La malattia di Aujeszky:
aspetti diagnostici
Stefano Nardelli
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
delle Venezie
Isola della Scala (VR)
10.05.2011
STORIA
• (1813)
• (1902)
• (1934)
prima descrizione USA
―prurito pazzo‖
Aujeszky identifica l‘agente
infettivo come un virus
il virus causale è identificato
come Herpesvirus
Eziologia
•
•
•
•
Herpesvirus suino tipo 1 (SuHV-1)
Sierologicamente unico
Ceppi a virulenza variabile
Struttura simile all‘IBR
STRUTTURA DEL VIRUS SuHV-1
ENVELOPE
gB
DNA
gE
NUCLEOCAPSIDE
Altre ...
Glicoproteine di membrana
• proteine virus-specifiche; variabili da ceppo a ceppo
• inducono anticorpi neutralizzanti
Delezione!!!
Principali glicoproteine del virus di Aujeszky
IMMUNITA‘
RUOLO NELLA REPLICAZIONE VIRALE E NELLA VIRULENZA
GLICO
PROTEINA
Essenziale
Adsorbimento
Penetrazione
Diffusione
Virulenza
Umorale
Cellulare
B
+
-
+
+
?
++
+
C
+
+
+
-
+/-
+++
+
D
+
+
+
-
?
++
++
E
+
-
-
+
+
+
-
G
-
-
-
+
-
-
-
H
+
-
+
-
?
+
?
I
+
-
-
+
+
?
-
L
+
-
+
-
?
?
?
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER
Spettro d‘ospite
• Ospite principale suino (serbatoio!)
FORMA NERVOSA (suinetti)
FORMA RESPIRATORIA (ingrasso)
FORMA GENITALE (scrofe)
• Ospiti occasionali altri mammiferi
– molto sensibili: gatto, ovicaprini, bovini
– moderatamente sensibili: gli altri in genere
– poco sensibili: primati
FORMA NERVOSA (prurito!) CON ESITO LETALE
(nb: morte di tali animali indicazione di sospetto)
Trasmissione del virus
• TRASMISSIONE DIRETTA
– aerosol (la più importante)
– escreti/secreti
– via venerea
• TRASMISSIONE INDIRETTA
EVIDENZA DI TRASMISSIONE
AEROGENA A LUNGA DISTANZA
(DIFFERENZA CON IBR: elevato numero animali?)
Patogenesi (nel suino)
A partire dalla via di ingresso (di norma oronasale)
• Forma nervosa
nervi olfattori SNC
• Forma respiratoria
torrente circolatorio epiteli respiratori, macrofagi alveolari
• Forma genitale
torrente circolatorio barriera placentare
riassorbimento, aborto
LATENZA! (nel bulbo olfattorio - ganglio del trigemino)
RIATTIVAZIONE!
Patogenesi (nel cinghiale)
• Popolazione selvatica in grado di mantenere
autonomamente il virus
• Tendenzialmente ceppi più attenuati rispetto a quelli
isolati nel suino domestico (anche nei confronti di
mammiferi diversi dal suino)
• Possibile ritardo nella sieroconversione (il 45% dei
cinghiali con virus nelle tonsille, ma non nei gangli del
trigemino, è sieronegativa)
Sintomatologia
• Forma nervosa suinetti
– incoordinamento, tremori, paralisi treno posteriore
– morte (specie per animali =< 3 settimane, anche 100%)
• Forma respiratoria magroni, grassi
– dispnea, tosse, scolo nasale, starnuti
– morte (casi limitati), complicanze batteriche
• Forma genitale
– riassorbimento (primo terzo di gestazione)
– aborto (secondo e terzo terzo di gestazione)
– spesso assente risentimento generale
POSSIBILI ANCHE FORME SUBCLINICHE
Diagnosi di laboratorio
• DIRETTA
Cervello, tonsille, polmoni, tamponi nasali, feti
– Isolamento
– Immunofluorescenza
– PCR
(differenziale per ceppi
di campo gE+ / vaccinali gE-)
• INDIRETTA
Siero di sangue
– Anticorpi ‗totali‘ SN, ELISA Ac tot, ELISA Ac gB
– Anticorpi gE ELISA Ac gE
NB:
persistenza Ac materni 2 – 3 mesi
sieroconversione 7 – 10 gg
Perché 57 campioni?
