centro di referenza nazionale per la malattia di aujeszky

ISTITUTO ZOOPROFILATTICO
SPERIMENTALE DELLA LOMBARDIA E
DELL'EMILIA ROMAGNA
“BRUNO UBERTINI”
(ENTE SANITARIO DI DIRITTO PUBBLICO)
-------------------------------------
Via Bianchi, 9
25124 BRESCIA
(Italy)
Tel. + 39 030-2290289
Fax: +39 030-2290535
E-mail: [email protected]
BRESCIA
CENTRO DI REFERENZA
NAZIONALE PER LA
MALATTIA DI AUJESZKY
Dirigente Responsabile Dr. Paolo Cordioli
RELAZIONE SULL’ATTIVITA’ DELL’ANNO 2012
PIANO DI ATTIVITA’ PER L’ANNO 2013
Novembre 2012
1
1. Obiettivi strategici
L'attività del Centro di Referenza Nazionale, anche per l’anno 2012, ha avuto come finalità
principale il monitoraggio dell’infezione da virus della malattia di Aujeszky (ADV), in relazione ad
una verifica costante dell’andamento del vigente Piano di Controllo nazionale.
L'attività diagnostica si è prevalentemente concentrata sui campioni provenienti dal territorio di
Lombardia ed Emilia Romagna, essendo l'esecuzione diretta a scopo diagnostico dei test
sierologici e virologici demandata direttamente agli altri IIZZSS per quanto di propria
competenza. I dati relativi al controllo a livello di singole Regioni sono riportati secondo quanto
dedotto dalla Banca dati del Centro di Referenza nella Tabella 1.
L’analisi dei dati da novembre 2011 a ottobre 2012, per il territorio di competenza IZSLER,
indica che il virus continua a circolare negli allevamenti suini, con una positività totale per
anticorpi nei confronti della gE dell’11,4%, rispetto al 12.6% dell’anno precedente.
Per quanto riguarda il contesto locale è da sottolineare l’attività associata al “Piano di controllo
della malattia di Aujeszky in regione Lombardia: verifica attuazione del piano vaccinale.”
(Decreto n. 10784 del 17/11/2011) che comporta una verifica dell’avvenuta vaccinazione
attraverso il prelievo di categorie specifiche di animali ed un controllo per gli anticorpi anti gB.
In tabella 2 vengono riportati gli allevamenti campionati per tale attività suddivisi per Provincia.
Presso il Centro sono state mantenute le attività di preparazione di materiali di riferimento per la
sierologia sia per uso interno sia per la rete degli IIZZSS e quella di organizzazione di circuiti
interlaboratorio (ring test). Il Centro di Referenza ha infatti provveduto anche per l’anno 2012
all’organizzazione di un ring test, che verrà inviato a novembre di quest’anno ed espletato entro
i primi mesi del 2013, con lo scopo di continuare il monitoraggio delle prestazioni dei laboratori
coinvolti nel piano di sorveglianza sierologica della Malattia di Aujeszky. Il centro ha inoltre
partecipato alla fine dell’anno 2011 con esito positivo ad un ring test esterno, organizzato dal
Laboratoire de Ploufragan-Plouzane (Francia).
A questo si è aggiunta la costante attività di ricerca e sperimentazione, la realizzazione di
iniziative di aggiornamento e formazione professionale, la fornitura di consulenze a referenti
pubblici (Ministero, regione, ASL) e privati e la divulgazione di indagini scientifiche a convegni
nazionali e internazionali.
Per quanto riguarda la ricerca è da sottolineare la stesura di un Progetto di Ricerca Corrente,
approvato con decorrenza Dicembre 2012, dal titolo “Suid Herpesvirus (SHV-1):
caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati in Italia e studio di patogenicità in suini e
cinghiali”. Il progetto ha come finalità lo studio filogenetico dei ceppi di SHV-1 isolati in Italia dal
1984 ad oggi,. Con particolare attenzione alle caratteristiche di virulenza dei ceppi isolati da
suini e da cani da caccia tramite infezioni sperimentali nei cinghiali e nei suini SPF. Il razionale
e la descrizione complessiva del Progetto è allegato alla presente relazione.
Poiché gli animali selvatici sono o possono essere il serbatoio di numerosi agenti patogeni che
colpiscono gli animali da reddito. L’IZSLER da vari anni ha messo a punto un sistema di
monitoraggio delle popolazioni selvatiche attraverso il controllo degli animali rinvenuti morti,
soppressi per piani di controllo specifici o abbattuti durante la stagione venatoria. Da
sottolineare per l’anno 2012 il notevole implemento dell’attività di controllo nelle specie
selvatiche, in particolare nel cinghiale, coerentemente al piano di controllo regionale della fauna
selvatica.
2
2. Attività di sorveglianza per la Malattia di Aujeszky a livello nazionale per l’anno 2012
Di seguito vengono riportati i dati riguardanti gli allevamenti e i centri genetici (Tab. 1)
controllati per la Malattia d’Aujeszky sull’intero territorio nazionale.
