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ELAS-Italia
Le analisi immunometriche:
basi teoriche e
applicazioni cliniche
A cura di ELAS-Italia
Coordinatori
Claudio Dotti e Antonio Fortunato
Tutti i diritti sono riservati
È VIETATA PER LEGGE LA RIPRODUZIONE IN FOTOCOPIA
E IN QUALSIASI ALTRA FORMA
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senza autorizzazione scritta dell’Editore.
Ogni violazione sarà perseguita secondo le leggi civili e penali.
La medicina è una scienza in continua evoluzione. Mentre nuove ricerche
e l’esperienza clinica ampliano la nostra conoscenza, possono rendersi convenienti
aggiornamenti tecnologici continuamente in divenire. Gli autori
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le informazioni disponibili al momento della pubblicazione. Tuttavia, in
considerazione della possibilità di errore umano o di evoluzioni
metodologiche, né gli autori né l’editore né alcuna altra parte che è stata
coinvolta nella preparazione o pubblicazione di questo lavoro garantiscono
che le informazioni contenute nel presente trattato siano accurate e
complete, e si declina ogni responsabilità per eventuali errori od omissioni.
I lettori sono invitati a confermare le informazioni contenute
nel presente trattato con altre fonti.
Capitoli 1, 2 e 3 sviluppati sulla base del testo francese
Immunoanalyse, a cura di Catherine Massart, © EDP Sciences 2009
Si ringrazia la Dr.ssa Lucia Belloni per il prezioso apporto
ai lavori di coordinamento dell’opera
ISBN 978-88-299-2335-9
Stampato in Italia
© 2014 by Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova
www.piccin.it
Autori
Lucia Belloni
SSD Autoimmunità, Allergologia e Biotecnologie
Innovative
Dipartimento di Medicina di Laboratorio
Azienda Ospedaliera “Arcispedale Santa Maria Nuova”
IRCCS – Reggio Emilia
[email protected]
Cinzia Carrozza
Dipartimento di Diagnostica e Medicina di Laboratorio
Policlinico Universitario “A. Gemelli”
Roma
[email protected]
Aldo Clerico
Dipartimento di Medicina di Laboratorio
Fondazione Regione Toscana “G. Monasterio”
Pisa
[email protected]
Mario Correale
SOC Patologia Clinica e Laboratori
IRCCS “S. De Bellis”
Castellana Grotte (Bari)
[email protected]
Giuseppe De Renzi
Ufficio di Sanità Marittima, Aerea e di Frontiera
Milano Malpensa
Ufficio Territoriale di Caselle Torinese (Torino)
[email protected]
Ruggero Dittadi
SC Laboratorio Analisi
Dipartimento di Patologia Clinica
Ospedale Dell’Angelo, ULSS 12 Veneziana
Mestre – Venezia
[email protected]
Claudio Dotti
SC Laboratorio Analisi Chimico Cliniche e di
Endocrinologia
Dipartimento di Medicina di Laboratorio
Azienda Ospedaliera “Arcispedale Santa Maria Nuova”
IRCCS – Reggio Emilia
[email protected]
Simona Ferraro
Dipartimento di Medicina di Laboratorio
Fondazione Regione Toscana “G. Monasterio”
Pisa
[email protected]
Antonio Fortunato
SC Laboratorio di Chimica Clinica ed Ematologia
Dipartimento di Patologia Clinica
Ospedale “San Bortolo”
Regione Veneto – ULSS 6
Vicenza
[email protected]
Massimo Gion
SC Laboratorio Analisi
Dipartimento di Patologia Clinica
Ospedale Dell’Angelo, ULSS 12 Veneziana
Mestre – Venezia
[email protected]
Marco Migliardi
SC Laboratorio Analisi
Ospedale “Umberto I”
Azienda Ospedaliera “Ordine Mauriziano di Torino”
Torino
[email protected]
Giulio Vignati
Centro Malattie Endocrine e Metaboliche
Ospedale “G. Fornaroli”
Magenta (Milano)
[email protected]
Simona Vittorini
Dipartimento di Medicina di Laboratorio
Fondazione Regione Toscana “G. Monasterio”
Pisa
[email protected]
Gian Carlo Zucchelli
Medicina di Laboratorio
Istituto di Fisiologia Clinica – CNR
Area della Ricerca
Pisa
[email protected]
Contributi dal testo francese IMMUNOANALYSE, a cura di Catherine Massart, EDP Sciences, 2009
Capitolo 1 sviluppato sulla base del capitolo Bases immunologiques de la réaction antigène-anticorps, di PierreJean Lamy e Frédéric Montels, pagine 15-37.
