PRODUZIONE DI ACIDI ORGANICI
(INDUSTRIA ALIMENTARE)
ACETO DI VINO
L’aceto di vino è un prodotto di largo consumo nell’uso
domestico come condimento e nell’industria alimentare
(preparazione di sottaceti, maionese, mostarda, ecc.). Contiene
il 6-12% di acido acetico CH3COOH.
La fermentazione acetica si basa sulla reazione:
CH3CH2OH + O2 → 2 CH3COOH +H2O
Promossa dall’attività degli acetobatteri (acetobacter aceti).
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L’operazione viene condotta in reattori a percolazione in legno
con batteri supportati su trucioli o con colture sommerse in
fermentatori di acciaio agitati meccanicamente.
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Fermentazione in coltura superficiale
Si lavora con soluzioni alcoliche circa al 12%, con temperatura
variabile dall’alto in basso da 29 a 35 °C, per 3 giorni. Le rese
sono intorno all’80-90% del teorico.
Rispetto alla fermentazione in coltura sommersa si ha una
minore produttività, ma si ottiene un prodotto qualitativamente
migliore.
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Fermentazione in coltura sommersa
Nelle colture sommerse si lavora a 30 °C, ottenendo rese anche
del 98%. Particolarmente importante è l’areazione che deve
essere omogenea ed efficace, poiché la carenza di O2 anche solo
per pochi secondi può portare alla morte di 1/3 dei batteri.
Il fermentatore “cavitator” è costituito da un contenitore munito
di un refrigerante a serpentino per la regolazione della
temperatura.
Al centro del fermentatore è posto un rotore cilindrico cavo,
aperto superiormente ed inferiormente. Quando il rotore è in
movimento, dalla parte superiore viene riscaldato il liquido (in
miscela con aria) che, scendendo lungo il rotore, viene proiettato
sul fondo del contenitore in tutte le direzioni. L’aria in miscela con
il liquido si fraziona in numerose bolle che, trascinate dal flusso
aerano l’intera massa in fermentazione.
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Il cavitator funziona in modo discontinuo (il liquido fermentato
che rimane sul fondo agisce da inoculo per la successiva
fermentazione) o continuo.
L’aceto viene chiarificato per centrifugazione o filtrazione e
quindi pastorizzato.
Qualsiasi liquido contenente etanolo può subire la
fermentazione acetica. Nei paesi produttori di vino, come l’Italia
e la Francia, quasi tutto l’aceto è prodotto dal vino, spesso da
partite acidule.
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ACIDO CITRICO
L’acido citrico è largamente usato come acidificante ed
aromatizzante nelle bibite, nei succhi di frutta, nei dolci e nelle
marmellate.
L’acido citrico è uno degli acidi del ciclo di Krebs.
Come microrganismi si utilizzano alcuni tipi di muffe, quali ceppi
mutanti di Aspergillus niger.
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Le migliori rese si ottengono con terreni a base di saccarosio o
fruttosio, anche se è possibile utilizzare materiali amidacei,
tenendo conto del fatto che l’aspergillus niger dispone anche di
amilasi.
L’inoculo è preparato facendo germinare le spore a 32°C in un
prefermentatore su melassa (sottoprodotto della fabbricazione
dello zucchero, ricco in saccarosio), con l’aggiunta di ioni cianuro
per indurre la formazione di micelio in forma di dischetti di
diametro inferiore al millimetro (un micelio poco compatto,
filamentoso e poco ramificato da risultati insoddisfacenti).
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Per le fermentazioni sommerse si usano reattori agitati aerati o
tipo air-lift.
Il terreno di coltura è costituito da melassa deionizzata (per
eliminare gli ioni Fe2+ e Mn2+), con l’aggiunta di KH2PO4 e sali di
Cu e Zn.
L’ammoniaca (fonte di azoto) viene aggiunta durante la
fermentazione per mantenere il pH a 2-3.5.
La fermentazione è portata avanti a 27-33°C per 5-14 giorni.
Nei primi giorni si ha un forte sviluppo di micelio, in seguito si
accumula l’acido citrico.
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Al termine della fermentazione si filtra il micelio, dopo aver
aggiunto una piccola quantità di latte di calce per precipitare
l’eventuale acido ossalico (COOH-COOH) formatosi.
L’acido citrico viene quindi separato dalla soluzione filtrata per
aggiunta di idrato o carbonato di calcio, che si separa per
filtrazione.
Il citrato di calcio (o dicitrato di
tricalcio tetratridrato) è il sale di
calcio dell'acido citrico.