Tabella 1. Esiti delle indagini per la Malattia di Aujeszky per gli allevamenti suini (parte a)
e per i centri genetici (parte b), riportati sul Database del Centro di Referenza suddivisi per
Regione
Regione
N. aziende con
N. aziende non
N. aziende oggetto
N. aziende
N. di
controllo
contaminate
di un programma per
positive alla
aziende
sierologico per la
dalla malattia di
la malattia di
malattia di
presenti
malattia di
Aujeszky (con
Aujeszky
Aujeszky
Aujeszky
vaccinazione)
Parte A: Allevamenti
Abruzzo
Basilicata
Calabria
Campania
EmiliaRomagna
Friuli Venezia
Giulia
Lazio
Liguria
Lombardia
Marche
Molise
P.A. Bolzano
P.A. Trento
Piemonte
Puglia
Sardegna
Sicilia
Toscana
Umbria
Valle D'Aosta
Veneto
Totale
12851
5988
6732
22967
775
1086
511
914
267
115
141
263
26
7
22
6
241
108
119
257
4714
1246
413
51
362
1814
746
117
0
117
4453
562
8128
13601
4822
4615
656
2820
920
14328
1606
6751
2901
128
7538
128895
867
80
2945
1424
364
159
8
1363
640
10316
1357
1241
775
56
1383
28256
256
21
1035
346
192
4
6
468
282
1946
0
676
489
0
274
7311
27
5
389
9
3
0
1
133
5
263
0
68
32
0
21
1068
229
16
646
337
189
4
5
335
277
1683
0
608
457
0
253
6243
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
5
5
4
0
4
3
3
1
0
1
6
2
4
1
2
26
6
2
4
1
1
25
6
1
1
1
1
16
0
0
0
0
0
0
6
1
1
1
1
16
Parte B: Centri genetici
Abruzzo
Calabria
Campania
EmiliaRomagna
Friuli Venezia
Giulia
Lombardia
Marche
Piemonte
Toscana
Veneto
Totale
3
Nella tabella seguente (Tab. 2) sono riportati i dati parziali ottenuti dall’Osservatorio
Epidemiologico Veterinario della regione Lombardia (OEVRL) in riferimento al Piano per la
verifica dell’attuazione del piano vaccinale (Decreto n. 10784 del 17/11/2011).
Tabella 2: Numero di allevamenti da campionare secondo quanto previsto dal Piano e numero
di allevamenti effettivamente analizzati al 31 ottobre 2012, suddivisi per provincia.
ASL
BG
BS
CO
CR
LC
LO
MN
MI
MI1
MI2
MB
PV
SO
VC
VA
Totale
N° allevamenti da campionare
38
121
9
82
8
37
105
1
7
9
5
22
16
15
6
481
N° allevamenti campionati
26
324
2
34
0
0
84
0
0
11
5
5
0
15
13
519
3. Attività Diagnostica e di ricerca effettuata presso il Centro
3.1 Analisi sierologiche e virologiche
Le indagini sierologiche eseguite nel 2011-2012 per la ricerca degli anticorpi nei confronti del
virus della malattia di Aujeszky hanno evidenziato una percentuale del 11.4% di campioni
positivi per anticorpi anti gE, leggermente inferiore rispetto a quella del 2010-2011 che era
12.6%.
Per quanto riguarda le analisi virologiche, nel periodo 2011-2012 sono stati isolati 8 ceppi (7
da campioni provenienti da cane e 1 da cinghiale) di virus della Malattia di Aujeszky, mentre le
positività alla PCR sono state 15 (Tab. 3).
Tabella 3: Risultati delle indagini sierologiche nei suini e virologiche in materiali ottenuti da
diverse specie animali, relative al periodo 1/11/2011 – 31/10/2012 effettuate da laboratori
dell’IZSLER
Esaminati
Positivi
%
anticorpi gB
45885
37941
82.7
anticorpi gE
131769
15122
11.4
Indagini virologiche
578
15
2.5%
4
Di seguito vengono inoltre riportati risultati delle indagini sierologiche e virologiche eseguite per
la Malattia di Aujeszky nei cinghiali (Tab. 4).
Tabella 4: Risultati delle indagini sierologiche e virologiche nei cinghiali relativi al periodo
1/11/2011-31/10/2012
anticorpi gE
PCR
Esaminati
4645
418
Positivi
%
1095
23.6%
8
2%
3.2 Caratterizzazione di ceppi di virus della malattia di Aujeszky
Anche per l’anno 2012 è continuato il lavoro di caratterizzazione dei ceppi di ADV isolati presso
il Centro, attraverso il sequenziamento parziale dei geni che codificano per gE e gC. Questa
analisi ha lo scopo di capire meglio l’epidemiologia e la distribuzione dei ceppi circolanti, in
modo da individuare più correttamente eventuali punti di debolezza del sistema di controllo.
Inoltre si è deciso di caratterizzare e confrontare i ceppi isolati da cane dal 1993 ad oggi (Tab.
5), per valutarne l’evoluzione rispetto ai ceppi isolati da suino o da selvatici. Il ceppo di ADV
160938/2012 è stato isolato presso l’IZS di Portici (NA) e inviato al CdR per caratterizzazione.
Tabella 5: Ceppi di ADV isolati da cane divisi per anno di isolamento, numero di conferimento e
provincia di origine.
Anno di isolamento
2012
2011
Conferimento n.