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
Numero capi
In azienda
7-27
28-37
38-55
56-100
101-600
> 600
Da controllare
sino a 25
sino a 29
35
45
56
57
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che UN campione scelto a caso
• sia positivo = 5% = 0,05
• sia negativo = 95% = 0,95
totale
= 1,00
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che DUE campioni scelti a caso
• siano positivo-positivo
= 0,05 x 0,05 = 0,0025
• siano negativo-positivo
= 0,95 x 0,05 = 0,0475
• siano positivo-negativo
= 0,05 x 0,95 = 0,0475
• siano negativo-negativo
= 0,95 x 0,95 = 0,9025
totale
= 1,0000
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che DUE campioni scelti a caso
• siano positivo-positivo
• siano negativo-positivo
• siano positivo-negativo
= 0,0025
= 0,0475
= 0,0475
siano ALMENO UNO positivo
• siano negativo-negativo
totale
+
+
+
= 0,0975
= 0,9025
= 1,0000
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che ALMENO UNO di n campioni sia
positivo
P = 1 - Pneg
Pneg = probabilità che TUTTI gli n campioni siano
negativi
Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
Pneg - PROBABILITA’ CHE TUTTI I CAMPIONI RISULTINO NEGATIVI
N.
Pneg(1) Pneg(2) Pneg(3) Pneg(4)
campioni
1
0,95
2
0,95
0,95
3
0,95
0,95
0,95
4
0,95
0,95
0,95
…
…
…
…
Pneg
PROBABILITA’ CHE
ALMENO UN CAMPIONE
RISULTI POSITIVO
(1 – Pneg)
0,951
= 0,95
= 0,05
0,952
= 0,9025
= 0,0975
0,953
= 0,857375
= 0,142625
0,95
0,954
= 0,81450625
= 0,18549375
…
…
…
…
56
0,9556
= 0,057
= 0,943
57
0,9557
= 0,053
= 0,947(*)
58
0,9558
= 0,051
= 0,949
59
0,9559
= 0,048
= 0,952
(*) ARROTONDATO = 0,95
Perché troviamo i falsi positivi?
• Qualsiasi test diagnostico è soggetto a due tipi di errore
– ESITO FALSAMENTE POSITIVO
– ESITO FALSAMENTE NEGATIVO
• E‘ possibile quantificare l‘errore del test diagnostico
definendone
– Sensibilità diagnostica (Se): probabilità che ha un campione
positivo di risultare positivo al test
– Specificità diagnostica (Sp): probabilità che ha un campione
negativo di risultare negativo al test
Se, Sp possono assumere un valore compreso fra 0 1
REAZIONE ELISA COMPETITIVA (PHV-1 gE)
Fenomeno dell’impedimento sterico
SUBSTRATO
INCOLORE COLORATO
ESITO
falso pos
ENZIMA
ANTICORPO CONIUGATO
ANTI - gE
SIERO IN ESAME
(positivo Ac gB)
PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS PHV-1
Glicoproteina B
Glicoproteina E
ESITO
neg
Specificità di gruppo (Spg)
Spg = Probabilità che, dato un gruppo di n animali veri negativi,
cui viene applicato un test con specificità Sp, tutti gli animali del
gruppo risultino negativi
Spg = Spn
Quindi, dato un gruppo di 57 scrofe negative Aujeszky che
vengono controllate con ELISA gE competitiva avente Sp=0,99,
la specificità di gruppo Spg risulta essere:
Sp = 0,99
Spg = 0,9957 = 0,56
Nel 44% dei casi almeno uno dei 57 capi risulta falso pos
PER OVVIARE:
si applicano due test combinandoli in serie
Combinando due test diagnostici ...
