Allegato n. 3 alla Delib.G.R. n. 22/12 del 11.6.2010
Regione proponente: Regione Autonoma della Sardegna
Linea progettuale nella quale si colloca il progetto: Linea progettuale b) malattie rare – art.
2, Decreto 14 ottobre 2009 recante “Progetti attuativi del Piano sanitario nazionale – Linee
guida per l’accesso al cofinanziamento alle regioni e alle province autonome di Trento e
Bolzano - Anno 2009”.
Titolo del progetto
STUDIO DELLE ENCEFALOMIOPATIE MITOCONDRIALI NEL SUD SARDEGNA
Durata del progetto: ventiquattro mesi
Referente regionale - Dott.ssa Anna Corona – Servizio dell'assistenza ospedaliera,
residenziale, riabilitativa ed autorizzazioni e accreditamenti delle Strutture sanitarie e socio
sanitarie - Settore assistenza ospedaliera
e riabilitazione - tel. 070-606.5372 - fax 070-606.5239 - mail: [email protected]
Responsabile della realizzazione del progetto:
Dott.ssa Eleonora Cocco - Dipartimento scienze Cardiovascolari e Neurologiche - Sez. Centro
Sclerosi
Multipla
-
Ospedale
Binaghi
–
Via
Is Guadazzonis,
2-
09126-Cagliari
tel.070.6093134- fax 070.6092929- email [email protected]
Aspetti finanziari
Costo complessivo del progetto: 400.000,00
finanziamento regionale: 100.000,00
Cofinanziamento ministeriale atteso: 300.000,00
Spese stimate
Il fabbisogno finanziario di massima necessario alla realizzazione del progetto si articola
nell’arco presumibile di 24 mesi nel seguente modo:
Nei primi 12 mesi 300000 per acquisto attrezzature e materiale di consumo (materiale di
laboratorio, software) e 150000 negli ultimi 12 mesi per acquisto materiale di laboratorio, per
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contratto a progetto per epidemiologo che presta la propria opera e contratto a progetto per
biologo che presta la propria opera.
Per un importo totale di € 400.000,00
Sintesi del progetto
Premesse
I mitocondri (Mt) sono organelli presenti all’interno della cellula che svolgono numerose
funzioni. Il ruolo più importante è sicuramente la produzione di energia sotto forma di ATP,
attraverso il sistema della catena di trasporto degli elettroni e della fosforilazione ossidativa.
Oltre il 90% dell’energia utilizzata nell’organismo è prodotta nei Mt, pertanto una disfunzione
di questi organelli pone a rischio la sopravvivenza delle cellule. La catena respiratoria,
localizzata nella membrana mt interna, è costituita da cinque complessi proteici formati da
proteine sintetizzate sia dal mitocondrio che dal nucleo. Il Mt infatti è il solo organello
all'interno della cellula, oltre al nucleo, che contenga un suo proprio DNA (mtDNA) e un suo
macchinario per la sintesi di RNA e proteine. Il genoma mt è costituito da una doppia elica
circolare di DNA di circa 16 000 paia di basi. E' stato stimato che ogni cellula possa contenere
da
un
centinaio
a
qualche
migliaio
di
Mt,
e
che
ogni
mitocondrio
contenga
approssimativamente cinque molecole di mtDNA. Delle oltre 900 proteine mt, solo 13 sono
codificate dal genoma mt. Tutti i mt dello zigote derivano dall'ovulo in quanto quelli contenuti
