Immunologia dei trapianti
Per trapianto si intende il trasferimento di
cellule, tessuti, organi, da un individuo detto
donatore a uno detto ricevente. Il fallimento di
tale trasferimento è detto rigetto: questo è
causato da una risposta immunitaria specifica.
autologo: da un individuo allo stesso individuo
singenico: tra due individui geneticamente identici
allogenico: tra individui della stessa specie ma
geneticamente differenti
xenogenico: tra individui di specie differenti
Le molecole riconosciute come estranee nel trapianto
allogenico sono dette alloantigeni
I linfociti (e gli ab) che reagiscono contro tali molecole
sono detti alloreattivi
Riconoscimento degli alloantigeni
Le molecole MHC sono le responsabili della maggior
parte delle reazioni di rigetto. Esse vengono
presentate per il riconoscimento ai linfociti T in due
modi differenti:
diretto, quando sono esposte sulle APC del donatore
e riconosciute dai linfociti T del ricevente (T
citotossici, CD8)
indiretto, quando le APC del ricevente le processa
come proteine antigeniche (del donatore), e vengono
riconosciute dai linfociti T del ricevente (T helper
CD4)
riconoscono" significa sempre "riconoscono come estraneo": quindi qualsiasi cosa sia nonself è riconosciuta, compreso un MHC non self.
Attivazione dei linfociti alloreattivi
ü sia la via diretta che indiretta attiva i linfociti T
alloreattivi
ü esistenza di APC (del donatore) che presentano gli
antigeni allogenici
ü le APC del ricevente processa MHA I del donatore
ü attivati, i linfociti alloreattivi migrano nel nel sito di
trapianto e ne causano il rigetto
CD4: danno il contributo maggiore al rigetto, una volta
differenziati in effettori, secernono citochine che
danneggiano l’organo trapiantato
CD8: attivati dalla via diretta da APC del donatore si
differenziano in CTL che eliminano le cells che esprimono
MHC I allogenici
Queste risposte vengono studiate in vitro mediante la
MLR (reazione linfocitaria mista). Tale processo è usato
come predittivo nel rigetto in un trapianto e si basa
sull’incontro delle popolazioni linfocitarie dei due individui
e nell’osservazione di assenza o presenza di
proliferazione.
MLR:
BALB/c
MHC APLOTYPE d
Purificaz MHC-dT cell
Purificaz MHC-dsplenociti
C57BL/6
MHC APLOTYPE b
Purificaz MHC-bT cell
Purificaz MHC-bsplenociti
PURIFICAZIONE:
Utilizzo di Ab diretti contro T cells (anti-CD4 e anti-CD8) coniugati
con MICROBEADS di metallo
Y
CD8
Y
CD4
CD4+ T cell
CD8+ T cell
Y
Sospensione unicellulare da milza:
Y
Y
Y
T cell
T cell
DC
Y
Y
Y
T cell
T cell
Y
B cell
MAC
Y
Y
T cell
T cell
APC
APC
APC
APC
APC
APC
APC
Sospensione cellulare + Anticorpi
Y
Y
Y
Y
Y
Y
APC
APC
T cell
T cell
APC
APC
Y
Y
MAGNETE
T cell
APC
APC
Y
Selezione positiva
Selezione negativa
Mix:
MHC-dT
cell
MHC-bsplenociti
Balb T cells react with C57 splenocytes
MHC-dT
cell
MHC-dsplenociti
Balb T cells don’t react
with Balb splenocytes
MHC-dsplenociti
MHC-bT
cell
C57 T cells react with Balb splenocytes
MHC-bT
cell
MHC-bsplenociti
C57 T cells don’t react
with C57 splenocytes
C57 T cells don’t react
with C57 splenocytes
Balb T cells don’t react
with Balb splenocytes
C57 T cells react
with Balb splenocytes
Balb T cells react
with C57 splenocytes
IL2 production
READ OUT: IL2 production
(Sandwich ELISA)
Mixed Lymphocyte Reaction (MLR)
milza di topo C57 (splenociti C57, T cells C57);
milza di topo BALB (splenociti BALB, T cells BALB)
Preparazione della milza per MLR
• Trasferire la milza dalla falcon nel setaccio contenuto nella Petri
• Omogenare la milza con il pistone di una siringa da 5 ml premendo contro il
fondo del setaccio con movimenti circolari
• Eliminare il setaccio, raccogliere le cells di milza, metterle in un tubo da 50ml
• Lavare la piastra con 3 ml di terreno e aggiungerli alla falcon da 50 ml
• Filtrare su cell streiner da 0.45 in un nuovo tubo da 50 ml
• Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm
• Scartare il surnatante
• Risospendere le cellule in 3 ml di RBC Lysis Buffer
• Lasciare in ghiaccio per 5 minuti
• Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm
• Eliminare il surnatante
• Risopendere le cellule in 5 ml di PBS
• Contare le cellule diluite 1:10
• Utilizzare per i passaggi successivi un n. max di 40x106 cellule
Purificazione delle cellule T su colonna
Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti
Risosp. il pellet, dopo aver eliminato il surnat. in 360 µl di PBS
Aggiungere 80 µl di CD4/CD8 MicroBeads
Miscelare bene
Incubare per 15 minuti a 4ｰC
Lavare le cellule con 4 ml di PBS
Centrifugare a 1300 rpm per 5 minuti
Risospendere il pellet in 500 µl di PBS
Equilibrare una MS column con 500 µl di PBS
Sostituire il tubo di raccolta sotto il magnete
Caricare la sospensione cellulare sulla colonna
Lavare con 1 ml di PBS per 3 X (raccogliere nello stesso tubo)
Conservare la frazione negativa (splenociti)
Staccare la colonna dal magnete
Fluxare con 1 ml di PBS in un nuovo tubo
Conservare la frazione positiva (T cells)
MLR:"
"
ü Contare gli splenociti (cellule della frazione negativa)"
ü Contare le cellule T (cellule della frazione positiva)"
ü Portare le cells alla conc. di 1x106/ml con terreno
completo"
"
In piastra da 48 wells piastrare 4 x 105 splenociti e 2 x 105
cellule T nelle seguenti combinazioni:"
"
a) splenociti BALB con T cells C57"
b) splenociti BALB con T cells BALB"
c) splenociti C57 con T cells BALB"
d) splenociti C57 con T cells C57"