C12H10Ca3O14 x 4 H2O
Il citrato di calcio, disperso in acqua, viene trattato con acido
solforico: si libera l’acido citrico (solubile) e precipita il solfato di
calcio.
L’acido citrico viene infine cristallizzato dalla sua soluzione,
previa decolorazione e deionizzazione.
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ACIDO LATTICO
L’acido lattico è diffusamente usato per l’acidificazione delle salamoie,
delle zuppe e delle marmellate, e per la conservazione delle olive e dei
sottaceti.
Fermentazione omolattica
A partire dal glucosio i batteri del tipo Lactobacillus, in condizioni
anaerobiche formano l’acido lattico:
C6H12O6 → 2 C3H6O3
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Come terreno di coltura si impiegano soluzioni di glucosio al 10-15%
addizionato di malto (0.3-0.4%), (NH4)2HPO4 (0.25%), vitamine e
CaCO3 (10%, corpo di fondo), che contribuisce a mantenere il pH
entro i limiti tali da non far arrestare la fermentazione:
CaCO3(s) +2H+ → Ca2+ + CO2↑+H2O
Il reattore è agitato meccanicamente ed ha volume di 25-120 mc.
Il terreno è inoculato con il lactobacillus prescelto (es. L. delbrueckii) e
la fermentazione condotta per 3-6 giorni a pH 5.5-6.5 e temperatura
45-50°C.
Il processo viene arrestato quando il contenuto di zucchero scende
sotto lo 0.1%.
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Il terreno esaurito è trattato a 82°C con latte di calce a pH 10, la
miscela è quindi lasciata riposare finché la soluzione di lattato di
calcio risulta limpida (chiarificazione).
La soluzione separata dal sedimento, dopo eventuale
decolorazione con carbone attivo, viene concentrata sotto vuoto a
70°C.
Si aggiunge quindi acido solforico e si separa il precipitato di
solfato di calcio, ottenendo acido lattico in soluzione.
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PRODUZIONE DI AMMINOACIDI
ACIDO GLUTAMMICO
L’interesse commerciale per l’acido glutammico è in gran parte
dovuto alla preparazione del glutammato monosodico,
largamente usato per il sapore che conferisce ai cibi.
L’acido glutammico si forma per amminazione dell’acido α-chetoglutarico (prodotto intermedio del ciclo di Krebs).
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Equazione complessiva a partire da glucosio:
C6H12O6 + NH3 + 1.5O2→ C5H9O4N + CO2+3H2O
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Il fermento comunemente usato è il Corynebacterium glutamicum.
Il terreno di coltura è costituito da zucchero (5-20%), urea
(NH2CONH2), acqua di macerazione del grano o estratti di farina di
soia; contiene anche sali di Ca, K ed Mg, ioni fosfato e solfato,
elementi in tracce quali Mn, Fe, Zn e Co, biotina (vitamina).
La fermentazione avviene in ambiente aerato, a 28-30 °C per 2448 ore, regolando il pH a circa 7.5 con aggiunta di NH3.
Si ottengono rese di 60-100g/L di glutammato ammonico.
Al termine della fermentazione le cellule batteriche vengono
separate, il terreno concentrato ed acidificato a pH 3.2 con
separazione dell’acido glutammico.
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L-LISINA
NH2-(CH2)4-CH(NH2)-COOH
L’importanza commerciale della L-Lisina deriva dall’essere uno degli
amminoacidi essenziali per i mammiferi.
Le proteine vegetali sono frequentemente carenti in uno o più
amminoacidi essenziali, quindi una dieta primariamente o
essenzialmente vegetale può richiedere un’integrazione.
Questo vale sia per le persone, sia per quegli erbivori che passano
l’inverno con una dieta limitata.
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Come fermento sono normalmente usati ceppi mutanti del
Corynebacterium glutamicum o di Brevibacterium flavum.
Il terreno di coltura contiene glucosio (5%) e Sali (NH4Cl, KH2PO4,
MgSO4, FeSO4, MnSO4).
Spesso si fa uso di melassa di barbabietola in quanto, essendo ricca
di biotina, favorisce l’accumulo della lisina.
La lisina si accumula nelle cellule e può essere liberata per
trattamento con vapore.
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ANTIBIOTICI
Gli antibiotici vengono usati come farmaci antimicrobici,
fungicidi, pesticidi, ecc., inibiscono la crescita e riproduzione di
microorganismi e cellule viventi attraverso vari meccanismi:
• inibizione della sintesi del peptidoglicano, costituente della
parete cellulare dei batteri.