Capitolo 2 sviluppato sulla base del capitolo Principes et techniques en immunoanalyse, di Anne Charrié, Karim
Chikh e Dany Alcaraz-Galvain, pagine 39-114.
Capitolo 3 sviluppato sulla base del capitolo Problèmes et pièges en immunoanalyse, di Chantal Valat e Rémy
Sapin, pagine 115-158.
Pierre-Jean Lamy
Centre de Lutte Contre le Cancer Val d’Aurelle-Paul Lamarque, Montpellier
Frédéric Montels
Centre de Lutte Contre le Cancer Val d’Aurelle-Paul Lamarque, Montpellier
Anne Charrié
Université Claude Bernard, Lyon
Karim Chikh
Université Claude Bernard, Lyon
Dany Alcaraz-Galvain
CHU, Lyon
Chantal Valat
Université François Rabelais, Tours
Rémy Sapin
Université Louis Pasteur, Strasbourg
Presentazione
Nata come ‘Radioimmunologia’ tra la fine degli anni ‘50 e i
primi ‘60, l’immunometria si è man mano imposta in qualità di disciplina specialistica nell’ambito della Medicina di laboratorio, evolvendosi sul piano tecnologico ed estendendo
le proprie pertinenze dall’iniziale endocrinologia a molteplici
campi: dall’oncologia al metabolismo, dall’allergologia all’autoimmunità, l’infettivologia, la cardiologia, la nefrologia, la farmaco-tossicologia, la medicina prenatale... così configurando
le tecniche immunochimiche fra le più versatili sul piano applicativo. Benché siano innumerevoli i singoli apporti specifici
dei biochimici italiani, i testi globali redatti nella nostra lingua
sono pochi e ormai di antica data. Risale al 1984 la prima
monografia di Renzo Malvano: Radioimmunologia - Materiale per un corso di aggiornamento, ed è sempre dello stesso
autore, assieme a Gianfranco Giraudi, il testo L’immunochimica analitica, edito nel 1998. Meritano menzione anche il
testo di F. Fraioli & Coll.: RIA - Principi di Radioimmunologia,
pubblicato nel 1989, e la Guida pratica agli immunodosaggi, di L. Romano & Coll., che uscì in due edizioni, la prima
nel ‘94 e la seconda nel ‘96. Notevole apporto al settore
specialistico deve poi essere riconosciuto alla rivista trimestrale Ligand Quarterly, nata nel 1982 come edizione italiana della CLAS statunitense (Clinical Ligand Assay Society)
e pubblicata sino al 1993. Ad essa fece seguito la rivista
LigandAssay (LA), edita da ELAS-Italia dal 1995 e tuttora pubblicata in quattro numeri all’anno. E ora l’opera: Le analisi
immunometriche: basi teoriche e applicazioni cliniche,
patrocinata da ELAS Italia. Essa aspira ad inserirsi nel filone dei
testi di immunometria in lingua italiana, implementando e
aggiornando sia gli aspetti tecnologici che le pertinenze diagnostiche della disciplina. Prendendo alcuni spunti dal testo
francese Immunoanalyse (EDP Sciences, 2009), nonché dal
manuale di Malvano e Giraudi del 1998, ne hanno curato la
redazione i componenti del Consiglio Direttivo di ELAS-Italia.
Marco Migliardi
(Presidente ELAS-Italia)
Gian Carlo Zucchelli
(Past President)
Prefazione
It is a great honour as well as a pleasure to write a few
words by way of introduction to this publication. Moreover a brief review of the history of immunoassay and
other ligand assay techniques and their likely future is
not out of place in a volume devoted to these topics.
My own involvement in this area commenced in 1954
when walking home one evening thinking of my and
my colleagues’ need to assay thyroxine (T4), and other
hormones, then a topic of discussion in the Physics
department of the Middlesex Hospital Medical School,
London, where I was employed as a research assistant.
