Diapositiva 1 - W W W . T E L E S A . ORG

Identificazione e studio delle Cellule
Staminali Tumorali del carcinoma della
mammella e dell’adenocarcinoma del colon
Carmelo Lupo
Coordinatore Tecnico
U.O. Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica
Casa di Cura di Alta Specialità La Maddalena
Palermo
AITIC
Riccione 19-22 maggio 2009
Centro
OncoBiolgia
Sperimentale
Referenze
Incontri ravvicinati….
Staminali Tumorali
Modello di crescita delle staminali tumorali
MODELLO GERARCHICO
Cellule Staminali Tumorali
Sono state identificate in tumori solidi e del sangue
�Hanno proprietà simili alle normali staminali ma
sono in grado di dare origine a cellule che presentano
una resistenza maggiore ai farmaci
�Hanno la capacità di auto-rigenerarsi
Stem cells in breast cancer are CD44+, CD24-/low,
ESA+.
Nel carcinoma della mammella la percentuale delle
staminali tumorali è del 10-20%
“Cancer stem cells drive metastasis”
Nature
Breast Cancer Stem Cells are Metastatic
Progetto Staminali Tumorali
APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE
Staminali tumorali come comune denominatore
Prelievo di frammento di carcinoma della mammella in
sala operatoria
TAGLIO SPECULARE
Frammento A:
un frammento del
tumore per
la diagnosi
istologica
e fattori
prognostici
Frammento B:
il frammento
speculare
destinato alle
colture cellulari
Frammento B:
Campione chirurgico prelevato e posto in
PBS; entro 15’ nel Laboratorio di Colture
cellulari (criticità per mRNA)
Dissociazione del tessuto
 Dissociazione del tessuto tramite enzimi (es: Collagenasi )
 Successivamente Tripsina e DNAsi
 Separazione per centrifugazione della quota cellulare
dall’estratto e successivi lavaggi
Cellule in coltura
Le cellule isolate vengono poste in coltura con siero al 20% ed
antibiotici in una fiasca da 25 cm2
(terreno di coltura DMEM + Glutamina o RPMI)
Crescita (nelle cellule tumorali manca
l’inibizione da contatto)
7g
Numero
di cellule
4g
tempo
La crescita cellulare ha un andamento gompertziano
Prima settimana: stato di confluenza, attese 2 milioni di
cellule alla conta (popolazione eterogenea)




Distacco mediante EDTA o Tripsina
Conta
Risemina in due fiasche da 75 cm2 ed una da 175 cm2
Attesa di circa un’altra settimana
Sorting
 Popolazione cellulare eterogenea (staminali tumorali, tumorali
adulte)
 Necessario fare un “SORTING” (citofluorimetro; sistema sfere
magnetiche)
CITOFLUORIMETRIA
ANTIGENI CELLULE TUMORALI STAMINALI DELLA
MAMMELLA
 CD44+
 CD24-/low
 ESA+(antigene superficiale epiteliale)
Cellule staminali tumorali del carcinoma della mammella
 Dopo circa un mese avremo le nostre staminali
tumorali del tumore della mammella.
 Lo scopo dello studio è finalizzato
all’identificazione di un fenotipo e di un genotipo
 Proiettare la tecnica per isolare le staminali del
tumore del colon.
Abbiamo “sacrificato” alcune cellule in
coltura per…
 allestire citologici su strato sottile ThinPrep ed
effettuare reazioni immunoistochimiche con:
 CK
 CD44
 CD133
Abbiamo osservato:
Popolazione eterogenea
CK+
CK+
CK+ positività apicale
Negatività
Perché cellule epiteliali di mammella sono
negative per CK?
Marcatore di staminalità
CD44
CD44+
CD44+
CD44+
CD44+
CD133 expression is an independent prognostic
marker for low survival in colorectal cancer
Horst D, Kriegl L, Engel J, Kirchner T, Jung A.
Pathologisches Institut der Ludwig-Maximilians-Universität München
BJC 2008 Oct 21;99(8):1285-9. Epub 2008 Sep 9
COLON:
CD133
CD133
Microdissettore laser




Estrazione DNA
Estrazione RNA
Sequenziamento per mutazioni note e non note
Mappe Proteomiche
Studio delle staminali tumorali in Anatomia Patologica e
comparazione con il dato istologico:
Tecniche immunoistochimiche
PTEN;
CD133; CD44; CD24, ESA;
Tecnica FISH
Determinazione dello status dei geni
FENOTIPO
Approccio proteomico
 Mappa proteomica (comparare profili proteomici
con cellule tumorali adulte sfruttando proteine già
note)
Sequenziamento DNA
Analisi mutazionale di segmenti di DNA delle staminali
per identificare le mutazioni genetiche coinvolte:
 Sequenziamento K-RAS, B-RAF,
 Microarray
Elettroferogramma K-RAS
Mappa proteomica
Immunoistochimica
DATA-MATCHING
Follow-up
FISH
Microarray
Abbiamo il potenziale giusto
Perché farlo?
 Potremmo avere il fenotipo delle cellule staminali
tumorali che, comparata con mappe già note di cellule
tumorali adulte, potrebbe evidenziare ulteriori proteine
presenti solo nelle staminali tumorali.
 Identificare proteine ignote o comunque specifiche per le
staminali tumorali potrebbe portare alla creazione di
anticorpi/farmaci specifici e selettivi.
 Identificare il genotipo delle staminali tumorali potrebbe
aiutarci a capire il pathway degli errori/mutazioni
genetici (amplificazioni, delezioni, traslocazioni)
coinvolti.
Cancer stem cell
TARGET THERAPY
Prospettive future
Radiology
Radiotherapy
Oncology
Nuclear
medicine
Grazie per l’attenzione