4966
Provincia
Cremona
160938
Napoli
286509
Brescia
290422
Brescia
310919/1
310919/2
Brescia
101452
Brescia
325415
Bologna
325409
Bologna
2009
980
Reggio Emilia
2008
203379
Reggio Emilia
2007
13814
Cremona
2004
249465
Bologna
1994
736
Piacenza
1993
3718
Piacenza
2010
5
L’isolamento è stato ottenuto su monostrati confluenti di colture primarie di rene suino e su
monostrati cellulari della linea continua PK15, partendo da matrici biologiche quali omogenati di
pool di visceri, tessuto cerebrale.
La ricerca del DNA virale è stata eseguita tramite real time PCR (Yoon et al., 2005).
Per il sequenziamento la amplificazione è stata eseguita in PCR, utilizzando due coppie di
primers che amplificano rispettivamente sui geni UL44 e US8, secondo la metodica descritta da
Fonseca et al. (2010). La caratterizzazione molecolare dei ceppi di ADV è stata ottenuta
attraverso il sequenziamento parziale dei geni gC e gE. Le sequenze ottenute sono state
analizzate in BLAST e confrontate con quelle dei ceppi di riferimento ottenuti in GenBank
mediante allineamento con il programma CLUSTAL W a parametri di default, mediante il
software Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA). L’albero filogenetico è stato costruito
con il programma MEGA 5.0 utilizzando il metodo del neighbor-joining.
L'analisi filogenetica del gene gE (Fig.1) ha dimostrato che 3 ceppi ( ) si trovavano nel cluster
B, strettamente correlato ai ceppi di riferimento Nova Prata (Brasile) e al 89V87 (Belgio).
Questo gruppo include la maggior parte degli ADV di origine suina, isolati negli ultimi venti anni
in Europa e in America. Questi ceppi originano da cani da lavoro utilizzati in allevamenti di suini,
che hanno presentato sintomatologia neurologica.
Gli altri 12 ceppi si sono raggruppati nella cluster C con i ceppi di riferimento NS374 e 75V19
isolati negli anni '70. Di questi dodici, 9 ceppi sono stati isolati da cani da caccia ( ) alimentati
con residui di cinghiali cacciati. I rimanenti 3 ceppi ( ) provenivano da cani non da caccia,
morti dopo sintomatologia nervosa durante i mesi di chiusura della caccia al cinghiale.
L’analisi filogenetica del gene gC (Fig.2) ha mostrato che i ceppi italiani si raggruppano in tre
gruppi. Tre ceppi, originati da cani di allevamenti suini ( ), si sono posti nel cluster B mentre
nove ceppi da cani da caccia ( ) si sono raggruppati nel cluster C insieme con il ceppo isolato
da cinghiale nel 1993 (ITA 561). Infine, gli ultimi 3 ceppi ( ) si sono posti in un gruppo separato
correlato al ceppo di campo brasiliano IB341/86.
Questi risultati dimostrano che vi è una netta distinzione tra i ceppi virali isolati da cani
d’allevamento e da cani da caccia. Il primo gruppo è stato strettamente correlato ai ceppi suini
isolati in Europa e in America negli ultimi 20 anni, che appartengono al gruppo B in entrambi gli
alberi filogenetici. L'altro gruppo era composto dai 9 isolati provenienti da cani da caccia e dal
ceppo isolato da cinghiale nel 1993. Questi ceppi hanno mostrato un’elevata omologia coi ceppi
di ADV circolanti negli anni '70 e '80, che sono quasi scomparsi nella popolazione suina
odierna. AL contrario, nella popolazione di suini selvatici tali ceppi, simili ai vecchi ceppi di ADV,
sono ancora in circolazione, a dimostrazione che la sostituzione con i recenti ceppi non ha
ancora avuto luogo. Gli ultimi ceppi mostrano un interessante pattern caratterizzato da un gene
gC simile ai ceppi suini e un gene gE correlato ai ceppi isolati da cani da caccia.
Queste analisi, condotte principalmente su isolati da cane da caccia e quindi su ceppi
probabilmente riferibili a ceppi di cinghiale, può approfondire la conoscenza sull'epidemiologia
di ADV nella fauna selvatica e quindi sulla circolazione del virus nel territorio, anche al di fuori
degli allevamenti, nell’ottica di un piano di eradicazione.
6
Figura 1: Albero filogenetico costruito sulle sequenze del gene gE utilizzando il metodo del
neighbor-joining
7
Figura 2: Albero filogenetico costruito sulle sequenze del gene gC utilizzando il metodo del
neighbor-joining.
8
3.3 Circuiti interlaboratorio
3.3.1 Organizzati dal Centro
Il Centro di Referenza ha provveduto anche per l’anno 2012 all’organizzazione di un ring test
sierologico (panel di 20 sieri sperimentali), che verrà inviato a novembre di quest’anno ed
espletato entro i primi mesi del 2013.
3.3.2 Organizzati da altri enti
Il Centro di Referenza ha partecipato con successo al Ring trial for Aujeszky’s disease serology
2011, organizzato dal Laboratoire de Ploufragan-Plouzane, Anses (Francia), laboratorio di
referenza OIE per la malattia d’Aujeszky. Questo ring test prevedeva l’invio di 15 sieri da
analizzare con una o più metodiche per la ricerca di anticorpi nei confronti della gE e della gB,
per valutare sensibilità, specificità, curva D-R e riproducibilità dei laboratori partecipanti.
