Immunologia dei trapianti
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Immunologia dei trapianti Per trapianto si intende il trasferimento di cellule, tessuti, organi, da un individuo detto donatore a uno detto ricevente. Il fallimento di tale trasferimento è detto rigetto: questo è causato da una risposta immunitaria specifica. autologo: da un individuo allo stesso individuo singenico: tra due individui geneticamente identici allogenico: tra individui della stessa specie ma geneticamente differenti xenogenico: tra individui di specie differenti Le molecole riconosciute come estranee nel trapianto allogenico sono dette alloantigeni I linfociti (e gli ab) che reagiscono contro tali molecole sono detti alloreattivi Riconoscimento degli alloantigeni Le molecole MHC sono le responsabili della maggior parte delle reazioni di rigetto. Esse vengono presentate per il riconoscimento ai linfociti T in due modi differenti: diretto, quando sono esposte sulle APC del donatore e riconosciute dai linfociti T del ricevente (T citotossici, CD8) indiretto, quando le APC del ricevente le processa come proteine antigeniche (del donatore), e vengono riconosciute dai linfociti T del ricevente (T helper CD4) riconoscono" significa sempre "riconoscono come estraneo": quindi qualsiasi cosa sia nonself è riconosciuta, compreso un MHC non self. Attivazione dei linfociti alloreattivi ü sia la via diretta che indiretta attiva i linfociti T alloreattivi ü esistenza di APC (del donatore) che presentano gli antigeni allogenici ü le APC del ricevente processa MHA I del donatore ü attivati, i linfociti alloreattivi migrano nel nel sito di trapianto e ne causano il rigetto CD4: danno il contributo maggiore al rigetto, una volta differenziati in effettori, secernono citochine che danneggiano l’organo trapiantato CD8: attivati dalla via diretta da APC del donatore si differenziano in CTL che eliminano le cells che esprimono MHC I allogenici Queste risposte vengono studiate in vitro mediante la MLR (reazione linfocitaria mista). Tale processo è usato come predittivo nel rigetto in un trapianto e si basa sull’incontro delle popolazioni linfocitarie dei due individui e nell’osservazione di assenza o presenza di proliferazione. MLR: BALB/c MHC APLOTYPE d Purificaz MHC-dT cell Purificaz MHC-dsplenociti C57BL/6 MHC APLOTYPE b Purificaz MHC-bT cell Purificaz MHC-bsplenociti PURIFICAZIONE: Utilizzo di Ab diretti contro T cells (anti-CD4 e anti-CD8) coniugati con MICROBEADS di metallo Y CD8 Y CD4 CD4+ T cell CD8+ T cell Y Sospensione unicellulare da milza: Y Y Y T cell T cell DC Y Y Y T cell T cell Y B cell MAC Y Y T cell T cell APC APC APC APC APC APC APC Sospensione cellulare + Anticorpi Y Y Y Y Y Y APC APC T cell T cell APC APC Y Y MAGNETE T cell APC APC Y Selezione positiva Selezione negativa Mix: MHC-dT cell MHC-bsplenociti Balb T cells react with C57 splenocytes MHC-dT cell MHC-dsplenociti Balb T cells don’t react with Balb splenocytes MHC-dsplenociti MHC-bT cell C57 T cells react with Balb splenocytes MHC-bT cell MHC-bsplenociti C57 T cells don’t react with C57 splenocytes C57 T cells don’t react with C57 splenocytes Balb T cells don’t react with Balb splenocytes C57 T cells react with Balb splenocytes Balb T cells react with C57 splenocytes IL2 production READ OUT: IL2 production (Sandwich ELISA) Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) milza di topo C57 (splenociti C57, T cells C57); milza di topo BALB (splenociti BALB, T cells BALB) Preparazione della milza per MLR • Trasferire la milza dalla falcon nel setaccio contenuto nella Petri • Omogenare la milza con il pistone di una siringa da 5 ml premendo contro il fondo del setaccio con movimenti circolari • Eliminare il setaccio, raccogliere le cells di milza, metterle in un tubo da 50ml • Lavare la piastra con 3 ml di terreno e aggiungerli alla falcon da 50 ml • Filtrare su cell streiner da 0.45 in un nuovo tubo da 50 ml • Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm • Scartare il surnatante • Risospendere le cellule in 3 ml di RBC Lysis Buffer • Lasciare in ghiaccio per 5 minuti • Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm • Eliminare il surnatante • Risopendere le cellule in 5 ml di PBS • Contare le cellule diluite 1:10 • Utilizzare per i passaggi successivi un n. max di 40x106 cellule Purificazione delle cellule T su colonna Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti Risosp. il pellet, dopo aver eliminato il surnat. in 360 µl di PBS Aggiungere 80 µl di CD4/CD8 MicroBeads Miscelare bene Incubare per 15 minuti a 4ｰC Lavare le cellule con 4 ml di PBS Centrifugare a 1300 rpm per 5 minuti Risospendere il pellet in 500 µl di PBS Equilibrare una MS column con 500 µl di PBS Sostituire il tubo di raccolta sotto il magnete Caricare la sospensione cellulare sulla colonna Lavare con 1 ml di PBS per 3 X (raccogliere nello stesso tubo) Conservare la frazione negativa (splenociti) Staccare la colonna dal magnete Fluxare con 1 ml di PBS in un nuovo tubo Conservare la frazione positiva (T cells) MLR:" " ü Contare gli splenociti (cellule della frazione negativa)" ü Contare le cellule T (cellule della frazione positiva)" ü Portare le cells alla conc. di 1x106/ml con terreno completo" " In piastra da 48 wells piastrare 4 x 105 splenociti e 2 x 105 cellule T nelle seguenti combinazioni:" " a) splenociti BALB con T cells C57" b) splenociti BALB con T cells BALB" c) splenociti C57 con T cells BALB" d) splenociti C57 con T cells C57"
