ISTOLOGIA e CITOLOGIA - W W W . T E L E S A . ORG
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ISTOLOGIA e CITOLOGIA F.Pagano • Organismo • Apparato • Organo • Tessuto • Cellula • Molecola • Atomo F.Pagano Definizioni • Citologia Studio della struttura della cellula e delle sue parti • Istologia Studio dei tessuti F.Pagano La sostanza vivente Proprietà della sostanza vivente: riproduzione, assimilazione, respirazione, accrescimento, sintesi, reattività agli stimoli, movimento. La sostanza vivente esiste a diversi livelli di organizzazione: VIRUS BATTERIOFAGI Cellule PROCARIOTE Cellule EUCARIOTE F.Pagano Esempi di diversità morfologica tra i tipi cellulari che compongono un essere umano F.Pagano F.Pagano Ruoli della membrana plasmatica • Mantiene l’integrità strutturale della cellula • Controlla le sostanze che penetrano ed escono dalla cellula • Regola i rapporti cellula-cellula • Riconosce mediante recettori antigeni, ormoni ed altri ligandi e permette una risposta cellulare a tali segnali che provengono dall’esterno • I lipidi di membrana sono i precursori di altre molecole lipidiche importanti per la fisiologia cellulare (ormoni steroidei, secondi messaggeri quali il diacil glicerolo, l’acido fosfatidico, l’inositolo trifosfato…..) F.Pagano Modello a mosaico fluido della membrana cellulare F.Pagano Trasporto passivo F.Pagano Trasporto attivo: la pompa sodiopotassio F.Pagano Trasporto attivo secondario F.Pagano Endocitosi ed esocitosi F.Pagano Il reticolo endoplasmatico Reticolo endoplasmatico Reticolo ruvido (RER): endoplasmatico liscio (REL): • sintesi proteine (sulla • sintesi steroidi trigliceridi e • colesterolo • detossificazione di materiali tossici quali • alcool e barbiturici • immagazzinamento di ioni calcio • F.Pagano superficie) modificazioni posttraduzionali delle proteine trasporto delle proteine in vescicole alla membrana plasmatica sintesi di fosfolipidilipidi e proteine integrali di membrana Sintesi proteica sul reticolo endoplasmatico ruvido F.Pagano F.Pagano F.Pagano Il mitocondrio : la centrale energetica della cellula F.Pagano Microfotografia elettronica di mitocondrio F.Pagano Il citoscheletro F.Pagano I microfilamenti di actina • Fibrille contrattili (actina associata alla miosina) • Reti gelificate (actina associata alla filamina) • Fasci paralleli (actina associata alla fimbrina o alla villina) F.Pagano Principali tipi di filamenti intermedi • Cheratine (cellule epiteliali) • Desmina (cellule muscolari) • Vimentina cellule di origine mesenchimale) • proteine dei neurofilamenti (neuroni) • lamina nucleare (rivestimento interno della membrana nucleare di tutte le cellule) F.Pagano I microtubuli F.Pagano - Conferiscono rigidità e forma alla cellula - regolano il movimento di organelli e vescicole tramite motori molecolari (dineine e chinesine) - costituiscono labase molecolare di ciglia e flagelli - sono necessari durante la mitosi F.Pagano Eucromatina ed Eterocromatina F.Pagano Nucleo • Duplicazione del DNA • Sintesi di RNA (mRNA, tRNA, rRNA) F.Pagano F.Pagano Sintesi di mRNA e rRNA F.Pagano La cromatina F.Pagano Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti? F.Pagano Questione di dimensioni… 1 mm Occhio umano 100 µm 10 µm cell. epiteliali globuli rossi batteri 1 µm Microscopio ottico 100 nm Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione F.Pagano virus 10 nm proteine 1 nm aminoacidi 1Å atomi F.Pagano Questione di dimensioni… 1 mm Occhio umano 100 µm 10 µm cell. epiteliali globuli rossi batteri 1 µm Microscopio ottico 100 nm Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione F.Pagano virus 10 nm proteine 1 nm aminoacidi 1Å atomi F.Pagano F.Pagano Ciò si ottiene aumentando invece il potere di risoluzione Si definisce potere di risoluzione la distanza minima che deve esserci tra due oggetti per essere visti come distinti Occhio: 0,1 mm Microscopio ottico: 0,25 micron Microscopio elettronico:0,5 nanometri il potere risolutivo di uno strumento (e non l’ingrandimento) determina il massimo livello di dettaglio che si può ottenere nell’immagine F.Pagano F.Pagano come si ottiene, a partire da tessuti biologici, una sezione da osservare al microscopio? F.Pagano La preparazione di materiale istologico • la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto • il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchiature, dette microtomi F.Pagano La preparazione di materiale istologico • la maggioranza dei tessuti biologici sono molli • prima del taglio, il tessuto deve essere indurito – Fissazione (es. con aldeidi) – Inclusione – In alternativa: congelamento F.Pagano La preparazione di materiale istologico • prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato • coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica F.Pagano sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica 1. fissazione di un campione di tessuto in formaldeide 2. Ovvero congelamento 3. inclusione del pezzo 