I recall thinking of a hormone as a very small stick, from
which, if one could cut off a short piece of a known
length, and determine the ratio of the resulting two
pieces, would permit the determination of the stick’s
total length.
But how to measure the ratio? By initially coating and
labelling the entire stick with a radioisotope. And how to
cut off a short piece of a known length? In the particular
case of T4 by reacting the sample with a small ‘saturable’ amount of the newly discovered T4 specific binding protein present in human serum, thyroxine binding
globulin, (TBG).
Reaching home I constructed some simple equations
from the Mass Action Laws as follows:
(F/B)2 + (F/B) (1 – [An]/[Ab ] - 1/K [Ab]) - 1/K [Ab] = 0
(1)
and
(B/F)2 + (B/F) (1 + K[An] – K[Ab]) - K[Ab] = 0
(2)
Both of these equations represent hyperbolae with an
asymptote coinciding in both cases with the analyte
concentration ([An]) axis. When [An] is plotted against
the free/bound (F/B) ratio, the slope of the second asymptote is given by 1/[Ab] and its intercept on the F/B
axis is given by 1/(K[Ab] – 1), where [Ab] represents
the ‘binding agent’ (e.g. antibody) concentration and K
the equilibrium constant (as measured in the system)
governing the reaction between the analyte and antibody. Conversely, the slope of the second asymptote
when [An] is plotted against B/F is given by –K and its
intercept on the B/F axis by K[Ab] – 1.
These theoretical considerations are of key importance
for a number of reasons. For example, they indicate that
the less antibody is employed, the greater the slope of
the dose response curve when this is plotted in terms
of the F/B ratio: conversely the slope is little affected at
high antibody concentrations when the response curve
is plotted in terms of B/F, though ultimately the slope
falls towards zero as the antibody concentration used in
the assay is reduced. In short, the effects on the dose
response curve slope of a change in the amount of antibody used in the system depend on the manner in
which the curve is plotted.
Of course, response variables other than B/F and F/B
are in common use, such as % or fraction of (analyte)
bound, or the logs or logits of these and other such variables. But the rule that changes in the response curve
slope caused by changes in the reagent concentrations
used in the assay depend on the co-ordinate frame
used to plot assay results invariably applies.
With these considerations in mind, we should now turn
to the concept of sensitivity, and the widely-accepted
beliefs governing the attainment of maximal sensitivity
in an immunoassay or other binding assay system.
But it should be noted that controversy has long existed
regarding the basic concept of sensitivity, many official
bodies - including the International Union of Pure and
Applied Chemistry (IUPAC) - insisting that “analytical
sensitivity” is given by the “slope of the analytical calibration function”. (see, e.g., R. Dybkaer: Vocabules for reference procedures and materials; IUPAC Compendium of
analytical nomenclature. Definitive rules 1987. Oxford:
Blackwell Scientific Publications).
Others, such as my colleagues and myself (and, originally, the IFCC) have disputed this definition as being
unworkable, arguing that the sensitivity of a measuring instrument or assay can only be validly indicated
by the least quantity that it can measure, i.e. the ‘detection limit’ or lower limit of detection (LLD). In other
Prefazione
words, the least quantity of that which the system
is intended to determine that can be reliably distinguished from a zero amount or concentration (see
Ekins, R. and Edwards P. (1997): On the meaning of
“sensitivity”. Clin Chem, 43:1824 - 1831). The detection limit depends in turn on the signal/noise ratio
manifested by the system at low analyte concentrations. Meanwhile IUPAC continues to disallow the detection limit definition of sensitivity.
Many workers in the immunoassay field (mostly notably Drs Berson and Yalow) have erroneously believed
that increasing the slope of the dose response curve
necessarily implies that the detection limit is reduced.
This belief is most clearly enunciated in a chapter of
these authors publication: Berson, S. A. and Yalow, R. S.