nello spermatozoo vengono in quasi tutti i casi distrutti dopo la fecondazione. Quindi una
madre con mutazioni del mt DNA le trasferisce a tutta la sua progenie, ma solo le sue figlie
potranno a loro volta trasferire la mutazione. Le patologie che colpiscono il mt sono chiamate
malattie mt (MM), e sono particolarmente interessanti poiché la catena respiratoria è sotto il
controllo di due genomi (nucleare e mt). Questo fa sì che nelle MM possano essere coinvolte
sia la genetica mendeliana che quella mt. (DiMauro S, et al 2009)
Caratteristiche peculiari delle MM dovute a mutazioni nel mt DNA sono l'ereditarietà materna
e l'eteroplasmia. Ci sono centinaia di molecole di mt DNA in ogni cellula, e in generale le
mutazioni patogenetiche
sono presenti in alcuni ma non in tutti questi genomi. Come
conseguenza, le cellule e i tessuti del futuro nascituro avranno sia mt DNA normale che
mutato, una situazione conosciuta come eteroplasmia. Nel tempo i livelli di eteroplasmia
potranno modificarsi da tessuto a tessuto, e nel momento in cui viene superata una soglia
critica potranno evidenziarsi delle disfunzioni nel tessuto stesso. I mitocondri d’altronde sono
ubiquitari, quindi potenzialmente ogni tessuto dell'organismo può essere colpito. Questo è
uno dei motivi per cui spesso le MM sono multisistemiche. Da notare che alcuni tessuti ad alta
richiesta energetica quali il sistema nervoso e il muscolo scheletrico (Cree LM et al 2010)
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sono frequentemente affetti e infatti queste entità nosologiche vengono anche indicate come:
encefalomiopatie mitocondriali (EM).
Nel contesto delle EM si possono identificare delle sindromi ben caratterizzate
fenotipicamente come: MELAS (Encefalomiopatia Mitocondriale con Acidosi Lattica ed
episodi “Stroke”); mioclono-epilessia con fibre “ragged-red” (MERRF), sindrome di NARP
(neuropatia,
atassia,
retinite
pigmentosa),
Miopatia
e
cardiomiopatia
(MIMYCA),
Oftalmoplegia Esterna Progressiva (PEO) , l’atrofia ottica di Leber e altre. (Zeviani M et al
2007)
Un numero cospicuo di pazienti affetti da EM presentano combinazioni di sintomi che non
permettono la definizione diagnostica all’interno di una sindrome ben definita.
Le EM sono inoltre eterogenee dal punto di vista genetico, potendo essere determinate da
mutazioni puntiformi nel mt DNA, riarrangiamenti dello stesso (macrodelezioni singole o
multiple) e da mutazioni in geni nucleari (Tuppen HA et al 2009). Le mutazioni puntiformi e le
macrodelezioni singole insorgono direttamente nel mt DNA, le delezioni multiple e la
deplezione del mtDNA sono determinate da mutazioni in geni nucleari (per es POLG, OPA1 e
altri) (Lamperti C et al 2009).
Dati epidemiologici certi sulle EM non sono attualmente disponibili, anche se le EM
considerate globalmente rappresentano una una fetta consistente di “malattie rare”. La loro
frequenza è verosimilmente sottostimata a livello mondiale anche a causa della difficoltà
diagnostica. (Schaefer AM et al Ann Neurol 2008).
