Relazione sull`attività dell`anno 2008

CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE
MALATTIA DI AUJESZKY
(Dirigente Responsabile Dr. Paolo Cordioli)
“Relazione sull’attività dell’anno 2008”
1. Obiettivi strategici
L’attività del Centro di Referenza per il periodo 2007-2008 ha avuto come finalità la
preparazione di materiali di riferimento per la sierologia sia per uso interno sia per la rete
degli II.ZZ.SS. e una attività di studio sugli allevamenti della Provincia di Brescia e zone
limitrofe con lo scopo di monitorare l’infezione da virus della malattia di Aujeszky. Presso
il Reparto di Virologia e Sierologia Specializzata, dove ha sede il centro di referenza, sono
state effettuate numerose indagini relative al Piano di controllo per la Malattia di Aujeszky
nei territori di competenza dell’IZSLER. Il Centro di Referenza ha provveduto, nell’anno
2008, all’elaborazione dei dati ottenuti dal circuito interlaboratorio eseguito nell’anno 2007
e all’organizzazione di un successivo “ring test” previsto per l’anno 2009. E’ stata
condotta, inoltre, la validazione del kit ELISA della ditta PrioCHECK PRV 2.0. Infine, è
stato presentato e accettato il progetto di ricerca PRC2007009.
2. Attività Diagnostica
2.1. Standardizzazione e validazione di metodiche diagnostiche
Le metodiche in uso sono in larga parte standardizzate.
Per la ricerca di anticorpi nei confronti della glicoproteina E (gE) del virus della Malattia
di Aujeszky è impiegata una metodica tipo ELISA competitiva, metodo normato OIE. Il
metodo si applica per la ricerca di anticorpi nei confronti dell’antigene gE del virus SHV-1
in siero di sangue di suino e cinghiale e consente di determinare la presenza di anticorpi
successivi a infezione e di discriminare tra animali vaccinati (con vaccino deleto per la
glicoproteina E) ed infetti. Il metodo valuta la capacità dei sieri in esame di inibire il
legame dell’antigene SHV-1 dell’anticorpo monoclonale specifico (3E3), impiegato come
anticorpo di rilevazione (anticorpo marcato).
Per la ricerca di anticorpi nei confronti della glicoproteina B (gB) è impiegata una
metodica tipo ELISA competitiva, metodo normato OIE. Il metodo si applica per la ricerca
di anticorpi nei confronti dell’antigene gB del virus SHV-1 in siero di sangue di suino e
cinghiale e consente di determinare la presenza di anticorpi successivi a infezione e/o
vaccinazione. Il metodo valuta la capacità dei sieri in esame di inibire il legame
dell’antigene SHV-1 dell’anticorpo monoclonale specifico (2C7), impiegato come anticorpo
di rilevazione (anticorpo marcato).
Per la ricerca del virus della Malattia di Aujeszky è impiegata la tecnica d’isolamento
virale su colture cellulari di rene suino a partire da campioni patologici. La specificità
dell’eventuale effetto citopatico (ECP) in coltura cellulare è confermata tramite due
metodiche ELISA sandwich, ripettivamnte specifiche per la glicoproteina B (gB) e E (gE),
oppure tramite reazione di immunofluorescenza indiretta.
Vedi anche punto 6.2
2.2. Produzione e distribuzione di reagenti
Durante il 2008, sono proseguite le prove sperimentali per la produzione di sieri di
riferimento per la sierologia, in parte già descritte nella relazione dell’anno precedente. In
questo modo si è cercato di ottenere una varietà di sieri a titolo anticorpale differente
(comprendente sieri precoci, sieri da vaccinazione e sieri da infezione in animali vaccinati
e non vaccinati) con i quali testare differenti kits ELISA. Prima dell’inizio della
sperimentazione, i sieri di tutti gli animali oggetto dello studio, sono stati testati con esito
negativo per la presenza di anticorpi anti-gB.
Di seguito, sono brevemente descritti i protocolli delle infezioni sperimentali condotte.
Sperimentazione n° 1: due suini SPF sono stati infettati sperimentalmente per via
endonasale con 107 TCDI50 del ceppo Koynock. I suini infettati sperimentalmente sono stati
sottoposti a prelievo ematico a 10, 12, 14 giorni post infezione, ed in seguito a salasso
ematico, al momento dell’ eutanasia, a 17 giorni post- infezione.
Sperimentazione n° 2: otto suini SPF sono stati infettati per via endonasale con 107.5
TCDI50 del ceppo Bartha (K61/BS). Due suini infettati sperimentalmente sono stati
sacrificati e sottoposti a salasso ematico 13 giorni dopo l’infezione, mentre sei suini, sono
stati sottoposti ad infezione per via endonasale con 108.5 TCDI50 del ceppo Koynock,
eseguendo i prelievi ematici al momento dell’eutanasia come riportato in seguito: 2 suini a
6 gg, 2 a 9 gg e 2 a 12 giorni post-infezione.