E‘ POSSIBILE
• APPROCCIO IN PARALLELO: rendere
massima la sensibilità (l‘animale è positivo se
reagisce ad almeno una delle due prove) ad
es. ELISA + SN per ingresso tori centro
genetico
• APPROCCIO IN SERIE: rendere massima
la specificità (l‘animale è positivo se reagisce
ad entrambe le prove) ad es. conferma gB
su positivi IBR anticorpi totali
IPOTIZZANDO L‘IMPIEGO DI DUE TEST
INDIPENDENTI, ENTRAMBI CARATTERIZZATI DA
Se = 0,99
Sp = 0,99
Test
singolo
2 Test in parallelo
( A + B)
2 test in serie
(A B [+])
Se
0,99
0,9999
0,98
Sp
0,99
0,98
0,9999
I due test devono essere INDIPENDENTI
• NEI SUINI NON VACCINATI
– ELISA (Ac tot, gB) seguita da sieroneutralizzazione
– ELISA (Ac tot) seguita da ELISA gB
• NEI SUINI VACCINATI CON DELETO
Non esiste (per ora) un secondo test indipendente: i test
commerciali sono tutti sostanzialmente strutturati nella stessa
maniera
Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:
Confronto fra test sierologici gE
MONOCLONALI ANTI-gE IZSLER
3E3
4F5
3H1
1D9
2E1
2B6
2A8
2F5
3G12
5A6
3D5
KIT 1
P
P
P
P
P
P
P
N
N
N
N
KIT 2
P
P
P
N
N
N
N
N
N
N
N
KIT 3
P
P
P
P
P
P
P
N
N
N
N
KIT 4
P
P
P
P
P
P
P
N
N
N
N
KIT 5
P
P
P
P
P
P
N
N
N
N
N
KIT 6
P
P
P
P
P
P
N
N
N
N
N
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER
Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:
Confronto fra test sierologici gE
117 sieri sperimentali, prodotti attraverso 6 diverse
infezioni in suini negativi o vaccinati, sono stati testati con
6 kit commerciali e non per la ricerca anticorpi anti gE
– Tutti i presieri e i sieri da animali vaccinati sono risultati negativi
con tutti i kit
– Sieri precoci (5-6 g p.i.) hanno dato esito negativo con tutti i test
(falsi negativi)
– Sieri prelevati dai 7-15 g p.i : risultati discordanti
– Sieri prelevati oltre i 15 g sono stati rilevati come positivi da tutti i
kit
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER
REAZIONE ELISA (SuHV-1 gE)
Ag ricombinante
Ag tradizionale
SUBSTRATO
INCOLORE COLORATO
ESITO
neg
ENZIMA
ANTICORPO CONIUGATO
ANTI - gE
SIERO IN ESAME
(positivo Ac gB)
PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS SuHV-1
Glicoproteina B
Glicoproteina E
ESITO
neg
Test ELISA con Ag ricombinante
• Attualmente a livello sperimentale (no kit
commerciale)
• Difficoltà nel produrre l‘antigene
ricombinante
– Epitopo gE conformazionale
– Epitopo gE glicosilato ( espressione in
vettore eucariota)
Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre
falsi positivi?
UN POSITIVO ISOLATO PUO‘ ESSERE
• Un falso positivo
• Un primo positivo (inizio sieroconversione –
possibile, ma poco probabile)
• Un ultimo positivo (fase finale eradicazione)
• Un unico positivo (ceppi a bassa capacità di
diffusione Bartha)
Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre
falsi positivi?