Pazienti e metodi
Determinare la prevalenza di EM nel quadro di specifiche sindromi neurologiche. Rilevazione
dei dati da fonti esistenti. In particolare è prevista la raccolta e registrazione dei dati
provenienti da: Registri esenzione ticket, Schede Dimissione Ospedaliera, Cartelle cliniche
provenienti da: Centro Sclerosi Multipla della ASL 8, Clinica Neurologica dell’Azienda
Ospedaliero Universitaria, Divisione Neurologia dell’Azienda Ospedaliera Brotzu. Le sindromi
neurologiche prese in esame saranno le seguenti: miopatie, ictus giovanile e ictus tardivo sine
causa; parkinsonismi atipici e sindromi parkinson plus; epilessia mioclonica; oftalmoplegia e
ptosi; atrofie ottiche non infiammatorie; emicranie atipiche; sindromi dementigene non
inquadrate in una specifica sindrome; ipoacusie neurosensoriali; malattie della sostanza
bianca non infiammatorie, malattie del motoneurone, neuropatie ereditarie plus. L’EM verrà
sospettata in tutti i pazienti che presentino un’associazione di segni di coinvolgimento di più
organi non correlati tra loro, con possibile compromissione neuromuscolare e con un decorso
progressivo. Inoltre sarà attentamente valutata la storia familiare per la ricerca di ereditarietà
materna e ereditarietà mendeliana. I soggetti identificati come sospette EM saranno rivalutati
dal punto di vista clinico. La documentazione clinica sarà nuovamente presa in esame e i
soggetti
saranno
sottoposti
quando
necessario
a
nuovi
accertamenti
diagnostici
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neuroradiologici i neurrofisiologci. Il protocollo di studio seguirà le linee guida dell’EFNS
“European Federation of Neurological Societies” (Finsterer J et al Eur J Neurol 2009)
In particolare nel caso in cui il sospetto di EM sia confermato verrà effettuato il dosaggio
ematico di lattato e piruvato e il loro rapporto sarà calcolato. Inoltre i pazienti verranno
sottoposti a biopsia muscolare mediante tecnica ad ago.
Il muscolo sarà processato e
sottoposto a indagini istologiche in microscopia ottica. In particolare, la colorazione Tricromica
di Gomori modificata permetterà di visualizzare le Fibre muscolari Rosse Stracciate (Ragged
Red Fibers), tipiche di molte miopatie mt. Inoltre indagini istochimiche, sempre in microscopia
ottica, per verificare l’attività di alcuni enzimi mt (Citocromo c ossidasi, Succinato
Deidrogenasi, ecc) e indagini biochimiche, per misurare l’attività degli enzimi della Catena
Respiratoria saranno effettuate. Il DNA verrà estratto dal muscolo e sarà effettuata la long
PCR per la ricerca di delezioni singole o multiple. Le mutazioni puntiformi più frequenti
saranno cercate tramite RFLP e sarà quantificata l’eteroplasmia. La deplezione sarà valutata
tramite PCR real time quantitativa. Se necessario il DNA mt sarà estratto da: sangue
periferico, urine, mucosa del cavo orale o bulbo pilifero.
Quando il muscolo mostrerà il tipico quadro neuropatologico da malattia mt ma risulteranno
negative le analisi molecolari si procederà al sequenziamento dell’intero genoma
mitocondriale. Nel caso di presenza di delezioni multiple saranno studiati i seguenti geni
nucleari associati alla sindrome da delezioni multiple: POLG, ANT1 and Twinkle. In caso di
atrofia ottica saranno studiate le 3 mutazioni mt principali associate a Leber ed eventualmente
il gene nucleare OPA1. Nelle forme di neuropatie sensitivo-motorie assonali sarà studiato il
gene codificante per mitofusina.
I dati clinici, quelli strumentali disponibili e risultati genetici verranno tabulati in un database.
Sarà eseguita un’analisi descrittiva: su distribuzione per età d’esordio, sesso, caratteristiche
socio-demografiche, residenza e fenotipo. La stima della prevalenza di EM sul totale dei
pazienti neurologici sarà calcolata sulla popolazione di pazienti totale e separatamente per le
diverse sindromi. Con la statistica inferenziale saranno identificate le mutazioni mt più
frequentemente associate ai pazienti EM, e saranno esaminate le associazioni genotipofenotipo analizzando la frequenza delle mutazioni mt in relazione alle caratteristiche cliniche.