4. Aggiornamento e formazione professionale
4.1. Convegni/congressi che il C. d. R. ha organizzato o a cui ha partecipato
EVENTO
ENTE
organizzatore
LOCALITA'
Data
Giornata di
aggiornamento
IZS UMBRIA E
MARCHE
Perugia-PG
24/05/12
Giornata di
aggiornamento
APA – IZSLER
SEZ PIACENZA
Gariga-PC
10/07/12
CREMONAFIERE
Cremona-CR
25/10/12
AIVEMP
Cremona -CR
26/10/12
67 fiera di
cremona
67 fiera di
cremona
TITOLO relazione
Il piano di controllo della malattia
di Aujeszky tra vecchi obiettivi e
nuove prospettive
Fattori di rischio e strategia per il
controllo e l’eradicazione della
malattia di Aujeszky
Dal 2013 semaforo verde solo per
suini Aujeszky free
Il piano di controllo della malattia
di Aujeszky: prospettive e criticità
5. Pubblicazioni scientifiche e divulgative
D. Lelli, A. Moreno, E. Sozzi, M. Chiari, G.Alborali, P. Cordioli “Genomic characterization of
pseudorabies virus strains isolated from dogs in Italy” IX international congress of veterinary
virology, Madrid (Spain) 4-7 sep 2012 pp 162-163
E. Sozzi, A. Moreno, D. Lelli, G. Alborali, A. Nigrelli, A. Luppi, M. Bresaola, A. Catella, P.
Cordioli “Genomic characterization of Pseudorabies virus strains isolated in Italy”
Transboundary and Emerging Diseases, in press
6. Sito Web
Sono consultabili e aggiornate le pagine dedicate al Centro di Referenza per la Malattia di
Aujeszky-Pseudorabbia (CRMA), pubblicate sul sito dell’IZSLER nella sezione Centri di
referenza, all’indirizzo
http://www.izsler.it/pls/izs_bs/consultazione.mostra_pagina?id_pagina=32.
9
7. Allegati
Di seguito vengono allegati il PRC “Suid Herpesvirus (SHV-1): caratterizzazione molecolare
dei ceppi isolati in Italia e studio di patogenicità in suini e cinghiali” e il frontespizio delle
pubblicazioni riportate al punto 5.
Titolo del progetto:
Suid Herpesvirus (SHV-1): caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati in Italia e
studio di patogenicità in suini e cinghiali
Responsabile Scientifico: Dr. Paolo Cordioli
Progetto presentato dall’ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE .
N. identificativo progetto: IZS LER ../11 RC (*)
1. Titolo del progetto: Suid Herpesvirus (SHV-1): caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati in Italia
e studio di patogenicità in suini e cinghiali
2. Durata del progetto (espressa in mesi): 24
3. Area tematica: Sanità Animale
4. Linea di ricerca n. 1 - Titolo linea di ricerca: Studio filogenetico dei ceppi di SHV-1 isolati in Italia
dal 1984 ad oggi. Studio sulle caratteristiche di virulenza di ceppi isolati da suini e da cani da caccia
tramite infezioni sperimentali nei cinghiali e nei suini SPF.
5. Responsabile scientifico del progetto:
Cognome: Cordioli Nome Paolo
Qualifica Veterinario Dirigente
Telefono 030/2290347 Fax 030/2290535
E-mail: [email protected]
4. Elenco delle Unità operative impegnate nel progetto:
a) n. identif. U.O.: .....1.IMS..... Responsabile U.O.: Enrica Sozzi
b) n. identif. U.O.: .....2..IMS.... Responsabile U.O.: Leonardo Vinco James
c) n. identif. U.O.: .....3..IMS.... Responsabile U.O.: Ilaria Barbieri
(*) Identificativi per IZS: AM=Abruzzo-Molise; LT=Lazio-Toscana; LER=Lombardia-Emilia Romagna; ME=Mezzogiorno;
PLV=Piemonte-Liguria-Valled’Aosta; PB=Puglia-Basilicata; SA=Sardegna; SI=Sicilia; UM=Umbria-Marche; VE=Venezie
Esempio: IZS AM 01/11 RC
RC = Ricerca Corrente
10
Razionale del progetto
Suid Herpesvirus (SHV-1) è un alphaherpesvirus che causa la malattia di Aujeszky, una delle
malattie che colpisce frequentemente l’allevamento suinicolo, causando gravi perdite economiche.
Unico dal punto di vista antigenico, il virus della malattia di Aujeszky ha un ampio spettro d’ospite,
ma gli unici reservoir dell’infezione sono i suini e i cinghiali. Il genoma virale è costituito da una
doppia catena lineare di Dna di lunghezza pari a 143 kb, suddiviso nelle due uniche regioni UL
(lunga) e Us (corta) intervallate tra loro da due sequenze ripetute (IRS e TRS). Il virione è
costituito da numerose proteine di cui 11, tutte glicosilate, sono presenti nell’envelope e sono
coinvolte nella patogenesi dell’infezione e nell’induzione della risposta immunitaria. Alcune di
queste, come gC e gE, influenzano la virulenza del ceppo, ma non sono importanti per la
replicazione virale e hanno consentito lo sviluppo di vaccini deleti che permettono di differenziare
gli animali infetti da quelli vaccinati.
