Mutanti Lac- di E. coli
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Regolazione dell’espressione genica nei batteri e nei batteriofagi Prof. Renato Fani Lab. di Evoluzione Microbica e Molecolare Dip.to di Biologia Evoluzionistica,Via Romana 17-19, Università di Firenze, 50125 Firenze Tel 055 2288244 Email [email protected] Website: www.unifi.it/dblemm Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Domande 17 1. Non tutti i geni funzionano simultaneamente, e molti devono rispondere (attivandosi o disattivandosi) a variazioni ambientali: come viene regolata l’espressione genica nei procarioti? 2. Come interagiscono fra loro siti del DNA e proteine regolatrici? 3. Succede tutto alla trascrizione, o possono contare anche meccanismi legati alla traduzione? Alcuni meccanismi sono molto semplici: fago λ replicazione, ricombinazione testa, coda integrazione Geni che si esprimono insieme occupano posizioni adiacenti sul cromosoma Altri meccanismi sono più complessi: geni inducibili Figura 17.1 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene X Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene X mutazione Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene X mutazione X X Nessuna trascrizione Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene Y Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene Y mutazione Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene Y mutazione X X Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Gene Y mutazione X X mRNA Trascrizione Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo Utilizzo del lattosio in E. coli Figura 17.2 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A MM + glucosio tempo Attività Beta-galattosidasi MM + glucosio tempo Attività Beta-galattosidasi Attività Beta-galattosidasi MM + glucosio MM + lattosio tempo Attività Beta-galattosidasi MM + glucosio MM + lattosio tempo Attività Beta-galattosidasi glucosio MM + glucosio MM + lattosio tempo Attività Beta-galattosidasi glucosio MM + glucosio MM + lattosio MM + glucosio tempo Quindi: a) In un terreno MM + glucosio si ha bassa (basale) attività dei tre enzimi b) In un terreno MM + lattosio si ha alta attività dei tre enzimi c) In un terreno MM + glucosio + lattosio si ha bassa (basale) attività dei tre enzimi 1) I tre enzimi sono INDUCIBILI (?) perché? - come? 2) I geni che controllano la sintesi dei tre enzimi sono co-regolati perché? - come? 3) La presenza del glucosio abbassa l’attività dei tre enzimi (?) perché? - come? (?) Variabilità fenotipica in ceppi di E. coli: enzimi sintetizzati Glucosio : enzimi Lac NO Lattosio E glucosio: enzimi Lac NO Solo Lattosio: enzimi Lac SI sintesi regolabile degli enzimi Lac: Fenotipo Lac+ Glucosio : enzimi Lac SI Lattosio E glucosio: enzimi Lac SI Solo lattosio: enzimi Lac SI sintesi costitutiva degli enzimi Lac: Fenotipo Lacc L’esistenza di mutanti Costitutivi implica un controllo di tipo NEGATIVO l’esistenza di un REPRESSORE che reprime….. Che cosa? Glucosio : enzimi Lac SI Lattosio E glucosio: enzimi Lac SI Solo lattosio: enzimi Lac SI sintesi costitutiva degli enzimi Lac: Fenotipo Lacc Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO mutazione Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO mutazione Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO ? Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Scenario 1 Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Repressore funzionale ? Scenario 1 Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Repressore funzionale ? Scenario 2 Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Repressore funzionale Scenario 2 Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac Mutazioni che davano un fenotipo Lacc mappavano in due punti diversi, ma molto vicini del cromosoma lacI lacO Repressore funzionale Scenario 2 Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Variabilità fenotipica in ceppi di E. coli: enzimi sintetizzati Glucosio : enzimi Lac NO Lattosio E glucosio: enzimi Lac NO Solo Lattosio: enzimi Lac SI sintesi regolabile degli enzimi Lac: Fenotipo Lac+ Glucosio : enzimi Lac NO Lattosio E glucosio: enzimi Lac NO Solo Lattosio: enzimi Lac NO deficit della sintesi degli enzimi Lac: Fenotipo Lac- Glucosio : Lattosio E glucosio: Solo lattosio: enzimi Lac SI enzimi Lac SI enzimi Lac SI sintesi costitutiva degli enzimi Lac: Fenotipo Lacc Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Alcuni mutanti - Permeasi + b-galatosside transacetilasi + Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Permeasi b-galatosside transacetilasi Alcuni mutanti - + + Altri mutanti + - + Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Permeasi b-galatosside transacetilasi Alcuni mutanti - + + Altri mutanti + - + Altri mutanti ancora + + - Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Alcuni mutanti - Permeasi + b-galatosside transacetilasi + Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ b-Galattosidasi Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ b-Galattosidasi Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Alcuni mutanti Altri mutanti - Permeasi + + b-galatosside transacetilasi + - + Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ b-Galattosidasi lacY Permeasi Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Mutanti Lac- di E. coli: enzimi sintetizzati b-galatossidasi Permeasi b-galatosside transacetilasi Alcuni mutanti - + + Altri mutanti + - + Altri mutanti ancora + + - Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ b-Galattosidasi lacY Permeasi Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A lacA b-Galattoside transacetilasi Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ b-Galattosidasi lacY Permeasi lacA b-Galattoside transacetilasi Il modello è in accordo con i risultati ? Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ lacY lacA mutazione b-Galattosidasi Permeasi b-Galattoside transacetilasi Il modello è in accordo con i risultati ? Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ lacY lacA mutazione b-Galattosidasi Permeasi b-Galattoside transacetilasi Il modello è in accordo con i risultati ? Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Organizzazione dei geni lac lacI lacO lacZ lacY lacA mutazione b-Galattosidasi Permeasi b-Galattoside transacetilasi Il modello è in accordo con i risultati ? Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Nei ceppi selvatici, quando nel terreno è presente solo lattosio vengono sintetizzati: 1. β-galattosidasi: scinde lattosio in glucosio + galattosio 2. permeasi 3. β-galattoside transacetilasi I tre geni producono inizialmente un unico messaggero Figura 17.3 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Modello dell’operon: (Monod e Jacob) Organizzazione dell’operon per il lattosio Figura 17.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Funzionamento dell’operon per il lattosio in assenza di lattosio Figura 17.5 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Modello molecolare del repressore Lac Figura 17.6 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Modello molecolare del repressore Lac Funzionamento dell’operon per il lattosio in presenza di lattosio Figura 17.7 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Controllo negativo della trascrizione 1. Un repressore controlla negativamente la trascrizione (cioè la disabilita) 2. I geni strutturali Z, Y ed A possono trascrivere solo se viene rimossa l’inibizione rappresentata dal repressore Traduzione all’operon del lattosio: 1 Traduzione all’operon del lattosio: 2 Mutazioni polari Mutazione in Z: galattosidasi alterata, né permeasi né transacetilasi Mutazione in Y: permeasi alterata, manca la transacetilasi Mutazione in A: transacetilasi alterata Diploidia parziale nello studio dell’operon A B G F E D E D C Diploidia parziale nello studio dell’operon a+ Sintesi regolabile a- Sintesi costitutiva 1. Una mutazione costitutiva che mappa a monte di p: I Sintesi regolabile Dipende dalla mancanza di una proteina, che è presente nell’eterozigote I - è la mutazione di un gene regolatore 2. Una mutazione costitutiva che mappa a valle di p: o C Sintesi costitutiva Se dipendesse dalla mancanza di una proteina l’eterozigote ce l’avrebbe, e avrebbe fenotipo a+ oC è la mutazione di un sito regolatore del DNA o è un sito del DNA Figura 17.8 (a) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A o è un sito del DNA Figura 17.8 (b) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A I è un gene che codifica per una proteina Figura 17.9 (a)(b) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A I è un gene che codifica per una proteina Figura 17.9 (c) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Superrepressione Nei mutanti IS non si esprimono i geni per il lattosio, né in presenza né in assenza di lattosio Figura 17.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Un passo indietro Lattosio, glucosio: Glu, non Lac Lattosio, non glucosio: Lac sintesi regolabile degli enzimi per Lac: Lac+ Il controllo negativo spiega perché i geni per il lattosio non sono espressi in assenza di lattosio Ma perché non sono espressi quando sono presenti sia lattosio che glucosio? Controllo positivo: Repressione da catabolita Repressione da catabolita In presenza di glucosio, sono bassi i livelli cellulari di cAMP Figura 17.11 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Inattivata in presenza di glucosio nella cellula cAMP tanto poco glucosio poco Figura 17.12 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A tanto Riassumendo, in ceppi selvatici 1. Glucosio, non lattosio repressore