(1973) Radioimmunoassay. In Methods in Investigative
and Diagnostic Endocrinology., Berson, S.A. and Yalow,
R.S (eds), North Holland, Amsterdam, p. 84-120. The
theoretical section of this chapter contains the following
paragraph:
“There has been some controversy concerning the
proper definition of sensitivity (Ekins and Newman
1970). Sensitivity can be defined as the minimal detectable concentration or the slope of the dose response
standard curve. Let us suppose that the slope of the
dose response curve is a 10% change in response per
picogram and that the statistical error in the determination is 10%. Then the minimal detectable quantity
would be about 1 picogram. If the slope is 10-fold
greater, i.e. 100% change in response per picogram,
then with the same 10% error in the measurement, the
minimal detectable quantity would be 0.1 pg. Thus assuming the experimental error is unchanged, increasing the sharpness of the dose-response curve results in
a reduction in minimal detectable quantity. Accordingly
we have defined sensitivity in terms of the slope of the
dose-response curve.”
Though superficially persuasive, this argument is demonstrably untenable.
Nevertheless relying on this argument and defining
sensitivity “as the slope the dose-response relationship
b versus [An]” (where b is the fraction of the analyte
bound) Berson and Yalow concluded that maximal sensitivity is achieved when b = 1/3. i.e when the antibody
concentration used in the assay = 0.5/K. Many workers
in the field accept and conform to this precept.
IX
In contrast, and adhering to the premise that an assay
is most sensitive when it yields the lowest attainable
detection limit, my colleagues and I have demonstrated that greater sensitivity (i.e. a lower detection limit)
can be obtained in a shorter incubation time using an
amount of antibody of less than 0.01 V/K moles located
as a molecular monolayer at high surface density within
a microspot of the order of 75 μm or less in diameter
on a solid support, where V = the sample volume. This
finding not only underlies so-called microarray or "biochip" technology, but the concept of "ambient analyte
assay" i.e. that above a certain sample volume, the occupancy of antibody binding sites by the analyte reveals
the ambient analyte concentration in a sample regardless of its volume.
Biochip technology, which enables the simultaneous
and ultrasensitive assay of hundreds or even thousands
of analytes, (see, e.g., R.P.Ekins. Multi-Analyte Immunoassay: Proc Swedish Acad Pharm Sciences Symposium
on Biomolecules – Analytical Options, Stochholm 4-6
May 1988. Also a similar paper I presented at “BIOTECH
RIA 88” International Symposium of Molecular Probes:
Technology and Medical Applications. Florence, Italy. 1113 April 1988) undoubtedly represents the future of
the binding assay field, most particularly for the assay
of nucleic acids such as DNA, but also for the assay of
proteins. Though not as yet a technology widely used in
Europe, the instrumentation necessary to construct and
scan microarrays is available and employed by individual
researchers in the US. Also a major €120 million project relying on this technology for genetic analysis has
been established in the UK to determine the genomes
of 100,000 cancer patients with the aim of determining the optimum treatment for different types of cancer.
This represents the first large scale project centred on
the technology’s application in the field of personalized
medicine.
Many other such applications are likely to emerge in the
future, and it would thus be a tragedy if ELAS - Italia
were to neglect this important development in the ligand assay field.
Roger Ekins
University College London
X
Indice
Indice generale
Capitolo 1 - Basi immunologiche della reazione antigene-anticorpo 1
Ruggero Dittadi
Le immunoglobuline 1
Introduzione 1
Struttura delle immunoglobuline 1
Struttura generale 1
Le classi di Ig 1
Eterogeneità degli anticorpi (Isotipia, Allotipia, Idiotipia) 3