Molti paesi europei hanno preso in considerazione il controllo e l'eradicazione di SHV-1 e hanno
fatto notevoli sforzi per indagare sull’epidemiologia dell'infezione. Per la realizzazione di questi
programmi ha contribuito notevolmente la caratterizzazione dei ceppi di SHV-1 attraverso l’analisi
in RFLP. Recentemente, sono stati segnalati alcuni studi basati sul sequenziamento di due geni
(US8 e UL44), che codificano rispettivamente per le proteine gE e gC (3, 1, 5). In Italia dal 1997 è
in vigore il Piano nazionale di controllo della Malattia di Aujeszky (D.M: 1 aprile 1997) che prevede
la vaccinazione obbligatoria di tutti i suini allevati con vaccini gE-deleti e l’applicazione di accurate
misure di biosicurezza allo scopo di ridurre la prevalenza della malattia a livelli tali da essere
compatibile con un successivo piano di eradicazione. Nonostante l’applicazione del piano abbia
consentito, soprattutto nei primi 5 anni di attività, di ridurre notevolmente la sieroprevalenza, il virus
è oggi ancora ampiamente diffuso negli allevamenti suini italiani con valori di prevalenza elevati.
Negli ultimi dieci anni in molti altri paesi d'Europa la malattia di Aujesky è stata eradicata nei suini
domestici, ma non nella popolazione di suini selvatici. Nonostante i progressi compiuti nel controllo
e l'eliminazione SHV-1 nei suini domestici, ci sono sempre più prove che le infezioni di SHV-1
siano più diffuse nei suini selvatici in tutto il mondo di quanto originariamente pensato (2, 4). Il
progetto si prefigge di approfondire l'epidemiologia delle infezioni di SHV-1 nei suini e nei cinghiali
attraverso la caratterizzazione genomica di ceppi isolati in un periodo vasto, dal 1984 ad oggi. I
risultati di questo progetto potranno fornire un aggiornamento delle attuali conoscenze delle
infezioni di SHV-1 nella popolazione dei suini selvatici e contribuiranno a chiarire il loro possibile
impatto
sul
proseguimento
dei
programmi
di
eradicazione.
Nel corso del progetto verranno eseguite infezioni sperimentali nei suini domestici e selvatici con
ceppi di diversa origine con lo scopo di contribuire a comprendere meglio le caratteristiche
dell'infezione, la trasmissibilità del virus e la durata della risposta immunitaria nei cinghiali.
Bibliografia di riferimento
1.
Fonseca AA Jr, Camargos MF, de Oliveira AM, Ciacci-Zanella JR, Patrício MA, Braga AC,
Cunha ES, D'Ambros R, Heinemann MB, Leite RC, dos Reis JK. Molecular epidemiology of
Brazilian pseudorabies viral isolates. Vet Microbiol. 2010 Mar 24;141(3-4):238-45. Epub
2009 Sep 25.
2.
Müller T, Hahn EC, Tottewitz F, Kramer M, Klupp BG, Mettenleiter TC, Freuling C.
Pseudorabies virus in wild swine: a global perspective. Arch Virol. 2011 Oct;156(10):1691705. Epub 2011 Aug 12.
3.
Müller T, Klupp BG, Freuling C, Hoffmann B, Mojcicz M, Capua I, Palfi V, Toma B, Lutz W,
Ruiz-Fon F, Gortárzar C, Hlinak A, Schaarschmidt U, Zimmer K, Conraths FJ, Hahn EC,
Mettenleiter TC. Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe.
Epidemiol Infect. 2010 Nov;138(11):1590-600. Epub 2010 Mar 12.
4.
Ruiz-Fons F, Vidal D, Höfle U, Vicente J, Gortázar C. Aujeszky's disease virus infection
patterns in European wild boar. Vet Microbiol. 2007 Mar 10;120(3-4):241-50. Epub 2006
Dec 12.
5.
Serena MS, Metz GE, Mórtola EC, Echeverría MG. Phylogenetic analysis of Suid
Herpesvirus 1 isolates from Argentina. Vet Microbiol. 2011 Jul 1.
11
Descrizione complessiva del progetto
1. Breve sintesi delle conoscenze già disponibili sull’argomento
La Malattia di Aujeszky è una malattia eradicata nella maggior parte dei Paesi Europei ma ancora
presente in Italia dove è presente un Piano di controllo. L’agente causale è Suid Herpesvirus 1
membro della sub famiglia delle Alphaherpesvirinae, è un DNA virus con un genoma di 150 kb in
grado di codificare per innumerevoli proteine strutturali e non. Tra le glicoproteine strutturali quelle
più importanti per la protezione perchè danno origine ad anticorpi neutralizzanti sono la gB e gD.
La presenza di glicoproteine non strutturali nel SHV1 ha permesso la creazione di ceppi deleti che,
usati come vaccini, permettono di differenziare gli animali vaccinati dagli infetti e quindi di avere un
mezzo che permette la riduzione dell’infezione a valori economicamente accettabili.
Come riportato il virus di Aujeszky è presente in molti allevamenti italiani dove può determinare,
come concausa, forme respiratorie in animali all’ingrasso. In assenza di vaccinazione il virus può
causare mortalità elevata in animali sottoscrofa, aborti tardivi nelle scrofe e forme respiratorie nei
suini all’ingrasso. L’infezione del virus di Aujeszky in altre specie domestiche come carnivori e
ruminanti determina una forma nervosa grave e mortale. Come tutti i virus herpetici il SHV1 è in
grado di determinare infezioni latenti e di riattivarsi in seguito a stress.
