad una disfunzione mitocondriale che
determina una perdita delle cellule trabecolari endoteliali, ma anche
da alterazione di cellule della matrice extracellulare e dall’alterazione di
espressione di geni che regolano la funzione del TM e la sua motilità.
Perché si sviluppi un glaucoma è necessaria l’attivazione di molti fattori:
ad esempio l’invecchiamento, la predisposizione genetica, l’ambiente
esogeno e fattori endogeni. Fattori ambientali possono interagire con
la predisposizione genetica. In alcune famiglie la malattia ha una chiara
ereditarietà dominante, anche se in casi molto rari. In un gran numero
di casi invece, c’è una certa predisposizione genetica testimoniata dalla
presenza di altri membri della famiglia affetti dalla malattia, pur avendo
un grado di parentela lontano. In particolare, un aspetto relativo è
la sensibilità individuale alla luce: infatti, questo potrebbe favorire la
produzione di radicali liberi che potrebbero indurre danno cellulare.
Effettivamente i ROS sono aumentati nell’UA dei soggetti glaucomatosi
determinando una riduzione degli antiossidanti totali (Ferreira et al 2004).
In particolare il nostro gruppo ha dimostrato recentemente che nell’UA
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fig. 8
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Fig. 8
I nostri dati ottenuti
mediante tecnologia
antibody microarray
hanno evidenziato
differenze sostanziali
dei livelli di glutammina
sintasi (GS), ossido
nitrico sintasi (NOS)
superossido dismutasi
(SOD) e glutatione
transferasi (GST)
nell’umore acqueo dei
soggetti glaucomatosi
e dei non affetti. I
livelli di SOD e di GST
erano significativamente
inferiori (2,0 - e 2,2
volte, p < 0,01) tra i
pazienti con glaucoma;
mentre l’espressione
di NOS e GS era
significativamente più
elevata (2,2 e 2,6
volte, p < 0,01 ) tra i
pazienti con glaucoma.
La sovrapproduzione
di NO attraverso
NOS inducibile può
formare prodotti
tossici e modificare le
condizioni metaboliche
del Trabecolato.
L'espressione maggiore
del GS potrebbe essere
correlata con l’insulto
neuronale o con il
ruolo potenziale del
glutammato come
modulatore dei segnali
nel corpo ciliare.
La ridotta espressione
degli enzimi
antiossidanti SOD e GST
potrebbe aggravare lo
sbilanciamento tra ROS
e NOS che si verifica in
corso di glaucoma.
di pazienti glaucomatosi, gli enzimi antiossidanti superossido dismutasi 1 e
2 e glutatione S-transferasi 1 sono significativamente diminuiti in pazienti
con POAG rispetto i controlli, mentre gli enzimi pro-ossidanti ossido
nitrico sintetasi 2 e glutammato/ammonio ligasi sono significativamente
aumentati in pazienti con POAG rispetto i controlli (Bagnis et al 2012) (Fig.
8). Questo disequilibrio esita in uno stato pro-ossidativo che colpisce nel
CA soprattutto il TM, che è particolarmante sensibile al danno ossidativo,
innescando così la cascata patogenetica del glaucoma (Izzotti et al 2009).
L’importanza dello stress ossidativo nella patogenesi del glaucoma è
ulteriormente evidenziata dalla recente scoperta che alcuni farmaci antiglaucomatosi con il Timololo (Izzotti et al 2008) e Dorzolamide (Saccà et al
2011) comunemente usati nel trattamento del glaucoma hanno proprietà
antiossidanti e contrasta le conseguenze negative del danno ossidativo
come si verifica in tutto il trabecolato e specificatamtente delle sue
componenti endoteliali, proteggendo cellule e mitocondri. Il Timololo ha un
effetto antiossidante sull’intera cellula mentre la Dorzolamide esercita la sua
attività difensiva verso lo stress ossidativo solo in presenza di mitocondri
intatti.
Perciò, farmaci il cui target sono i processi mitocondriali fondamentali come
la produzione di energia o la generazione di radicali liberi, o specifiche
interazioni di proteine correlate a malattie con mitocondri, sono molto
promettenti per la terapia del glaucoma.
CONCLUSIONI
Grazie all’uso di nuove tecnologie le basi molecolari del glaucoma si stanno
iniziando a capire ed in un prossimo futuro queste conoscenze potranno
essere sfruttate per applicazioni pratiche sia nel campo della diagnostica
sia in quello della terapia. Le tecniche “Microarray” basata sulla proteomica
in grado di rilevare i primi danni molecolari nel glaucoma includono
l'espressione genica che può essere applicata in vitro sulle cellule endoteliali.
Su soggetti umani questa analisi è stata usata sui leucociti circolanti ed è
stata in grado di discriminare tra pazienti glaucomatosi e controlli (Colak et
al 2012)
Molto promettente sembra essere la metodica antibody microarray che, a
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differenza di altri metodi, è in grado di quantificare proteine del glaucoma
mediante una tecnica moderatamente invasiva come una puntura corneale.
Ed è immaginabile che questo metodo possa essere migliorabile mediante
micropunture (Izzotti et al, 2012). Questo metodo si basa sull'identificazione
di diverse proteine differenzialmente espresse nell’UA in soggetti sani
o malati mediante anticorpi specifici marcati con fluorescenza. I segnali
fluorescenti sono acquisiti per mezzo di uno scanner laser e analizzati
con software in grado di valutare l'espressione di gruppi di proteine così
da essere in grado di distinguere il pattern di espressione di un soggetto
normale da quello affetto da POAG.
La conoscenza dei meccanismi molecolari che portano all’ insorgenza del
POAG contribuiranno a sviluppare nuovi approcci terapeutici, contrastare in
TM stress ossidativo e le sue conseguenze molecolari, il miglioramento del
metabolismo energetico mitocondriale, correggendo e riducendo l’apoptosi.
Questo approccio molecolare ci permetterà presto di comprendere
quali segnali molecolari portano l’informazione del danno dalla Camera
Anteriore alla testa del nervo ottico, ovvero il fodamento molecolare che
sta alla base del Glaucoma e della perdita del Campo Visivo.
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