• In alcuni soggetti è possibile riattivare l‘infezione
con trattamento cortisonico(*)
• In altri soggetti è possibile identificare la presenza
del genoma virale nei gangli del trigemino / bulbi
olfattori, MA NON si riesce a riattivare l‘infezione
con trattamento cortisonico ( esperienza svedese)
(*)
trattamento molto più energico rispetto al bovino
- 2 – 3 mg/kg desametasone x 5 gg
SUINO
- 0,1 mg/kg desametasone x 5 gg
BOVINO
Quante volte succede di avere
positivi ―isolati‖?
Sierologia Aujeszky gE - Anno 2010
Veneto + Trentino +Friuli VG
• N. 306 prelievi con ≥ 35 campioni, ripartiti in n. 174
aziende (aziende con consistenza ≥ 38 capi)
• N. 286 prelievi (156 aziende) tutti negativi
• N. 20 prelievi (18 aziende) almeno un campione
positivo
–
–
–
–
–
2 prelievi 1 campione positivo (nella stessa azienda!)
2 prelievi 2 campioni positivi
1 prelievo 3 campioni positivi
1 prelievo 4 campioni positivi
14 prelievi ≥ 8 campioni positivi
Come controlliamo le prestazioni
delle prove ELISA?
DECISIONE DELLA COMMISSIONE
del 21 febbraio 2008
che stabilisce garanzie supplementari
per la malattia di Aujeszky
negli scambi intracomunitari di suini,
e fissa i criteri relativi alle informazioni
da fornire su tale malattia
(2008/185/CE)
PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA
La sensibilità della prova deve essere di livello tale da
catalogare come positivi i seguenti sieri di riferimento CE:
— Siero di riferimento CE ADV 1 alla diluizione 1:8
— Siero di riferimento CE ADV-gE A
— Siero di riferimento CE ADV-gE B
— Siero di riferimento CE ADV-gE C
— Siero di riferimento CE ADV-gE D
— Siero di riferimento CE ADV-gE E
— Siero di riferimento CE ADV-gE F
PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA
La specificità della prova deve essere di livello tale da
catalogare come negativi i seguenti sieri di riferimento CE:
— Siero di riferimento CE ADV-gE G
— Siero di riferimento CE ADV-gE H
— Siero di riferimento CE ADV-gE J
— Siero di riferimento CE ADV-gE K
— Siero di riferimento CE ADV-gE L
— Siero di riferimento CE ADV-gE M
— Siero di riferimento CE ADV-gE N
— Siero di riferimento CE ADV-gE O
— Siero di riferimento CE ADV-gE P
— Siero di riferimento CE ADV-gE Q
PER L’APPROVAZIONE DEI SINGOLI
LOTTI
Siero di riferimento positivo CE ADV 1 alla
diluizione 1:8 deve risultare positivo
Uno dei sieri di riferimento negativi (ADV gE G
Q) deve risultare negativo
Controllo ―grossolano‖
RING TEST
CENTRO REFERENZA
IZSLER
2010/2011
DISEGNO DEL RING TEST
PANNELLO = 20 SIERI
•
•
•
No. 2 = suini neg ac totali (SPF)
No. 6 = suini neg ac gE / pos ac totali
(vaccinati da 1 a 3x)
No. 12 = suini positivi ac tot / gE
- 4 = 10 gg PI (suini neg ac tot)
- 8 = da 15 a 24 gg PI
(suini vacc da 1 a 5x)
N. LABORATORI PARTECIPANTI = 21
N. KIT ELISA UTILIZZATI = 4
IZSLER – Idexx – IdVet - Synbiotics
RISULTATI DEL RING TEST
SOLO QUATTRO CAMPIONI HANNO
DATO RISULTATI DISCORDANTI
corrispondono ai 4 prelievi effettuati da suini
10 gg PI (=> esito atteso = positivo)
QUESTI QUATTRO CAMPIONI RISULTANO
TUTTI POSITIVI ALLA PROVA ELISA gB
(eseguita in 9 dei 21 laboratori partecipanti)
Aujeszky Aladár
1869 - 1933
medico e
veterinario
ungherese
