ISTOLOGIA
e
CITOLOGIA
F.Pagano
• Organismo
• Apparato
•
Organo
•
Tessuto
• Cellula
• Molecola
• Atomo
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Definizioni
• Citologia
Studio della struttura della
cellula
e delle sue parti
• Istologia
Studio dei tessuti
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La sostanza vivente
Proprietà della sostanza vivente: riproduzione,
assimilazione, respirazione, accrescimento, sintesi, reattività
agli stimoli, movimento.
La sostanza vivente esiste a diversi livelli di organizzazione:
VIRUS
BATTERIOFAGI
Cellule PROCARIOTE
Cellule EUCARIOTE
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Esempi di
diversità
morfologica
tra i tipi
cellulari che
compongono
un essere
umano
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Ruoli della membrana plasmatica
• Mantiene l’integrità strutturale della cellula
• Controlla le sostanze che penetrano ed
escono dalla cellula
• Regola i rapporti cellula-cellula
• Riconosce mediante recettori antigeni, ormoni
ed altri ligandi e permette una risposta
cellulare a tali segnali che provengono
dall’esterno
• I lipidi di membrana sono i precursori di altre
molecole lipidiche importanti per la fisiologia
cellulare (ormoni steroidei, secondi
messaggeri quali il diacil glicerolo, l’acido
fosfatidico, l’inositolo trifosfato…..)
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Modello a mosaico fluido della
membrana cellulare
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Trasporto passivo
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Trasporto
attivo:
la pompa
sodiopotassio
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Trasporto
attivo
secondario
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Endocitosi
ed
esocitosi
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Il reticolo endoplasmatico
Reticolo endoplasmatico
Reticolo
ruvido (RER):
endoplasmatico liscio
(REL):
• sintesi proteine (sulla
• sintesi steroidi
trigliceridi e
•
colesterolo
• detossificazione di
materiali tossici quali •
alcool e barbiturici
• immagazzinamento
di ioni calcio
•
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superficie)
modificazioni
posttraduzionali delle
proteine
trasporto delle proteine
in vescicole alla
membrana plasmatica
sintesi di fosfolipidilipidi
e proteine integrali di
membrana
Sintesi proteica sul reticolo
endoplasmatico ruvido
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Il
mitocondrio :
la centrale
energetica
della cellula
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Microfotografia elettronica di
mitocondrio
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Il citoscheletro
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I microfilamenti di actina
• Fibrille contrattili
(actina associata
alla miosina)
• Reti gelificate
(actina associata
alla filamina)
• Fasci paralleli
(actina associata
alla fimbrina o alla
villina)
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Principali tipi di filamenti intermedi
• Cheratine (cellule
epiteliali)
• Desmina (cellule muscolari)
• Vimentina cellule di origine
mesenchimale)
• proteine dei
neurofilamenti (neuroni)
• lamina nucleare
(rivestimento interno della
membrana nucleare di
tutte le cellule)
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I microtubuli
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- Conferiscono rigidità e forma
alla cellula
- regolano il movimento di
organelli e vescicole tramite
motori molecolari (dineine
e chinesine)
- costituiscono labase molecolare
di ciglia e flagelli
- sono necessari durante la mitosi
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Eucromatina ed
Eterocromatina
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Nucleo
• Duplicazione del DNA
• Sintesi di RNA (mRNA, tRNA, rRNA)
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Sintesi di
mRNA e rRNA
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La cromatina
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Quali sono gli strumenti a
disposizione dell’istologo per lo
studio della cellula e dei tessuti?
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Questione di dimensioni…
1 mm
Occhio umano
100 µm
10 µm
cell. epiteliali
globuli rossi
batteri
1 µm
Microscopio ottico
100 nm
Microscopio elettronico
a scansione
Microscopio elettronico
a trasmissione
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virus
10 nm
proteine
1 nm
aminoacidi
1Å
atomi
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Questione di dimensioni…
1 mm
Occhio umano
100 µm
10 µm
cell. epiteliali
globuli rossi
batteri
1 µm
Microscopio ottico
100 nm
Microscopio elettronico
a scansione
Microscopio elettronico
a trasmissione
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virus
10 nm
proteine
1 nm
aminoacidi
1Å
atomi
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Ciò si ottiene aumentando
invece il potere di
risoluzione
Si definisce potere di risoluzione la distanza
minima che deve esserci tra due oggetti per
essere visti come distinti
Occhio: 0,1 mm
Microscopio ottico: 0,25 micron
Microscopio elettronico:0,5 nanometri
il potere risolutivo
di uno strumento
(e non l’ingrandimento)
determina il massimo livello di dettaglio
che si può ottenere nell’immagine
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come si ottiene, a partire da
tessuti biologici, una sezione da
osservare al microscopio?