Sperimentazione n° 3: tre suini SPF sono stati vaccinati per via intramuscolare con un
vaccino inattivato gE-deleto del commercio e posti a contatto con altri due suini SPF. Dopo
30 giorni tutti i suini sono stati sottoposti ad infezione sperimentale con 108.5 TCDI50 del
ceppo di campo 252504/2006 isolato da un suino in magronaggio nella provincia di
Brescia. I prelievi ematici sono stati effettuati 26 giorni dopo l’intervento vaccinale, a 11gg
post-infezione e, al momento dell’eutanasia, a 24 giorni per i suini precedentemente
vaccinati ed a 25 giorni post-infezione per i suini non vaccinati.
A differenza di quanto è stato eseguito nelle precedenti infezioni sperimentali, nelle quali
sono stati impiegati ceppi di riferimento, in quest’ultima è stata simulata l’infezione di
suini vaccinati e non con un ceppo di campo.
2.2 Attività analitica
Le indagini sierologiche eseguite nel 2008 per la ricerca del virus della malattia di
Aujeszky hanno evidenziato, così come confermato dai dati del 2007, una percentuale
bassa ma comunque rilevante (13,5%) di risultati positivi. Le indagini sierologiche sono
state eseguite anche su cinghiali selvatici, specie che può divenire un reservoir selvatico del
virus importante in caso di eradicazione dell’infezione dal suino domestico, che hanno
evidenziato una positività del 15-20% nel periodo 2007-2008.
Gli isolamenti virali nell’anno 2008, 8 ceppi di virus della Malattia di Aujeszky da suini e
un ceppo da un cervello di cane, dimostrano che il virus è ancora attivamente circolante
negli allevamenti suini.
Tabella 1: Risultati delle indagini sierologiche e virologiche relative agli anni 2007 e 2008
2007
2008*
Esaminati
Positivi
%
Esaminati
Positivi
%
gB
24230
18410
76%
19096
15474
81%
anticorpi
gE
72989
7543
10,3%
104802
14170
13,5%
anticorpi
Indagini
269
1
0,37%
306
9
2,9%
virologiche
* I dati relativi all’anno 2008 non tengono in considerazione le determinazioni eseguite nel mese di dicembre
2008.
Tabella 2: Risultati delle indagini sierologiche nei cinghiali relativi agli anni 2007 e 2008
2007
2008
Esaminati
Positivi
%
Esaminati
Positivi
%
gE anticorpi
830
163
19,6%
1435
206
14,3%
* I dati relativi all’anno 2008 non tengono in considerazione le determinazioni eseguite nel mese di dicembre
2008.
2.3 Circuiti interlaboratorio organizzati dal C. d. R
Nel corso dell’anno 2007 è stato organizzato un “ring test” per la diagnosi sierologica della
malattia di Aujeszky, in cui sono stati impiegati i sieri dei suini delle infezioni sperimentali
descritte nella relazione annuale del 2006-2007. Il pannello comprendeva 50 sieri.
Al ring test hanno partecipato 21 laboratori delle 10 sedi centrali degli Istituti
Zooprofilattici Sperimentali dislocati su tutto il territorio nazionale. I dati ottenuti dai
singoli laboratori sono stati trasmessi all’Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regione
Lombardia (OEVRL), che ha provveduto ad aggregarli ed analizzarli. E’ stato, quindi,
prodotto un report distribuito ad ogni laboratorio partecipante, al quale è stato assegnato
un numero, a conoscenza del singolo laboratorio e utilizzato nel report stesso. Il report è
stato pensato per dare ai partecipanti la possibilità di confrontare i propri risultati con
quelli degli altri laboratori e per avere dati statistici riguardo i tests ELISA utilizzati sul
territorio nazionale. I laboratori hanno utilizzato 7 diversi kit: PRV gB, kit IZS Brescia (4
laboratori), PRV gE, kit IZS Brescia (3 laboratori), Herdcheck® anti-ADV gpI antibody test
kit, IDEXX (14 laboratori), Herdcheck® PRV gB test kit, IDEXX (3 laboratori), ELISA
Aujeszky gB serum Pourquier (4 laboratori), Synbiotics® serelisa PRV gI Ab Mono Bloking
kit (ASPRV1)(2 laboratori), PRV gI kit Bommeli (1 laboratorio).