Nella maggioranza dei Paesi Europei il virus è stato eradicato negli allevamenti suini ma è ancora
presente nella popolazione di cinghiali che non mostrano sintomatologia ma sono sieropositivi.
2. Nuove conoscenze/informazioni
Ad oggi sono poche le conoscenze relative alla epidemiologia dell’infezione da SHV1 nei cinghiali
come pure limitate sono le caratteristiche dei ceppi di Aujeszky isolati dai selvatici. Lo scopo
principale della ricerca è quello di attuare un’analisi molecolare e filogenetica dei vari ceppi di
SHV1 presenti nella Biobanca dell’IZSLER per approfondire le conoscenze epidemiologiche della
malattia. La caratterizzazione genomica di SHV1 isolati da suini, cinghiali e altre specie di
mammiferi permetterà una migliore conoscenza sulle differenze trai ceppi e sarà utile per
comprendere le varie catene di infezione. L’infezione sperimentale di cinghiali con ceppi derivati
dagli stessi o dai suini permetterà, inoltre, una più approfondita conoscenza della variabilità della
patogenicità in questa specie del SHV1.
3. Metodologia
La ricerca si svilupperà utilizzando i ceppi presenti in Biobanca e attraverso la ricerca di campioni
positivi derivanti dalla routine diagnostica durante il periodo di svolgimento della ricerca:
- i campioni patologici deriveranno da quelli della routine diagnostica per i suini e da campioni di
cinghiali abbattuti durante la stagione venatoria
- tutti i campioni verranno esaminati con due differenti metodiche PCR real time (Ma et al.2008 J
Vet Diagn Invest;20:440-7; Yoon et al. 2005 J Microbiol;43:430-6)
- i campioni PCR positivi verranno inoculati su linee cellulari sensibili per l’isolamento virale
- sui ceppi virali di SHV1 presenti nella raccolta IZSLER e isolati durante la ricerca verrà effettuata
una PCR per l’amplificazione di due glicoproteine non essenziali quali la gE e la gC come descritto
da Fonseca et al. (1)
- le sequenze ottenute saranno valutate in parallelo tra loro e con quelle depositate in GenBank, e,
utilizzando il software Mega 5 sarà effettuata un’analisi molecolare e di filogenesi
- tutte le sequenze ottenute dall’analisi dei ceppi saranno depositate in GenBank
- i campioni ottenuti dagli animali infettati e a contatto saranno esaminati per valutare l’escrezione
virale attraverso la ricerca di SHV1 e la dinamica anticorpale
- si valuterà la ricerca del virus riattivato a seguito di trattamenti immunosoppressivi negli animali
infettati sperimentalmente sia ricercandolo in tamponi nasali e lacrimali che nei tessuti dopo
soppressione degli animali
Al termine della ricerca tutti i dati ottenuti verranno inseriti nel report finale
4. Criteri di trasferibilità e di diffusione dei prodotti e dei risultati
I risultati sia della caratterizzazione dei ceppi che dell’infezione sperimentale dei cinghiali verranno
presentati sia in meeting di settore che pubblicati su riviste nazionali e internazionali
5. Valore aggiunto dell’aggregazione tra soggetti diversi che partecipano al progetto
L’area di competenza dell’IZSLER è caratterizzata da 45.985 km2 di estensione e da una
popolazione suina di circa 6.300.000 animali. Il valore aggiunto dei soggetti che partecipano al
progetto è dato dalle competenze nell’ambito dell’epidemiologia, della diagnostica e della ricerca.
Il laboratorio di Virologia (UO1) è il Centro di Referenza Nazionale per la malattia di Aujeszky e
Laboratorio europeo di riferimento italiano per il virus di Aujeszky. La collaborazione con il
dipartimento di Biologia Molecolare (UO3) è essenziale per la definizione e la validazione dei
12
moderni protocolli di diagnostica molecolare e analisi genetica. L'UO2 è rappresentato dall'Unità
Infezioni Sperimentali negli animali dotata di strutture ad alto contenimento (BS3) per la
stabulazione degli animali. La sperimentazione animale sarà approvata dalla legislazione
nazionale e monitorata dal centro di referenza nazionale del benessere animale.
6. Descrizione e spiegazione dell’articolazione del programma in fasi fra le varie UU.OO.
Fase 1: Isolamento dei ceppi virali
Campioni di tessuto prelevati da suini con sintomi clinici respiratori, riproduttivi e neurologici
saranno raccolti e controllati per SHV-1 attraverso la metodica real time PCR. Saranno raccolti e
testati anche campioni clinici da altri ospiti non serbatoio come bovini e cani con sintomi
neurologici. Inoltre, durante la stagione venatoria saranno analizzati per SHV-1 campioni di tessuto
di cinghiali (tonsille e polmoni). L'isolamento del virus verrà eseguito su tutti i campioni positivi alla
PCR.
Nell’analisi filogenetica e molecolare sarà incluso un numero elevato di ceppi virali (circa 80 ceppi),
isolati dal 1984 fino ad oggi in IZSLER. Due ceppi di SHV-1 isolati rispettivamente da un suino
domestico e da un cane da caccia, verranno propagati su linea cellulare di PK15, titolati con il
metodo Reed e Muench e usato per le infezioni sperimentali.