Funzioni effettrici e proprietà biologiche degli anticorpi. I frammenti Fc e Fab delle Ig 3
Produzione degli anticorpi 5
Anticorpi policlonali 5
Anticorpi monoclonali 7
Gli antigeni 8
Gli antigeni proteici 8
Gli antigeni polisaccaridici 9
Gli apteni 9
Antigeni e immunodosaggi 9
Le soluzioni standard 10
L’antigene come analita 11
Reazioni antigene-anticorpo 12
Introduzione 12
Basi fisico-chimiche 12
La legge di azione di massa 12
La formazione del complesso Ag-Ab 13
Le reazioni Ab-macromolecole (legami polivalenti) 14
Determinazione della specificità della reazione antigene-anticorpo 14
Determinazione della Kd con il metodo di Scatchard 14
Bibliografia 16
Capitolo 2 - Principi e tecniche in immunometria 17
Antonio Fortunato
Principi generali 17
Determinazioni competitive e non competitive 18
Metodi competitivi 18
Metodi non competitivi 23
Determinazione di anticorpi 27
Determinazioni in fase eterogenea e in fase omogenea 31
Metodi in fase eterogenea 31
Metodi in fase omogenea 33
Fattori critici che influenzano le determinazioni immunometriche 34
Forme circolanti di analita 34
Fragilità delle molecole da determinare 35
Possibile presenza di molecole interferenti 36
Reazione Ag-Ab 36
Modalità di esecuzione dei dosaggi immunometrici 39
Traccianti e tecniche di rilevazione del segnale 40
Traccianti radioattivi 42
Traccianti enzimatici 48
Traccianti luminescenti 62
Traccianti fluorescenti 65
Traccianti chemiluminescenti 79
La relazione concentrazione-segnale analitico 85
Espressione e trasformazione del segnale 85
Dai metodi di interpolazione ai metodi di regressione 87
Bibliografia 92
Indice generale
Capitolo 3 - Problematiche nell’analisi immunometrica 93
Claudio Dotti e Lucia Belloni
Fase pre-analitica 93
Raccolta del campione biologico 93
Tipo di prelievo 93
Condizioni di prelievo 96
Conservazione e trasferimento al laboratorio 99
Ricezione e trattamento in laboratorio 100
Fase analitica 100
Effetto “gancio” 101
Effetto matrice 104
Effetti da proteine 104
Interferenze 106
Specificità – Reazioni crociate 106
Interferenze da autoanticorpi 109
Contaminazione 117
Interferenze da proteine di legame 117
Standardizzazione 118
Standardizzazione nel dosaggio di apteni 118
Standardizzazione nel dosaggio di proteine 119
Conseguenze sul versante clinico 120
Bibliografia 120
Capitolo 4 - La qualità e il controllo dei saggi immunometrici 123
Gian Carlo Zucchelli
Introduzione 123
Gli errori nei saggi immunometrici 123
Errore totale 123
Errore sistematico 124
Errore casuale 125
I criteri di qualità delle prestazioni analitiche 125
Precisione 125
Profilo di precisione 127
Sensibilità e Minima Concentrazione Misurabile (MCM) 128
Sensibilità funzionale 130
Accuratezza 131
Specificità 132
Il controllo di qualità 133
Controllo di Qualità Interno (CQI) 134
Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) 139
Altri schemi di controllo di qualità 144
Bibliografia 147
Capitolo 5 - La misura degli ormoni liberi 149
Marco Migliardi, Antonio Fortunato e Giuseppe De Renzi
Significato e ruolo degli ormoni liberi 149
Ipotesi dell’ormone libero 151
Metodi di misura degli ormoni liberi 156
Classificazione dei metodi per la misura degli ormoni liberi 157
Dialisi all’equilibrio e ultrafiltrazione 158
Saggio a due stadi (titolazione di ritorno) 160
Saggio a singolo stadio (con analogo) 162
Stima e calcolo con modelli matematici 166
Determinazioni salivari 167
Trasferimento degli ormoni dal sangue alla saliva 167
Dosaggio degli ormoni nella saliva: aspetti metodologici 169
Problematiche analitiche nella misura degli ormoni liberi 170
XI
XII
Indice generale
Diluizione 170
Matrice 171
Interferenze anticorpali 172
Autoanticorpi anti-analita 172
Anticorpi anti-anticorpo (anticorpi eterofili) 173
Anticorpi diretti contro altri componenti della reazione 174
Altri fattori interferenti 174
Obiettivi analitici e standardizzazione dei metodi 175
Bibliografia 177
Capitolo 6 - Gli anticorpi come analiti 179
Mario Correale e Cinzia Carrozza
Introduzione 179
Metodi di misura 180