La valutazione dell'accordo dei risultati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti al ring
test, rispetto ai risultati attesi per i singoli sieri, è stata effettuata mediante la stima
dell'indice di concordanza di Cohen (detto indice K). In caso di assenza di eterogeneità
(p>0.05) si è proceduto ad effettuare una stima complessiva del valore di K (overall k)
relativo alla concordanza dei risultati di tutti i laboratori con i risultati attesi.
Le differenze dei valori di K tra i laboratori riguardo i risultati del test ELISA gE non sono
risultate significative al test di eterogeneità (p>0.05). Data l'omogeneità degli indici di
concordanza K tra i singoli laboratori, il K overall è risultato pari a 0.88 (0.85-0.91).
Invece, per quanto riguarda gli esiti del test ELISA per la ricerca di anticorpi nei confronti
della glicoproteina B dei singoli laboratori, la concordanza è risultata del 100% ed il K di
overall pari a 1.00.
Per l’anno 2009 si prevede l’organizzazione di un circuito interlaboratorio per la diagnosi
sierologica della Malattia di Aujeszky, nel quale saranno impiegati i sieri di suini delle
infezioni sperimentali descritte nella sezione relativa alla “produzione di sieri di
riferimento” e di quelli prodotti come descritto nella relazione annuale per il periodo 20062007.
4. Ricerca e sperimentazione
Alla fine del 2007 è stato presentato e successivamente accettato il progetto di ricerca
corrente PRC2007009 “Strategie diagnostiche e di controllo della malattia di Aujeszky con
particolare riferimento a diversi fattori che influenzano negativamente l’esito del piano di
eradicazione”. Il responsabile scientifico è il Dr. Paolo Cordioli. La durata prevista del
progetto è di 24 mesi, con data di avvio il 01/09/2008 e data di scadenza 31/08/2010.
Considerando la possibilità che possano essere attuate restrizioni all’importazione di
animali o di prodotti derivati da parte di Paesi che hanno raggiunto lo stato di indennità, il
progetto si prefigge attraverso l’esecuzione di indagini di tipo sierologico, virologico ed
epidemiologico di approfondire diversi aspetti relativi alla malattia di Aujeszky, in
particolare di:
1. valutare le cause della mancanza di risultati del Piano di Controllo della Malattia di
Aujeszky
2. individuare i punti critici nell’attuazione del piano stesso
3. individuare le misure atte a raggiungere l’eradicazione
4. sviluppare un protocollo per il mantenimento della qualifica sanitaria di indennità per
Malattia di Aujeszky basato sulla valutazione del rischio.
Nel corso del progetto verranno, inoltre, eseguite infezioni sperimentali con diversi ceppi
di PRV con lo scopo di condurre studi di patogenesi e per la produzione di materiali di
riferimento (antigene e sieri positivi) per le prove virologiche e sierologiche. Nel progetto
sono impegnate 4 Unità Operative:
- U.O. n°1: Reparto di Virologia e Sierologia Specializzata
- U.O. n°2: Sezione diagnostica provinciale di Mantova
- U.O. n°3: Sezione diagnostica provinciale di Bologna
- U.O. n°4: Reparto benessere animale, immunoprofilassi, allevamenti e sperimentazione
animale.
Obiettivi dell’attività di tutte le unità operative impegnate saranno:
1. Tramite infezioni sperimentali in suini SPF produrre materiali di riferimento (antigene
e siero positivo) da impiegare nella “routine” diagnostica, nella ricerca e in circuiti
interlaboratorio organizzati dal Centro di Referenza della malattia di Aujeszky.
2. Conoscere l’attuale stato di attuazione del piano di eradicazione passando attraverso la
valutazione dell’applicazione del piano vaccinale.
3. Valutazione di fenomeni che interferiscono con l’attuazione del piano (fenomeno della
latenza, “singleton reactor”)
4. Valutare la sieroprevalenza nella popolazione di cinghiali e caratterizzazione dei ceppi
eventualmente isolati.
5. Stesura di un protocollo basato sulla base della valutazione dei fattori di rischio che
permetta di evidenziare i punti critici e la loro rimozione, nel raggiungimento dello
stato di indennità e nel mantenimento di questa, una volta raggiunto.