Fase 2: Sequenziamento ed analisi filogenetica
I ceppi di SHV-1 isolati in Italia saranno caratterizzati geneticamente attraverso la sequenza
parziale dei geni UL44 e US8 che codificano rispettivamente per le glicoproteine gC e gE.
L’amplificazione verrà eseguita tramite PCR utilizzando due coppie di primers che amplificano
rispettivamente i geni UL44 e US8, secondo la metodica descritta da Fonseca et al. (2010).
Le sequenze ottenute saranno analizzate in BLAST e confrontate con quelle dei ceppi di
riferimento ottenuti in GenBank e sarà costruito l’albero filogenetico. Parte delle sequenze saranno
depositate in GenBank.
Fase 3: Infezioni sperimentali in suini SPF e nei cinghiali
Saranno realizzati due disegni sperimentali con l’utilizzo di due ceppi di SHV-1, uno di origine
suina e uno da un cane da caccia, con differente patterns genomico. I cinghiali saranno acquistati
da un allevamento sieronegativo e testati prima degli esperimenti tramite test sierologici e PCR.
Disegni sperimentali - due gruppi di 8 animali, 4 cinghiali e 4 maiali SPF, saranno inoculati
rispettivamente con un ceppo isolato da un cane da caccia e con un ceppo isolato da un suino e
alloggiati a contatto con due cinghiali e suini non infetti. Verranno utilizzati un totale di 24 animali
tra cinghiali e suini.
Gli animali saranno osservati quotidianamente per verificare la comparsa di segni clinici e
campioni saranno testati per analizzare l’escrezione di SHV-1 e la produzione di anticorpi
omologhi. Dopo la riattivazione dell'infezione latente indotta da immunosoppressione, verrà
eseguita l'individuazione di SHV-1 nei tessuti degli animali sottoposti a necroscopia utilizzando
colture cellulari e metodi di PCR.
Fase 4: Report finale
A fine progetto sarà predisposta la stesura della relazione finale del progetto e la pubblicazione dei
risultati ottenuti.
7. Output del programma con indicazione dei tempi previsti per la presentazione
Dopo dodici mesi dall’inizio del progetto sarà possibile avere sufficienti risultati preliminari che
permetteranno la produzione di documenti e pubblicazioni. Per avere a disposizione i risultati
completi della ricerca bisognerà attendere, tuttavia, la fine del progetto, quando tutti i dati ed i
risultati ottenuti dalle infezioni sperimentali e l’analisi filogenetica delle sequenze potranno
permettere un aggiornamento delle attuali conoscenze delle infezioni di SHV-1 nella popolazione
dei suini selvatici e contribuiranno a chiarire il loro possibile impatto sul proseguimento dei
programmi di eradicazione.
8. Obiettivi e indicatori per la verifica dei risultati raggiunti
Obiettivi:
- Valutazione della circolazione di ceppi di SHV-1 in allevamenti di suini e cinghiali in
Lombardia ed Emilia Romagna.
- Sequenziamento, caratterizzazione e identificazione delle differenze molecolari in ceppi
raccolti dal 1984 fino ad oggi.
- Valutazione delle differenze cliniche e virologiche tra cinghiali e suini infettati con ceppi di
origine suina e da cane da caccia.
13
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15
16
Allegato 2a “Consuntivo 2012”
1. Personale
A
Personale in servizio
(Nominativo)
B
qualifica
C
Tip. di
cont.
1. Cordioli Paolo
Dir. Vet.
Indet.
2. Alborali Loris
Dir. Vet.
Indet.
3. Tamba Marco
Dir. Vet.
Indet.
4. Zanoni Mariagrazia
Dir. Vet.
Indet.
5. Lombardi Guerino
Dir. vet.
Indet.
6. Sozzi Enrica
7. Lelli Davide
8. Moreno Ana Maria
Dir. Vet.
Dir. Vet.
Dir. Vet.
Tec. san. lab.
biom.
Tec. san. lab.
biom.
Tec. san. lab.
biom.
Oper. tec.
cat. C
Indet.
Indet.
Indet.
8. Bresciani Daniela
9. Tirelli Annamaria
10. Marella Loredana
11. Barbeno Claudio
Indet.
Indet.
D
Breve descrizione
dell’attività svolta nel
2012
Ricerca, Diagn.,
Gestione
Ricerca, Diagn. Gestione
piani
Epidemiol. Anal. gest.
piani
Epidemiol. Anal. gest.
piani
Prod. sieri e sper.
animale
Ricerca, Diagn.
Ricerca, Diagn.
Ricerca, Diagn.
Diagn. sierol. coll. Ric. e
Svil.
Diagn. virol. coll. guid.
Ricerca e svil.
E
Costo medio
annuo
F
% di
utilizzo
ExF
Costo finale
160.000,00
7%
11.200,00
140.000,00
10%
14.000,00
100.000,00
6%
6.000,00
100.000,00
6%
6.000,00
160.000,00
5%
8.000,00
70.000,00
70.000,00
100.000,00
5%
5%
5%
3.500,00
3.500,00
5.000,00
40.000,00
5%
2.000,00
40.000,00
5%
2.000,00
Indet.
Elab. progr. controllo
40.000,00
8%
3.200,00
Indet.
Prelievo sangue e camp.
in allev.