• inibizione della sintesi delle proteine batteriche.
• inibizione della funzione degli acidi nucleici (DNA, RNA).
• danneggiamento della membrana cellulare.
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Gli antibiotici, derivanti dal metabolismo secondario di funghi o
batteri, hanno nella fisiologia di questi organismi una funzione
molto differenziata.
Negli streptomiceti, batteri composti da un micelio vegetativo e
da un micelio aereo contenente spore, la produzione di antibiotici
avrebbe lo scopo di frenare la crescita degli altri batteri più
semplici ed a sviluppo più rapido.
In altri organismi, come muffe e lieviti, la produzione di antibiotici
sembra legata a trasformazioni di metaboliti primari prodotti in
eccesso.
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In ogni caso, la produzione di antibiotici comporta una notevole
richiesta di energia; esistono perciò dei limiti alla loro
produzione, anche perché, oltre un certo valore, gli antibiotici
inibiscono molte funzioni vitali dell’organismo stesso.
Per mezzo di trattamenti mutageni è stato possibile migliorare
notevolmente la produzione.
I ceppi produttori di antibiotici sono caratterizzati da una elevata
variabilità e quelli capaci di elevate produzioni perdono
facilmente questa proprietà. Pertanto, i processi sono
normalmente di tipo discontinuo.
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I processi fermentativi, aerobi, durano dai 5 ai 10 giorni, ma è
nelle prime ore di crescita esponenziale che vengono create le
condizioni, modificando opportunamente le condizioni di coltura,
per ottenere buone rese.
Nella seconda fase si dovrà invece indirizzare i microorganismi
verso la maggiore produzione possibile di antibiotici.
Esistono vari tipi di antibiotici:
•penicilline naturali,
•penicilline semisintetiche,
•cefalosporine naturali,
•cefalosporine semisintetiche,
•amminoglicosidi,
•tetracicline,
•macrolidi,
•rifamicine, ecc.
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PENICILLINE
Le penicilline sono prodotte da ceppi di Penicillium notatum, un
caratteristico ascomicete (muffa) il cui micelio è suddiviso in
cellule che formano una struttura ramificata.
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le ricerche che portarono all'impiego della penicillina presero il
via dalla scoperta compiuta da Alexander Fleming che a Londra,
nel 1928, osservò che in una piastra di coltura contaminata da
una muffa, la crescita batterica era inibita; così nacque la
penicillina G capostipite di tutta la famiglia, usata ora solo come
profarmaco per sintetizzare le nuove penicilline.
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Le penicilline e gli antibiotici da esse derivate hanno in comune
la struttura di base, formata da un anello β-lattamico a cui è
legato un anello tiazolinico; sono perciò derivate dall’acido 6amminopenicillanico (6-APA):
RCO = H
6-APA
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Le penicilline inibiscono la sintesi del peptidoglicano.
Il peptidoglicano (o mureina) costituisce uno strato nella parete
cellulare dei batteri che è il principale responsabile della rigidità
della cellula.
La più importante difesa messa in campo dai batteri patogeni
contro i β-lattamici è la produzione di β-lattamasi, che provoca
l’idrolisi del legame ammidico, rendendo inattiva la molecola
(grazie a questo meccanismo la maggioranza degli stafilococchi è
resistente alla penicillina G).
Le penicilline, a seconda del gruppo prostetico R, presentano
caratteristiche diverse sia di efficacia, sia di resistenza.
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Le catene laterali possono essere introdotte in due modi:
a) Per via biologica (penicilline naturali) – in questo casi si aggiunge
al terreno di coltura un precursore corrispondente al gruppo
prostetico.
b) Per via chimica (penicilline semisintetiche) – usando degli enzimi
di origine microbica capaci di rimuovere la catena laterale si
ottiene l’acido 6-amminopenicillanico. Questo viene poi fatto
reagire con il cloruro acilico (RCOCl) corrispondente al gruppo
prostetico che si vuole inserire.
6-APA
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Produzione di penicillina G
La penicillina G, pur non essendo più usata come antibiotico (a
causa della elevata crescita della resistenza batterica a questo
farmaco) viene ancora prodotta come materia prima per la
fabbricazione delle penicilline semisintetiche.
La penicillina G è prodotta da ceppi di Penicillium Chrysogenum
mediante fermentazione aerobica in fermentatori discontinui muniti
di agitazione, aerazione e raffreddamento (temperatura mantenuta
sui 25°C).