L’attività del Reparto di Virologia e Sierologia Specializzata sarà impegnato nella
realizzazione del progetto attraverso diverse attività elencate di seguito:
a. Infezione sperimentale di suini SPF con ceppi di virus della Malattia di Aujeszky, al
fine di ottenere materiali di riferimento da impiegare sia come controlli nelle prove
diagnostiche routinarie sia come campioni da utilizzare in circuiti interlaboratorio
organizzati dal Centro di Referenza della Malattia di Aujeszky che afferisce al Reparto
di Virologia.
b. Esecuzione di indagini virologiche e sierologiche sui campioni prelevati e già descritti
nelle sezioni precedenti. Questo prevede l’impiego di una metodica PCR per la ricerca
del DNA virale, nonché l’isolamento virale su coltura cellulare (PK15, Marc). Le
indagini sierologiche verranno condotte con metodiche ELISA “home made” sia per la
ricerca di anticorpi nei confronti della glicoproteina E (gE) sia B (gB). Le indagini di
laboratorio sopraccitate permetteranno di acquisire tutti gli elementi (titolo anticorpale
negli animali vaccinati e pronti per la macellazione, incidenza delle infezioni latenti e
del fenomeno dei “sigleton reactors”, nonché la prevalenza dell’infezione nei cinghiali)
per la formulazione di un protocollo, basato sull’analisi del rischio, in gradi di
individuare quei parametri che permettano il raggiungimento dello stato “indenne” da
malattia di Aujeszky ed il mantenimento dello stesso.
c. Sopralluogo in allevamento. Tale attività sarà tesa a verificare la tipologia degli
allevamenti in cui si avrà la comparsa di focolai, nonché la valutazione delle norme di
biosicurezza messe in atto nell’allevamento stesso. Oltre a questo, tale attività, sarà
allargata agli allevamenti situati nelle vicinanze dell’azienda in cui si è verificato il
focolaio.
5. Aggiornamento e formazione professionale
5.1. Convegni/congressi che il C. d. R. ha organizzato o a cui ha partecipato
TITOLO
Convegno-Corso etc.
ENTE
organizzatore
LOCALITA'
evento
Convegno Annuale SIPAS
SIPAS
Salsomaggiore
2nd annual Meeting of EPIZONE
EPIZONE IZSLER
Brescia
International Pig Veterinary Society
(IPVS)
IPVS
Durban
7th ESVV PESTIVIRUS SYMPOSIUM
ESVV - SVA
Uppsala
TITOLO relazione
Data
13-14
Marzo
2008,
5-7 giugno
2008
22-26
giugno
2008
16-19
settembre
2008
-
X convegno SIDILV
SIDILV
Alghero
22-24
ottobre
6. Consulenze, attività di docenza, collaborazioni nazionali
6.1 Consulenze e pareri tecnici forniti ad esterni
Validazione test ELISA PrioCHECK PRV 2.0 della Ditta Prionics
La ditta Prionics ha richiesto la validazione del kit commerciale PrioCHECK PRV gE 2.0
da parte del Centro di Referenza della Malattia di Aujeszky. L’attività richiesta ha
consistito nella valutazione di n°648 sieri suini di campo, impiegando due lotti del kit
sopraccitato in comparazione con il kit ELISA IZS-Brescia impiegato presso il laboratorio
di Virologia e Sierologia Specializzata. Al termine delle prove è stato prodotto un report,
nel quale sono stati valutati i risultati ottenuti. I campioni utilizzati per la validazione
comprendevano 492 sieri di campo negativi gE PRV e 156 sieri positivi. E’ stata calcolata la
sensibilità analitica attraverso il calcolo della diluizione limite (impiegando sieri positivi
da infezione sperimentale), la sensibilità diagnostica (sui campioni positivi), la specifità
analitica (impiegando 12 sieri positivi nei confronti di altri virus del suino, ma negativi per
gE PRV), la specificità diagnostica (sui campioni negativi), la riproducibilità (differenti
tecnici di laboratorio esaminano 10 sieri in doppio nello stesso giorno) e la ripetibilità (10
repliche di uno stesso siero, impiegando due sieri, rispettivamente negativo e positivo).
Questo lavoro conferma l’importanza dell’attività di consulenza del Centro di Referenza
della Malattia di Aujeszky nei confronti di una ditta, conosciuta a livello internazionale,
come la PRIONICS.
7. Pubblicazioni scientifiche e divulgative
Durante l’anno 2007 sugli Atti della Società Italiana di Patologia ed Allevamento dei Suini
è stata pubblicata una comunicazione scientifica, il cui titolo è “Confronto tra test
sierologici gE-ELISA per la Malattia di Aujeszky utilizzando sieri di suini infettati
sperimentalmente”.
8. Sito Web
Le pagine dedicate al Centro di Referenza per la Malattia di Aujeszky-Pseudorabbia
(CRMA) sono pubblicate sul sito dell’IZSLER nella sezione dedicata ai Centri di referenza.
Il sito consultabile all’indirizzo http://www.bs.izs.it/Referenza/CRMA/Auj.htm è redatto
anche in lingua inglese (http://www.bs.izs.it/Referenza/CRMA/Auj_en.htm) e si articola
nel seguente modo:
- Presentazione
- Responsabile del centro
- Collaborazioni e consulenze
- La malattia
- Legislazione
- Link di interesse specifico