Il problema della standardizzazione e l’espressione dei risultati 183
Aspetti clinico-laboratoristici 185
Epatiti virali 186
Complesso TORCH 187
Malattie autoimmuni e allergie 189
I test di avidità delle IgG 190
I test combinati 191
Il dosaggio degli Ab contro i farmaci anti-TNF 191
Bibliografia 192
Capitolo 7 - L’automazione 195
Antonio Fortunato e Giulio Vignati
Dai dosaggi manuali alla automazione totale 195
Storia dell’evoluzione: i passaggi fondamentali 195
L’automazione delle operazioni ripetitive 197
L’automazione del conteggio e dell’elaborazione dati 199
Evoluzione dei sistemi automatici 203
Integrazione e consolidamento: motivazioni e significato 216
I sistemi integrati e i sistemi collegati 218
I sistemi associati a catene di trasporto e la Total Laboratory Automation 221
Immunochimica e automazione: aspetti metodologici 223
Il concetto di calibrazione e ricalibrazione sui sistemi automatici 223
La produzione e l’applicazione delle Master Curve 226
I traccianti 230
Il tracciante radioattivo 231
Il tracciante enzimatico 233
Il tracciante fluorescente 233
Il tracciante luminescente 233
La separazione libero / legato 236
Saggi omogenei 236
Saggi eterogenei 238
L’interpolazione dei dati 240
Bibliografia 242
Capitolo 8 - I biomarcatori: considerazioni generali 245
Aldo Clerico e Simona Ferraro
Definizione di biomarcatore 245
Caratteristiche di un biomarcatore ideale 246
Valutazione delle prestazioni del biomarcatore 247
Processo di valutazione ed implementazione nella pratica clinica di un biomarcatore 251
Bibliografia 253
Indice generale
Capitolo 9 - I biomarcatori del sistema cardio-renale 255
Aldo Clerico, Simona Ferraro e Simona Vittorini
I biomarcatori cardiaci 255
Introduzione 255
Gruppo 1. Marcatori di danno miocardico 257
Gruppo 2. Marcatori di funzionalità cardiaca 263
Gruppo 3. Fattori di rischio cardiovascolare: biomarcatori infiammatori e predittori del primo evento trombotico 267
Gruppo 4. Tecniche di analisi di biologia molecolare applicate alle malattie cardiovascolari 271
I biomarcatori del sistema renina-angiotensina-aldosterone 273
Introduzione 273
I metodi di dosaggio dei biomarcatori del Sistema Renina-Angiotensina 276
I metodi di dosaggio dell’angiotensina II 278
I metodi di dosaggio dell’aldosterone 279
I biomarcatori di funzionalità e di danno renale 281
Introduzione 281
La misura della cistatina C come biomarcatore di funzione renale 283
La misura di NGAL come biomarcatore di danno renale acuto 285
Bibliografia 287
Capitolo 10 - Gli ormoni come biomarcatori di funzione e di malattia 293
Aldo Clerico e Simona Ferraro
Introduzione 293
Il sistema degli ormoni tiroidei 293
Considerazioni generali 293
I metodi di dosaggio del TSH 295
I metodi di dosaggio degli ormoni tiroidei 297
L’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi 299
Considerazioni generali 299
I metodi di dosaggio delle gonadotropione ipofisarie FSH e LH 300
I metodi di dosaggio degli ormoni steroidei sessuali femminili 302
I metodi di dosaggio degli ormoni steroidei sessuali maschili 305
I metodi di dosaggio degli ormoni proteici testicolari: inibine e ormone anti Mulleriano 309
L’asse ipotalamo-ipofisi-surrene 310
Considerazioni generali 310
I metodi di dosaggio dell’ACTH 311
I metodi di dosaggio del cortisolo 312
Bibliografia 315
Capitolo 11 - I biomarcatori in oncologia 319
Ruggero Dittadi e Massimo Gion
Introduzione 319
Biomarcatori tradizionali 319
Lo stato dell’arte 319
La valutazione dinamica di biomarcatori su prelievi seriati 320
La variabilità biologica nella valutazione dinamica dei biomarcatori 321
La combinazione di biomarcatori e integrazione con altri parametri in algoritmi diagnostici 322
I principali biomarcatori in oncologia 324
AFP 324
CEA 325
Biomarcatori mucinici 325
Calcitonina (CT) 326
Cromogranina A (CgA) 326
Gonadotropina Corionica (hCG) 326
Antigene Prostatico Specifico (PSA) 327
Squamous Cell Carcinoma Antigen (SCCA) 327
Tireoglobulina (Tg) 327
Tabelle riassuntive 327
Bibliografia 330
Indice analitico 333
XIII