30.000,00
5%
1.500,00
Totale spese personale: 65.900,00
2. Apparecchiature, tecnologie, arredi acquistati nel 2011-2012
Apparecchiature, tecnologie, arredi adibiti solo ed esclusivamente al servizio del Centro e quelli condivisi
con altri laboratori.
Totale spese apparecchiature, tecnologie, arredi: € 0
3. Altri costi previsti per le attività
Per la realizzazione delle iniziative volte al conseguimento degli obiettivi del programma operativo 20112012, il Centro ha sostenuto i seguenti costi:
Voci di costo
Formazione e missione
Materiali di consumo
Smaltimento rifiuti
Prove sperimentali
costo
6000,00
25000,00
5000,00
8000,00
Ente finanziatore (se diverso dall’IZS di appartenenza)
Totale altre voci di costo: € 44.000,00
4. Spese generali
Sono comprese diverse voci di spesa dell’Intero Istituto le cui tipologie principali sono: costi relativi a
personale amministrativo, consulenti, direzione generale sanitaria ed amministrativa, collegio sindacale,
consiglio amministrazione, concorsi, spese legali, utenze varie, manutenzioni generiche. Vengono
calcolate come 10% sul totale delle tre voci di spesa precedenti (personale, apparecchiature, altri costi).
Totale altre spese generali: (€65.900 + 0 + 44.000) x 0,10 = € 10.990
Consuntivo anno 2011-2012
(1 + 2. + 3. + 4.)
€ 65.900 + 0 + 44.000 + 10.990 = 120.890
Allegato 2b: “Ricavi 2012”
1. Consulenze
Nessuno
2. Finanziamento specifico del Ministero della Salute (specificare quale)
Nessuno
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Allegato 4: “Risorse ritenute necessarie per la realizzazione delle iniziative di intervento
nel 2012-2013”
Il Centro di Referenza per svolgere l’attività prevede di sostenere i seguenti costi:
1. Personale
A
Personale in servizio
(Nominativo)
B
qualifica
C
Tip. di
cont.
1. Cordioli Paolo
Dir. Vet.
Indet.
2. Alborali Loris
Dir. Vet.
Indet.
3. Tamba Marco
Dir. Vet.
Indet.
4. Zanoni Mariagrazia
Dir. Vet.
Indet.
5. Lombardi Guerino
Dir. vet.
Indet.
6. Sozzi Enrica
7. Lelli Davide
8. Moreno Ana Maria
Dir. Vet.
Dir. Vet.
Dir. Vet.
Tec. san. lab.
biom.
Tec. san. lab.
biom.
Tec. san. lab.
biom.
Oper. tec.
cat. C
Indet.
Indet.
Indet.
8. Bresciani Daniela
9. Tirelli Annamaria
10. Marella Loredana
11. Barbeno Claudio
D
Breve descrizione
dell’attività svolta 2012
Ricerca, Diagn.,
Gestione
Ricerca, Diagn. Gestione
piani
Epidemiol. Anal. gest.
piani
Epidemiol. Anal. gest.
piani
Prod. sieri e sper.
animale
Ricerca, Diagn.
Ricerca, Diagn.
Ricerca, Diagn.
Diagn. sierol. coll. Ric. e
Svil.
Diagn. virol. coll. guid.
Ricerca e svil.
E
Costo medio
annuo
F
% di
utilizzo
ExF
Costo finale
160.000,00
6%
9.600,00
140.000,00
10%
14.000,00
100.000,00
6%
6.000,00
100.000,00
6%
6.000,00
160.000,00
6%
9.600,00
70.000,00
70.000,00
100.000,00
5%
5%
5%
3.500,00
3.500,00
5.000,00
40.000,00
5%
2.000,00
40.000,00
5%
Indet.
Elab. progr. controllo
40.000,00
8%
3.200,00
Indet.
Prelievo sangue e camp.
in allev.
30.000,00
10%
3.000,00
Indet.
Indet.
2.000,00
Totale spese personale: €67.400
2. Apparecchiature, tecnologie, arredi che si prevede di acquistare
Apparecchiature, tecnologie, arredi adibiti solo ed esclusivamente al servizio del Centro e quelli condivisi
con altri laboratori.
Totale spese apparecchiature, tecnologie, arredi: € 0
3. Altri costi previsti per le attività
Per la realizzazione delle iniziative volte al conseguimento degli obiettivi del programma operativo 20112012, il Centro prevede di sostenere i seguenti costi:
Voci di costo
Formazione e missione
Materiali di consumo
Smaltimento rifiuti
Prove sperimentali
Costo
6000,00
25000,00
5000,00
10000,00
Ente finanziatore (se diverso dall’IZS di appartenenza)
Totale altre voci di costo: € 46.000,00
4. Spese generali
Sono comprese diverse voci di spesa dell’Intero Istituto le cui tipologie principali sono: costi relativi a
personale amministrativo, consulenti, direzione generale sanitaria ed amministrativa, collegio sindacale,
consiglio amministrazione, concorsi, spese legali, utenze varie, manutenzioni generiche :
Totale altre spese generali: € 10% dei precedenti (67.400 + 0 +46.000) = € 11.340
Previsione totale costi anno 2013
(1 + 2. + 3. + 4.)
67.400 + 0 + 46.000 + 11.340
Totale € 124.740
Brescia 29 novembre 2012
Il responsabile
Dr. Paolo Cordioli
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