Nella prima fase della produzione occorre dapprima far germinare le
spore, normalmente conservate in terreno sterile disidratato o in
soluzione acquosa a bassa temperatura.
Le germinazione si fa avvenire prima in beute di 300-500 ml,
contenenti terreno di vegetazione, oppure in un germinatoio, e si
conclude in 36-40 ore.
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Il terreno di coltura più usato è a base di corn steep (prodotto
della macerazione in acqua dei residui lavorazione del mais)
oppure si usa farina di soia.
A questi terreni di base vengono aggiunti glucosio, melassa, olio
di lardo, solfato d’ammonio.
Terminata la fase germinativa, l’inoculo è trasferito nel
fermentatore vegetativo, dove si realizza la prima fase della
crescita del fungo a una temperatura di 24 °C, con un pH
tamponato a 6.5 con soda caustica.
Dopo 1-2 giorni si passa alla fase produttiva vera e propria,
inoculando un fermentatore produttore.
La fase produttiva dura circa 150 ore. In questo tempo
l’andamento della fermentazione attraversa 3 fasi distinte:
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1. Fase iniziale con sviluppo esponenziale della popolazione
colturale, ma scarsa produzione di antibiotico. I
microorganismi utilizzano dapprima come fonte di carbonio
il glucosio e come fonte di azoto l’ammoniaca libera, poi,
esauriti questi, attaccano gli amminoacidi (il pH aumenta per
la liberazione di ammine).
2. La crescita assume un andamento stazionario (idiofase) e la
quantità di penicillina prodotta aumenta notevolmente (tra
le 50 e le 120 ore). Durante la fase di produzione i
microorganismi attaccano il lattosio che è idrolizzato
lentamente a glucosio e galattosio. Durante questa fase
vengono utilizzati come fonte di carbonio anche i grassi
come l’olio di soia, l’olio di lardo, ecc. ed aggiunti anche
agenti anti-schiuma.
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3. Dopo circa 120 ore diminuiscono i ceppi in grado di dare elevate
produzioni ed i nuovi ceppi producono meno penicillina. Il
processo viene interrotto dopo 150 ore.
Durante la fermentazione è indispensabile l’aggiunta di materie
prime: corn steep, zuccheri (glucosio e lattosio) ed esteri
dell’acido fenilacetico (C6H5)-CH2-COOH che è un importante
precursore della penicillina G ed è contenuto anche nel corn
steep. Purtroppo, però, l’acido fenilacetico è anche
estremamente tossico per i miceli e quindi va aggiunto
gradatamente durante il ciclo produttivo, per mantenerlo ad una
concentrazione ottimale.
La temperatura è mantenuta da 24 a 26 °C, mentre il pH da 6.5
arriva alla fine della fermentazione a 7.2-7.4.
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Terminato il processo, il micelio viene separato per filtrazione;
l’antibiotico si separa poi dal terreno di coltura per estrazione.
Nell’estrazione si sfrutta la solubilità della penicillina sotto forma
acida (a pH 1.8-2) in solventi organici (acetato di butile) e sotto
forma di sale sodico in acqua.
Dopo successive estrazioni (raffinazione), la penicillina viene
fatta cristallizzare sotto forma di sale potassico.
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Nell’estrazione si sfrutta la solubilità della penicillina sotto forma
acida (a pH 1.8-2) in solventi organici (acetato di butile) e sotto
forma di sale sodico in acqua.
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Produzione di penicilline semisintetiche
Il metodo di produzione semisintetico prevede prima l’idrolisi
della penicillina G a 6-APA, per via fermentativa o chimica.
La prima via è la più usata e permette l’idrolisi del legame acilico
grazie alla presenza dell’enzima penicillin-acilasi prodotto da
alcuni attinomiceti (batteri filamentosi e ramificati) o da ceppi
mutati del genere Escherichia coli.
Il terreno di coltura, a base di corn steep, caseina ed NaCl, viene
inoculato con il ceppo batterico. Dopo 24 ore circa, quando la
produzione batterica si è sufficientemente ingrandita, si porta il
pH a 7.5 e si aggiunge la penicillina G.
Si lascia incubare a 37-38 °C per 16 ore circa, mantenendo il pH
costante con l’aggiunta di KOH (la reazione di idrolisi tende ad
abbassare il pH per liberazione di acido fenilacetico).
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Si precipita infine il 6-APA abbassando il pH a 4.2 e si recupera per
filtrazione.
L’acido prodotto è quindi fatto reagire con un cloruro acilico
contenente la catena che si vuole legare alla penicillina:
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