4. taglio al microtomo 5. “immersione” in soluzioni di coloranti 6. montaggio su vetrino F.Pagano Comuni colorazioni istologiche e reazioni REAGENTE RISULTATO Ematossilina Blu: nucleo, regioni acide del citoplasma, matrice cartilaginea Rosa: regioni basiche del citoplasma, fibre collagene Blu scuro nucleo; Rosso: muscoli, cheratine, citoplasma Blu chiaro: mucinogeno, collagene Marrone: fibre elastiche Blu: le fibre elastiche Nero: fibre reticolari Nero: striature muscolari, nucleo, eritrociti Magenta: glicogeno e molecole ricche di carboidrati Utilizzate per la colorazione differenziale delle cellule del sangue Rosa: eritrociti, granuli eosinofili Porpora: nuclei dei leucociti, granuli basofili Blu: citoplasma dei monociti e dei linfociti Eosina Colorazione tricromica di Masson Orceina per le fibre elastiche Weigert per le fibre elastiche Argento Ematossilina ferrica Acido periodico-Schiff Colorazioni di Giemsa e Wright F.Pagano tessuto epiteliale al microscopio ottico F.Pagano cute F.Pagano Attenzione alla sezione... F.Pagano lo striscio di sangue Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto. F.Pagano striscio striscio F.Pagano Citochimica e Istochimica • L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti. (es. Acido periodico di Schiff, falloidina) F.Pagano Altri microscopi • A contrasto di fase • Ad interferenza • In campo oscuro • A luce polarizzata • A fluorescenza • Confocale • Elettronico – a trasmissione F.Pagano – a scansione Microscopio a contrasto di fase F.Pagano Microscopio a contrasto di fase Le cellule (sopra) sono quasi invisibili in campo chiaro, ma possono essere osservate chiaramente in contrasto di fase (sotto). F.Pagano Microscopia in campo oscuro Strutture finissime non possono spesso essere viste se si trovano contro un fondo chiaro. Questa situazione cambia se le strutture vengono illuminate obliquamente di lato ed osservate contro un fondo possibilmente scuro. F.Pagano Microscopia a luce polarizzata Immagini di capelli umani in luce normale (sinistra) e in luce polarizzata (destra). microscopio ottico composto utilizzabile per preparati il cui indice di rifrazione dipende dall’orientamento della luce. Il campione viene illuminato con luce polarizzata; alcune zone del campione appariranno scure, altre colorate. F.Pagano Microscopia a fluorescenza F.Pagano Microscopia a fluorescenza Nella microscopia in fluorescenza i preparati vengono trattati con reagenti speciali, le cui singole molecole sono in grado di assorbire la luce per un tempo eccezionalmente breve - generalmente miliardesimi di secondo - e di emetterla poi nuovamente Le molecole fluorescenti possono assorbire solamente la luce di una certa lunghezza d'onda. Esempio di fluorescenza semplice: La marcatura rende visibili i nuclei cellulari ed in particolare i cromosomi F.Pagano Immunofluorescenza e immunoistochimica • Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti • IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti • IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica) F.Pagano Metodo immunoistochimico diretto ed indiretto F.Pagano Esempio di immunoistochimica diretta un gruppo di neuroni è decorato con anticorpi fluorescenti che riconoscono il recettore dell’insulina F.Pagano Immunofluorescenza indiretta F.Pagano Microscopia Confocale Il microscopio confocale a scansione laser ha la possibilità di produrre sezioni ottiche anche dello spessore di 0.5 nm e di acquisirle direttamente per fare una ricostruzione 3D del preparato osservato. I dati acquisiti possono poi essere analizzati per determinare il volume, l'area e la morfologia del preparato o per osservarne la struttura da ogni punto dello spazio. F.Pagano Microscopia Confocale F.Pagano Microscopia Confocale F.Pagano Microscopia Confocale Glomerulo olfattivo F.Pagano filamento (catodo) il microscopio elettronico a trasmissione anodo condensatore preparato obiettivo proiettore schermo fluorescente F.Pagano B Microscopia elettronica • Preparazione del tessuto – – – – Fissazione in glutaraldeide Postfissazione in tetrossido di osmio Disidratazione con alcool Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche • Taglio all’ultramicrotomo – Sezioni di 20-40 nm • Aumento del contrasto – Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo F.Pagano F.Pagano Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono “in bianco e nero”. Le parti “scure” si dicono elettrondense. L’altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. linfocito F.Pagano Microfotografia elettronica di RER F.Pagano Microfotografia elettronica di Golgi + vescicole F.Pagano Citochimica e congelamentofrattura F.Pagano Microscopio elettronico a scansione • Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione • Consente di valutare il rilievo degli oggetti • Usata per lo studio delle superfici cellulari F.Pagano F.Pagano F.Pagano Macrofago in microscopia elettronica a scansione capello F.Pagano