Contesto
Gli isolati genetici, con una ristretta popolazione originaria, lunghi periodi di isolamento e alti
livelli di endogamia, rappresentano una risorsa eccezionale nello studio di malattie rare come
quelle mt. La popolazione Sarda è un antico isolato genetico caratterizzato da componenti
genetiche altamente omogenee ed è pertanto ideale per studiare l’influenza di geni potendo
escludere fattori dovuti alla presenza di stratificazioni (Lampis R, et al Tissue Antigens 2000;
56 (6): 515-21). Il presente progetto si propone di valutare la frequenza e le caratteristiche
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fenotipiche e genetiche dell’’EM in una popolazione di pazienti neurologici nella Sardegna del
sud, sfruttando le particolari caratteristiche della popolazione Sarda. In particolare i pazienti
verranno identificati nelle tre maggiori strutture ospedaliere: Centro Sclerosi Multipla della
ASL 8, Clinica Neurologica dell’Azienda Ospedaliero Universitaria, Divisione Neurologia
dell’Azienda Ospedaliera Brotzu. La biopsia muscolare e le analisi neuropatologiche saranno
effettuate presso il Centro per le Malattie Neuromuscolari del Centro Sclerosi Multipla (ASL8,
Università di Cagliari), tale struttura è l’unica presente in Sardegna in cui vengano effettuate
tali procedure, questo permetterà di avere accesso ad un’ampia casistica bioptica e
permetterà di studiare anche i sospetti casi pediatrici. Le analisi di biologia molecolari saranno
effettuate presso il laboratorio del centro sclerosi Multipla (ASL8, Università di Cagliari).
L’analisi statistica sarà effettuata presso il dipartimento di Igiene e Sanità Pubblica
dell’Università di Cagliari.
Obiettivo finale
L’obiettivo finale del progetto proposto è quello di stimare la frequenza nelle malattie
neurologiche delle EM nella Sardegna del Sud e caratterizzarle dal punto di vista fenotipico e
genetico.
Obiettivi intermedi
Gli obiettivi intermedi sono i seguenti:
-
Identificare i soggetti con sospetta EM e categorizzarli sulla base delle diverse sindromi
neurologiche
-
Sottoporre tali soggetti a test di screening e ulteriori analisi diagnostiche per individuare i
casi di effettiva EM e identificare il difetto molecolare alla base della malattia
-
Eseguire l’analisi statistico epidemiologica dei dati raccolti
-
Predisporre un piano di consulenza genetica per le famiglie dei soggetti affetti
Risultati attesi
Dal presente progetto ci si aspetta di ottenere i dati epidemiologici e genetici sulle EM nelle
malattie neurologiche in Sardegna. Tali malattie sono considerate di bassa frequenza ma non
esistono dati precisi nell’isola. I risultati che ci aspettiamo da questo progetto sono importanti
sia per diagnosticare in maniera corretta l’EM ed offrire un migliore servizio ai pazienti e alle
loro famiglie, sia per avanzare nelle conoscenze scientifiche su queste patologie. A loro volta,
queste informazioni sono importanti per la consulenza genetica, la diagnosi prenatale e la
possibilità di studiare strategie terapeutiche. La caratterizzazione fenotipica e molecolare delle
EM e l’identificazione dei soggetti affetti permetterà di effettuare un piano di consulenza
genetica nelle famiglie.
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Tempi di attuazione
La durata del progetto è di 24 mesi. In particolare durante i primi 21 mesi saranno identificati i
soggetti che presentano sintomi suggestivi di EM. Durante i primi 21 mesi del progetto i
soggetti identificati verranno sottoposti ai test di screening e analisi diagnostiche. Dal mese
21 al 24 verranno effettuate le valutazioni statistiche.
Indicatori per la verifica dei risultati raggiunti
−
Disponibilità di un elenco dei soggetti con sospetta EM, caratterizzati sulla base delle
diverse sindromi neurologiche.
−
Disponibilità di un database contenente i dati fenotipici e genetici dei pazienti affetti da
EM.
−
Disponibilità di dati di prevalenza di EM nelle totalità delle malattie neurologiche e nelle
diverse sindromi neurologiche; disponibilità di dati sulla frequenza delle mutazioni mt nella
popolazione di pazienti affetti da EM e di eventuali associazioni genotipo – fenotipo.
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