attivo, cAMP basso, poco cAMP-CAP al sito CAP Nessuna trascrizione all’operon lac 2. Glucosio, lattosio repressore inattivo, cAMP basso, poco cAMP-CAP al sito CAP, Bassi livelli di trascrizione all’operon lac 3. Non glucosio, lattosio repressore inattivo, cAMP alto, molto cAMP-CAP al sito CAP, Alti livelli di trascrizione all’operon lac Sequenza del promotore del gene lacI+ Qui GUG = Met, non Val ! Sequenza di Shine-Dalgarno, 9-12 basi a monte dell’AUG. La traduzione comincia da qui. Figura 17.13 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Regioni regolatrici dell’operon lac Figura 17.14 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Biosintesi degli amminoacidi in E. coli Quando un amminoacido non è presente sul terreno, E. coli attiva i geni per la sua biosintesi; quando è presente sul terreno, E. coli disattiva i geni per la sua biosintesi L’operon per il triptofano in E. coli Due forme di regolazione: 1. Negativa (con repressore) • L’operon è composto da 5 geni strutturali •TrpR è prodotta da un gene distante dall’operon •Da sola non è in grado di legarsi al sito o (aporepressore) •Quando è legata a molecole di trp, si lega al sito o e inibisce la trascrizione (ne riduce i livelli di 70 volte) L’operon per il triptofano in E. coli Due forme di regolazione: 2. Per attenuazione L’assenza di membrana nucleare permette che la traduzione cominci a trascrizione in corso. Questo permette, a sua volta, di regolare la trascrizione in funzione della posizione del ribosoma sul DNA È fondamentale il ruolo di un sito attenuatore, nella regione leader del messaggero L’operon per il triptofano in E. coli Figura 17.15 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Il messaggero può assumere tre conformazioni diverse a seconda della concentrazione di triptofano. Il cambio di conformazione agisce sui livelli di trascrizione Figura 17.16 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Quando il ribosoma si ferma ai codoni UGG la trascrizione continua ai 5 loci strutturali Figura 17.17 (a) trp-tRNA scarichi: blocco della traduzione, la trascrizione continua Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Attenuazione: quando il ribosoma non si ferma ai codoni UGG si interrompe la trascrizione a monte dei loci strutturali Figura 17.17 (b) trp-tRNA carichi: prosegue la traduzione, la trascrizione si interrompe Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Riassumendo Triptofano abbondante. L’aporepressore si lega al trp e così attivato va a occupare il sito o, inibendo la trascrizione Triptofano assente. L’aporepressore non si lega al trp, il sito o è libero e la trascrizione comincia. La traduzione si arresta ai due codoni UGG. Si appaiano le regioni 2 e 3 del trascritto e perciò la RNA P può continuare la trascrizione Basse concentrazioni di Triptofano. L’aporepressore non si lega al trp, il sito o è libero e la trascrizione comincia. La traduzione prosegue oltre i due codoni UGG. Si appaiano le regioni 3 e 4 del trascritto e perciò la RNA P si stacca e si interrompe la trascrizione Riassumendo 1. Niente trp Bassa affinità dell’aporepressore per o, trp-tRNA scarichi Alti livelli di trascrizione all’operon trp 2. Poco trp Bassa affinità dell’aporepressore per o, trp-tRNA carichi Bassi livelli di trascrizione all’operon trp 3. Tanto trp Alta affinità del repressore per o (trp-tRNA carichi, ma non conta) Nessuna trascrizione all’operon trp Attenuazione: nella regione leader degli operoni per la biosintesi di diversi amminoacidi sono presenti in più copie i codoni per lo stesso amminoacido. Figura 17.19 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A fago λ (cromosoma lineare che si circolarizza all’interno della cellula batterica ospite) I geni che si esprimono insieme sono localizzati in regioni contigue Figura 17.21 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A La trascrizione comincia sempre dai promotori precoci PL e PR Figura 17.22 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A La scelta fra ciclo litico e lisogenico dipende dai livelli relativi di cII (che attiva PRE e la conseguente sintesi di integrasi) e Cro (che, tramite Q, stimola la sintesi ai geni tardivi) Figura 17.22 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Sintesi 17 •Geni funzionalmente collegati sono spesso localizzati in regioni contigue del cromosoma •Nei casi più semplici (fago λ) questa contiguità è sufficiente a determinare una regolazione genica •In altri casi (lac, trp, in E. coli) delle proteine (repressori) inibiscono o attenuano la trascrizione: controllo negativo •Il controllo negativo della trascrizione può avvenire anche grazie a meccanismi legati alla traduzione (trp, in E. coli) •In molti casi (lac, in E. coli) esistono anche controlli positivi che stimolano la trascrizione