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La preparazione di materiale istologico
• la luce del microscopio può
attraversare solo materiale di
spessore molto ridotto
• il tessuto deve essere sezionato
mediante speciali apparecchiature,
dette microtomi
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La preparazione di materiale istologico
• la maggioranza dei tessuti biologici
sono molli
• prima del taglio, il tessuto deve
essere indurito
– Fissazione (es. con aldeidi)
– Inclusione
– In alternativa: congelamento
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La preparazione di materiale istologico
• prima dell’osservazione al microscopio,
il tessuto deve essere colorato
• coloranti con affinità per componenti
cellulari e tissutali diverse possono
essere combinati nella stessa sezione
istologica
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sequenza dei passaggi in una
tipica procedura istologica
1. fissazione di un campione di tessuto in
formaldeide
2. Ovvero congelamento
3. inclusione del pezzo
4. taglio al microtomo
5. “immersione” in soluzioni di coloranti
6. montaggio su vetrino
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Comuni colorazioni istologiche e reazioni
REAGENTE
RISULTATO
Ematossilina
Blu: nucleo, regioni acide del citoplasma,
matrice cartilaginea
Rosa: regioni basiche del citoplasma, fibre
collagene
Blu scuro nucleo; Rosso: muscoli,
cheratine, citoplasma
Blu chiaro: mucinogeno, collagene
Marrone: fibre elastiche
Blu: le fibre elastiche
Nero: fibre reticolari
Nero: striature muscolari, nucleo,
eritrociti
Magenta: glicogeno e molecole ricche di
carboidrati
Utilizzate per la colorazione differenziale
delle cellule del sangue
Rosa: eritrociti, granuli eosinofili
Porpora: nuclei dei leucociti, granuli
basofili
Blu: citoplasma dei monociti e dei linfociti
Eosina
Colorazione tricromica di Masson
Orceina per le fibre elastiche
Weigert per le fibre elastiche
Argento
Ematossilina ferrica
Acido periodico-Schiff
Colorazioni di Giemsa e Wright
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tessuto epiteliale al microscopio ottico
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cute
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Attenzione alla sezione...
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lo striscio
di sangue
Lo “striscio”, una delle
tecniche istologiche
più diffuse, consente lo
studio microscopico
delle cellule del sangue
e si distingue dal
protocollo “generico”
appena delineato
perché, ovviamente,
non richiede il taglio
del tessuto.
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striscio
striscio
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Citochimica e Istochimica
• L’identificazione e/o la misura quantitativa
mediante reazioni di colorazione specifiche (o
mediante metodi fisici) di costituenti chimici
delle cellule e dei tessuti. (es. Acido periodico
di Schiff, falloidina)
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Altri
microscopi
• A contrasto di fase
• Ad interferenza
• In campo oscuro
• A luce polarizzata
• A fluorescenza
• Confocale
• Elettronico
– a trasmissione
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– a scansione
Microscopio a contrasto di fase
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Microscopio a contrasto di fase
Le cellule (sopra) sono quasi
invisibili in campo chiaro, ma
possono essere osservate
chiaramente in contrasto di
fase (sotto).
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Microscopia in campo oscuro
Strutture finissime non possono spesso essere viste se si
trovano contro un fondo chiaro. Questa situazione cambia se le
strutture vengono illuminate obliquamente di lato ed osservate
contro un fondo possibilmente scuro.
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Microscopia a luce polarizzata
Immagini di
capelli umani in
luce normale
(sinistra) e in luce
polarizzata
(destra).
microscopio ottico composto utilizzabile per preparati il cui indice
di rifrazione dipende dall’orientamento della luce. Il campione
viene illuminato con luce polarizzata; alcune zone del campione
appariranno scure, altre colorate.
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Microscopia a fluorescenza
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Microscopia a fluorescenza
Nella microscopia in fluorescenza i preparati vengono
trattati con reagenti speciali, le cui singole molecole sono in
grado di assorbire la luce per un tempo eccezionalmente
breve - generalmente miliardesimi di secondo - e di
emetterla poi nuovamente
Le molecole fluorescenti possono
assorbire solamente la luce di una
certa lunghezza d'onda.
Esempio di fluorescenza semplice:
La marcatura rende visibili i nuclei
cellulari ed in particolare i cromosomi
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Immunofluorescenza e
immunoistochimica
• Metodi altamente sensibili per la
localizzazione di proteine o polisaccaridi
nei tessuti
• IF: anticorpi coniugati con sostanze
fluorescenti
• IIC: anticorpi coniugati con enzima
perossidasi (rivelato poi da una
reazione istochimica)
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Metodo immunoistochimico
diretto ed indiretto
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Esempio di
immunoistochimica
diretta
un gruppo di neuroni è decorato con
anticorpi fluorescenti che riconoscono il
recettore dell’insulina
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Immunofluorescenza indiretta
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Microscopia Confocale
Il microscopio confocale a scansione laser ha la
possibilità
di produrre sezioni ottiche anche dello spessore di
0.5 nm e di acquisirle direttamente per fare una
ricostruzione 3D del preparato osservato. I dati
acquisiti possono poi essere
analizzati per determinare il volume, l'area e la
morfologia del preparato o per osservarne la
struttura da ogni punto dello spazio.
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Microscopia Confocale
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Microscopia Confocale
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Microscopia Confocale
Glomerulo
olfattivo
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filamento
(catodo)
il microscopio
elettronico a
trasmissione
anodo
condensatore
preparato
obiettivo
proiettore
schermo
fluorescente
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B
Microscopia elettronica
• Preparazione del tessuto
–
–
–
–
Fissazione in glutaraldeide
Postfissazione in tetrossido di osmio
Disidratazione con alcool
Inclusione in plastiche acriliche o resine
epossidiche
• Taglio all’ultramicrotomo
– Sezioni di 20-40 nm
• Aumento del contrasto
– Coloranti elettronici come acetato di
uranile o citrato di piombo
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Esempio di
microscopia
elettronica a
trasmissione
Le immagini di
microscopia elettronica
sono “in bianco e nero”.
Le parti “scure” si
dicono elettrondense.
L’altissimo potere
risolutivo del ME
consente di distinguere
numerose componenti
subcellulari.
linfocito
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Microfotografia elettronica di
RER
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Microfotografia elettronica di
Golgi + vescicole
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Citochimica e
congelamentofrattura
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Microscopio elettronico
a scansione
• Risoluzione piu’ bassa rispetto
alla ME a trasmissione
• Consente di valutare il rilievo
degli oggetti
• Usata per lo studio delle
superfici cellulari
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Macrofago in microscopia
elettronica a scansione
capello
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